JP2021035931A - 細孔修飾メソポーラスシリカナノ粒子による薬物送達 - Google Patents

Abstract

【課題】メソ細孔内に１種以上の生物活性成分を負荷することができる、メソ細孔の表面上に修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子、これを調製するプロセスおよびその適用の提供。
【解決手段】メソポーラスシリカナノ粒子であって、その細孔の表面に有機修飾を含み、１００ｎｍ以下の粒子サイズおよび１５０ｎｍ以下の動的光散乱によって測定される媒体中の流体力学的サイズを有し、有機修飾が少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を含み、前記媒体がリン酸緩衝生理食塩水と生物学的に類似または同等であることを特徴とする、メソポーラスシリカナノ粒子。
【選択図】なし

Description

本開示は（拡張された）メソ細孔の表面上に修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子に関し、これは、（拡張された）メソ細孔内に１種以上の生物活性成分をさらに負荷することができ、これを調製するプロセスおよびその適用に関する。

組合せ薬物療法は、がんや感染症など最も恐ろしい疾患の治療に最も広く用いられている。薬物組合せを使用する主な目的は相乗的な治療効果を達成し、投与量および有害作用を減少させ、薬物耐性の誘発を最小限に抑えることである。したがって、患者への２つ以上の薬物の同時投与は、通常、各薬物治療単独よりも大きな治療効果を示す。がん治療において、組合せ療法は薬剤耐性を克服し、治療成績を高めるためのスタンダードな臨床診療である。異なる作用機序をもつ２つ（またはそれ以上）の（異なる細胞周期チェックポイント、遺伝子、またはがんの代謝経路を標的とする）薬物の相乗効果は、がんを排除する機会を高める。しかし、組合せ薬物療法を開発する際には、薬物の物理化学的性質や薬物動態特性の違いが多くの課題につながる。組合せ薬物療法の開発に伴う主な問題は（１）適切な薬物組合せと薬物比率の同定、（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ ｖｉｖｏ挙動との相関、（３）薬物が効果的な投与量と比率（薬物の薬物動態）で同じ腫瘍細胞に到達できるかどうか、である。ナノ粒子多剤共送達は、組合せ薬物療法におけるこれらの課題を解決する潜在的経路を提供する。

ナノ粒子製剤は（１）ナノ粒子が疎水性薬物および親水性薬物を同時に送達することができ、単一のナノ粒子において最適化された相乗効果薬物比率を維持することができる、（２）ナノ粒子が循環時間を延長し、薬物の腫瘍ターゲッティング能力を増強することができる、および（３）薬物カプセル化ナノ粒子が標的細胞中に多剤を同時に送達し、薬物間の薬物動態学的相違点を正常化することができるなど、多剤併用送達にいくつかの利点をもたらす。メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は大きな細孔容積、化学的／熱的安定性、高い負荷容量、調節可能な表面特性、および優れた生体適合性などの独特の物理的／化学的性質のために、薬物送達システムとして大きな可能性を有すると考えられてきた。ＭＳＮの外表面または細孔表面は、種々の官能基で個々に容易に修飾することができる。しかしながら、同じ粒子中の疎水性薬物および親水性薬物のカプセル化は通常、溶液中の粒子の単分散に影響を及ぼし、したがって、この送達システムは依然として課題を提示し、改善の必要がある。本発明では、拡大された細孔サイズ（任意選択で）および特定の官能基および比による細孔表面修飾を有する小サイズＭＳＮ（＜１００ｎｍ）が同じ粒子中に２つの薬物をカプセル化することができ（一実施形態では１つは疎水性であり、別のものは親水性）、抗多剤耐性がん細胞において相乗的治療効果を示す。本発明において言及される粒子による多剤共送達はまた、がん、多剤耐性がん、脳がん、転移性脳がん、および中枢神経系疾患などの様々な疾患を治療するために使用することができる。

本発明は、メソ細孔の表面上に修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子を提供する。メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は５０ｎｍ未満の細孔サイズを有し、孔径が３ｎｍより大きい（すなわち、細孔が「拡張」される）場合、「ｅｘＭＳＮ」と呼ぶことができる。

また、本発明は、（拡張された）メソ細孔内に1種以上の生物活性成分が負荷された細孔修飾ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮを提供する。本出願はまた、生物活性成分を負荷して、または負荷せずに、細孔修飾ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮを生成する方法を提供する。

一態様では、本発明が細孔の表面上に１種以上の生物活性成分を安定に捕捉または封入するために、細孔の表面が官能基で修飾されているメソポーラスシリカナノ粒子を提供する。

一実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子の細孔サイズが５０ｎｍより小さい。
一実施形態では、官能基が疎水性または親水性またはその両方である。

一実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子の細孔の表面が末端ヒドロカルビル部分を有する官能基で修飾される。一実施形態では、末端ヒドロカルビル部分が末端芳香族部分、末端（シクロ）脂肪族部分、またはそれらの組合せを含む。

いくつかの実施形態では、末端芳香族部分が低級アルキルまたはハロゲンで置換されている。さらなる実施形態では、末端芳香族部分がトリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）から誘導される。いくつかの実施形態では末端（シクロ）脂肪族部分が（シクロ）アルキル、（シクロ）アルケニルまたはその組合せを含み、これらは任意選択で低級アルキルまたはハロゲンで置換することができる。

いくつかの実施形態では、生物活性成分が親水性、疎水性、または親油性である。
いくつかの実施形態では、生物活性成分が小分子、化学薬物、酵素、タンパク質薬物、抗体、ワクチン、抗生物質またはヌクレオチドドラッグである。

いくつかの実施形態では、少なくとも２つの生物活性成分が細孔内、例えば、細孔の表面上に負荷される。一実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子が１つ以上の親水性生物活性成分および１つ以上の疎水性生物活性成分を細孔内、例えば細孔の表面上に負荷する。一実施形態では、メソポーラスシリカナノ粒子が細孔内、例えば細孔の表面上に、１つ以上の疎水性生物活性成分を負荷する。

別の態様では、本開示は、本発明のメソポーラスシリカナノ粒子を対象に投与することを含む、生物活性成分を対象に送達するための方法を提供する。

一実施形態では、本方法が本開示のメソポーラスシリカナノ粒子を送達して、血液脳関門および／または血液眼関門を透過することができる。

図１は、抗ＭＣＦ−７／ＡＤＲがん細胞に対するｅｘＭＳＮによるＪＭ１７とＤｏｘ共送達の相乗効果を示す。 図２は、ＮＴＴ２＿１３１ナノ粒子によるＪＭ１７およびＤｏｘ共送達の抗ＭＣＦ−７／ＡＤＲ腫瘍効力を示す。

本明細書の開示の理解を容易にするために、本明細書で使用される用語は、以下で定義される。
明細書及び特許請求の範囲の文脈において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は特に明記しない限り、複数の指示対象を含む。特に明記しない限り、本明細書で提供される任意のおよびすべての例または例示的な言語（例えば、「そのような（such as）」）は、本発明の範囲を限定するのではなく、単に本発明をより良く例示するために使用されるにすぎない。

本明細書に列挙される任意の数値範囲は、その中に包含される全てのサブ範囲を含むことが意図されることが理解されるべきである。例えば、「５０〜７０℃」の範囲には、５０℃の規定最小値と７０℃の規定最大値との間のすべてのサブ範囲および特定値（例えば５８℃〜６７℃、５３℃〜６２℃、６０℃または６８℃）が含まれる。開示された数値範囲は連続的であるので、それらは最小値と最大値との間の各数値を含む。特に明記しない限り、本明細書に示される様々な数値範囲はおおよそのものである。

本発明において、「約」という用語は当業者によって測定された所与の値の許容可能な偏差を指し、これは、部分的にはその値をどのように測定または決定するかに依存する。

本発明において、特に指定しない限り、本明細書で使用される接頭語「ナノ−」は約３００ｎｍ以下のサイズを意味し、特に指定しない限り、本明細書で使用される接頭語「メソ−」は約５０ｎｍ未満のサイズを意味する。

本発明において、本明細書で使用される「シラン」という用語は、ＳｉＨ_４の誘導体を意味する。通常、４つの水素のうちの少なくとも１つは、後述するように、アルキル、アルコキシル、アミノなどの置換基で置換されている。本明細書で使用される用語「アルコキシシラン」は、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基を有するシランを指す。本明細書で使用される用語「オルガノアルコキシシラン」は、ケイ素原子に直接結合した少なくとも１つのアルコキシル置換基および少なくとも１つのヒドロカルビル置換基を有するシランを指す。本明細書で使用される「シリカ源」という用語は、オルトケイ酸の塩の形態またはエステルの形態とみなすことができる物質、例えば、オルトケイ酸ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、テトラエチルオルトケイ酸（テトラエトキシシラン、ＴＥＯＳ）、テトラメチルオルトケイ酸、テトラプロピルオルトケイ酸を指す。場合により、ヒドロカルビル置換基はヘテロ原子でさらに置換されていてもよいし、中断されていてもよい。

本発明において、本明細書で使用される「ヒドロカルビル」という用語は、炭化水素に由来する１価のラジカルを意味する。本明細書で使用される「炭化水素」という用語は、炭素原子と水素原子のみからなる分子を指す。炭化水素の例としては（シクロ）アルカン、（シクロ）アルケン、アルカジエン、芳香族化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。ヒドロカルビルが上記のようにさらに置換される場合、置換基は、ハロゲン、アミノ基、水酸基、チオール基などであり得る。ヒドロカルビルが上記のようにヘテロ原子で中断される場合、ヘテロ原子はＳ、ＯまたはＮであり得る；本発明において、ヒドロカルビルは好ましくは１〜３０個のＣ原子を含む。

本発明において、用語「アルキル」は、好ましくは１〜３０個の炭素原子、より好ましくは１〜２０個の炭素原子を含む飽和、直鎖または分岐アルキルを指す。アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−エチルブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、１−メチルペンチル、１，３−ジメチルブチル、ｎ−ヘキシル、１−メチルヘキシル、ｎ−ヘプチル、イソヘプチル、１，１，３，３−テトラメチルブチル、１−メチルヘプチル、３−メチルヘプチル、ｎ−オクチル、２−エチルヘキシル、１，１，３−トリメチルヘキシル、１，１，３，３−テトラメチルペンチル、ノニル、デシル、ウンデシル、１−メチルウンデシル、ドデシル、１，１，３，３，５，５−ヘキサメチルヘキシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含むが、これらに限定されない。

本発明において、本明細書で使用される「アルコキシル」または「アルコキシ」という用語は式「−Ｏ−アルキル」を有する基を意味し、前記式中の「アルキル」の定義は、上記の「アルキル」の意味を有する。

本発明において、用語「シクロアルキル」は、本明細書中で使用される場合、３〜１０個の環状炭素原子およびより好ましくは３〜８個の環状炭素原子、ならびに場合により環上のアルキル置換基を含有する、飽和または部分的に不飽和の環状炭素ラジカルを意味する。シクロアルキルの例としてはシクロプロピル、シクロプロペニル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、２−シクロヘキセン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明において、「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。

本発明において、本明細書で使用される「アミノ」という用語は式−ＮＲ_１Ｒ_２の官能基を意味し、式中、Ｒ_１およびＲ_２は、それぞれ独立して、水素または上で定義されたヒドロカルビル基を表す。

本発明において、用語「水相」は、本明細書中で使用される場合、水と実質的に混和性である相を意味する。水相の例としては水それ自体、水性緩衝液、水性ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液、水性アルカノール溶液などが挙げられるが、これらに限定されない。水相は、合成の要求および／または水相中に存在する物質の安定性に基づいて、酸性、中性またはアルカリ性であるように調整することができる。

本発明において、用語「油相」は、本明細書中で使用される場合、上記のような水相と実質的に非混和相を意味する。油相の例としては液体、置換または非置換（シクロ）アルカン（例えば、ヘキサン、デカン、オクタン、ドデカン、シクロヘキサンなど）；置換または非置換芳香族溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、本明細書中で使用される「生物活性成分」という語は、生物において活性を有する物質を指す。生物活性成分の例としては低分子、化学薬物、酵素、タンパク質薬物、抗体、ワクチン、抗原、抗生物質またはヌクレオチド薬物が挙げられるが、これらに限定されない。

細孔修飾ＭＳＮ
ナノ粒子製剤は、以下のような遊離薬物の組合せと比較して、多剤同時送達にいくつかの利点をもたらす。（１）ナノ粒子は疎水性薬物および親水性薬物を同時に送達することができ、単一のナノ粒子において最適化された相乗効果薬物比を維持することができる。（２）ナノ粒子は循環時間を延長し、薬物の腫瘍標的化能力を増強することができる。（３）薬物カプセル化ナノ粒子が標的細胞中に多剤を同時に送達し、薬物間の薬物動態学的相違点を正常化することができる。メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は大きな細孔容積、化学的／熱安定性、高い負荷容量、調節可能な表面特性、および優れた生体適合性などの独特の物理的／化学的性質のために、薬物送達システムとして大きな可能性を有すると考えられてきた。ＭＳＮの外表面または細孔表面は、種々の官能基で個々に容易に修飾することができる。しかしながら、同じ粒子中の疎水性薬物および親水性薬物のカプセル化は溶液中の粒子の単分散に影響を及ぼさなかったが、依然として課題であり、改善が必要である。本発明では、細孔サイズが拡大された（任意選択で）細孔表面が特定の官能基および比によって修飾された小さいサイズのＭＳＮ（＜１００ｎｍ）が同じ粒子中に２つの薬物をカプセル化することができ（１つの実施形態では１つは疎水性であり、別のものは親水性）、抗多剤耐性がん細胞において相乗的な治療効果を示す。本発明において言及される粒子による多剤共送達はまた、がん、多剤耐性がん、脳関連がん、転移性脳がん、および中枢神経系疾患などの様々な適応症を治療するために使用することができる。

本発明の細孔修飾ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは生物活性成分を十分に負荷し、対象の循環系中で輸送することができるように、適切な見かけのサイズ、動的光散乱サイズ、および細孔サイズを有する。特定の実施形態に、細孔修飾ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは、血液脳関門（ＢＢＢ）および／または血液眼関門さえ透過し得る。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの細孔サイズは、生物活性成分の負荷容量および／または効率に影響を及ぼし得る。細孔サイズが小さすぎると、より大きな分子の負荷容量が不十分になることがある。細孔サイズが大きすぎると、負荷効率が低くなり、負荷された薬物が細孔から容易に漏れることがある。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの細孔サイズが５０ｎｍ以下、好ましくは１〜２０ｎｍ、より好ましくは３〜１０ｎｍ、１〜１０ｎｍ、または１〜５ｎｍである。細孔サイズは適切な合成手順および／または要求に基づく材料によって、例えば、細孔内に負荷されるべき生物活性成分のサイズに基づいて、適切に制御され得る。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのサイズは、循環系におけるその輸送を増強する際に重要な役割を果たし得る。サイズが大きすぎる場合、ナノ粒子は、免疫系によって迅速に同定され、除去され得る。サイズが小さすぎる場合、ナノ粒子は、腎臓濾過によって体から迅速かつ容易に除去され得る。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのサイズが１００ｎｍ以下、好ましくは８０ｎｍ以下、６５ｎｍ以下、６０ｎｍ以下または５０ｎｍ以下、より好ましくは４０ｎｍ以下である。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのサイズが少なくとも６０ｎｍ、好ましくは少なくとも４０ｎｍ、より好ましくは少なくとも３０ｎｍである。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのサイズが数値範囲の終点として本明細書に開示される任意の点、例えば３０ｎｍ〜１００ｎｍなどからなる実行可能な数値範囲から変動する。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの動的光散乱（ＤＬＳ）サイズを使用して、異なる溶液中の懸濁液を評価する。ＤＬＳの大きさが大きすぎると、ストック溶液中または生理学的条件下で容易に凝集することがあり、これは、医薬的に安定な組成物を製造し、安定なプロセスを提供する際に不利であることがあり、組成物はまた、血液循環が不十分であり、血管閉塞の危険性が高いために、臨床用途に使用することができないことがある。生きている対象における適用のためのＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの可能性をより良く評価するために、ＤＬＳの大きさは、好ましくは水中およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等である培地中の両方で測定される。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの動的光散乱サイズが少なくとも６０ｎｍ、より好ましくは少なくとも３０ｎｍである。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの動的光散乱サイズが１５０ｎｍ以下、好ましくは１００ｎｍ以下、より好ましくは６０ｎｍ以下、または３０ｎｍ以下である。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの動的光散乱サイズが数値範囲の終点として本明細書に開示される任意の点、例えば３０ｎｍ〜１５０ｎｍなどからなる実行可能な数値範囲からの範囲である。理論に束縛されるものではないが、１５０ｎｍを超えるＤＬＳサイズを有するナノ粒子は容易に凝集するか、または免疫系によって除去され得、したがって、生物活性成分を適切に送達することができない。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの細孔の表面が官能基で修飾され、これを以下、「内面修飾」と呼ぶ。内面修飾は、生物活性成分をより安定に細孔内に捕捉または封入することを可能にし得る。内面修飾はまた、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの分散性に影響を及ぼし得る。内面修飾のための官能基は通常疎水性であり、特に芳香族である。一実施形態では、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの細孔の表面が末端ヒドロカルビル部分を有する官能基で修飾される。一実施形態では、ヒドロカルビル部分がベンゼン（フェニル）、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ジフェニルエーテル、エラグ酸、カルバゾリル、ケルセチンなどから選択される芳香族部分である。一実施形態では、芳香族部分が低級アルキル、アルケニル、アルコキシルまたはハロゲンで置換される。一実施形態では、芳香族部分は芳香族シロキサン、例えばトリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）から誘導することができる。末端芳香族部分の量（含有量等）は、末端芳香族部分が充分であることを確実にするために測定することができる。一実施形態では、末端ヒドロカルビル部分が（シクロ）パンタニル、（シクロ）ヘキサニル、（シクロ）ヘプタニル、（シクロ）オクタニル、（シクロ）ノナニル、（シクロ）デカニル、（シクロ）ウンデカニル、（シクロ）ドデカニルなどから選択される（シクロ）脂肪族部分である。一実施形態では、末端ヒドロカルビル部分が芳香族部分、（シクロ）脂肪族部分、またはそれらの組合せを含む。理論に束縛されるものではないが、内面上の末端ヒドロカルビル部分の量が多すぎる場合、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの分散性は不十分であり得、末端部分の量（比率）が低すぎる場合、疎水性生物活性成分の負荷容量／効率は不十分であり得る。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの「外側」表面、すなわち粒子の表面は官能基で修飾することができ、これはまた、ＭＳＮの特性を変化させ、それによって生体適用性能を変化させる。例えば、ポリ（アルコキシレングリコール）（ＰＡＧ）型基修飾は、粒子を、培地中でのより良好な懸濁、より低い免疫原性、および体内でのより長い循環期間を示すようにすることができる。ＭＳＮはいかなる外側表面修飾も有さないが、通常、表面上に負電荷を有する。したがって、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、アルコキシルシラン末端（ポリ）アルキレン（ポリ）アミンまたはアミン含有有機アルコキシシラン修飾を適用して、粒子を正または弱い負の表面電荷を有するようにするか、または外側表面を電気的に中性にすることができる。一方、カルボキシル、ホスホリル、スルホネート含有有機アルコキシシラン修飾は、粒子を強い負電荷を有するようにすることができる。さらに、粒子の表面上の官能基の組合せは、多数の表面特性を提供する。

ＭＳＮとｅｘＭＳＮのＥＰＲ効果
一般に、ＥＰＲ媒介受動ターゲッティングは、ナノキャリアの循環時間の延長に大きく依存する。透過性および保持性（ＥＰＲ）増強効果に基づく腫瘍標的化は、（１）高密度ＰＥＧ化；（２）表面の官能基の空間的制御；（３）小さなＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの作製；および（４）タンパク質コロナ形成の制御によって取り組むことができる。特に重要な２つのパラメータは粒子サイズおよび表面特性であり、これは、ナノキャリアの循環半減期、薬物動態、および生体内分布に重要な役割を果たすと予想される。典型的には、注射された材料が血清オプソニンによって認識され、迅速に結合され、続いて食作用を受け、肝臓および脾臓（単核食細胞系としても知られる）の両方に実質的に蓄積される。さらに、包括的な研究は標的化ナノ材料送達の開発における重大な設計としてタンパク質コロナニュートラル性をハイライトし、そして表面不均一性におけるわずかな差異でさえ、細胞および組織との著しく異なる相互作用を生じる機会を有し得ることを実証した。したがって、タンパク質コロナ組成物の制御および理解は、成功したＥＰＲ標的ナノ医薬を開発するために重要であり得る。

ＢＢＢ透過効果
血液脳関門（ＢＢＢ）は脳内に輸送される治療薬のほとんどを制限する。ナノメディシンは、ナノ粒子サイズ、形状、表面電荷、結合型リガンドを調節して、ＢＢＢの透過を増加させることができる。トランスフェリン、ラクトフェリン、グルタチオンおよび低密度リポタンパク質受容体などの内皮細胞上の受容体に結合する標的化リガンドと結合したナノ粒子もまた、ＢＢＢ透過を促進し得る。しかしながら、ナノ表面外面上の標的化リガンドによる修飾はまた、血液中のナノ表面の懸濁および循環に影響を及ぼし、ナノ表面の血液クリアランスを加速することができる。本発明者らは、ＰＥＧ化ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのサイズ、表面組成、およびゼータ電位の変化および制御に基づいて、ＢＢＢ透過能力を増加させた。これらの修飾、空間配置、および電荷により、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは、最小限の非特異的結合、生理学的環境における適切な循環期間、および血液から脳へのその輸送を含む特性を明らかにする。

血液眼関門透過効果
視力障害および失明の主な原因は、加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、緑内障、眼内炎などを含む後眼部関連疾患である。しかし、血液眼関門は血液脳関門と同様に、治療薬のほとんどが眼、特に眼の後眼部に運ばれることを控える。関門を克服するために、ナノ粒子サイズ、表面電荷、および構成などのようなＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの特性を調節して、眼の静的および動的障壁の透過を増加させ、それによって眼のバイオアベイラビリティを改善することができる。従って、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは、眼疾患を処置するための潜在的な眼薬物送達担体である。このような用途におけるＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの投与経路は、局所（点眼剤）、硝子体内、結膜下、網膜下、球周囲、後部強膜、脈絡膜後球上、前房内、サブテノン、全身注射などであり得る。

生物活性成分
本明細書中で使用される生物活性成分は、親水性、疎水性または親油性であり得る。一実施形態では、生物活性成分が親水性であってもよく、または親水性になるように修飾されていてもよく、水溶性であるか、または水相中に分散または溶解することができるようにする表面修飾を有するものから選択することができる。一実施形態では、生物活性成分が酵素、タンパク質薬物、抗体、ワクチン、抗生物質またはヌクレオチド薬物である。酵素の例としては、アガルシダーゼ、イミグルセラーゼ、タリグルセラーゼ、ベラグルセラーゼ、アルグルセラーゼ、セベリパーゼ、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼ、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼ、アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ、アルギニンデミナーゼ、アルギナーゼ、メチオニナーゼ、システイナーゼ、ホモシステイナーゼ、フェニルアラニン水酸化酵素、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、尿酸オキシダーゼ、カタラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼまたはグルタチオンペルオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施形態では、生物活性成分が親水性、疎水性、または両親媒性、および関連する障害／疾患に基づいて適切に選択することができる。生物活性成分の例は、以下を挙げることができるが、これらに限定されない：エベロリムス、トラベクテジン（ｔｒａｂｅｃｔｅｄｉｎ）、アブラキサン、ＴＬＫ２８６、ＡＶ−２９９、ＤＮ−Ｉ０ｌ、パゾパニブ、ＧＳＫ６９０６９３、ＲＴＡ７４４、ＯＮ ０９１０．Ｎａ、ＡＺＤ６２４４（ＡＲＲＹ−１４２８８６）、ＡＭＮ−１０７、ＴＫＩ−２５８、ＧＳＫ４６１３６４、ＡＺＤ１１５２、エンザスタウリン、バンデタニブ、ＡＲＱ−１９７、ＭＫ−０４５７、ＭＬＮ８０５４、ＰＨＡ−７３９３５８、Ｒ−７６３、ＡＴ−９２６３、ＦＬＴ−３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、オーロラキナーゼ阻害剤、ＰＩＫ−１モジュレーター、Ｂｃｌ−２阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｃ−ＭＥＴ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、Ｃｄｋ阻害剤、ＥＧＦＲ ＴＫ阻害剤、ＩＧＦＲ−ＴＫ阻害剤，抗ＨＧＦ抗体、ＰＩキナーゼ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、チェックポイント１又は２阻害剤、焦点型接着キナーゼ阻害剤、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ｍｅｋ）阻害剤、ＶＥＧＦ ｔｒａｐ抗体、ペメトレキセド、エルロチニブ、ダサタニブ、ニロチニブ、デカタニブ、パニツムマブ、アムルビシン、オレゴボマブ、Ｌｅｐ−ｅｔｕ、ノラトレキセド、ａｚｄ２１７１、バタブリン、オファツムマブ、ザノリムマブ、エドテカリン、テトランドリン、ルビテカン、テスミリフェネ、オブリマーセン、チシリムマブ、イピリムマブ、ゴシポール、Ｂｉｏ １１１、１３１−Ｉ−ＴＭ−６０１、ＡＬＴ−１１０、ＢＩＯ １４０、ＣＣ ８４９０、チレンギタイド（cilengitide）、ギマテカン、ＩＬ １３−ＰＥ３８ＱＱＲ、ＩＮＯ １００１、ＩＰｄＲ１ ＫＲＸ−０４０２、ルカントン、ＬＹ ３１７６１５、ニューラディアブ、バイテスパン、Ｒｔａ ７４４、Ｓｄｘ １０２、タランパネル、アトラセンタン、Ｘｒ ３１１、ロミデプシン、ＡＤＳ−Ｉ００３８０、スニチニブ、５−フルオロウラシル、ボリノスタット、エトポシド、ゲムシタビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、５´−デオキシ−５−フルオロウリジン、ビンクリスチン、テモゾロミド、ＺＫ−３０４７０９、セリシクリブ、ＰＤ０３２５９０１ 、ＡＺＤ−６２４４、カペシタビン、Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−［４−［２−［２−アミノ−４，７−ジヒドロ−４−オキソ−１−Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］エチル］ベンゾイル］−二ナトリウム塩、ヘプタハイドレート、カンプトテシン、ＰＥＧ標識イリノテカン、タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、アナストラゾール、エクセメスタン、レトロゾール、ＤＥＳ（ジエチルスチルベストロール）、エストラジオール、エストロゲン、結合型エストロゲン、ベバシズマブ、ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＣＨＩＲ−２５８、３−［５−（メチルスルホニルピペラジネメチル）インドリル］キノロン、バタラニブ、ＡＧ−０１３７３６、ＡＶＥ−０００５、酢酸ゴセレリン、酢酸リュープロライド、トリプトレリンパモエート、メドロキシプロゲステロンアセテート、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メグストールアセテート、ラロキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、メグストールアセテート、ＣＰ−７２４７１４；ＴＡＫ−１６５、ＨＫＩ−２７２、エルロチニブ、ラパタニブ、カネルチニブ、ＡＢＸ−ＥＧＦ抗体、エルビタックス、ＥＫＢ−５６９、ＰＫＩ−１６６、ＧＷ−５７２０１６、イオナファルニブ、ＢＭＳ−２１４６６２、ティピファミブ；アミホスティン、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ヒドロキサム酸サブエロイルアナリド、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、ＦＫ−２２８、ＳＵ１１２４８、ソラフェニブ、ＫＲＮ９５１、アミノグルテチミド、アムサクレイン、アナグレライド、Ｌ−アスパラギナーゼ、バチルス・カルメットゲラン（ＢＣＧ）ワクチン、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、エピルビシン、フルダラビンなど、フルドロコルチゾン、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、リュープロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレスタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、トレチノイン、ビンデシン、１３−シス−レチノイン酸、フェニルアラニンマスタード、ウラシルマスタード、エストラムスチン、アルトレタミン、フロクスリジン、５−デオキシウリジン、シトシンアラビノシド、６−メカプトプリン、デオキシコホルマイシン、カルシトリオール、バルルビシン、ミトラマイシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、トポテカン、ラゾキシン、マリマスタット、ＣＯＬ−３、ネオバスタット、ＢＭＳ−２７５２９１、スクワラミン、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、インターロイキン１２、ＩＭ８６２、アンジオスタチン、ビタキシン、ドロロキシフェン、イドキシフェン、スピロノラクトン、フィナステリド シミチジン、トラスツズマブ、デニロイキンジフチトックス、ゲフィチニブ、ボルテジミブ、パクリタキセル、クレモフォフリーパクリタキセル、ドセタキセル、イクサベピロン、エピチロンＢ、ＢＭＳ−２４７５５０、ＢＭＳ−３１０７０５、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、ピペンドキシフェン、ＥＲＡ−９２３、アルゾキシフェン、フルベストラント、アコルビフェン、ラソフォキシフェン、イドキシフェン、ＴＳＥ−４２４、ＨＭＲ−３３３９、ＺＫ１８６６１９、トポテカン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、ＶＸ−７４５、ＰＤ １８４３５２、ラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）ラパマイシン、テンシロリムス、ＡＰ−２３５７３、ＲＡＤ００１、ＡＢＴ−５７８、ＢＣ−２１０、ＬＹ２９４００２、ＬＹ２９２２２３、ＬＹ２９２６９６、ＬＹ２９３６８４、ＬＹ２９３６４６、ワートマーミン、ＺＭ３３６３７２、Ｌ−７７９，４５０、ＰＥＧフィルグラスチム、ダルベポエチン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、ゾレンドロン酸、プレドニゾン、セツキシマブ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒストレリン、ペグ化インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ａ，ペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−２ｂ、アザシチジン、ＰＥＧ−Ｌ−アスパラギナーゼ、レナリドミド、ゲムツズマブ、ヒドロコルチゾン、インターロイキン−１１、デクスラゾキサン、アレムツズマブ、全トランス型レチノイン酸、ケトコナゾール、インターロイキン−２、メゲストロール、免疫グロブリン、窒素マスタード、メチルプレドニゾロン、イブリグモマブチウキセタン、アンドロゲン、デシタビン、ヘキサメチルメラミン、ベキサロテン、トシツモマブ、三酸化ヒ素、コルチゾン、エディトロネート、ミトタン、シクロスポリン、リポソームダウノルビシン、エドウィナアスパラギナーゼ、ストロンチウム８９、カソピタント、ネツピタント、ＮＫ−１受容体拮抗薬、パロノセトロン、アプレピタント、ジフェンヒドラミン、ヒドロキシジン、メトクロプラミド、ロラゼパム、アルプラゾラム、ハロペリドール、ドロペリドール、ドロナビノール、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、プロクロルペラジン、グラニセトロン、オンダンセトロン、ドラセトロン、トロピセトロン、ペグフィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファ、クルクミン、ＡＬＺ００１、ＪＭ１７およびダルベポエチンアルファ。

生物活性成分はそれらがＭＳＮおよびｅｘＭＳＮにまたはそれらの上に適切に負荷され得るように、種々の形態であり得る。形態の例としては水性形態、分散形態、溶液または分散液中のイオン化形態、溶液または分散液中の水和物または溶媒和形態などが挙げられるが、形成に限定されない。

生理活性成分を負荷したＭＳＮとｅｘＭＳＮ
ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは、細孔内に生物活性成分を負荷し得る。確かに、本発明は、少なくとも１つの生物活性成分を負荷するＭＳＮまたはｅｘＭＳＮを提供することができる。特に、本発明は、少なくとも２つの生物活性成分を負荷するＭＳＮまたはｅｘＭＳＮを提供する。少なくとも２つの生物活性成分は、それらの疎水性が類似していても異なっていてもよい。一実施形態では、ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮが親水性生物活性成分および疎水性生物活性成分を負荷する。一実施形態では、ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮが少なくとも１つが親水性であり、残りが疎水性で少なくとも２つの生物活性成分を負荷する。一実施形態では、ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮが少なくとも２つの生物活性成分を負荷し、少なくとも１つが疎水性であり、残りが親水性である。一実施形態では、ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮが少なくとも２つの生物活性成分を負荷し、それらの全ては親水性である。一実施形態では、ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮが少なくとも２つの生物活性成分を負荷し、それらの全ては疎水性である。１つの実施形態において、２つ以上の生物活性成分は、相乗的な効果を提供する。生物活性成分の比率は、意図される目的の要件を満たすように調整することができる。

細孔修飾されたＭＳＮまたはｅｘＭＳＮおよび生物活性成分を負荷したナノ粒子の製造方法
本願は、また、細孔上に内面有機修飾を有するＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの製造方法を提供する。一実施態様では、本方法は、以下の工程を含む：
（ａ）界面活性剤を含有するアルカリ性溶液を提供してミセルを形成する工程、
（ｂ）第１のシリカ源と、末端ヒドロカルビル部分を提供する第２のシリカ源とを溶液に添加し、第１のシリカ源と第２のシリカ源とのモル比は５：１以上である工程、
（ｃ）溶液に水熱処理を実施する工程および、
（ｄ）溶液からＭＳＮを抽出し、場合によっては精製する工程。

さらなる実施態様において、前記方法が以下の工程の少なくとも１つを更に含む：
（ｅ）工程（ａ）の後かつ工程（ｂ）の前に、細孔拡張のために、前記溶液に油相を導入する工程、
（ｆ）工程（ｂ）の後にさらなるシリカ源を添加する工程および、
（ｇ）前記ＭＳＮの外面の表面修飾を行う工程であって、前記表面修飾は工程（ｂ）の後に、または工程（ｆ）が行われる場合には工程（ｆ）の後に行われる工程。

末端ヒドロカルビル部分を提供する第１のシリカ源と第２のシリカ源との比は、このように調製されたＭＳＮの生物活性成分の負荷容量および／または効率が特に５：１以上改善され得るように調節され得る。一実施形態では、シリカ源と末端芳香族部分提供試薬とのモル比が２９：１〜４：１、好ましくは２６：１〜５：１、より好ましくは２１：１〜１１：１の範囲である。さらに、前記比率は、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮのＤＬＳサイズに影響を及ぼす重要な要因であり得る。理論に束縛されるものではないが、出願人は第２のシリカ源に対する第１のシリカ源の比率が低すぎる場合、ＤＬＳの大きさが１５０ｎｍを超えて（劇的に）拡大するように、外面が有機修飾を有することになり、これが、生きた対象での生物活性成分の送達への適用を妨げると主張する。

内面修飾のための修飾剤は、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの細孔の表面上に末端ヒドロカルビル部分を提供する。修飾剤の例は、トリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）、トリエトキシフェニルシラン、ジフェニルジエトキシシラン、１−ナフチルトリメトキシシラン、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシシリルプロポキシ）ジフェニルケトン、Ｏ−４−メチルクマリニル−Ｎ−［３（トリエトキシシリル）プロピル］カルバメート、７−トリエトキシシリルプロポキシ−５−ヒドロキシフラボン、３−カルバゾリルプロピルトリエトキシシラン、ビス（２−ジフェニルホスフィノエチル）メチルシリルエチルトリエトキシシラン、２−（ジフェニルホスフィノ）エチルトリエトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ｎ−ブチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、ヘプチルトリエトキシシラン、オクチルトリエトキシシラン、ノニルトリエトキシシラン、デシルトリエトキシシラン、ウンデシルトリエトキシシラン、ドデシルトリエトキシシラン、シクロプロピルトリエトキシシラン、シクロブチルトリエトキシシラン、シクロペンチルトリエトキシシラン、シクロヘキシルトリエトキシシラン、シクロヘプチルトリエトキシシラン、シクロオクチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、ｎ−ブチルトリメトキシシラン、ペンチルトリメトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘプチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ノニルトリメトキシシラン、デシルトリメトキシシラン、ウンデシルトリメトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、シクロプロピルトリメトキシシラン、シクロブチルトリメトキシシラン、シクロペンチルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリメトキシシラン、シクロヘプチルトリメトキシシランおよびシクロオクチルトリメトキシシラン等。

ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮの外側表面の修飾は、新た(de novo)に行うことができるか、または事後(post)修飾であり得る。修飾の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾、ポリエチレニミン（ＰＥＩ）修飾、３−（トリヒドロキシシリル）プロピルメチルホスホネート（ＴＨＰＭＰ）修飾、Ｎ−（トリメトキシシリルプロピル）エチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡＳ）Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン修飾、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＴＡ−トリメトキシシラン）修飾、（３−メルカトプロピル）トリメトキシシラン（ＭＰＴＭＳ）修飾、双性イオン性シラン修飾などの親水性修飾；バイオマーカーによる修飾、例えば抗体修飾、リンカー修飾、腫瘍標的化リガンド修飾などのような特異性修飾；または、シェルの表面特性の修飾、例えば、電荷の種類や分布の修飾など非特異的活性の修飾を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

また、本対象は、生物活性成分を負荷したＭＳＮおよびｅｘＭＳＮを製造する方法を提供する。一実施形態では、方法が以下の工程を含む：
（ａ）上記の方法のいずれかで調製されたＭＳＮまたはｅｘＭＳＮを提供すること；
（ｂ）ＭＳＮまたはｅｘＭＳＮを第１の生物活性成分と接触させることにより第１の生物活性成分を負荷すること；
（ｃ）第１の生物活性成分を負荷したＭＳＮまたはｅｘＭＳＮと接触させることによって第２の生物活性成分を負荷すること；
（ｄ）任意選択で、工程（ｃ）を繰り返し、生物活性成分を負荷したＭＳＮまたはｅｘＭＳＮをさらなる生物活性成分と独立して連続的に接触させることによって、さらなる生物活性成分を負荷すること。

一実施形態では、第１および第２の生物活性成分が類似または同じ疎水性である。一実施形態では、第１および第２の生物活性成分が疎水性に関し異なる。特定の実施形態では、第１の生物活性成分は親水性であり、第２の生物活性成分は疎水性である。別の特定の実施形態では、第１の生物活性成分は疎水性であり、第２の生物活性成分は親水性である。一実施形態では、さらなる生物活性成分が独立して親水性または疎水性である。

生物活性成分を負荷したＭＳＮとｅｘＭＳＮの用途
メソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）は大きな細孔容積、化学的／熱安定性、高い負荷容量、調節可能な表面特性、および優れた生体適合性などの独特の物理的／化学的性質のために、薬物送達システムとして大きな可能性を有すると考えられてきた。特に、本対象出願のＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは特定の用途に使用できるように、血液脳関門（ＢＢＢ）および／または血液眼関門を透過する能力を有する可能性がある。

以下の実施例は、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者にとって本発明をより理解しやすくするために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
材料、方法および試験モデル

透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、シリカナノ粒子の外観を直接調べ、検証した。ＴＥＭ像は、７５〜１００ｋＶの加速電圧で作動する日立Ｈ‐７１００透過電子顕微鏡で撮影した。エタノールに分散した試料を炭素被覆銅グリッド上に滴下し、ＴＥＭ観察のために空気乾燥した。

動的光散乱（ＤＬＳ）
異なる溶液環境におけるシリカナノ粒子のサイズ測定を、Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)上で動的光散乱（ＤＬＳ）を用いて行った。種々の溶液中で形成された（溶媒和された）粒子径を分析した：Ｈ_２Ｏ、１０％ ＦＢＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）および５％グルコースを室温で用いた。

元素分析
シリカナノ粒子中の炭素、窒素、酸素および水素の質量パーセンテージを、元素分析器(elementar Vario EL cube type for NCSH, German)によって測定した。
ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）
サンプル液の粒子濃度（数／ｍｇ）は、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００によって測定する。

ナノ粒子中の薬物の定量
５μＬの薬物負荷ナノ粒子懸濁液（ストックから、２００ｍｇ／ｍＬ）に、４５μＬのＨ_２Ｏを１０倍希釈のために添加し、次いで、１９．６μＬの希釈液（２０ｍｇ／ｍＬ）を、３２．４μＬのＤＭＳＯおよび７８μＬのＡＣＮ（０．５％ ＨＦを含む）と混合するために採取した。４℃で１０分間振盪した後、ＨＦ残基を枯渇させるために、さらなる裸のシリカナノ粒子を溶液中に添加した。次に、溶液を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１２０μＬの上清をＨＰＬＣ分析のために採取した。

ナノ粒子の生体内分布とＥＰＲ効果検出するためのｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム
ナノ粒子のｉｎ ｖｉｖｏ生体内分布画像は、ＩＶＩＳイメージングシステム（Lumina）から得た。Ｂａｌｂ／ｃマウス（４週齢）をＢｉｏＬＡＳＣＯから購入した。異所性移植用の４Ｔ１（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２５３９ＴＭ）腫瘍細胞を皮下注射することにより、腫瘍担持マウスを樹立した。４Ｔ１細胞を２〜３週間増殖させた後、ＰＢＳ中の試料を静脈内注射した。注射から２４時間後、主要な器官（心臓、肺、脾臓、肝臓および腎臓）ならびに腫瘍、尿および血液を注意深く収集し、収集した試料の蛍光画像および強度をＩＶＩＳイメージングシステムによって取得した。

脳血管内のナノ粒子を検出するための２光子蛍光顕微鏡法
健常ＩＣＲマウス（２７〜３０ｇ）に２００ｍｇ／ｋｇのナノ粒子を静脈内注射し、マウスの耳たぶの動的イメージングを、調整可能な励起波長（８００〜１０００ｎｍ）を用いた多光子顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶＭＰＥ−ＲＳ）によって行った。ナノ粒子がもはや脳血管中を循環しなくなった後、マウスを麻酔し、次いで頭蓋骨除去（開頭術）手術を行った。本研究では、短期観測のために脳表にガラスカバーを置く代わりに正常生理食塩水を使用した。血液血管系を画像化するために、０．６ｍＬの２．５％（ｗ／Ｖ）フルオレセインイソチオシアネートデキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン、Ｍｗ：７０ｋＤａ）を、マウスに静脈内注射した無菌生理食塩水に溶解した。マウス大脳におけるナノ粒子の深さプロフィールイメージングを、脳の表面下０〜３００μｍ（軸方向間隔は１μｍ）で収集した。

In vitro抗腫瘍相乗効果試験による薬物組合せ投与量比率の決定
ＪＭ１７（クルクミン類似体）およびドキソルビシン（Ｄｏｘ）の相乗的細胞毒性効果を、アラマーブルーアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって評価した。増殖アッセイのために、ウェルあたり５×１０^４のＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞（Ｄｏｘ耐性乳がん細胞）を２４ウェルプレートに播種した。種々の濃度のＪＭ１７、種々の濃度のＤｏｘ、および種々の組合せ投与量比率のＪＭ１７＋Ｄｏｘを細胞と共にインキュベートした。４８時間インキュベートした後、細胞を培養培地で２回洗浄し、続いてアラマーブルー試薬と共に３７℃で２時間インキュベートした。アラマーブルーアッセイからの蛍光シグナルは生きた細胞数に比例し、シグナル（Ｅｘ／Ｅｍ＝５６０／５９０）はマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、モデル６８）を用いて測定した。Ｚｈｅｎｇ‐Ｊｕｎ Ｊｉｎ法（Ｑ法）またはＣｈｏｕ‐Ｔａｌａｌａｙの組合せ指数（ＣＩ）定理を用いて薬物組合せの相乗作用を解析した。

ＭＣＦ７／ＡＤＲがん動物モデル
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５〜６週齢）をＮａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒから購入した。実験期間中、マウスに飲水によるエストロゲンの持続的経口投与を行った。２５μＬのＰＢＳおよび２５μＬのマトリゲルマトリックス中の５×１０^６のＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの左側腹部に皮下異種移植した。腫瘍増殖を約１ヶ月（大きさ〜５０ｍｍ^３）続けた後、０日目、４日目および８日目に全ての群に静脈内注射した。マウスの体重と腫瘍体積を週２回測定した。

合成例１
細孔拡大ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ（ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ−ＴＡ）合成
細孔拡大メソポーラスシリカナノ粒子（ｅｘＭＳＮ）は、明確な構造、大きな細孔および高密度の表面シラノール基を有し、広範囲の有機官能基で修飾することができる。最初に、０．３８６ｇのＣＴＡＢを、１６０ｇの水酸化アンモニウム溶液（０．２２Ｍ）中に、所望の温度（５０℃）で、密封ビーカー中に溶解した。１０分後、１６．２ｍＬの希釈デカンアルコール溶液（７．４％ ｖ／ｖ）を添加し、混合物を少なくとも８時間連続的に撹拌した（細孔サイズを拡大するために油相としてデカンを添加した）。その後、密封した蓋を取り外し、２．６４ｍＬのエタノール中の６６０μＬのＴＥＯＳを混合物にさらに１時間撹拌しながら導入した。次に、３ｍＬのエタノール中の５５０μＬ（２−［メトキシ（ポリエチレンオキシ）プロピル］トリメトキシシラン）（ＰＥＧ）および３００μＬのＮ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＡ）を反応系に導入した。混合物を３０分間撹拌した後、溶液を一晩撹拌することなく所望の温度（５０℃）でエージングした。次に、０．４５μｍ、０．２２μｍのフィルターで溶液をろ過し、薄膜副産物を除去した後、ろ液を密閉し、８０℃のオーブンに２４時間入れ、水熱処理を行った。合成されたままの試料を洗浄し、クロスフロー濾過によって収集した。ナノ粒子の細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの試料を、８４８μＬ（１回目）および５０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する５０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃で１時間インキュベートした。生成物を洗浄し、クロスフロー濾過によって回収し、次いで９０％エタノール中に保存した。

ＮＨ２＋ＣＯＯＨ−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ合成
最初に、０．３８６ｇのＣＴＡＢを、１６０ｇの水酸化アンモニウム溶液（０．２２Ｍ）中に、所望の温度（５０℃）で、密封ビーカー中に溶解した。１０分後、１６．２ｍＬの希釈デカンアルコール溶液（７．４％ ｖ／ｖ）を添加し、混合物を少なくとも８時間連続的に撹拌した。その後、密閉された蓋を取り外し、３．３５ｍＬエタノール中のＴＥＯＳの７００μＬ、３‐（２‐アミノエチルアミノ）プロピルトリメトキシシラン（ＡＡＳ）の５０μＬおよびＮ‐（トリメトキシシリル‐プロピル）エチレンジアミン三酢酸三ナトリウム塩（ＥＤＴＡＳ）の５μＬを混合物中に１時間撹はん導入した。次に、３ｍＬのエタノール中の５５０μＬのＰＥＧを反応系に導入した。混合物を３０分間撹拌した後、溶液を一晩撹拌することなく所望の温度（５０℃）でエージングした。次に、０．４５μｍ、０．２２μｍのフィルターで溶液をろ過し、薄膜副産物を除去した後、ろ液を密閉し、８０℃のオーブンに２４時間入れ、水熱処理を行った。合成されたままの試料を洗浄し、クロスフロー濾過によって収集した。ナノ粒子の細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの試料を、８４８μＬ（１回目）および５０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する５０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃で１時間インキュベートした。生成物を洗浄し、クロスフロー濾過によって回収し、次いで９０％エタノール中に保存した。

（異なるＴＥＯＳ／ＢｉｓＴＥＳＢ比を有する）ＢｉｓＴＥＳＢ−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ合成
最初に、０．３８６ｇのＣＴＡＢを、１６０ｇの水酸化アンモニウム溶液（０．２２Ｍ）中に、所望の温度（５０℃）で、密封ビーカー中に溶解した。１０分後、１６．２ｍＬの希釈デカンアルコール溶液（７．４％ ｖ／ｖ）を添加し、混合物を少なくとも８時間連続的に撹拌した。その後、密閉した蓋を外し、２．８ｍＬのエタノール中の５８３．３μＬのＴＥＯＳ／２００μＬの１，４−ビス（トリエトキシシリル）ベンゼン（ＢｉｓＴＥＳＢ）（４：１）、６３６．４μＬのＴＥＯＳ／１０９μＬのＢｉｓＴＥＳＢ（９：１）、または６５６．３μＬのＴＥＯＳ／７５μＬのＢｉｓＴＥＳＢ（１４：１）を混合物に１時間撹拌しながら導入した。次に、３ｍＬのエタノール中の５５０μＬのＰＥＧおよび３００μＬのＴＡを反応系に導入した。混合物を３０分間撹拌した後、溶液を一晩撹拌することなく所望の温度（５０℃）でエージングした。次に、０．４５μｍ、０．２２μｍのフィルターで溶液をろ過し、薄膜副産物を除去した後、ろ液を密閉し、８０℃のオーブンに２４時間入れ、水熱処理を行った。合成したままの試料を洗浄し、クロスフローろ過により回収し、ナノ粒子の細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの試料を、８４８μＬ（１回目）および５０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する５０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃で１時間インキュベートした。生成物を洗浄し、クロスフロー濾過によって回収し、次いで９０％エタノール中に保存した。

（異なるＴＥＯＳ／フェニルシラン比を有する）フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ合成
ｅｘＭＳＮ構造は、無機テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）と有機トリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）の共縮合によって形成され、これはｅｘＭＳＮ細孔への疎水性を与え、疎水性薬物負荷効率を改善することができる。拡大された細孔を有する単分散フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡは、高度に希釈された界面活性剤を含むアンモニア溶液にデカンをさらに導入することによって調製された。最初に、０．３８６ｇのＣＴＡＢを、１６０ｇの水酸化アンモニウム溶液（０．２２Ｍまたは０．３５Ｍ）中に、所望の温度（５０℃）で、密封ビーカー中に溶解した。１０分後、１６．２ｍＬの希釈デカンアルコール溶液（７．４％ ｖ／ｖ）を添加し、混合物を少なくとも８時間連続的に撹拌した。その後、密閉したふたを外し、２．５ｍＬの希釈ＡＰＴＭＳアルコール溶液（１０．７ｍＭ）と３５０μＬ〜７００μＬのＴＥＯＳを加え、１．９ｍＬ〜３．３ｍＬのエタノールに混合した３７μＬ、４７μＬ、５６μＬ、１１２μＬのＴＭＰＳ（ＴＥＯＳ／ＴＭＰＳのモル比＝１６：１、１３：１、１１：１、および５：１、ＴＥＯＳ：ＴＭＰＳ比を変えて、様々な用途または負荷された薬物に対する細孔表面の疎水性を調節することができる）を溶液に激しく攪拌しながら加えた。３〜６０分後、０．５６ｍＬ〜１．４ｍＬのＥｔＯＨ中の１４０μＬ〜３５０μＬのエタノール性ＴＥＯＳをいくつかの条件（ＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ＝１６：１、１３：１および１１：１）で添加し、反応の１〜２時間後、２ｍＬ〜３ｍＬのＥｔＯＨ中に混合した５５０μＬ〜１０００μＬのＰＥＧおよび１５５．８μＬ〜４５０μＬのＴＡを反応に導入した。混合物を６０分間撹拌した後、混合物を一晩撹拌することなく、所望の温度（５０℃）でエージングした。次に、０．４５μｍ、０．２２μｍのフィルターで溶液をろ過し、薄膜副産物を除去した後、ろ液を密閉し、８０℃のオーブンに２４時間入れ、水熱処理を行った。合成されたままの試料を洗浄し、クロスフロー濾過によって収集した。フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡの細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの試料を、８４８μＬ（１回目）および５０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する５０ｍＬの酸性エタノール中で、それぞれ６０℃で１時間インキュベートした。生成物を洗浄し、クロスフロー濾過によって回収し、次いで９０％エタノール中に保存した。異なる溶液環境において動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された種々の内面修飾を有するフェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡの粒子サイズを表１に示す。ＤＬＳの結果は全てのＭＳＮがＨ_２Ｏ中で約４０ｎｍ〜７０ｎｍの範囲内で良好に分散したが、高フェニル導入粒子（ＴＥＯＳ：ＴＭＰＳ＝５：１）の分散性はＰＢＳ緩衝液中で影響を受けたことを示した。これは、部分フェニル基が高フェニル導入粒子の表面上で修飾されて、粒子の分散性に影響を及ぼし得ることを意味する。

合成例２
（異なるＴＥＯＳ／フェニルシラン比を有する）フェニル−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ合成
フェニル‐ＭＳＮ‐ＰＥＧ＋ＴＡは、高度に希釈した低界面活性剤条件下でアンモニア塩基触媒法を用いて調製した。フェニル−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ中のフェニル基の量は種々のＴＥＯＳおよびＴＭＰＳ量（ＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ＝２９：１、２６：１、２１：１、２０：１、１５：１および１１：１のモル比）を反応に導入することにより調節し、典型的には、０．２９ｇのＣＴＡＢを１５０ｍＬの水酸化アンモニウム溶液（０．１７１Ｍまたは０．２０５Ｍ）中に、所望の温度（５０℃）で溶解した。１５分間撹拌した後、密封した膜を除去し、次いで、１ｍＬのＥｔＯＨ中に混合した１６μＬ、２０μＬ、２４μＬ、３２μＬまたは４０μＬのＴＭＰＳを含む２５０μＬのエタノール性ＴＥＯＳを、激しく撹拌しながら溶液に添加した。１０〜３０分後、１ｍＬまたは１．２ｍＬのＥｔＯＨ中の２５０μＬまたは３００μＬのエタノール性ＴＥＯＳを添加した。反応１〜２．５時間後、２００μＬのＥｔＯＨに溶解した５０μＬのエタノール性ＴＥＯＳを１０分間加え、２ｍＬ〜２．６ｍＬのＥｔＯＨに混合した５５０μＬ〜８２５μＬのＰＥＧと３００μＬ〜４５０μＬのＴＡを導入した。混合物を１時間撹拌した後、混合物を、少なくとも１２時間撹拌することなく、所望の温度（５０℃）でエージングした。その後、溶液を密封し、７０℃のオーブンに２４時間水熱処理した。合成されたままの試料を洗浄し、クロスフロー濾過によって収集した。フェニル‐ＭＳＮ‐ＰＥＧ＋ＴＡの細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの試料を、６７８μＬ（１回目）および４０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する４０ｍＬの酸性エタノール中に、それぞれ６０℃で１時間抽出して回収した。生成物を洗浄し、クロスフロー濾過によって回収し、次いで９０％エタノール中に保存した。異なる溶液環境において動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された種々の内面修飾を有するフェニル−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡの粒子サイズを表２に示す。ＤＬＳの結果はすべてのＭＳＮがＨ_２Ｏ中で約３０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内で良好に分散したが、高フェニル導入粒子（ＴＥＯＳ：ＴＭＰＳ＝１１：１および１５：１）の分散性はＰＢＳ緩衝液中で影響を受けたことを示した。これは、部分フェニル基が高フェニル導入粒子の表面上で修飾されて、粒子の分散性に影響を及ぼし得ることを意味する。

合成例３
（異なるＴＥＯＳ／Ｃ８−シラン比を有する）Ｃ８−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ合成
Ｃ８‐ＭＳＮ‐ＰＥＧ＋ＴＡは、高希釈および低界面活性剤レベル溶液を用いたアンモニア塩基触媒法を用いて調製した。Ｃ８−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ中のオクチル基含有量は全ＴＥＯＳおよびＣ８−反応量（ＴＥＯＳ／Ｃ８−反応のモル比は２０：１、１５：１、１０：１、および５：１から変化する）によって調節した。典型的には０．２９ｇのＣＴＡＢを、密封ビーカー中で所望の温度（５０℃）で１５０ｍｌの水酸化アンモニウム溶液（０．２０５Ｍ）に溶解した。１５分間撹拌した後、密封した膜を除去し、次いで、１ｍＬのＥｔＯＨ中に混合した３９．２μＬ、５２．２μＬ、７８．４μＬまたは１５６．８μＬのＣ８−シランを含む２５０μＬのエタノール性ＴＥＯＳを、激しく撹拌しながら溶液に添加した。１．２ｍＬのＥｔＯＨ中の３００μＬのエタノール性ＴＥＯＳの別の添加を、１時間後に導入した。反応の３時間後、２．６ｍＬのエタノール中に混合した８２５μＬのＰＥＧおよび４５０μＬのＴＡを、さらなる反応のために導入した。混合物を１時間撹拌した後、混合物を、少なくとも１２時間、撹拌することなく、所望の温度（５０℃）でエージングした。次に、得られた溶液を密閉し、７０℃のオーブンに２４時間水熱処理した。最後に、合成されたままの試料を洗浄し、生成物をクロスフローシステムによって収集した。Ｃ８−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡの細孔中の界面活性剤を除去するために、合成したままの生成物を、６７８μＬ（１回目）および４０μＬ（２回目）の塩酸（３７％）を含有する４０ｍＬの酸性エタノールに、６０℃で１時間の抽出の２回導入した。生成物を洗浄し、クロスフローシステムによって回収して最終産物を得、最終産物を最終的に９０％エタノール中に貯蔵した。種々の環境において動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された種々の内面修飾を有するＣ８−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡの粒子サイズを表３に列挙する。すべてのＭＳＮは良好に分散し、Ｈ_２Ｏ中で約２５ｎｍ〜４０ｎｍの大きさを有した；しかし、ＰＢＳ緩衝液中の高Ｃ８導入粒子（ＴＥＯＳ：Ｃ８‐シラン＝１０：１および５：１）の分散性に影響を与えた。結果はより多い量のＣ８‐シランを使用すると、アルキル基の一部がＣ８導入粒子の外面に付着し、それによって粒子の分散性が低下したことを示す。

実施例４
細孔修飾ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮにおけるドキソルビシンおよびＪＭ１７共負荷
５０ｍｇのｅｘＭＳＮを最初にＮａＨＣＯ_３溶液（ｐＨ９．９５）に３０分間浸漬し、次いで溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ １５によって濃縮して濃縮物を得た。その後、濃縮物を脱イオン水で希釈し、次いで希釈液を再度濃縮した。このように濃縮した溶液にドキソルビシン（Ｄｏｘ）溶液を加え、混合物を４℃で３０分間振盪した。その後、混合溶液（ＤｏｘおよびｅｘＭＳＮを含む）をＪＭ１７溶液（１００％ ＤＭＳＯ中）中にゆっくりと滴下し、４℃で２時間連続振盪した。次に、ＤＭＳＯ濃度をＶｉｖａｓｐｉｎ膜の最大ＤＭＳＯ耐性のレベルまで低下させるために、激しく振盪しながら混合物にＤＩ水を添加した。濃縮および洗浄プロセスの前に、溶液を低速度（３５００ｇ）で１０分間遠心分離し、部分的なＪＭ１７沈殿物を分離する（必要であれば）。最後に、生成物をＤＩ水中に貯蔵する。ｅｘＭＳＮ中のＪＭ１７およびＤｏｘ負荷量は、薬物負荷プロセス中に種々の濃度のＪＭ１７およびＤｏｘ溶液を使用することによって調節することができる。

すべての種類のｅｘＭＳＮに、上記の方法によりＪＭ１７およびＤｏｘを負荷した。ＪＭ１７およびＤｏｘはｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡおよびＮＨ２＋ＣＯＯＨ−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧに同時に負荷することができず、これはＭＳＮの細孔サイズを拡大するか、または細孔表面を修飾する方法（正荷電を有する、負荷電を有する、Ｈ結合ドナーを有する、またはＨ結合アクセプターを有する）だけではＭＳＮが疎水性薬物（ＪＭ１７）および親水性薬物（Ｄｏｘ）を同時に吸着させることができないことを意味することが注目された。ＢｉｓＴＥＳＢ−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子は構造中に疎水性フェニル基を有するように構築されたが、それらは依然として両方の薬物を粒子中にカプセル化することができない。対照的に、フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡはＪＭ１７およびＤｏｘを同時にカプセル化する能力を有し、これは、フェニル基が細孔の表面上で修飾され、それによって薬物負荷能力を増強したことを意味する。フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ中の、ＴＭＰＳから誘導される疎水性フェニル基は疎水性薬物負荷効率を改善するのに重要な役割を果たし、したがって、フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ合成のＴＭＰＳ／ＴＥＯＳ比は、溶液中の材料分散性に影響を及ぼすことなく、より高い薬物負荷能力を達成するために最適化される。したがって、５：１、１１：１、１３：１および１６：１のＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比をｅｘＭＳＮ合成のために選択して、効果を評価する。結果は、１１：１のＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比によって合成されたナノ粒子が最良の薬物負荷能力（ＤＯＸ：１〜５％；ＪＭ１７：１〜５％）を示し、依然としてＰＢＳ中で優れた分散性（ＤＬＳサイズ／ＰＤＩ：４４．４ｎｍ／０．０９５）を維持することを実証する。他方、ナノ粒子はより低いＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比、例えば５：１で合成される場合、薬物負荷プロセスの間に激しく凝集し得、そして凝集は粒子の表面に結合したフェニル基によって引き起こされ得、これは疎水性薬物が細孔の空間内ではなく、粒子の表面にも結合されることを可能にする。凝集したナノ粒子（Ｈ_２Ｏ中でさえ＞２００ｎｍの大きさ）は低い薬物負荷率を引き起こし、血行不良および血管閉塞の危険性のために、それらをインビボ実験に利用することができなくなる。さらに、低いＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比（１６：１）を有するナノ粒子は溶液中で良好な懸濁液を示すが、それらはＪＭ１７を効率的に吸着しない；負荷容量が使用するには低すぎる。

フェニル−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡはまた、材料の分散性に影響を及ぼすことなく、より高い薬物負荷能力で薬物をカプセル化することができる。６つのＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比、２９：１、２６：１、２１：１、２０：１、１５：１および１１：１が、細孔修飾ＭＳＮ合成のために選択される。２９：１〜２０：１の範囲のＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比で合成されたナノ粒子は高い薬物負荷能力（＞３％負荷質量％）を示し、ＰＢＳ中で優れた分散性（ＤＬＳサイズ＜６０ｎｍ）を依然として維持することができる。一方、１５：１または１１：１のＴＥＯＳ／ＴＭＰＳ比で合成された場合、ナノ粒子は負荷工程後に激しく凝集し、凝集したナノ粒子のＤＬＳサイズはＨ_２Ｏ中で約２００ｎｍを超える。

フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ、フェニル−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ、およびＣ８−ＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡはまた、イクサベピロン、パクリタキセル、イリノテカンなどの様々な疎水性薬物をカプセル化することができる。試験結果によれば、細孔の比表面積修飾および官能基の比率の活性調節によって、ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮは、同じ粒子中に異なる物理化学的特性を有する複数の薬物をカプセル化する能力を有することができる。

実施例５
フェニル−ｅｘＭＳＮのフェニル基濃度
フェニル‐ＭＳＮ‐ＰＥＧ＋ＴＡおよびフェニル‐ｅｘＭＳＮ‐ＰＥＧ＋ＴＡ合成過程では、異なるモル比のＴＥＯＳおよびＴＭＰＳを、細孔の表面修飾を調節するための反応に使用した。ＭＳＮおよびｅｘＭＳＮナノ粒子の内面上のフェニル官能基を定量するために、フェニル−ＭＳＮ粒子の元素組成を元素分析器によって測定した。粒子１ｍｇ当たりのフェニル基の数は、フェニル−ＭＳＮおよびフェニル−ｅｘＭＳＮ粒子の炭素の質量パーセントに由来する。元素分析から得られたフェニル（２９：１）、（２１：１）および（１１：１）‐ＭＳＮのフェニル基の数はそれぞれ約６．６８×１０^１７、７．９×１０^１７、１．０３×１０^１８（分子／ｍｇ）であり、元素分析から得られたフェニル（１６：１）、（１１：１）および（５：１）ｅｘＭＳＮのフェニル基の数は、それぞれ約８．０８×１０^１７、１．０４ｃ１０^１８、１．６２×１０^１８（分子／ｍｇ）である。サンプル液の粒子濃度（数／ｍｇ）は、ナノ粒子追跡分析によって測定した。フェニル（２９：１），（２１：１），（１１：１）−ＭＳＮの濃度はそれぞれ２．２９ｘ１０^１２，２．２７×１０^１２，３．０２×１０^１２（粒子／ｍｇ）であり、また、フェニル（１６：１），（１１：１），（５：１）−ｅｘＭＳＮの濃度はそれぞれ２．９８×１０^１２，３．９７×１０^１２，４．４４×１０^１２（粒子／ｍｇ）である。結果から、フェニル（２９：１）、（２１：１）、（１１：１）‐ＭＳＮの各ナノ粒子上のフェニル基の量はそれぞれ、２．９２×１０^５、２．８５×１０^５、３．４１×１０^５（フェニルの数／粒子）であり、フェニル（１６：１）、（１１：１）、（５：１）‐ｅｘＭＳＮの各ナノ粒子上のフェニル基の量は、それぞれ、２．７１×１０^５、２．６１×１０^５、３．６４×１０^５（フェニルの数／粒子）である。

実施例６
ｅｘＭＳＮによるＪＭ１７とＤｏｘ共送達のＩｎ−ｖｉｔｒｏ相乗効果
薬物組合せ投与量比の決定方法によると、ＪＭ１７：Ｄｏｘの比範囲（１：０．４〜１：０．６）はＤｏｘ耐性がん細胞（ＭＣＦ‐７／ＡＤＲ）の抑制に対してより高い相乗効果を示した。したがって、ｅｘＭＳＮによってカプセル化された特定のＪＭ１７：Ｄｏｘ用量比を合成し、粒子の相乗的細胞毒性効果を評価した。増殖アッセイのために、ウェルあたり５×１０^４のＭＣＦ７／ＡＤＲ細胞を２４ウェルプレートに播種した。種々の濃度の（１）フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ（ＮＴＴ２＿１３１）、（２）ＤＯＸ＠フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ（Ｄｏｘ＠ＮＴＴ２＿１３１）、（３）ＪＭ１７＠フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ（ＪＭ１７＠ＮＴＴ２＿１３１）および（４）ＪＭ１７＋ＤＯＸ＠フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ（ＪＭ１７／Ｄｏｘ＠ＮＴＴ２＿１３１）を含む４つの群を細胞と共にインキュベートした。ＪＭ１７／Ｄｏｘ＠ＮＴＴ２＿１３１処置群は、ＭＣＦ−７／ＡＤＲがん細胞の効率的な阻害を示した；ナノ粒子によるＪＭ１７およびＤｏｘ共送達がインビトロで良好な相乗効果を示し得ることが明らかにされた。結果を図１に示す。

実施例７
Ｉｎ ｖｉｖｏ抗ＭＣＦ７／ＡＤＲ腫瘍効果
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを６群（ｎ＝５〜６）に無作為に割りあてた：（１）対照、（２）ＤＯＸ、（３）ＪＭ１７＋ＤＯＸ（溶液形態）、（４）ＪＭ１７＋ＤＯＸ＠ＮＴＴ２＿１３１、（５）ＪＭ１７＋ＤＯＸ＠ＮＴＴ２＿１３１（半用量）、および（６）ＮＴＴ２＿１３１（粒子のみ）。（１）〜（４）群はＤｏｘとＪＭ１７の用量が同じであった。２５μＬのＰＢＳおよび２５μＬのマトリゲルマトリックス中の５×１０^６のＭＣＦ−７／ＡＤＲ細胞（Ｄｏｘ耐性乳がん細胞）を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの左側腹部に皮下異種移植した。腫瘍増殖を約１ヵ月間（大きさ〜５０ｍｍ３）継続した後、０、４および８日目に全群に静脈内注射し、１２、１６および２０日目に半用量群にさらに３回注射した。マウスの体重と腫瘍体積を週２回測定した。結果によると、ＪＭ１７とＤｏｘ共送達は抗腫瘍効果において相乗効果を示した。ＪＭ１７／Ｄｏｘ＠ＮＴＴ２＿１３１（半用量）群は、ＪＭ１７＋Ｄｏｘ（溶液形態）群と同等の抗腫瘍効果および毒性が低く；さらにＪＭ１７／Ｄｏｘ＠ＮＴＴ２＿１３１群（通常用量）が最も高い抗腫瘍効果を示した（図２）。この結果は、ナノ粒子が遊離薬物（溶液形態）の組合せと比較して、多剤同時送達のためのいくつかの利点を提供することができることを実証した：（１）ナノ粒子が疎水性および親水性薬物を同時に送達し、単一のナノ粒子において最適化された相乗効果薬物比率を維持することができる、（２）ナノ粒子が循環時間を延長し、薬物の腫瘍ターゲティング能力を増強することができる、および（３）多剤を標的細胞中に同時に送達することで、薬物カプセル化ナノ粒子が薬物間の薬物動態学的差異を正常化することができるなど。ナノ粒子製剤のこれらの利点は、抗腫瘍効力に対する組合せ薬物の相乗効果を増強するのであろう。

実施例８
フェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡ粒子の血液脳関門透過能
治療薬の脳内への送達は、血液脳関門（ＢＢＢ）のため、依然として大きな課題である。１００ｎｍ未満のナノ粒子は、ＢＢＢを横切る薬物輸送を改善する利点を提供する。表面上の正に荷電したＴＡ分子で修飾された３０ｎｍのフェニル−ｅｘＭＳＮは、ＢＢＢを横切る電位を有し得る。ナノ粒子ｉｎ ｖｉｖｏのＢＢＢ浸透能力を理解するために、本発明者らは、マウスの脳の血管におけるナノ粒子の分布をモニターするために２光子蛍光分光法を使用した。蛍光標識ナノ粒子を尾静脈を通して投与した。注射の２日後に、本発明者らは、表面から０〜３００μｍの深さ内に位置する脳血管を検出した。一方、血管拡張をマッピングし、血管壁の境界を明らかにするために、ＦＩＴＣ−デキストランをＩＶを通して注入した。ナノ粒子からの蛍光信号がＦＩＴＣ−デキストランの信号（緑色の信号）と重なった場合、黄色の信号（場合によっては赤色になる）として現れ、ナノ粒子が血管内に存在せず、ＢＢＢを越えて脳組織に入ってきた可能性があることを意味する。脳血管の３Ｄ画像は、血管壁および脳組織領域に分布したフェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡナノ粒子からの多数の赤色シグナルを示した。結果は、３０ｎｍのフェニル−ｅｘＭＳＮ−ＰＥＧ＋ＴＡがＢＢＢを脳組織に横切る可能性を示すことを示した。

本発明の当業者は、本出願の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の教示および開示に対して変形および修正を行うことができることを理解すべきである。上記の内容に基づいて、本出願は、その変更または修飾が添付の特許請求の範囲またはそれらの等価物に定義される範囲内に入ることを条件として、そのあらゆる変更および修飾を対象とすることを意図している。

Claims (21)

1. メソポーラスシリカナノ粒子であって、その細孔の表面に有機修飾を含み、１００ｎｍ以下の粒子サイズおよび１５０ｎｍ以下の動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される媒体中の流体力学的サイズを有し、有機修飾が少なくとも１つの末端ヒドロカルビル部分を含み、前記媒体がリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と生物学的に類似または同等であることを特徴とする、メソポーラスシリカナノ粒子。
2. 前記メソポーラスシリカナノ粒子の細孔サイズが５０ｎｍ以下である、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
3. 前記メソポーラスシリカナノ粒子の流体力学的サイズが１００ｎｍ以下である、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
4. 末端ヒドロカルビル部分が末端芳香族部分、末端脂肪族部分またはそれらの組合せを含む、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
5. 末端芳香族部分が、トリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）、トリエトキシフェニルシラン、ジフェニルジエトキシシラン、１−ナフチルトリメトキシシラン、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシシリルプロポキシ）ジフェニルケトン、Ｏ−４−メチルクマリニル−Ｎ−［３（トリエトキシシリル）プロピル］カルバメート、７−トリエトキシシリルプロポキシ−５−ヒドロキシフラボン、３−カルバゾリルプロピルトリエトキシシラン、ビス（２−ジフェニルホスフィノエチル）メチルシリルエチルトリエトキシシランおよび２−（ジフェニルホスフィノ）エチルトリエトキシシランからなる群から選択されるシラン源から誘導される、請求項４に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
6. 末端脂肪族部分が、プロピルトリエトキシシラン、ｎ−ブチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、ヘプチルトリエトキシシラン、オクチルトリエトキシシラン、ノニルトリエトキシシラン、デシルトリエトキシシラン、ウンデシルトリエトキシシラン、ドデシルトリエトキシシラン、シクロプロピルトリエトキシシラン、シクロブチルトリエトキシシラン、シクロペンチルトリエトキシシラン、シクロヘキシルトリエトキシシラン、シクロヘプチルトリエトキシシラン、シクロオクチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、ｎ−ブチルトリメトキシシラン、ペンチルトリメトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘプチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ノニルトリメトキシシラン、デシルトリメトキシシラン、ウンデシルトリメトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、シクロプロピルトリメトキシシラン、シクロブチルトリメトキシシラン、シクロペンチルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリメトキシシラン、シクロヘプチルトリメトキシシランおよびシクロオクチルトリメトキシシランからなる群から選択されるシラン源に由来する請求項４のメソポーラスシリカナノ粒子。
7. 粒子当たりの末端ヒドロカルビル部分の量が１×１０^６分子／粒子未満である、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
8. 細孔内に負荷された少なくとも１つの疎水性生物活性成分または少なくとも１つの親水性生物活性成分をさらに含む、請求項１に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
9. 疎水性生物活性成分が、小分子、化学薬物、酵素、タンパク質薬物、抗体、ワクチン、抗生物質、ヌクレオチド薬物またはそれらの組合せである、請求項８に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
10. 細孔内に負荷された少なくとも１つの親水性または疎水性生物活性成分をさらに含む、請求項８に記載のメソポーラスシリカナノ粒子。
11. 生物活性成分が相乗効果を有する、請求項１０のメソポーラスシリカナノ粒子。
12. （１）請求項１のメソポーラスシリカナノ粒子の細孔内に生物活性成分を負荷すること、および
    （２）（１）に記載のメソポーラスシリカナノ粒子を対象に投与することを含む、生物活性成分を対象に送達するための方法。
13. メソポーラスシリカナノ粒子が血液脳関門を透過するように送達される、請求項１２に記載の方法。
14. メソポーラスシリカナノ粒子が血液眼球関門を透過するように送達される、請求項１２に記載の方法。
15. 細孔上に内面有機修飾を有するメソポーラスシリカナノ粒子（ＭＳＮ）の製造法であって、
    （ａ）界面活性剤を含有するアルカリ性溶液を提供してミセルを形成する工程、
    （ｂ）第１のシリカ源と、末端ヒドロカルビル部分を提供する第２のシリカ源とを前記溶液に添加し、第１のシリカ源と第２のシリカ源とのモル比が５：１以上である工程、
    （ｃ）前記溶液に水熱処理を実施する工程、および
    （ｄ）前記溶液からＭＳＮを抽出し、場合によっては精製する工程
    を含む方法。
16. 前記方法が以下の工程の少なくとも１つをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
    （ｅ）工程（ａ）の後かつ工程（ｂ）の前に、細孔拡張のために、前記溶液に油相を導入する工程、
    （ｆ）工程（ｂ）の後にさらなるシリカ源を添加する工程、および
    （ｇ）前記ＭＳＮの外面の表面修飾を行う工程であって、前記表面修飾は工程（ｂ）の後に、または工程（ｆ）が行われる場合には工程（ｆ）の後に行われる工程。
17. 前記界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、またはそれらの任意の組合せである、請求項１５に記載の方法。
18. 前記第１のシラン源が、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、テトラメトキシシラン（ＴＭＯＳ）、ケイ酸ナトリウムまたはそれらの混合物を含む、請求項１５に記載の方法。
19. 第２のシラン源が、トリメトキシフェニルシラン（ＴＭＰＳ）、トリエトキシフェニルシラン（ＴＥＰＳ）、ジフェニルジエトキシシラン、１−ナフチルトリメトキシシラン、２−ヒドロキシ−４−（３−トリエトキシシリルプロポキシ）ジフェニルケトン、Ｏ−４−メチルクマリニル−Ｎ−［３（トリエトキシシリル）プロピル］カルバメート、７−トリエトキシシリルプロポキシ−５−ヒドロキシフラボン、３−カルバゾリルプロピルトリエトキシシラン、ビス（２−ジフェニルホスフィノエチル）メチルシリルエチルトリエトキシシラン、２−（ジフェニルホスフィノ）エチルトリエトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ｎ−ブチルトリエトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、ヘプチルトリエトキシシラン、オクチルトリエトキシシラン、ノニルトリエトキシシラン、デシルトリエトキシシラン、ウンデシルトリエトキシシラン、ドデシルトリエトキシシラン、シクロプロピルトリエトキシシラン、シクロブチルトリエトキシシラン、シクロペンチルトリエトキシシラン、シクロヘキシルトリエトキシシラン、シクロヘプチルトリエトキシシラン、シクロオクチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、ｎ−ブチルトリメトキシシラン、ペンチルトリメトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘプチルトリメトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、ノニルトリメトキシシラン、デシルトリメトキシシラン、ウンデシルトリメトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、シクロプロピルトリメトキシシラン、シクロブチルトリメトキシシラン、シクロペンチルトリメトキシシラン、シクロヘキシルトリメトキシシラン、シクロヘプチルトリメトキシシランおよびシクロオクチルトリメトキシシランからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
20. 工程（ｅ）に記載の油相が、置換または非置換（シクロ）アルカン、置換または非置換芳香族溶媒またはそれらの組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
21. 請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法によって調製される、メソポーラスシリカナノ粒子。