JP2021021569A - 検出方法および検出キット - Google Patents

Abstract

【課題】被検出物質と、結合物質とを十分に結合させて被検出物質を高感度に検出し、また、少ない検体量で被検出物質の検出が可能となる検出方法を提供すること。【解決手段】被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップを準備する。前記被検出物質が含まれる検体と、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第１粒子とを含む第１混合液を準備する。前記第１混合液を前記反応場上に提供して、前記第１混合液中の前記被検出物質を前記反応場上の前記第１結合物質に結合させる。前記反応場の前記第１結合物質に結合した前記被検出物質を検出する。【選択図】図１

Description

本発明は、検体中の被検出物質を検出するための検出方法および検出キットに関する。

被検出物質に結合する結合物質が固定化された反応場を利用し、被検出物質を結合物質に結合させて被検出物質の存在又はその量を検出する検出方法が知られている。

たとえば、特許文献１に記載されている測定方法では、リガンド（結合物質）が固定化されているセンサ面上へアナライト（被検出物質）溶液を吐出した後、少なくとも１回の吸引を行って逆流させて、アナライト溶液を少なくとも１回往復させている。このようにアナライト溶液を往復させることにより、センサ面上のリガンドへのアナライトの結合が促進される。次に、センサに光を入射させたときの反射光の減衰により、センサ面上のアナライトを検出している。

特開２００６−０９０９８５号公報

しかしながら、上記の特許文献１に記載されている測定方法では、溶液の流れが層流となり、下層の流れにおいては結合物質と被検出物質とが比較的よく結合するが、上層の流れにおいては結合物質と被検出物質との結合が十分でないことがある。そのため被検出物質の存在又はその量を感度よく検出することができないことがある。

また、特許文献１に記載されている測定方法では、反応場が存在する流路を被検出物質の溶液で満たすために、多くの検体が必要であることがある。この場合、たとえば、多くの血液サンプルが必要となり、患者の負担が大きくなるなどの問題が生じることがある。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、被検出物質と、結合物質とを十分に結合させて被検出物質を高感度に検出し、また、少ない検体量で被検出物質の検出が可能となる検出方法および検出キットを提供することを目的とする。

本発明の実施形態に係る検出方法は、被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップを準備する工程と、前記被検出物質が含まれる検体と、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第１粒子と、を含む第１混合液を準備する工程と、前記第１混合液を前記反応場上に提供して、前記第１混合液中の前記被検出物質を前記反応場の前記第１結合物質に結合させる工程と、前記反応場の前記第１結合物質に結合した前記被検出物質を検出する工程と、を有する。

本発明の実施形態に係る検出キットは、被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップと、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第１粒子と、を有する。

本発明によれば、被検出物質と、結合物質とをより多く結合させて被検出物質を高感度に検出し、また、より少ない検体量で被検出物質の検出が可能となる検出方法および検出キットを提供することができる。

図１は、本発明の実施形態に係る検出方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、本発明の実施形態に係る検出方法の一例による検出結果を示すグラフである。

［検出方法］
以下、本実施形態に係る検出方法について、具体的に説明する。図１は、本発明の実施形態に係る検出方法の一例を示すフローチャートである。図１を参照しつつ本発明の実施形態に係る検出方法の一例を説明する。

（検出チップの準備）
まず、被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップを準備する。（工程Ｓ１０）。

上記反応場において第１結合物質を固定化される部材の種類は、第１結合物質を適切に固定化することができれば特に制限されない。たとえば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ−ｆｉｅｌｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＳＰＦＳ」）を利用して被検出物質を検出する場合、第１結合物質は金属膜に固定化される。上記金属膜は、励起光を照射されたときに表面プラズモン共鳴を生じさせる。金属膜を構成する金属の種類は、表面プラズモン共鳴を生じさせうる金属であれば特に制限されない。金属膜を構成する金属の例には、金、銀、銅、アルミニウムおよびこれらの合金が含まれる。また、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ、以下「ＥＬＩＳＡ」）を利用して被検出物質を検出する場合、第１結合物質は、マイクロチューブやマイクロプレートなどに固定化される。マイクロチューブやマイクロプレートの材料の種類は、特に制限されず、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどの樹脂、ガラスなどである。

検出チップ内の反応場が配置される位置は、特に制限されない。たとえば、検出チップが流路を備えているときは、反応場は、流路内に配置されていてもよい。また、検出チップが、ウェルを備えているときは、反応場は、ウェルの底部に配置されていてもよい。

上記第１結合物質は、被検出物質に結合することができ、反応場に固定化されている。通常、第１結合物質は、所定の領域にある反応場に均一に固定化されている。第１結合物質の種類は、被検出物質に結合することができれば特に制限されないが、被検出物質に特異的に結合できることが好ましい。第１結合物質の例には、被検出物質に特異的に結合できる抗体、被検出物質に特異的に結合できる核酸、被検出物質に特異的に結合できる脂質、および被検出物質に特異的に結合できる抗体以外のタンパク質が含まれる。第１結合物質が抗体である場合、抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、抗体の断片であってもよい。また、反応場に固定化される第１結合物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。たとえば、反応場に固定化される第１結合物質は、１種類または２種類以上のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。

第１結合物質の固定化方法は、特に制限されず、結合物質の種類に応じて適宜選択される。たとえば、金属、樹脂またはガラスの上に、第１結合物質（たとえば抗体）を結合させた自己組織化単分子膜（以下「ＳＡＭ」という）または高分子膜を形成すればよい。ＳＡＭの例には、ＨＯＯＣ−（ＣＨ_２）_１１−ＳＨなどの置換脂肪族ジオールで形成された膜が含まれる。高分子膜を構成する材料の例には、ポリエチレングリコールおよびＭＰＣポリマーが含まれる。また、結合物質に結合可能な反応性基（または反応性基に変換可能な官能基）を有する高分子を反応場に固定化し、この高分子に第１結合物質（たとえば抗体）を結合させてもよい。

検出チップは、好ましくは各片の長さが数ｍｍ〜数ｃｍの構造物であるが、「チップ」の範疇に含まれないより小型の構造物またはより大型の構造物であってもよい。

（第１混合液の準備）
次に、被検出物質が含まれる検体と、比重が１以上であり、直径が１００μｍ以下である第１粒子と、を含む第１混合液を準備する。たとえば、検体と第１粒子とを混合して、第１混合液を調製する（工程Ｓ２０）。

検体の種類は、特に制限されず、目的に応じて適宜選択される。検体の例には、血液、血清、血漿、尿、鼻孔液、唾液、精液およびこれらの希釈液が含まれる。

第１粒子は、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下のものであれば特に制限されない。比重を１以上の粒子を用いることで、検体中の粒子の分散性を向上させることができる。また、直径が１００μｍ以下の粒子を用いることで、流路やウェル等において粒子が詰まることを抑制できる。

第１粒子の比重は、検体中での第１粒子の分散性の観点から、１以上２５以下であることが好ましく、１以上５以下であることがさらに好ましい。

第１粒子の直径は、検出チップ内において第１粒子の詰りを抑制する観点、および検出チップ内において第１混合液を撹拌する観点から、１μｍ以上１００μｍ以下であることが好ましく、１μｍ以上５０μｍ以下であることがさらに好ましい。

第１混合液中の第１粒子の含有量は、後述する、被検出物質と結合物質との反応性を向上させるという観点から、第１混合液の全質量に対して２０質量％以上であることが好ましく、３０質量％以上であることがさらに好ましく、６０質量％以上であることがさらに好ましい。第１粒子の含有量の上限は、たとえば、第１混合液の全質量に対して８０質量％以下であることが好ましい。

第１粒子の材料は、特に制限されないが、ガラスまたは樹脂であることが好ましく、タンパク質の非特異的な吸着が抑制される材料が好ましい。上記樹脂の例には、アクリル樹脂、メタクリル樹脂等が含まれる。また、第１粒子は中実粒子であることが好ましい。

検体と第１粒子とを混合する方法は、特に制限されない。たとえば、検体と第１粒子との混合は、検体と第１粒子とを容器中で混合することによって行われる。第１粒子は、通常高い分散性を有するため検体中で容易に分散する。しかし、第１粒子を確実に検体中に分散させるために混合後に撹拌を行ってもよい。

（被検出物質と結合物質との結合）
次に、第１混合液を検出チップの反応場上に提供して、第１混合液中の被検出物質を反応場の第１結合物質に結合させる（工程Ｓ３０）。この後、反応場を緩衝液などで洗浄して、結合物質に結合していない被検出物質や他のタンパク質などを除去することが好ましい（工程Ｓ４０）。

第１混合液中の被検出物質を反応場上の結合物質に結合させる方法は特に制限されない。当該方法は、たとえば、ピペットチップを先端に装着したピペットを用いて反応場上に第１混合液を提供することによって行われる。また、ピペットを用いて混合液を往復送液してもよい。また、第１粒子が予め入っている検出キットに検体を加える場合、上記の第１混合液とする工程と、第１混合液中の被検出物質を結合物質に結合させる工程とは同時に行われる。

被検出物質と第１粒子とを含む第１混合液を反応場上に提供することによって、第１粒子の存在下で被検出物質と結合物質とを結合させることになる。このように、第１粒子が存在することで、たとえば流路に混合液を提供した場合、見かけの流路高さが低くなり、被検出物質の拡散距離が短くなり、被検出物質と結合物質との反応性が上がると考えられる。また、第１粒子が存在することで、混合（攪拌）が促進され混合液中で被検出物質の濃度が均一となり、被検出物質と結合物質との反応性が上がると考えられる。具体的には、流路にピペットを用いて混合液を提供する場合、第１粒子が存在することで、混合液の流れが層流になりにくく、被検出物質と結合物質との反応性が上がると考えられる。被検出物質と結合物質との反応性が上がることで被検出物質の高感度な検出が可能となる。また、検体と粒子とを含む第１混合液を流路に提供すればよいので、必要となる検体量は少なくなる。

（被検出物質の検出）
次に、反応場の第１結合物質に結合した被検出物質を検出する。被検出物質の検出方法は、特に制限されない。たとえば、標識物質で標識された、被検出物質に結合する第２結合物質を反応場の第１結合物質に結合した被検出物質に結合させた後に、標識物質由来のシグナルを検出することで反応場の第１結合物質に結合した被検出物質を検出してもよい。この場合、標識物質の種類は、特に制限されず、蛍光物質や酵素などである。ＳＰＦＳにより被検出物質を検出する場合は、蛍光物質で標識された第２結合物質を用いる。ＥＬＩＳＡにより被検出物質を検出する場合は、酵素で標識された第２結合物質を用いる。標識物質が蛍光物質の場合、蛍光物質から放出される蛍光を検出することで、反応場の第１結合物質に結合した被検出物質を検出することができる。また、標識物質が酵素の場合、酵素反応による発色または発光を検出することで、反応場の第１結合物質に結合した被検出物質を検出することができる。

上記第２結合物質を用いる場合、さらに比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第２粒子も用いてもよい。第２結合物質と第２粒子とを組み合わせて使用することで、第２結合物質を反応場の第１結合物質に結合した被検出物質に効率的に結合させることができる。この場合、例えば、蛍光物質で標識された第２結合物質と、第２粒子とを混合して、第２混合液を調製する（工程Ｓ５０）。また、別途調製された、標識物質で標識された第２結合物質と第２粒子とを含む第２混合液を購入してもよい。

標識物質として蛍光物質を用いる場合、蛍光物質の種類は、特に制限されない。蛍光物質の例には、シアニン系色素、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、およびＢｉｏｔｉｕｍ社のＣＦ色素が含まれる。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ色素およびＣＦ色素は、市販されている蛍光色素の中では、ＳＰＦＳで使用する励起光の波長についての量子効率が高い。また、ＣＦ色素は、蛍光検出時における退色があまり生じないため、安定して蛍光検出を行うことができる。また、標識物質として酵素を用いる場合、酵素の種類は、酵素反応により発色または発光を生じさせることが可能であれば特に制限されない。酵素の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどが含まれる。発色または発光のために用いる基質の種類は、特に制限されず公知の基質から適宜選択される。また、第２結合物質を標識物質で標識する方法は、特に制限されず、公知の方法から適宜選択されうる。たとえば、第２結合物質のアミノ基またはスルフヒドリル基に標識物質を結合させればよい。

第２結合物質の種類は、被検出物質に結合することができれば特に制限されないが、被検出物質に特異的に結合できることが好ましい。第２結合物質の例は、第１結合物質の例と同じである。第２結合物質は、第１結合物質と同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。

第２粒子は、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下であれば特に制限されない。第２粒子は、上記の第１粒子と同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。

第２粒子の役割は、上記の第１粒子の役割と同様である。すなわち、第２粒子が存在することで、たとえば流路に第２混合液を提供した場合、見かけの流路高さが低くなり、被検出物質の拡散距離が短くなり、被検出物質と標識された結合物質との反応性が上がると考えられる。また、第２粒子が存在することで、混合（攪拌）が促進され第２混合液中で標識された結合物質の濃度が均一となり、被検出物質と標識された結合物質との反応性が上がると考えられる。具体的には、流路にピペットを用いて第２混合液を提供する場合、第２粒子が存在することで、第２混合液の流れが層流になりにくく、被検出物質と標識された結合物質との反応性が上がると考えられる。被検出物質と標識された結合物質との反応性が上がることで被検出物質の高感度な検出が可能となる。また、標識された結合物質と粒子とを含む第２混合液を流路に提供すればよいので、必要となる標識された結合物質の量は少なくなる。

第２混合液中の第２粒子の含有量は、被検出物質と第２結合物質との反応性を向上させるという観点から、第２混合液の全質量に対して２０質量％以上であることが好ましく、３０質量％以上であることがさらに好ましく、６０質量％以上であることがさらに好ましい。第２粒子の含有量の上限は、たとえば、第２混合液の全質量に対して８０質量％以下であることが好ましい。

第２結合物質と第２粒子とを混合する方法は、特に制限されない。たとえば、第２結合物質と第２粒子との混合は、第２結合物質と第２粒子とを容器中で混合することによって行われる。第２粒子も上記の第１粒子と同様に、通常、高い分散能力を有するため第２混合液中で容易に分散する。しかし、第２粒子を確実に第２混合液中に分散させるために混合後に撹拌を行ってもよい。

標識物質で標識された第２結合物質を用いる場合、標識物質で標識された第２結合物質を反応場上に提供して、反応場の第１結合物質に結合した被検出物質に第２結合物質を結合させる。また、標識物質で標識された第２結合物質および第２粒子を含む第２混合液を用いる場合、第２混合液を反応場上に提供して、反応場の第１結合物質に結合した被検出物質に第２結合物質を結合させる（工程Ｓ６０）。この後、反応場を緩衝液などで洗浄して、被検出物質に結合していない第２結合物質などを除去することが好ましい（工程Ｓ７０）。

標識物質で標識された第２結合物質を用いる場合、標識物質由来のシグナルを検出することで被検出物質を検出する（工程Ｓ８０）。たとえば、標識物質が蛍光物質の場合、蛍光物質で標識された被検出物質が反応場に固定化された第１結合物質に結合している状態で、反応場に励起光を照射し、これにより蛍光物質から放出される蛍光を測定する。また、標識物質が酵素の場合、酵素で標識された被検出物質が反応場に固定化された第１結合物質に結合している状態で、反応場に酵素の基質を提供して酵素反応を生じさせ、この反応により生じる発色または発光を測定する。蛍光または発光を測定する場合、測定された蛍光値または発光値から、予め測定された光学ブランク値を引いて、被検出物質の量に相関するシグナル値を算出する。必要に応じて、予め作成しておいた検量線などにより、シグナル値を被検出物質の量や濃度などに換算してもよい。

以上の手順により、検体に含まれる被検出物質を検出することができる。

［検出キット］
本実施形態に係る検出キットは、上記の検出チップと、上記の第１粒子と、を有する。また、当該検出キットは、上記の標識物質で標識された第２結合物質と、上記の第２粒子とをさらに有してもよい。このように上記の検出チップや第１粒子などを予めセットとしておくことで、ユーザー（医療従事者など）が被検出物質の検出を簡便に行うことが可能となる。

［効果］
以上のように、本実施形態に係る検出方法または検出キットによれば、検体中の被検出物質を高感度に検出することができ、また、必要となる検体量が少なくなる。

以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

（検体中の被検出物質の検出）
ＳＰＦＳ用の検出チップを準備し、流路内に露出している金属膜の特定の領域に、マウス抗トロポニンモノクローナル抗体（第１結合物質）を固定化した。

ボランティアの健常者から採血管を使って血液を採取し、この血液を２つに分け、トロポニン（被検出物質）の濃度が１５ｎｇ／Ｌ、２００ｎｇ／Ｌとなるようトロポニンを加え、これらの２つの血液にさらに緩衝液を加えて２倍に希釈してそれぞれ検体１、２とした。

検体１、２のそれぞれについて、アクリル樹脂ビーズ（早川ゴム社製、ハヤビーズ３ＤＳ−ＢＫ）（第１粒子）の濃度が、上記検体とアクリル樹脂ビーズとの混合液の全質量に対して０質量％、３０質量％、６０質量％となる混合液（第１混合液）を準備した。

ピペットチップにより、上記の検出チップの液体注入部から流路内に上記の混合液を導入し、往復送液させた。液体注入部から流路内の混合液を除去した後、流路内を洗浄液で１回洗浄した。次いで、標識物質（アミノ基を介してＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ社）で標識されたマウス抗トロポニンモノクローナル抗体（第２結合物質）を液体注入部から流路内に導入し、往復送液させた。液体注入部から流路内の標識された抗体を除去した後、流路内を洗浄液で３回洗浄した。次いで、液体注入部から流路内に測定液を導入した。この状態で、ＳＰＦＳにより蛍光値を測定した。すなわち、金属膜に対する励起光の入射角が増強角となるようにプリズム側から金属膜に励起光（レーザー光）を照射し、そのときに放出される蛍光値を測定した。図２のグラフに測定結果を示す。

図２のグラフでは、アクリル樹脂ビーズを加えなかった試料のシグナルを１００％とし、これとの対比を示している。図２のグラフから明らかなように、アクリル樹脂ビーズを混合液の全質量に対して３０質量％、６０質量％加えたサンプルは、アクリル樹脂ビーズを加えないものと比較してシグナルが約１１０％、約１２０％とより多くなり、被検出物質をより高感度に検出することができていることがわかる。これは、アクリル樹脂ビーズの存在により、トロポニンと抗トロポニン抗体との反応性が向上しているためであると考えられる。

本実施形態に係る検出方法または検出キットを用いることで、被検出物質を高感度に検出することができ、また、少ない検体量での検出が可能となる。したがって、本発明に係る検出方法および検出キットは、たとえば臨床検査などに有用である。

Claims (9)

1. 被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップを準備する工程と、
   前記被検出物質が含まれる検体と、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第１粒子と、を含む第１混合液を準備する工程と、
   前記第１混合液を前記反応場上に提供して、前記第１混合液中の前記被検出物質を前記反応場の前記第１結合物質に結合させる工程と、
   前記反応場の前記第１結合物質に結合した前記被検出物質を検出する工程と、
   を有する、検出方法。
2. 前記第１粒子の直径は、１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１に記載の検出方法。
3. 前記第１混合液中の前記第１粒子の含有量が、前記第１混合液の全質量に対して２０質量％以上である、請求項１または請求項２に記載の検出方法。
4. 前記第１粒子は、樹脂またはガラスを含む、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の検出方法。
5. 標識物質で標識され、かつ被検出物質に結合する第２結合物質と、比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第２粒子と、を含む第２混合液を準備する工程と、
   前記被検出物質を前記第１結合物質に結合させる工程の後に、前記第２混合液を前記反応場上に提供して、前記第２混合液中の前記第２結合物質を、前記反応場の前記第１結合物質に結合した前記被検出物質に結合させる工程と、
   をさらに有し、
   前記被検出物質を検出する工程では、前記標識物質由来のシグナルを検出することで前記被検出物質を検出する、
   請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の検出方法。
6. 被検出物質に結合する第１結合物質が固定化された反応場を有する検出チップと、
   比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第１粒子と、
   を有する、検出キット。
7. 前記第１粒子の直径は、１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項６に記載の検出キット。
8. 前記第１粒子は、樹脂またはガラスを含む、請求項６または請求項７に記載の検出キット。
9. 標識物質で標識され、かつ被検出物質に結合する第２結合物質と、
   比重が１以上であり、かつ直径が１００μｍ以下である第２粒子と、
   をさらに有する、請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載の検出キット。

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