JP2021007375A - 組換え微生物を用いるグルタミン酸−５−セミアルデヒドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安価かつ安定な原料からグルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸の１つ以上を生産する方法を提供すること。【解決手段】ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または、これら酵素の活性が抑制されるように改変が行われた、組換え微生物。【選択図】なし

Description

本発明は、産業上有用な化合物を生産するように人為的に遺伝子操作された組換え微生物、および、当該組換え微生物を用いて、グルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸のうちの１つ以上を製造する方法に関する。

グルタミン酸−５−セミアルデヒド（ＣＡＳＮｏ．２８８６−９１−１）は、例えば、有機合成用原料、ポリアミド原料中間体、ポリウレタン原料中間体、イソシアナート原料中間体、ＰＥＴ原料中間体、溶媒原料中間体として重要な化合物である（特許文献１〜４）。生体内において、グルタミン酸−５−セミアルデヒドは、Ｌ−グルタミン酸から出発し、中間代謝産物としてＬ−グルタミン酸−５−リン酸を経由して生成する（図１参照）。酵素的には、Ｌ−オルニチンと２−オキソグルタル酸を基質として、オルニチンアミノトランスフェラーゼ処理により合成される（非特許文献１）。また、グルタミン酸−５−セミアルデヒドを生産する天然の微生物を取得した例が報告されているが、その生合成メカニズムについては明記されていない（特許文献５）。

ピロリン−５−カルボン酸（ＣＡＳＮｏ．２９０６−３９−０）は、グルタミン酸−５−セミアルデヒドが分子内縮合することによって生成する化合物である。グルタミン酸−５−セミアルデヒドに変換されることによって、グルタミン酸−５−セミアルデヒドについて挙げた前記目的に使用されるとともに、本化合物そのものも、除草剤原料、医薬中間体原料として有用な化合物である（特許文献６、非特許文献２）。生体内においては、グルタミン酸−５−セミアルデヒドの自発的環化によって生じ、必須アミノ酸であるプロリンへと酵素的に還元される。有機合成においては、例えば、（Ｓ）−５−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ａｍｉｎｏｖａｌｅｒｉｃ Ａｃｉｄを酸性条件下、酸化クロム（ＩＶ）存在下で８０℃に加熱することにより合成されるが、酸化クロム（ＩＶ）は化審法において第一種指定化学物に指定されており、その使用は厳しく制限を受ける（非特許文献３）。前記した２つの化合物は、産業的に重要な化合物でありながら、有用な製造方法は未だ確立されていない。

Ｌ−ピログルタミン酸（ＣＡＳＮｏ．９８−７９−３）は、Ｌ−グルタミン酸が分子内縮合することによって生成する化合物である。Ｌ−ピログルタミン酸は、生体への無害性から、保湿を目的とした皮膚外用医薬品、化粧品の保湿剤として実用化されている（特許文献７〜９）。Ｌ−ピログルタミン酸は、有機合成においては、Ｌ−グルタミン酸を酸性条件下で１７５℃に加熱脱水することにより行われる。しかしながら、この製造法は加熱温度が１７５℃と非常に高温高圧であり、かつ、酸性条件下で行われるため、望ましくない（非特許文献４）。Ｌ−ピログルタミン酸のそのほかの合成法として、Ｌ−グルタミン酸から酵素的に生産する手法が報告されている（特許文献１０）。

特許第１２１０１９０号公報 特表２０１５−５１９０８３号公報 特許第５７７３９９０号公報 特許第５９１２５２９号公報 特開昭５３−１３６５８６号公報 特許第４４１８５４０号公報 特公平３−２９７６４号公報 特許第４５２２５８０号公報 特開昭６１−６０６２０号公報 特許第２６９８０５６号公報

Ｓｔｒａｎｓｋａ ｅｔ． Ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅａ ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ−δ−ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ： Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉ− ａｎｄ ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， Ｈｏｒａｎｄ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｍａｓｓｏｎ ＳＡＳ， ２０１０， ９２， ９４０−９４８． Ｈａｍｅｄ ｅｔ．ａｌ． Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄａｔｅｄ ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｒｏｌｉｎｅ／ｐｉｐｅｃｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｖｉａ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｒｏｔｏｎａｓｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｌｋｙｌｍａｌｏｎｙｌ−ＣｏＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＵＫ， Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２１ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１３， １１， ４７， ８１９１−８１９６ Ｌｕｅｓｃｈ ｅｔ．ａｌ． Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ４−Ｍｅｔｈｙｌｐｒｏｌｉｎｅ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ： Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆｎｏｓＥ ａｎｄ ｎｏｓＦ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ＵＳＡ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００３， ６８， ８３−９１ Ｂｅｅｃｈａｍ ｅｔ． Ａｌ． Ｌ−Ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ＡＣＳ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９５４， ７６， １８， ４６１３−４６１４．

本発明の課題は、安価かつ安定な原料である糖から、遺伝的に操作された微生物を使用し、グルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸のうちの１つ以上を生産する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために、鋭意研究を重ねた結果、微生物がもつＬ−プロリン生合成経路に関連する遺伝子を操作することによって、糖からグルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸のうちの１つ以上を生産することのできる組換え微生物が得られることを見出した。

すなわち本発明は以下を提供する：
［１］ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または、これら酵素の活性が抑制されるように改変が行われた、組換え微生物；
［２］グルタミン酸−５−リン酸合成酵素の活性が増強されるように更に改変が行われた、［１］に記載の組換え微生物；
［３］前記改変により、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素のフィードバック阻害が解除される、［２］に記載の組換え微生物；
［４］前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、
・配列番号２７に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・配列番号２７に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・配列番号２７に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・配列番号２７に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または
・配列番号２７に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
であり、
および／または、
前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子が、
・配列番号２８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・配列番号２８に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
・配列番号２８に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・配列番号２８に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または
・配列番号２８に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［５］前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素がＥＣ １．２．１．８８で表わされる酵素から選択され、および／または
前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素がＥＣ １．５．１．２で表わされる酵素から選択される、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の組換え組成物。

［６］前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、
および／または、
前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［７］前記微生物が、エシェリヒア属である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［８］前記微生物が、エシェリヒア コリである、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［９］前記グルタミン酸−５−リン酸合成酵素が、
・配列番号２９に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
・配列番号２９に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
によりコードされる、［２］〜［８］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［１０］配列番号２５に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、［２］〜［９］のいずれか１項に記載の組換え微生物；
［１１］配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対し、
１０７番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基への置換、
１１７番目のアラニン残基のバリン残基への置換、および
１４３番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換
を含むアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、［２］〜［１０］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［１２］配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対し、
１０７番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基への置換、
１１７番目のアラニン残基のバリン残基への置換、および
１４３番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換
からなる群から選択される１以上の変異を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、［２］〜［１１］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［１３］前記グルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子が、グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子とのオペロンとして含まれる、［２］〜［１２］のいずれか１項に記載の組換え組成物；
［１４］［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、グルタミン酸−５−セミアルデヒドの製造方法；
［１５］［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、ピロリン−５−カルボン酸の製造方法；
［１６］［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、Ｌ−ピログルタミン酸の製造方法。

本発明により、安価かつ安定な原料である糖から、グルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸のうちの１つ以上を生産することができる。

微生物細胞内でのプロリン生合成経路を示す。 大腸菌Ｗ３１１０株由来のＰｕｔＡ酵素のアミノ酸配列（１〜７６０残基）を示す。 大腸菌Ｗ３１１０株由来のＰｕｔＡ酵素のアミノ酸配列（７６１〜１３２０残基）を示す。 大腸菌Ｗ３１１０株由来のＰｒｏＣ酵素のアミノ酸配列を示す。 大腸菌Ｗ３１１０株由来のＰｒｏＢ酵素のアミノ酸配列を示す。 大腸菌Ｗ３１１０株由来のＰｒｏＡ酵素のアミノ酸配列を示す。 実施例３−１における培養上清のＬＣＭＳ分析ＴＩＣチャートを示す。 実施例３−２における培養上清のＬＣＭＳ分析ＴＩＣチャートを示す。

以下、本発明を実施するための形態について具体的に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本発明にかかる組換え微生物は、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、あるいは、これら酵素の活性が抑制されるように改変が行われたものである。すなわち、本発明の組換え微生物は、宿主微生物に対して、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、あるいは、これら酵素の活性が抑制されるように改変を行ったものである。ここで、改変には、塩基の置換、欠失、挿入および／または付加が含まれる。

＜１＞ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素
「ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素」には、当該酵素のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、当該酵素と機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで「機能的に同等なタンパク質」とは、その酵素またはタンパク質の活性と同様の活性を備えたタンパク質である。例えば、「機能的に同等なタンパク質」には、その酵素のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するタンパク質を含む。具体的に、「ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素」は、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質を包含する。本発明の好ましい一態様において、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素は、ＥＣ １．２．１．８８で表される酵素から選択される。

「ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子」は、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列と８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。

本発明に関し、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である「１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６８℃」程度の条件である。

＜２＞ピロリン−５−カルボン酸還元酵素
「ピロリン−５−カルボン酸還元酵素」には、当該酵素のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、当該酵素と機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで「機能的に同等なタンパク質」については、「ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素」について説明したのと同様である。具体的に、「ピロリン−５−カルボン酸還元酵素」は、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質を包含する。本発明の好ましい一態様において、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素は、ＥＣ １．５．１．２で表される酵素から選択される。

「ピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子」は、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列と８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。

本発明で使用され得る宿主微生物は、図１に示すＬ−プロリン生合成経路を持つ微生物であれば、本質的にどのような宿主でも利用可能である。そのような微生物として、例えば、エシェリヒア、シュードモナス、バチルス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ミクロコッカス、フラボバクテリウム、エルビニア、ビブリオ、ロドトルラ、サッカロマイセス、カンジダ属等の細菌が挙げられる。その中でも好ましくはエシェリヒア属が挙げられ、さらに好ましくはエシェリヒア コリ Ｗ３１１０株が挙げられる。

本発明において、酵素に関して、「活性の抑制」とは、「機能の抑制」、「機能の低下」および「活性の低下」と同義であり、互換可能に使用される。「酵素の活性の抑制」とは、細菌あたりの活性が、非改変株の活性よりも低くなっていることを意味する。例えば、細菌あたりのタンパク質分子の数が低下している場合、又は、タンパク質当たりの比活性が低下している場合、等が挙げられる。

酵素の活性が抑制された微生物の取得方法としては、紫外線照射や変異原性化学物質で処理することにより、ゲノムＤＮＡにランダムな変異を誘導し、目的変異を生じた株をスクリーニングする方法がある。他には、遺伝子配列があらかじめわかっている場合、相同組み換えやゲノム編集等の技術を用いて、細菌染色体の遺伝子を一部または全部を除去することによっても達成できる。または、目的遺伝子の発現に関与するプロモーター配列をより発現効率が低いものに変更してもよい。いずれにしても、その方法は例示したものに限定されない。

以下、図面を参照して、本発明についてさらに詳述する。

ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素（例えば、ＥＣ １．２．１．８８で表される）は、図１に示すように、プロリンを酸化しピロリン−５−カルボン酸を生成する反応と、ピロリン−５−カルボン酸への水分子付加により自発的に生成するグルタミン酸セミアルデヒドのアルデヒド基を、ＮＡＤを補酵素として酸化する反応を触媒し、グルタミン酸を生成する。ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素のアミノ酸配列および当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列に関する情報は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。代表的な遺伝子としては、大腸菌（エシェリヒア コリ）のｐｕｔＡが挙げられる。大腸菌ＰｕｔＡ酵素のアミノ酸配列を図２および３に示す（配列番号２３）。また、大腸菌ｐｕｔＡの塩基配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋからも利用可能であり、一例として、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４５６００（配列番号２７）が挙げられる。

ピロリン−５−カルボン酸還元酵素（例えば、ＥＣ １．５．１．２で表される）は、図１に示すように、ピロリン−５−カルボン酸を還元しプロリンを生成する反応を触媒する。ピロリン−５−カルボン酸還元酵素のアミノ酸配列および当該酵素をコードする遺伝子の塩基配列に関する情報は、当該分野で既知のデータベースから取得することができる。遺伝子配列として代表的なものは、大腸菌（エシェリヒア コリ）のｐｒｏＣが挙げられる。大腸菌ＰｒｏＣ酵素のアミノ酸配列を図４に示す（配列番号２４）。また、大腸菌ｐｒｏＣの塩基配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋからも利用可能であり、一例として、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４５０３４（配列番号２８）が挙げられる。

上記２つの酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または、これら酵素の活性が抑制されるように改変が行わることによって、プロリン生合成経路における、ピロリン−５−カルボン酸のプロリンやＬ−グルタミン酸への変換を抑制し、本発明の目的化合物の収率を向上させることができる。

本発明の好ましい態様では、前述の遺伝子の発現抑制または酵素活性の抑制に加え、宿主微生物においてグルタミン酸−５−セミアルデヒド生合成を促進するために、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素の活性が増強されるように改変が行われている。当該酵素の活性の増強は、例えば、宿主微生物が元来持っているグルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子に加えて更にグルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を導入することにより、または、宿主微生物が元来持っているグルタミン酸−５−リン酸合成酵素遺伝子に変異を導入することによって行われる。宿主微生物が元来持っているグルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子に加えて更にグルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を導入する場合、変異を導入したグルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子（以下、「グルタミン酸−５−リン酸合成酵素変異遺伝子」とも称する。）を、宿主微生物に導入する。グルタミン酸−５−リン酸合成酵素変異遺伝子の宿主微生物への導入においては、当該酵素単独として導入してもよく、以下で説明するグルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素（例えば、ＥＣ １．２．１．４１として表される）をコードする遺伝子とのオペロンとして導入してもよい。

グルタミン酸−５−リン酸合成酵素は、グルタミン酸の５位カルボン酸をリン酸化し、グルタミン酸−５−リン酸を生成する反応を触媒する。ここで、「グルタミン酸−５−リン酸合成酵素」には、当該酵素のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、当該酵素と機能的に同等なタンパク質も含まれる。「機能的に同等なタンパク質」については、「ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素」および「ピロリン−５−カルボン酸還元酵素」について説明したのと同様である。具体的に、「グルタミン酸−５−リン酸合成酵素」は、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を包含する。本発明の好ましい一態様において、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素は、ＥＣ ２．７．２．１１で表される酵素から選択される。

「グルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子」は、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列と８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。

代表的な遺伝子としては、大腸菌（エシェリヒア コリ）のｐｒｏＢが挙げられる。大腸菌ＰｒｏＢ酵素のアミノ酸配列を図５に示す（配列番号２５）。また、大腸菌ｐｒｏＢの塩基配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋからも利用可能であり、一例として、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４６４２５（配列番号２９）が挙げられる。

グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素（例えば、ＥＣ １．２．１．４１で表される）は、Ｌ−グルタミン酸−５−リン酸の５位カルボキシル基に修飾されたリン酸を外しながらアルデヒド基を生成する反応を触媒する。「グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素」には、当該酵素のアミノ酸配列において、１つまたは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質であって、当該酵素と機能的に同等なタンパク質も含まれる。具体的に、「グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素」は、下記で特定する配列番号に示されるアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素活性を有するタンパク質を包含する。また、「グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子」は、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列と８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１つまたは複数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個もしくは２個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、および
・下記で特定する配列番号に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
を包含する。代表的な遺伝子としては、大腸菌（エシェリヒア コリ）のｐｒｏＡが挙げられる。大腸菌ＰｒｏＡ酵素のアミノ酸配列を図６に示す（配列番号２６）。また、大腸菌ｐｒｏＡの塩基配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋからも利用可能であり、一例として、Ｇｅｎｅ ＩＤ： ９４６６８０（配列番号３０）が挙げられる。

野生型のグルタミン酸−５−リン酸合成酵素は、Ｌ−プロリンによってフィードバック阻害されることが一般的に認知されている。したがって、フィードバック阻害が解除される変異を有するものが好ましい。遺伝子組換操作により、フィードバック阻害が解除された変異型グルタミン酸−５−リン酸合成酵素を高発現させた微生物の例が報告されている（特許第４６３７１８３号、Ｊｉａｎｇ ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，ＳＰＲＩＮＧＥＲ ＮＡＴＵＲＥ，２０１７、 Ｄａｎｄｅｋａｒ ｅｔ． ａｌ．， ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ， Ａｍｅｒｉｃａｎ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８８， １７０， １２， ５９４３−５９４５．）。

以下、エシェリヒア コリＷ３１１０由来のｐｒｏＢをグルタミン酸−５−リン酸合成酵素の例として説明するが、本発明に用いる遺伝子はこれに限定されるものではない。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害を受けない変異型のＰｒｏＢとしては、そのアミノ酸配列において１０７番目のアスパラギン酸残基がアスパラギン残基に置換されたもの、１１７番目のアラニン残基がバリン残基に置換されたもの、１４３番目のグルタミン酸残基がリジン残基に置換されたものが挙げられる。ただし、置換に用いるアミノ酸の種類はこれらに限定されない。また、変異点は１つであってもよいし、複数の組み合わせであってもよい。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害を受けない変異型のグルタミン酸−５−リン酸合成酵素には、上記アミノ酸置換を有するアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質が含まれる。

本発明において、上記のグルタミン酸−５−リン酸合成酵素変異遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。

上記のプロモーターは、大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。ターミネーターとしては、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）に記載されている。

上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、または線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。本発明ではプラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体に挿入され複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９８、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩなどが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、ＰＣＲによる断片増幅、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及び種々のライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。

上記のようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、当該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。

本発明の別の実施形態は、先述の組換え微生物を用いて、グルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸のうちの１つ以上を製造する方法に関する。例えば、一態様において、先述の組換え微生物を培養することにより、グルタミン酸−５−セミアルデヒド、ピロリン−５−カルボン酸およびＬ−ピログルタミン酸が製造される。別の態様では、先述の組換え微生物を培養することにより、グルタミン酸−５−セミアルデヒドおよびピロリン−５−カルボン酸が製造される。さらに別の態様では、先述の組換え微生物を培養することにより、Ｌ−ピログルタミン酸が製造される。

本発明にかかる組換え微生物のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は、当業者により適宜選択できる。

培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。使用する培地は、培養すべき形質転換体の栄養要求を適切に満たさなければならない。

炭素源としては、Ｄ−グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）が挙げられる。更にＤ−グルコースを含有するバイオマスであり得る。好適なバイオマスとしては、トウモロコシ分解液やセルロース分解液を例示できる。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。炭素源としては、特に、グルコースが好ましい。

窒素源としては、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉および尿素など）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

また、培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。抗生物質としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

上記、セルロースや多糖類などの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したグルタミン酸−５−セミアルデヒドおよびプロリン−５−カルボン酸、およびＬ−ピログルタミン酸生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。

培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。

以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。

本実施例に示す全てのＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を用いて実施した。大腸菌の形質転換は、塩化カルシウム法（羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照）を用いた。

プラスミドの構築においては、ＬＢ培地を用い、必要な抗生物質を添加して使用した。各実施例で使用したプライマー配列を表１に示す。

各実施例で用いた培地の組成は以下のとおりである。

（ＬＢ培地）
２０ｇ／Ｌ ＬＢ培地、レノックス（ディフコ社製）。

［１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。必要に応じて、終濃度１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、もしくは終濃度５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン硫酸塩、もしくは終濃度３０ｍｇ／ｍＬ クロラムフェニコール、１．５％ Ｂａｃｔｏ ａｇａｒ（ディフコ社製）を加えた。

（Ｍ９培地）
６ｇ／Ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４、１２ｇ／Ｌ
Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ、２ｇ／Ｌ
ＮＨ_４Ｃｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、
０．２ｍＭ ＣａＣｌ_２、
Ｇｌｕｃｏｓｅ ２０ｇ／Ｌ、
１ｍＬ ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（５００ｍｇ／Ｌ ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、４００ｍｇ／Ｌ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２０ｍｇ／Ｌ ＭｎＣｌ_２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／Ｌ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌ ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１５ｍｇ／Ｌ Ｈ_３ＢＯ_３、２５０ｍｇ／Ｌ ＥＤＴＡ）、
１００ｍｇ／Ｌ チアミン、
１ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ
［必要に応じて、終濃度１００ｍｇ／Ｌ アンピシリン、もしくは終濃度５０ｍｇ／Ｌ カナマイシン硫酸塩、もしくは３０ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール、終濃度２５０ｍｇ／ｍＬのＬ−アラビノースも加えた。ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＮａＣｌ、ＮＨ_４Ｃｌは混合して１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行った。ｔｒａｃｅ ｍｅｔａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔは個別に１２０℃、２０分間蒸気滅菌を行ってから混合した。ＭｇＳＯ_４、ＣａＣｌ_２、Ｇｌｕｃｏｓｅ、チアミンは個別にフィルター滅菌を行ってから混合した。］
［実施例１］プラスミドの構築
（１−１）構成発現型プラスミドの構築
大腸菌にもちいる遺伝子構成発現用ベクターは次のように作製した。プラスミドｐＮＦＰ−Ａ５１（ＦＥＲＭ Ｐ−２２１８２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に２０１１年１０月２５日付けで寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１５）のマルチクローニングサイトに、ターミネーター配列及びプロモーター配列を挿入し、ｐＳＫ０００を構築した。プロモーター配列（配列番号２１）およびターミネーター配列（配列番号２２）を表２に示す。

大腸菌株Ｗ３１１０（ＮＢＲＣ１２７１３）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅを使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、グルタミン酸−５−リン合成酵素遺伝子、および、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素遺伝子／グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素遺伝子オペロンをＰＣＲ増幅した。ｐｒｏＢ遺伝子増幅に、表１に示す配列番号１、２記載のプライマーセットを使用した。ｐｒｏＢ／ｐｒｏＡオペロン遺伝子配列増幅に、表１に示す配列番号１、３記載のプライマーセットを使用した。ｐｒｏＢ遺伝子増幅の反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐｒｏＢ／ｐｒｏＡオペロン遺伝子増幅の反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１５ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたｐｒｏＢコード領域およびｐｒｏＢ／ｐｒｏＡオペロンコード領域は、Ｍｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、ｐＳＫ０００プラスミドのプロモーター下流にライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、それぞれｐＳＫ００１およびｐＳＫ００４とした。

グルタミン酸−５−リン合成酵素遺伝子配列への変異導入は、インバースＰＣＲ法を用いて行った。まず、１０７番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基への置換、１１７番目のアラニン残基のバリン残基への置換を目的とした変異導入を行った。すなわち、ｐＳＫ００１プラスミドまたはｐＳＫ００４プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号４，５記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲを行った。ｐｒｏＢ遺伝子増幅の反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐｒｏＢ／ｐｒｏＡオペロン遺伝子増幅の反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１５ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、セルフライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、それぞれｐＳＫ００２およびｐＳＫ００５とした。以降、上記のような２変異を導入したｐｒｏＢ遺伝子をｐｒｏＢ２ｍと表記する。

ｐＳＫ００５プラスミドを鋳型として、１４３番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換を行う変異導入を実施した。まず、表１に示す配列番号６，７記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は、９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１５ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、セルフライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出しｐＳＫ００６とした。以降、上記のような３変異を導入したｐｒｏＢ遺伝子をｐｒｏＢ３ｍと表記する。

（１−２）誘導発現型プラスミドの構築
ＰｒｏＢ３ｍ誘導発現型プラスミドの構築のため、ｐＳＫ００６プラスミドを鋳型とし、表１に示す配列番号１、３記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１５ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。プラスミドｐＢＡＤ３３（国立遺伝学研究所、ＮＢＲＰ Ｅ． Ｃｏｌｉ ｓｔｒａｉｎより分譲）を鋳型とし、表１に示す配列番号８，９記載のプライマーセットによりＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＳＫ００７とした。挿入方向の確認は、表１に示す配列番号３、１０記載のプライマーセットを用いたコロニーＰＣＲにより行った。

（１−３）ゲノム遺伝子組換え用プラスミドの構築
大腸菌株Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡ（前述）を鋳型として、ｐｒｏＣを含む遺伝子配列を、表１に示す配列番号１１，１２記載のプライマーセットにてＰＣＲ増幅した。同様に、ｐｕｔＡを含む遺伝子配列を、配列番号１３，１４記載のプライマーセットにてＰＣＲ増幅した。ｐｒｏＣ遺伝子増幅の反応条件は、９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅ、ｐｕｔＡ遺伝子増幅の反応条件は、９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（２０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片２種をそれぞれＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、ｐＨＡＫ１プラスミド（ＮＩＴＥ Ｐ−０２９１９として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に２０１９年３月１８日付けで寄託した。）のマルチクローニングサイトにライゲーションした。ｐＨＡＫ１プラスミドで形質転換した大腸菌の培養は、特記のない限り、３０℃で行った。ライゲーション産物を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、出現コロニーからプラスミドを抽出した。ｐｒｏＣ遺伝子を含むプラスミドをｐＳＫ００８、ｐｕｔＡ遺伝子を含むものをｐＳＫ００９とした。

ｐＳＫ００８およびｐＳＫ００９プラスミドを鋳型として、遺伝子配列の一部を欠損させるためのインバースＰＣＲを実施した。ｐＳＫ００８には、表１の配列番号１５，１６記載のプライマーセットを、ｐＳＫ００９には、表１の配列番号１７，１８記載のプライマーセットをそれぞれ用いた。反応条件は、９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（４０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化し、セルフライゲーションして、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐｒｏＣの部分断片を含むプラスミドをｐＳＫ０１０、ｐｕｔＡの部分断片を含むプラスミドをｐＳＫ０１１とした。

ゲノム中に挿入するためのＰｒｏＢｍ２発現カセットは、次のように取得した。すなわち、ｐＳＫ００２を鋳型として、表１の配列番号１９、２０記載のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化した。セルフライゲーションせずに脱リン酸化したｐＳＫ００８もしくはｐＳＫ００９ ＤＮＡ断片に、上記のＰｒｏＢｍ２発現カセットをライゲーションした。ライゲーション産物を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、出現コロニーからプラスミドを抽出した。プラスミド配列を解析し、ｐｒｏＣ断片中にＰｒｏＢｍ２発現カセットを挟んだプラスミドをｐＳＫ０１２、ｐｕｔＡ断片中にＰｒｏＢｍ２発現カセットを挟んだプラスミドをｐＳＫ０１３とした。ここでは、ＰｒｏＢｍ２発現カセットが差し込まれる先の遺伝子配列は、一部削除されるような設計となっている。

［実施例２］ゲノム遺伝子組み換え株の構築
遺伝子活性抑制を目的として、ゲノム遺伝子組み換え用プラスミドｐＳＫ０１０、ｐＳＫ０１１、ｐＳＫ０１２、ｐＳＫ０１３を用いて、大腸菌のゲノム遺伝子のｐｕｔＡおよびｐｒｏＣの一部を欠損させる遺伝子組み換えを実施した。また、前記２遺伝子配列のどちらかに、ＰｒｏＢｍ２発現カセットの挿入を行う操作を実施した。

（２−１）一遺伝子破壊株の作成
ｐＳＫ０１０またはｐＳＫ０１１を大腸菌ＡＫＣ−０１６株（ＦＥＲＭ Ｐ−２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に２０１１年４月２０日付で寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１５１２）に形質転換し、カナマイシンを含む平板培地にて３０℃培養しコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、カナマイシンを含む平板培地に塗布して４４℃培養し、複数のコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、スクロース１０％を含む平板培地に塗布して３０℃培養し、複数のコロニーを取得した。ｐＳＫ０１０プラスミドを形質転換して最終的に得られた株のゲノムｐｒｏＣ配列を解析し、目的の遺伝子破壊が起こった株としてＡＫＳＫ０１を得た。ｐＳＫ０１１プラスミドを形質転換して最終的に得られた株のゲノムｐｕｔＡ配列を解析し、目的の遺伝子破壊が起こった株としてＡＫＳＫ０２株を得た。

（２−２）二遺伝子破壊株の作製
二遺伝子破壊株の作製のため、ｐＳＫ０１０プラスミドでＡＫＳＫ０２株を形質転換し、カナマイシンを含む平板培地にて３０℃培養しコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、カナマイシンを含む平板培地に塗布して４４℃培養し、複数のコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、スクロース１０％を含む平板培地に塗布して３０℃培養し、複数のコロニーを取得した。得られたコロニーのｐｒｏＣ、ｐｕｔＡ配列を解析し、双方に目的の遺伝子破壊が起こっているものをＡＫＳＫ０３株とした。

（２−３）ＰｒｏＢｍ２発現カセットのゲノム挿入株の作製
二遺伝子を破壊しかつＰｒｏＢｍ２発現カセットを挿入した大腸菌株の作製のため、ｐＳＫ０１２プラスミドでＡＫＳＫ０２株を形質転換し、ｐＳＫ０１３プラスミドでＡＫＳＫ０１株を形質転換して、それぞれカナマイシンを含む平板培地にて３０℃培養しコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、カナマイシンを含む平板培地に塗布して４４℃培養し、複数のコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、３０℃にて３ｈ培養した。この培養液を、スクロース１０％を含む平板培地に塗布して３０℃培養し、複数のコロニーを取得した。ｐＳＫ０１２で形質転換して得られたコロニーのうち、ゲノムｐｒｏＣを解析して目的の遺伝子挿入が起こった株をＡＫＳＫ０４株とした。ｐＳＫ０１３で形質転換して得られたコロニーのうち、ゲノムｐｕｔＡ遺伝子配列を解析し、目的の遺伝子挿入が起こった株をＡＫＳＫ０５株とした。なお、ＡＫＳＫ０４株は、ｐｒｏＣ配列中にｐｒｏＢｍ２発現カセットが挿入されており、ＡＫＳＫ０５株は、ｐｕｔＡ配列中にｐｒｏＢｍ２発現カセットが挿入されている。ｐｒｏＢｍ２発現カセットが差し込まれる先の遺伝子配列は、一部削除されるような設計としているため、ＡＫＳＫ０４株ではｐｕｔＡ遺伝子に加えてｐｒｏＣ遺伝子にも破壊が起こっており、ＡＫＳＫ０５株ではｐｒｏＣ遺伝子に加えてｐｕｔＡ遺伝子にも破壊が起こっている。

［実施例３］作製株の培養と解析
（実施例３−１）
ＡＫＳＫ０３株またはＡＫＣ−０１６株をｐＳＫ００４プラスミドで形質転換した（これをそれぞれＡＫＳＫ０６株、ＡＫＳＫ０７株とする）。比較対象として、形質転換されていないＡＫＣ−０１６株およびＡＫＳＫ０３株も準備し、ＬＢ平板培地で３７℃一晩培養した。得られたコロニーを２ｍＬのＬＢ培地に稙菌し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を、１５ｍＬ丸底チューブに入れたＭ９培地 ５ｍＬに５０ｕＬ稙菌した。濁度（ＯＤ６００）を経時観察し、０．４を超えた時点でＬ−アラビノースを添加して、さらに２０時間３７℃で振とう培養した。回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を、１％ギ酸で４倍希釈した。この希釈液をクロマトディスク（島津ディーエルシー社製）でＭＦ濾過し、ＬＣＭＳによる分析を行った。分析条件を表３に示す。

培養上清のトータルイオンクロマトグラフィーチャートを図７に示す。ＡＫＣ−０１６株、ＡＫＳＫ０７株、ＡＫＳＫ０３株の培養サンプルにおいては、グルタミン酸セミアルデヒド（図中、「ＧＳＡ」）もしくはプロリン−５−カルボン酸（図中、「Ｐ５Ｃ」）を示すピークは検出できなかった。これに対して、ＡＫＳＫ０６株の培養サンプルにおいては、グルタミン酸セミアルデヒド（ＧＳＡ）とプロリン−５−カルボン酸（Ｐ５Ｃ）を示すピークが検出された。

培養上清中に排出されていたグルタミン酸セミアルデヒドおよびプロリン−５−カルボン酸の濃度を、文献（Ｒｕｉｔｅｒ ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ， １９８３， ７３， ５２５−５２８．）記載の方法に従って定量した。ｏ−アミノベンズアルデヒドとの反応物の吸光係数は、ε＝２，３００ Ｍ−１ｃｍ−１として計算した。結果を表４に示す。

（実施例３−２）
ＡＫＳＫ０４株、ＡＫＳＫ０５株を、２ｍＬのＬＢ培地に稙菌し、３７℃で一晩振とう培養した。この培養液を、１５ｍＬ丸底チューブに入れたＭ９培地 ５ｍＬに５０ｕＬ稙菌し、２２時間３７℃で振とう培養した。ＡＫＣ−０１６株をコントロールとして同様の条件で培養した。回収した培養液を遠心分離することで得られる上清を、１％ギ酸で４倍希釈した。この希釈液をクロマトディスク（島津ジーエルシー社製）でＭＦ濾過し、ＬＣＭＳによる分析を行った。

ＡＫＣ−０１６株、ＡＫＳＫ０４株、ＡＫＳＫ０５株培養上清のトータルイオンクロマトグラフィーチャートを図８に示す。ＡＫＳＫ０４、ＡＫＳＫ０５のチャートにおいて、Ｌ−ピログルタミン酸のピークを検出した。ＡＫＳＫ０４株においては、さらにグルタミン酸セミアルデヒドおよびピロリン−５−カルボン酸のピークが検出された。

培養上清中に排出されていたグルタミン酸セミアルデヒドおよびプロリン−５−カルボン酸の濃度を定量した。結果を表５に示す。

本発明は、グルタミン酸−５−セミアルデヒドおよびピロリン−５−カルボン酸および／またはＬ−ピログルタミン酸の工業的発酵生産に利用できる。

Claims (16)

1. ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子およびピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子の発現が抑制されるか、または、これら酵素の活性が抑制されるように改変が行われた、組換え微生物。
2. グルタミン酸−５−リン酸合成酵素の活性が増強されるように更に改変が行われた、請求項１に記載の組換え微生物。
3. 前記改変により、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素のフィードバック阻害が解除される、請求項２に記載の組換え微生物。
4. 前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、
   ・配列番号２７に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
   ・配列番号２７に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   ・配列番号２７に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   ・配列番号２７に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または
   ・配列番号２７に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
   であり、
   および／または、
   前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素をコードする遺伝子が、
   ・配列番号２８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
   ・配列番号２８に示される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
   ・配列番号２８に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
   ・配列番号２８に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または
   ・配列番号２８に示される塩基配列の縮重異性体からなるＤＮＡ
   である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換え微生物。
5. 前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素がＥＣ １．２．１．８８で表わされる酵素から選択され、および／または
   前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素がＥＣ １．５．１．２で表わされる酵素から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え組成物。
6. 前記ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸脱水素酵素活性を有するタンパク質であり、
   および／または、
   前記ピロリン−５−カルボン酸還元酵素が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、ピロリン−５−カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換え微生物。
7. 前記微生物が、エシェリヒア属である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え微生物。
8. 前記微生物が、エシェリヒア コリである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え微生物。
9. 前記グルタミン酸−５−リン酸合成酵素が、
   ・配列番号２９に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、または、
   ・配列番号２９に示される塩基配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡであって、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
   によりコードされる、請求項２〜８のいずれか１項に記載の組換え微生物。
10. 配列番号２５に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の組換え微生物。
11. 配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対し、
    １０７番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基への置換、
    １１７番目のアラニン残基のバリン残基への置換、および
    １４３番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換
    を含むアミノ酸配列に対して８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の組換え組成物。
12. 配列番号２５に示されるアミノ酸配列に対し、
    １０７番目のアスパラギン酸残基のアスパラギン残基への置換、
    １１７番目のアラニン残基のバリン残基への置換、および
    １４３番目のグルタミン酸残基のリジン残基への置換
    からなる群から選択される１以上の変異を有し、かつ、グルタミン酸−５−リン酸合成酵素活性を有するタンパク質を生産する、請求項２〜１１のいずれか１項に記載の組換え組成物。
13. 前記グルタミン酸−５−リン酸合成酵素をコードする遺伝子が、グルタミン酸−５−セミアルデヒド還元酵素をコードする遺伝子とのオペロンとして含まれる、請求項２〜１２のいずれか１項に記載の組換え組成物。
14. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、グルタミン酸−５−セミアルデヒドの製造方法。
15. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、ピロリン−５−カルボン酸の製造方法。
16. 請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え微生物を培養することを含む、Ｌ−ピログルタミン酸の製造方法。

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