JP2020529992A - 心外傷後の心機能を増強することができる皮質骨幹細胞由来のエキソソーム - Google Patents

心外傷後の心機能を増強することができる皮質骨幹細胞由来のエキソソーム Download PDF

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Abstract

本発明は、罹患した心臓に送達された際に、心臓修復を促進するための、皮質骨幹細胞（ＣＢＳＣ）由来のエキソソームの単離された集団、及びエキソソーム及び/又はそのＲＮＡを含む組成物を提供する。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願との相互参照
本出願は、２０１７年８月１日に出願された米国仮出願６２／５３９，６１２号の優先権を主張し、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
心筋梗塞（ＭＩ）を含む心臓の虚血傷害は、構造的及び機能的なリモデリング（Pfeffer et al., 1990, Circulation 81:1161-1172）につながり、多くの場合、心不全に至る（Gomez et al., 2001, Circulation 104:688-693）主要な健康問題である。ＭＩ患者の予後を改善するために、損傷した心臓組織を修復又は交換するための新規治療法が必要である。幹細胞療法は、虚血傷害後の心臓を修復する可能性を有する。
幹細胞を介して心臓修復のメカニズムは、解明されていない。動物モデルの多くの前臨床研究は、注入された細胞の新しい心筋細胞への分化が、この修復のメカニズムの１つである可能性を示している（Smith et al., 2007, Circulation 115:896-908; Orlic et al., 2001, Nature 410:701-705; Rota et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:17783-17788）。自身の心臓（Beltrami et al., 2003, Cell 114:763-776; Tang et al., 2010, Circulation 121:293-305; Rota et al., 2008, Circ Res 103:107-116; Smith et al., 2007, Circulation 115:896-908）又は骨髄由来幹細胞（Orlic et al., 2001, Nature 410:701-705; Rota et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA 104:17783-17788）の移植、人工多能性幹細胞（Mauritz et al., 2008, Circulation 118:507-517; Zhang et al., 2009, Circ Res 104:e30-41; Zwi et al., 2009, Circulation 120:1513-1523）の移植、及び内因性非幹細胞の心原生表現型への直接的なプログラミング（Qian et al., 2012, Nature 485:593-598; Song et al, 2012, Nature 485:599-604）により、傷害後の心機能を改善できることが研究により示されている。しかしながら、このアプローチの主な制限として、提供された幹細胞集団の増殖、生存及び分化能力の低下及び宿主環境内で統合する細胞の能力の低下が挙げられる。
従って、当該技術分野において、心臓修復を増強するための無細胞治療法に関する組成物及び方法が必要である。本発明は、上記必要性を満たすためのものである。
一態様において、本発明は、単離された皮質骨幹細胞（ＣＢＳＣ）由来のエキソソームを含む、対象における心血管疾患又は障害を治療するための組成物を提供する。
一実施形態において、エキソソーム組成物は、少なくとも１つのＲＮＡ分子をさらに含む。
一実施形態において、エキソソーム組成物のＲＮＡ分子は、以下の群から選択される少なくとも１つである： ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
他の態様において、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、対象における心血管疾患又は障害を治療するための組成物を提供する。
一実施形態において、ＲＮＡ分子は、以下の群から選択される少なくとも１つである：ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
一態様において、本発明は、対象における心血管疾患又は障害の少なくとも１つを治療する方法であって、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム及びＲＮＡ分子の群から選択される少なくとも１つを含む組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む方法、を提供する。
一実施形態において、当該発明のＲＮＡ分子は、以下の群から選択される少なくとも１つである： ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
一実施形態において、前記心血管疾患は、心筋損傷である。
一実施形態において、前記心筋損傷は、以下の群から選択される少なくとも１つである：動脈疾患、アテローム、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈疾患、不整脈、狭心症、うっ血性心疾患、虚血性心筋症、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、大動脈瘤、心臓心膜炎、感染症、炎症、弁閉鎖不全症、血管凝固欠陥、及びそれらの組み合わせ。
一実施形態において、前記組成物は、以下の群： 直接注射、静脈注入、及び動脈注入、から選択される少なくとも１つにより前記対象に投与される。
一実施形態において、本発明の組成物は、医薬的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む。
本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより理解されるであろう。本発明は、図面に示す実施形態の正確な取り決め及び手段に限定されないことを理解されたい。
図１Ａ〜図１Ｊを含む図１は、ＣＢＳＣから単離されたエキソソームを実証する例示的な実験結果を示す。図１Ａは、培養中の骨由来幹細胞を示す。図１Ｂは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームの顕微鏡写真を示し、典型的な形態及びサイズ＜１００ｎｍを示す。図１Ｃは、小胞サイズのサイズ範囲を確認する動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。図１Ｄ〜図１Ｆは、新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）のタネル染色を示す一連の画像である。図１Ｄは、未処理のＮＲＶＭでのタネル染色を示す。図１Ｅは、アポトーシス障害に曝されたＮＲＶＭのタネル染色を示す。図１Ｆは、ＣＢＳＣに由来するエキソソームで前処理され、アポトーシス攻撃に曝されたＮＲＶＭを示す。図１Ｇは、図１Ｄ〜図１Ｆの結果を定量化したものである。 図１Ａ〜図１Ｊを含む図１は、ＣＢＳＣから単離されたエキソソームを実証する例示的な実験結果を示す。図１Ａは、培養中の骨由来幹細胞を示す。図１Ｂは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームの顕微鏡写真を示し、典型的な形態及びサイズ＜１００ｎｍを示す。図１Ｃは、小胞サイズのサイズ範囲を確認する動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。図１Ｄ〜図１Ｆは、新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）のタネル染色を示す一連の画像である。図１Ｄは、未処理のＮＲＶＭでのタネル染色を示す。図１Ｅは、アポトーシス障害に曝されたＮＲＶＭのタネル染色を示す。図１Ｆは、ＣＢＳＣに由来するエキソソームで前処理され、アポトーシス攻撃に曝されたＮＲＶＭを示す。図１Ｇは、図１Ｄ〜図１Ｆの結果を定量化したものである。 図１Ａ〜図１Ｊを含む図１は、ＣＢＳＣから単離されたエキソソームを実証する例示的な実験結果を示す。図１Ａは、培養中の骨由来幹細胞を示す。図１Ｂは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームの顕微鏡写真を示し、典型的な形態及びサイズ＜１００ｎｍを示す。図１Ｃは、小胞サイズのサイズ範囲を確認する動的光散乱（ＤＬＳ）を示す。図１Ｄ〜図１Ｆは、新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）のタネル染色を示す一連の画像である。図１Ｄは、未処理のＮＲＶＭでのタネル染色を示す。図１Ｅは、アポトーシス障害に曝されたＮＲＶＭのタネル染色を示す。図１Ｆは、ＣＢＳＣに由来するエキソソームで前処理され、アポトーシス攻撃に曝されたＮＲＶＭを示す。図１Ｇは、図１Ｄ〜図１Ｆの結果を定量化したものである。 図２Ａ〜図２Ｆを含む図２は、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム移植が、心筋損傷後に機能的な有益性を有することを実証する例示的な実験結果を示す。図２Ａは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物での心エコー検査により測定された駆出率のパーセンテージの分析を示す。図２Ｂは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物での心エコー検査により測定された短縮率のパーセンテージの分析を示す。図２Ｃは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の梗塞の画像を示す。図２Ｄは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の梗塞サイズの割合の分析を示す。図２Ｅは、ＭＩの２日後のタネル染色細胞の画像を示す。図２Ｆは、ＭＩの２日後のタネル染色細胞の定量化を示す例示的な結果を示す。親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物との間で、心機能の有意な差は確認されなかった。 図２Ａ〜図２Ｆを含む図２は、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム移植が、心筋損傷後に機能的な有益性を有することを実証する例示的な実験結果を示す。図２Ａは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物での心エコー検査により測定された駆出率のパーセンテージの分析を示す。図２Ｂは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物での心エコー検査により測定された短縮率のパーセンテージの分析を示す。図２Ｃは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の梗塞の画像を示す。図２Ｄは、親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の梗塞サイズの割合の分析を示す。図２Ｅは、ＭＩの２日後のタネル染色細胞の画像を示す。図２Ｆは、ＭＩの２日後のタネル染色細胞の定量化を示す例示的な結果を示す。親細胞で処理された動物及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物との間で、心機能の有意な差は確認されなかった。 図３は、親細胞で処理された動物及びＭＩの移植後６週間でＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物における梗塞サイズを示す画像を示す。 図４は、エキソソームを注射されたマウスの血管密度が増加していることを示す画像を示す。 図５Ａ〜図５Ｄを含む図５は、ＣＢＳＣ及びエキソソーム由来のＣＢＳＣが、心外傷後の自然免疫応答を調節することを実証する例示的な実験結果を示す。図５Ａは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の境界部における抗炎症因子のｍＲＮＡ発現分析を示す。図５Ｂは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物における抗炎症因子の例示的な血清分析を示す。図５Ｃは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物におけるＣＤ８６の組織学的分析を示す。図５Ｄは、図５Ｂの血清分析の定量化を示す。 図５Ａ〜図５Ｄを含む図５は、ＣＢＳＣ及びエキソソーム由来のＣＢＳＣが、心外傷後の自然免疫応答を調節することを実証する例示的な実験結果を示す。図５Ａは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の境界部における抗炎症因子のｍＲＮＡ発現分析を示す。図５Ｂは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物における抗炎症因子の例示的な血清分析を示す。図５Ｃは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物におけるＣＤ８６の組織学的分析を示す。図５Ｄは、図５Ｂの血清分析の定量化を示す。 図５Ａ〜図５Ｄを含む図５は、ＣＢＳＣ及びエキソソーム由来のＣＢＳＣが、心外傷後の自然免疫応答を調節することを実証する例示的な実験結果を示す。図５Ａは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の境界部における抗炎症因子のｍＲＮＡ発現分析を示す。図５Ｂは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物における抗炎症因子の例示的な血清分析を示す。図５Ｃは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物におけるＣＤ８６の組織学的分析を示す。図５Ｄは、図５Ｂの血清分析の定量化を示す。 図５Ａ〜図５Ｄを含む図５は、ＣＢＳＣ及びエキソソーム由来のＣＢＳＣが、心外傷後の自然免疫応答を調節することを実証する例示的な実験結果を示す。図５Ａは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ由来のエキソソームで処理された動物の境界部における抗炎症因子のｍＲＮＡ発現分析を示す。図５Ｂは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物における抗炎症因子の例示的な血清分析を示す。図５Ｃは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣエキソソーム処理動物におけるＣＤ８６の組織学的分析を示す。図５Ｄは、図５Ｂの血清分析の定量化を示す。 図６Ａ〜図６Ｇを含む図６は、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓における心臓免疫応答を調節することによりＣＢＳＣエキソソームが心臓機能を高めることを実証する例示的な実験結果を示す。図６Ａは、心臓免疫細胞の単離方針を示す図を示す。図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの７日後のＣＢＳＣ由来エキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における全血球増殖性のマーカーの発現の分析を示す。図６Ｃは、ＭＩから７日後に動物に投与されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｄは、ＭＩの７日後にＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。図６Ｅは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水をされた動物における全血球増殖性のマーカーＣＤ４５の発現の分析を示す。図６Ｆは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｇは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。 図６Ａ〜図６Ｇを含む図６は、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓における心臓免疫応答を調節することによりＣＢＳＣエキソソームが心臓機能を高めることを実証する例示的な実験結果を示す。図６Ａは、心臓免疫細胞の単離方針を示す図を示す。図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの７日後のＣＢＳＣ由来エキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における全血球増殖性のマーカーの発現の分析を示す。図６Ｃは、ＭＩから７日後に動物に投与されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｄは、ＭＩの７日後にＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。図６Ｅは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水をされた動物における全血球増殖性のマーカーＣＤ４５の発現の分析を示す。図６Ｆは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｇは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。 図６Ａ〜図６Ｇを含む図６は、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓における心臓免疫応答を調節することによりＣＢＳＣエキソソームが心臓機能を高めることを実証する例示的な実験結果を示す。図６Ａは、心臓免疫細胞の単離方針を示す図を示す。図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの７日後のＣＢＳＣ由来エキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における全血球増殖性のマーカーの発現の分析を示す。図６Ｃは、ＭＩから７日後に動物に投与されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｄは、ＭＩの７日後にＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。図６Ｅは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水をされた動物における全血球増殖性のマーカーＣＤ４５の発現の分析を示す。図６Ｆは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｇは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。 図６Ａ〜図６Ｇを含む図６は、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓における心臓免疫応答を調節することによりＣＢＳＣエキソソームが心臓機能を高めることを実証する例示的な実験結果を示す。図６Ａは、心臓免疫細胞の単離方針を示す図を示す。図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの７日後のＣＢＳＣ由来エキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における全血球増殖性のマーカーの発現の分析を示す。図６Ｃは、ＭＩから７日後に動物に投与されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｄは、ＭＩの７日後にＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。図６Ｅは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水をされた動物における全血球増殖性のマーカーＣＤ４５の発現の分析を示す。図６Ｆは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｇは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。 図６Ａ〜図６Ｇを含む図６は、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓における心臓免疫応答を調節することによりＣＢＳＣエキソソームが心臓機能を高めることを実証する例示的な実験結果を示す。図６Ａは、心臓免疫細胞の単離方針を示す図を示す。図６Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの７日後のＣＢＳＣ由来エキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における全血球増殖性のマーカーの発現の分析を示す。図６Ｃは、ＭＩから７日後に動物に投与されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｄは、ＭＩの７日後にＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。図６Ｅは、ＦＡＣＳにより測定された、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水をされた動物における全血球増殖性のマーカーＣＤ４５の発現の分析を示す。図６Ｆは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ２０６の発現を示す。図６Ｇは、ＭＩの１４日後のＣＢＳＣ由来のエキソソーム及び生理食塩水を投与された動物における定量化されたＣＤ８の発現を示す。 図７Ａ〜図７Ｄを含む図７は、心臓免疫応答がＣＢＳＣエキソソームによって調節されることを実証する例示的な実験結果を示す。図７Ａは、ＭＩの１４日後の心臓へのＣＢＳＣの移植後のＣＤ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｂは、ＭＩの１４日後に心臓へのＣＢＳＣの移植後のｆｏｘｐ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｃは、ＭＩの１４日後に心臓へのＣＢＳＣの移植後のｆｏｘｐ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｃは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｄは、ＭＩの１４日後の心臓へのＣＢＳＣ又はＣＢＳＣ外部移植後の定量化されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞を示す。 図７Ａ〜図７Ｄを含む図７は、心臓免疫応答がＣＢＳＣエキソソームによって調節されることを実証する例示的な実験結果を示す。図７Ａは、ＭＩの１４日後の心臓へのＣＢＳＣの移植後のＣＤ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｂは、ＭＩの１４日後に心臓へのＣＢＳＣの移植後のｆｏｘｐ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｃは、ＭＩの１４日後に心臓へのＣＢＳＣの移植後のｆｏｘｐ３＋細胞の発現の分析を示す。図７Ｃは、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の例示的なフローサイトメトリー分析を示す。図７Ｄは、ＭＩの１４日後の心臓へのＣＢＳＣ又はＣＢＳＣ外部移植後の定量化されたＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞を示す。 図８Ａ及び図８Ｂを含む図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調節に対するＣＢＳＣエキソソームの能力を実証する例示的な実験結果を示す。図８Ａは、トランスウェルシステムでＣＢＳＣと共培養された骨髄から単離されたマクロファージ（ＢＭＤＭФ）の炎症誘発因子の分析を示す。図８Ｂは、ＬＰＳ処理と比較したＣＢＳＣ培地で処理したＢＭＤＭФの食作用のレベルの分析を示す。 図８Ａ及び図８Ｂを含む図８は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調節に対するＣＢＳＣエキソソームの能力を実証する例示的な実験結果を示す。図８Ａは、トランスウェルシステムでＣＢＳＣと共培養された骨髄から単離されたマクロファージ（ＢＭＤＭФ）の炎症誘発因子の分析を示す。図８Ｂは、ＬＰＳ処理と比較したＣＢＳＣ培地で処理したＢＭＤＭФの食作用のレベルの分析を示す。 図９Ａ及び図９Ｂを含む図９は、エキソソームにおける異なるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現を実証する例示的な実験結果を示す。図９Ａは、対応するＣＢＳＣと比較したＣＢＳＣ由来のエキソソームでのｍｉＲの発現を示す。図９Ｂは、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び皮質骨由来幹細胞（ＣＢＳＣ）に由来するエキソソームのｍｉＲの比較を示す（濃い灰色が高い発現、薄い灰色が低い発現である）。 図９Ａ及び図９Ｂを含む図９は、エキソソームにおける異なるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現を実証する例示的な実験結果を示す。図９Ａは、対応するＣＢＳＣと比較したＣＢＳＣ由来のエキソソームでのｍｉＲの発現を示す。図９Ｂは、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）及び皮質骨由来幹細胞（ＣＢＳＣ）に由来するエキソソームのｍｉＲの比較を示す（濃い灰色が高い発現、薄い灰色が低い発現である）。 図１０Ａ〜図１０Ｃを含む図１０は、ＭＩ後及びＭＩ後１か月のミニブタにおける治療の分析を実証する例示的な実験結果を示す。図１０Ａは、プラセボ処理されたミニブタのベースラインでのＮＯＧＡマップを示す。図１０Ｂは、ＣＢＳＣ処理されたミニブタのベースラインでのＮＯＧＡマップを示す。図１０Ｃは、ＣＢＳＣで処理した動物が、プラセボ治療群と比較して、ＭＩ後１か月で痕跡サイズを有意に減少させたことを示す実験結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、皮質骨由来幹細胞（ＣＢＳＣ）由来のエキソソーム及びそれに由来する組成物を手供する。一実施形態において、エキソソームが由来する細胞は、多能性である。他の実施形態において、エキソソームが由来する細胞は、心筋細胞に分化することができる。本発明はまた、心疾患の治療においてＣＢＳＣ由来のエキソソームを使用する方法を含む。
本発明は、誘導された心筋梗塞（ＭＩ）の境界部に注射されたＣＢＳＣ由来のエキソソームが、心臓の構造、機能、及び生存の著しい改善をもたらしたという発見に部分的に基づく。ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、内因性血管形成の引き金となる要因を提供することにより、ＭＩ後のＭＩ境界部で血管新生を促進した。加えて、ＭＩ境界部に注射されたＣＢＳＣ由来のエキソソームは、細胞の注射の領域の心機能を増強する新規な機能的に成熟した心筋細胞に分化した。
一実施形態において、本発明は、皮質骨由来幹細胞（例えば、ＣＢＳＣ）に由来するエキソソームの新規集団を提供し、それによって、細胞は、ｃ−ｋｉｔ＋及びＳｃａ１＋であり得るが、造血系マーカーを発現し得ない。一実施形態において、ＣＢＳＣによるｃ−ｋｉｔの発現は、その後の培養後に減少する。しかしながら、ＣＢＳＣは、限定されないが、ＣＤ２９、Ｓｃａ−１、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ７３、ＣＤ４４、ＣＤ２７１及びＣＤ９０を含む継代培養の初期から最後まで他の全てのシグネチャーマーカーを発現し続けることができる。ＣＢＳＣは、限定されないが、ＣＤ４５、及びＣＤ１１ｂを含む造血系統マーカーに対して陰性のままである可能性がある。
他の実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、虚血性心臓に注射されると機能することができ、成熟機能を有する心筋細胞の産生を促進し、内因性の修復を促進する因子を提供する可能性を有する。
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されることと同じ意味を有する。
本明細書で用いられているように、以下の各用語は、このセクションでそれに付随する意味を有する。
冠詞「ａ」及び「ａｎ］は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は１より多い要素を意味する。
本明細書で使用される「約」とは、一時的期間等の測定可能な値を示す場合、±２０％、±１０％、±５％、±１％、又は±０．１％の変動を、そのような変動が、開示された方法を実施するために適切であるため、包含することを意味する。
「異常（ａｂｎｏｒｍａｌ）」という用語は、生物、組織、細胞又はその成分の意味で使用される場合、「正常な」（期待される）それぞれの特性を示す生物、組織、細胞又はその成分と少なくとも１つ観察可能又は検出可能な特性（例えば、年齢、治療、時刻等）が異なる生物、組織、細胞又はその成分を指す。ある細胞又は組織タイプで正常又は期待される特定は、異なる細胞又は組織タイプでは異常である可能性がある。
「バイオリアクター」という用語は、当該技術分野での通常の意味、すなわち、バイオプロセスを実行するために使用される装置を意味するものとする。本明細書に記載のバイオリアクターは、ＣＢＳＣ培養での使用に適している。細胞培養のシンプルなバイオマーカーは、一般的に使用されるＴ−１７５フラスコ等の単一コンパートメントフラスコである。当該技術分野で知られているように、バイオリアクターは、複数のコンパートメントを持つことができる。これらの複数のコンパートメントを有するバイオリアクターは、通常、細胞を含むコンパートメントを気体及び／又は培養培地を含む１つ以上のコンパートメントから分離する１つ以上の膜又は障壁によって分離された少なくとも２つのコンパートメントを含む。複数コンパートメントを有するバイオリアクターは、当該技術分野で周知である。複数コンパートメントを有するバイオリアクターの例は、Ｉｎｔｅｇｒａ ＣｅＬＬｉｎｅバイオリアクターである。これは、１０ｋＤａの半透膜によって分離された培地コンパートメント及び細胞コンパートメントが含まれる； この膜により、阻害性廃棄物を同時に除去しながら、細胞コンパートメントへの栄養素の連続的な拡散が可能になる。コンパートメントの個々のアクセス性により、培養に機械的に干渉することなく細胞に新鮮な培地を供給することが可能である。シリコン膜は、細胞コンパートメントのベースを形成し、細胞コンパートメントへの短い拡散通路を提供することにより、最適な酸素供給及び二酸化炭素レベルの制御を付与する。何れかの適切な複数のコンパートメントを有するバイオリアクターが用いられ得る。
「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」とは、心臓を構成する細胞を指し、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ）としても知られる。「筋芽細胞」は、短角の未分化筋肉前駆細胞である。
本明細書で使用される「心血管病状、疾患又は障害」という語句は、例えば、虚血性心筋症、高血圧性心疾患及び肺高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患及び対象、特にヒト対象のうっ血性心不全を引き起こす何れかの病状等の不十分な、望ましくない、又は異常な心機能を特徴とする全ての障害を含むことを意図する。不十分又は異常な心機能は、疾患、障害及び／又は加齢の結果である可能性がある。背景として、心筋損傷への反応は、明確に定義された経路に従い、これは、いくつかの細胞が死滅する一方で、他の細胞は未だ死滅していないが機能していない冬眠状態に入る。これに続いて、炎症細胞の浸潤、痕跡の一部としてコラーゲンの沈着が続いて起こり、これらは全て、新規血管の内殖及びある程度の継続した細胞死と並行して起こる。本明細書で使用される場合、「虚血」という用語は、血液流入の減少による局所的な組織虚血を指す。「心筋虚血」という用語は、冠状動脈アテローム性硬化症及び／又は心筋への不十分な酸素供給によって引き起こされる循環障害を指す。例えば、急性心筋梗塞は、心筋組織への不可逆的な虚血性障害を表す。この損傷の結果は、冠循環における閉塞性イベント（血栓性又は塞栓性）に起因し、心筋の代謝要求が、心筋組織への酸素の供給を超える環境を作り出す。
「細胞」及び「細胞の集団」という用語は、交換可能に使用され、複数の細胞、すなわち２つ以上の細胞を指す。集団は、１つの細胞タイプを含む純粋な集団であり得る。あるいは、集団は、複数の細胞タイプを含み得る。本発明において、細胞集団に含まれ得る細胞タイプの数に制限はない。
本明細書で使用される「中胚葉（又は外胚葉又は内胚葉）系統に分化する細胞」は、それぞれ、特定の中胚葉、外胚葉又は内胚葉系統に関与するようになる細胞を定義する。中胚葉系統に分化する又は特定の中胚葉細胞を生じさせる細胞の例は、限定されないが、脂肪生成細胞、軟骨形成細胞、心原生細胞、原表皮細胞、造血性細胞、血管新生細胞、筋原生細胞、腎原生細胞、泌尿生殖器原生細胞、骨原生細胞、心臓形成細胞、又は間質性細胞を含む。外胚葉系統に分化する細胞の例は、限定されないが、表皮細胞、神経細胞、及び神経膠細胞を含む。内胚葉系統に分化する細胞の例は、限定されないが、胸膜形成細胞、及び肝性細胞、腸の内層を生じさせる細胞、膵臓形成細胞及び内臓形成細胞を生じさせる細胞を含む。
本明細書で使用される「順化培地」は、特定の細胞又は細胞集団が培養され、その後除去される培地を定義する。細胞は、前記培地で培養される間、限定されないが、ホルモン、サイトカイン、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、タンパク質、小胞、抗体、及び顆粒等を含む細胞因子を分泌する。培地に細胞因子を加えたものが順化培地である。
本明細書で使用される「分化した」とは、細胞が完全に発達し、特定の環境及び／又は機能への生物学的特殊分化及び／又は適応を実証するように、成熟の最終状態を達成した細胞を指す。典型的に、分化した細胞は、その細胞の分化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現によって特徴付けられる。本明細書でその用語が使用されているように、細胞が「分化している」と言われる場合、その細胞は、分化の過程にある。
本明細書で使用される「分化培地」は、幹細胞、脂肪由来の生体間質細胞又は他のそのような前駆細胞、すなわち、培地でインキュベートしても完全には分化しない細胞が分化細胞の特徴の一部又は全てを備えた細胞に発達するような添加物を含む細胞増殖培地又は添加物を欠く細胞増殖培地を指す。
「由来する」という用語は、特定の供給源に由来することを意味するために本明細書で用いられる。
「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができない動物の健康状態、及び疾患が改善されない場合、動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態を指す。
対照的に、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持できる健康状態であるが、動物の健康状態が、障害が無い場合より不利な状態を指す。治療せずに放置すると、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
疾患又は障害の症状の重症度、患者がそのような症状を経験する頻度、又はその両方が軽減される場合、疾患又は障害は「緩和」される。
化合物の「有効量」又は「治療有効量」とは、化合物が投与される対象に対して有益な効果を提供するために十分な化合物の量である。送達ビヒクルの「有効量」は、化合物を効果的に結合又は送達するために十分な量である。
本明細書で用いられる「成長因子」とは、限定されないが、以下を含む非限定的な因子を意図する：成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテジェリンリガンド、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、及びピコグラム／ｍｌ〜ミリグラム／ｍｌの間の濃度の骨形成タンパク質。
本明細書で使用される「増殖培地」という用語は、細胞の増殖を促進する培養培地を指すことを意味する。増殖培地は、一般に動物の血清を含む。場合によって、増殖培地は、動物の血清を含まない場合がある。
「単離された細胞」とは、他の成分及び／又は組織又は哺乳動物の単離された細胞に付随し得る細胞から分離された細胞を指す。
本明細書で使用される、細胞の「系統」は、細胞の遺伝を定義する、すなわち、それがどの細胞由来か、どの細胞を生じさせられ得るか。細胞の系統は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に置かれる。
「微粒子」という用語は、当該技術分野で公知であり、膜粒子、膜小胞、微小胞、エキソソーム様小胞、エキソソーム、エクトソーム様小胞、エクトソーム又はエキソベシクルを含む多数の異なる種の微粒子を包含する。様々なタイプの微粒子は、直径、細胞内起源、ショ糖密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー及び分泌様式（すなわち、シグナル（誘導可能）又は自発的（構成的）に基づいて区別される。
「多系統幹細胞」又は「多能性幹細胞」とは、それ自体と異なる発達系統からの少なくとも二つのさらに分化した子孫細胞を再生する幹細胞を指す。系統は、同じ胚葉（すなわち、中胚葉、外胚葉、又は内胚葉）からのもの、又は異なる胚葉からのものであり得る。多系統幹細胞の分化から異なる発達系統を有する2つの子孫細胞の例は、筋原細胞及び脂肪生成細胞である（両方とも中胚葉起源であるが、異なる組織を生じる）。他の例は、神経原細胞（外胚葉起源）及び脂肪生成細胞（中胚葉起源）である。
本明細書で使用される「心筋損傷」又は「心筋に対する損傷」という用語は、心臓及び／又は血管に影響を及ぼす何れかの構造的又は機能的障害、疾患、又は病状を指す。心筋損傷の例は、限定されないが、動脈疾患、アテローム、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈疾患、不整脈、狭心症、うっ血性心疾患、虚血性心筋症、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、大動脈瘤、心臓心膜炎、感染症、炎症、弁閉鎖不全症、血管凝固欠陥、及びそれらの組み合わせ、を含むことができる。
本明細書で使用される「多能性細胞」は、少なくとも２つの異なる（遺伝子型及び／又は表現型）さらなる分化した子孫細胞を生じさせることができる低分化細胞を指す。
「前駆細胞」「祖先細胞」、及び「幹細胞」という法語は、当該技術分野及び本明細書で互換的に使用され、無数の有糸分裂が可能である可能性があり、自身を再生するか、又は所望の細胞型に分化する子孫細胞を産生する可能性がある多能性前駆細胞又は系統非拘束性前駆細胞の何れかを指す。多能性幹細胞とは異なり、系統に拘束された前駆細胞は、一般に、互いに表現型が異なる多数の細胞型を生じさせることができないと考えられている。代わりに、前駆細胞は、1つ又は場合によって２つの系統拘束性細胞タイプを生じさせる。
「増殖」は、本明細書では、特に細胞の同様の形態の複製又は増殖を指すために使用される。すなわち、増殖は、より多くの細胞の産生を包含し、とりわけ、単に細胞の数を数えること、細胞への３Ｈ−チミジンンの取り込みを測定すること、及び同様の方法により測定され得る。
「細胞周期の進行」は、細胞が有糸分裂及び／又は減数分裂を準備及び／又は入力するプロセスを指すために本明細書で使用される。細胞周期の進行には、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期の進行を含む。
細胞は、特定のバイオマーカーに対して「陽性」と特徴づけられる場合がある。バイオマーカーに対して陽性の細胞は、本発明の細胞が、特定のバイオマーカータンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸を発現する細胞である。
細胞は、特定のバイオマーカーに対して「陰性」と特徴づけられる場合がある。バイオマーカーに対して陰性の細胞は、本発明の細胞が、特定のバイオマーカータンパク質、又は前記タンパク質をコードする核酸を発現しない細胞である。
用語「患者」、「対象」、「個体」、及び同様のものは、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載の方法を受けることができる何れかの動物、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｓｉｔｕの何れかのその細胞を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、対象又は個体は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、細胞は、その本来の環境に存在する全ての細胞から単離されている場合、また、細胞の混合物中のその細胞の割合がその本来の環境で見られるよりも大きい場合、細胞は「精製された形態」で存在する。別の言い方をすれば、主題の細胞集団が、富化された目的の細胞集団を表す場合、他の細胞及び細胞タイプも富化集団に存在する場合であっても、細胞は「精製された形態」にあるとみなされる。混合された細胞集団の少なくとも約１０％、混合された細胞集団の少なくとも約２０％、混合された細胞集団の少なくとも約２５％、混合された細胞集団の少なくとも約３０％、混合された細胞集団の少なくとも約４０％、混合された細胞集団の少なくとも約５０％、混合された細胞集団の少なくとも約６０％、混合された細胞集団の少なくとも約７０％、混合された細胞集団の少なくとも約７５％、混合された細胞集団の少なくとも約８０％、混合された細胞集団の少なくとも約９０％、混合された細胞集団の少なくとも約９５％、混合された細胞集団の少なくとも約１００％、を含む場合、ただし、細胞が、精製前の集団で行ったよりも「精製された」集団内の総細胞集団の割合が大きいという条件で、細胞は精製されたとみなすことができる。この点で、「精製された」及び「富化された」という用語は、同義語とみなすことができる。
「自己再生」とは、それらが生じたものと同一の分化能を有する複性娘幹細胞を産生する能力を指す。本明細書で使用される同様の用語は、「増殖」である。
本明細書で使用される「幹細胞」は、それ自体及び／又はさらに分化した子孫細胞を産生することができる未分化細胞を指す。
本明細書で使用される「生体組織工学（ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とは、組織置換又は再構成で使用するためにｅｘ ｖｉｖｏで組織を生成するプロセスを指す。生体組織工学は、「再生医療（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」の例であり、細胞、遺伝子又は他の生物学的構成単位（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）を生物工学によって作製された材料及び技術と共に組み込むことによる、組織及び臓器の修復又は置換のアプローチを包含する。
範囲： この開示を通して、本発明の様々な態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する決められた制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、全ての取り得る部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６等の範囲の説明は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等、並びに例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６等のその範囲内の個々の数の部分範囲を具体的に開示しているものと見なされるべきである。これは、範囲の広さに関係なく適用される。
発明の詳細な説明
本発明は、心臓の疾患、障害、及び傷害の治療における治療的使用のためのエキソソームに関する。本発明はまた、心外傷の治療のための１つ以上のＲＮＡ分子の治療的使用に関する。一実施形態において、ＲＮＡ分子は、エキソソームに包み込まれる。一実施形態において、エキソソームは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームである。
特定の理論に拘束されることを望まないが、エキソソームは、直接的及び間接的なメカニズムを介してドナー細胞及びレシピエント細胞の間のビヒクルとして作用することにより、細胞間コミュニケーションにおいて役割を果たすと考えられている。直接的なメカニズムには、レシピエント細胞によるエキソソーム及びそのドナー細胞由来成分（タンパク質、脂質、核酸等）の取り込みが含まれ、その成分は、レシピエント細胞で生物学的活性を有する。間接的なメカニズムには、エキソソーム−レシピエント細胞表面の相互作用、及びレシピエント細胞の細胞内シグナル伝達の改変を含む。故に、エキソソームは、レシピエント細胞による１つ以上のドナー細胞由来の特性の獲得を媒介する場合がある。動物モデルにおける幹細胞療法の有効性にも関わらず、幹細胞は、宿主に生着しないようであることが観察されている。従って、幹細胞療法が効果的であるメカニズムは、解明されていない。特定の理論に拘束されることを望まないが、幹細胞によって分泌されるエキソソームは、これらの細胞の治療的有用性において役割を果たすため、それ自体治療的に有効であると考えられている。
一般的に、本発明のエキソソームは、単離されている。「単離された」という用語は、それが指すエキソソーム又はエキソソーム集団がその本来の環境内にないことを示す。エキソソーム又はエキソソーム集団は、周囲の細胞及び／又は組織から実質的に分離されている。いくつかの実施形態において、サンプルが、少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において少なくとも８５％、いくつかの実施形態において少なくとも９０％、及びいくつかの実施形態において少なくとも９５％のエキソソームを含む場合、エキソソーム又はエキソソーム集団は、周囲の細胞及び／又は組織から実質的に分離されている。言い換えると、サンプルが、約２５％未満、いくつかの実施形態において約１５％未満、及びいくつかの実施形態において約５％未満のエキソソーム以外の材料を含む場合、サンプルは、周囲の組織から分離される。そのようなパーセンテージの値は、重量パーセンテージを指す。この用語は、それらに起源する生物から取り除かれ、別々に存在するエキソソームを包含する。この用語は、それらに起源する生物から取り除かれ、その後、生物に再挿入されたエキソソームも包含する。再挿入された細胞を含む生物は、細胞が取り除かれたものと同じ生物でも異なる生物でもよい。
典型的に、エキソソームが生成される皮質骨幹細胞（ＣＢＳＣ）集団は、実質的に純粋なものである。本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、全細胞集団を構成する他の細胞に対して少なくとも約７５％、いくつかの実施形態において少なくとも約８５％、いくつかの実施形態において少なくとも約９０％、及びいくつかの実施形態において少なくとも約９５％純粋であるＣＢＳＣの集団を指す。例えば、ＣＢＳＣ集団に関して、この用語は、全細胞集団を構成する他の細胞と比較して、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％純粋なＣＢＳＣが存在することを意味する。言い換えると、「実質的に純粋」という用語は、その後の培養及び増幅の前に元の非増幅及び単離集団において、約２５％未満、いくつかの実施形態において約１５％未満、及びいくつかの実施形態において約５％未満の系統拘束細胞を含む本発明のＣＢＳＣ集団を指す。
ＣＢＳＣエキソソームは、脂質、タンパク質及び核酸を含む環境（ｍｉｌｉｅｕ）を典型的に囲む少なくとも１つの脂質二重層を含む。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及び／又はリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ）又はｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及び／又は核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）等の何れかのｍｉＲＮＡ前駆体であり得る。
ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、それが由来するＣＢＳＣの少なくとも１つの生物学的機能を保持する。保持される可能性のある生物学的機能には、心臓組織の再生を促進する能力が含まれる。一実施形態において、少なくとも１つの生物学的機能は、複数のコンパートメントを有するバイオリアクターで少なくとも１０週間、任意で２０週間以内に培養されたＣＢＳＣの機能である。あるいは、少なくとも１つの生物学的機能は、複数のコンパートメントを有するバイオリアクターで少なくとも１０週間、任意で２０週間以下の間培養されたＣＢＳＣ集団からＣＢＳＣ順化培地の機能であり得る。他の実施形態において、少なくとも１つの生物学的機能は、標準条件下で細胞培養フラスコにて培養されたＣＢＳＣの機能である。
一実施形態において、組成物のＲＮＡは、ｍｉＲ及び／又はｓｎｏＲＮＡである。他の実施形態において、ＲＮＡは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームに含まれており、そこから単離され得る。一実施形態において、心外傷の治療における治療的使用のためのｍｉＲ及び／又はｓｎｏＲＮＡを提供するエキソソームは、人工エキソソームである。
一実施形態において、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム、又はそれに由来するｍｉＲ及び／又はｓｎｏＲＮＡは、創傷修復、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ組織再生、組織移植、及び本発明のエキソソームによって提供されるｍｉＲ又はｓｎｏＲＮＡを必要とする他の方法に有用である。
一実施形態において、ＲＮＡは、以下の群から選択される少なくとも１つである：ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
特定の実施形態において、ＲＮＡは、以下の群から選択される少なくとも１つである：ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
一実施形態において、ＲＮＡは、１つ以上のｍｉＲＮＡ遺伝子ファミリーの１つ以上のメンバーを含む。一実施形態において、ＲＮＡは、以下の群から選択される少なくとも１つである：ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
一実施形態において、ＲＮＡは、以下の群から選択される少なくとも１つである：ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ。
一実施形態において、本発明は、ＣＢＳＣからの精製エキソソームの新規集団を提供する。
組成物
本発明は、単離されたＣＢＳＣ由来のエキソソーム、ＣＢＳＣ由来のエキソソームを含む組成物、及び少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む組成物を提供する。本組成物の単離されたＣＢＳＣ由来のエキソソームは、限定されないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、及びげっ歯類を含む何れかの哺乳動物の供給源から得られ得る。加えて、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、それらが投与される対象に関して自家又は異種であり得る。ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、必ずしもそうではないが、その後、ＣＢＳＣ由来のエキソソームが投与される対象から得られたＣＢＳＣに由来し得る。いくつかの実施形態において、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、患者以外の１人以上の固体から取得される（すなわち、異種ＣＢＳＣ由来のエキソソーム）。特定の実施形態において、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、２つ以上のドナーから得られたＣＢＳＣからのＣＢＳＣ由来のエキソソームのプールを起源とする。
一実施形態において、本明細書に記載の組成物中のＣＢＳＣ由来のエキソソームの濃度は、１０１個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０２個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０３個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０４個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０５個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０６個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０７個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０８個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０９個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０１０個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０１１個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０１２個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、１０１３個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い、又は１０１４個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬより高い場合がある。一実施形態において、本明細書に記載の組成物中のＣＢＳＣ由来のエキソソームの濃度は、１０１個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０２個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０３個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０４個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０５個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０６個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０７個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０８個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０９個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０１０個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０１１個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０１２個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、１０１３個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満、又は１０１４個のＣＢＳＣ由来のエキソソーム／μＬ未満の場合がある。
本明細書に記載の組成物のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、対象の治療に使用する前に様々な条件に供され得る。それらは、限定されないが、遠心分離及び濾過を含む何れかの適切な方法により、濃縮され得る。濃縮に加えて、生理食塩水又は他の適切な溶液で１回以上洗浄し、ＣＢＳＣ由来のエキソソームが精製され得る。同様に、それらは、周囲に液体培地をほとんど又は本質的に含まない、又はＣＢＳＣ由来のエキソソームと適合する安定剤又は他の物質を含む可能性のある適切な水性溶液又は緩衝液に懸濁された包み込まれた濃縮物として維持され得る。また、濾過製品から濾過又は調製され得、病原体を処理して、広範囲のウイルス及び細菌を不活性化することもでき、これは、輸血による感染のリスクを低減することを目的としたプロセスで、様々な用途で有用である。
遺伝子改変
他の実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、例えば、外因性（例えば導入）遺伝子（「導入遺伝子」）を発現するため、又は内因性遺伝子の発現を抑制するために、遺伝的に改変されたＣＢＳＣに由来し得る。この方法によれば、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、導入遺伝子を含む核酸を含む遺伝子導入ベクターに曝されたＣＢＳＣに由来し、導入遺伝子が細胞内で発現されるために適した条件下で核酸が細胞に導入される。導入遺伝子は一般に、適切なプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドを含む発現カセットであり得る。ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードすることができ、又は生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ又はリボザイム）をコードすることができる。遺伝子導入技術を使用して所定の導入遺伝子を送達することが望ましい場合、導入遺伝子配列は、一般的に公知である。
そのような遺伝子改変は、治療上の利益をもたらし得る。あるいは、遺伝子改変は、例えば、本発明の組成物を固体へ移植した後に、そのよう改変された細胞を追跡又は同定する手段を提供し得る。エキソソーム標的細胞の追跡には、移植された遺伝子改変細胞由来のエキソソームの機能の追跡を含む。遺伝子改変はまた、少なくとも第２の遺伝子を含み得る。第２の遺伝子は、例えば、選択可能な抗生物質耐性遺伝子又は他の選択可能なマーカーをコードし得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏでのＣＢＳＣの遺伝子改変のウイルス及び非ウイルスベクターの手段が含まれる。細胞への組成物（例えば、核酸及びタンパク質）の導入は、浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合等の当該技術分野で周知の方法によって実施され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの核酸及びポリペプチドの導入は、他の技術を使用して達成され得る。例えば、これは、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロテミン、又はラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマー等の高分子物質の使用によって達成され得る。核酸は、例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル、又はポリ（メチルメタクロレート）マイクロカプセルを使用するか、又はコロイド系を使用したコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセルに補足され得る。コロイド分散システムには、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む巨大分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、及び脂質ベースの系を含む。
種々の組成物を細胞に導入するためのリポソームは、当該技術分野で周知であり、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、リポフェクチン及びＤＯＴＡＰが含まれる（例えば、U.S. Pat. Nos. 4,844,904, 5,000,959, 4,863,740, and 4,975,282; and GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）。遺伝子両方に有用なピペラジンベースの両親媒性カチオン脂質も知られている（例えば、U.S. Pat. No. 5,861,397を参照）。カチオン脂質系も知られている（例えば、U.S. Pat. No. 5,459,127を参照）。ポリマー物質、マイクロカプセル、及びリポソーム等のコロイド分散系は、本明細書においては合わせて「小胞」と呼ばれることがある。
エキソソームは、それらを生成するＣＢＳＣの機能の少なくとも一部を保持し得る。従って、幹細胞（何れかの幹細胞タイプであり得、皮質骨幹細胞に限定されない）を操作して1つ以上の所望する機能（通常タンパク質又はｍｉＲの発現）を持たせることでエキソソームを設計することが可能である。通常、操作には、1つ以上の外因性のコーディング、非コーディング、又は調節核酸配列をＣＢＳＣに導入するための遺伝子操作が含まれる。例えば、ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦを含むエキソソームが望ましい場合、次いで、エキソソーム産生ＣＢＳＣが形質転換又はトランスフェクトされ得、（高レベルの）ＶＥＧＦ及び／又はｂＦＧＦを発現させることができ、これは次いで、そのＣＢＳＣによって産生されるエキソソームに組み込まれ得る。従って、本発明は、それらが産生される細胞に本来存在しない機能を含む、何れかの幹細胞タイプ由来のアドホックエキソソーム、すなわち、エキソソームは、1つ以上の外因性タンパク質又は核酸配列を含み得、これは、自然に発生せず、操作されている。
一実施形態において、培養されたＣＢＳＣの順化培地から単離又は精製されたエキソソームは、標的細胞で所望の機能を発揮することを意図する１つ以上の外因性核酸、脂質、タンパク質、薬物又はプロドラッグが充足される。これは、ＣＢＳＣの操作を必要とせず、外因性物質を任意にエキソソームに直接追加することも可能である。例えば、外因性核酸は、エレクトロポレーションによってエキソソームに導入され得る。次いで、エキソソームは、外因性物質のビヒクル又は担体として使用され得る。一実施形態において、それらを産生した細胞から単離されたエキソソームは、典型的にはエレクトロポレーションによって外因性ｓｉＲＮＡが充足され、１つ以上の異常な遺伝子をサイレンシングするために効果的に用いられ得るエキソソームを産生する。このようにして、エキソソームは、例えば心疾患の進行の内因性の阻害を増強又は補完することで、１つ以上の薬剤、典型的には治療薬又は診断薬を標的細胞に送達するためのビヒクルとして使用され得る。この例は、１つ以上の以上遺伝子をサイレンシングすることができる外因性ｓｉＲＮＡを含むＣＢＳＣエキソソームである。
本発明のエキソソームを得る方法
皮質骨細胞は、本発明のＣＢＳＣ由来エキソソームの供給源として使用され得る。一実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、心臓修復を促進することができる。一実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、筋形成を促進することができる。他の実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、血管新生を促進することができる。従って、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、傷害又は疾患に起因する損傷をうけた心臓組織を治療するために用いられ得る。本明細書で使用する治療という用語は、直接的又は間接的に修復、交換、増強、改善、救助、再増殖、又は再生することを含むことを当業者は理解するだろう。
エキソソームは、ＣＢＳＣ順化培地から単離され得る。「順化培地」（ＣＭ）は、ＣＢＳＣの増殖培地であり得、ＣＢＳＣの大量培養時の培養に使用され、必要に応じて使用前に適切な手段、例えば濾過により取り除かれ及び滅菌されている。
心疾患又は障害を治療することができるエキソソームは、十分な期間培養されたＣＢＳＣから単離される。従って、エキソソームを産生する１つの方法は、エキソソームが採取される前の十分な期間、例えば、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、少なくとも１３週間、少なくとも１４週間、少なくとも１５週間、及び任意に２０週間以内、複数のコンパートメントを有するバイオリアクターで細胞を培養することである。一実施形態において、ＣＢＳＣは、エキソソーム生産に適していると判断された期間、培養される。
エキソソームは、分子量、サイズ、形状、流体力学半径、組成、電荷、基質とリガンドの相互作用、電磁波の吸収又は散乱、又は生物活性に基づいて、他の培地成分から分離され得る。一実施形態において、適切なサイズのフィルター（例えば、１００Ｋ ＭＷＣＯフィルター）を使用して順化培地を濾過し、所望のエキソソームを分離する。任意に、濃縮された順化培地をサイズ排除クロマトグラフィーにかけることにより、エキソソームの単離の前に順化培地が濃縮される。次いで、目的のエキソソームを単離するためにＵＶ吸収画分が選択され得る。
様々な種類のエキソソームを、様々な単離手法及びパラメーターを使用して培地から単離することができる。例えば、エキソソームの小胞密度は、１．１３〜１．１９ｇ／ｍＬであり、１００，０００〜２００，０００ｇでの差動遠心分離及びショ糖勾配超遠心分離によって単離され得る。
典型的な生産方法は、以下を含む：ＣＢＳＣを培養し、順化培地を産生する； １５００ｒｐｍで遠心分離し細胞片を除去する； 限外濾過によりエキソソームを単離するか、又は１２０，０００ｇでの超遠心分離によりエキソソームを単離する； 及びＢＣＡタンパク質アッセイを使用してエキソソーム含有量を定量化する。
エキソソームを産生するための細胞は、比較的若く、例えば最大で対象の予想寿命の１／１０、１／５、１／３又は半分の年齢の対象から得ることができる。例えば、エキソソームは、最大、未満又は約１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、又は５０歳、又はそこから導き出される何れかの年齢又は範囲であるヒトから得られ得る。特定の態様において、エキソソームは、１歳未満又は１８歳未満のヒトから得られ得る。特定の態様において、エキソソームは、１８歳〜５０歳のヒトから得られ得る。ヒトは、治療される患者と同じであり得る。
さらに、いくつかの態様において、単離されたエキソソーム又はナノベシクル（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ再構成由来の人工的に操作されたエキソソーム）は、内因性のエキソソームを含み得るか又は核酸又はタンパク質分子等の外部から加えられた治療薬が充足され得る。核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｍＲＮＡ等のＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。特定の態様において、単離されたエキソソームは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせの１つ以上等のＲＮＡを含み得る。
エキソソームの産生株としての条件付き不死化幹細胞
本発明の一態様において、条件付き不死化幹細胞を使用してエキソソームが産生される。これらの条件付き不死化幹細胞は、典型的に皮質骨由来幹細胞であるが、例えば、造血幹細胞又は間葉系幹細胞等の何れかのタイプの幹細胞であり得る。従って、本明細書に記載されるように、条件付き不死化幹細胞を培養し、その細胞によって産生されたエキソソームを採取する工程を含む幹細胞エキソソームを産生する方法が提供される。条件付き不死化幹細胞は、当該技術分野で周知である。混同を避けるために、当該方法は、ＣＢＳＣの使用に限定されない。
エキソソーム分泌を誘導する方法
幹細胞によるエキソソームの産生を増加させることが可能である。皮質骨由来幹細胞に限定されず、何れかの幹細胞由来のエキソソームの産生に使用され得る当該利点は、幹細胞培養から得られるエキソソームの収率を向上させることができる。
幹細胞によるエキソソームの産生を増加させるための第１の技術は、典型的には１〜２５ｎｇの間、例えば、１０ｍｇ／ｍｌで、順化培地を取り除く前に、ＴＧＦ−β、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−αの１つ以上で幹細胞を処理することである。
幹細胞によるエキソソームの産生を増加させる第２の技術は、低酸素条件下で細胞を培養することである。低酸素条件下での細胞の培養は、当業者に周知であり、大気レベル未満のＯ２、すなわち、２１％未満のＯ２を有する雰囲気で細胞を培養することを含む。これは通常、酸素レベルを変更できるインキュベーターに細胞を置くことで実現する。低酸素培養は、典型的に、１０％未満のＯ２、より典型的には５％以下のＯ２、例えば、４％以下のＯ２、３％以下のＯ２、２％以下のＯ２、又は１％以下のＯ２を含む雰囲気での培養を含む。
幹細胞が産生するエキソソームの量は、複数のコンパートメントを有するバイオリアクターで幹細胞を培養するだけで大幅に増加され得る。この特性は、皮膚骨由来幹細胞に限定されず、一般的に全ての幹細胞の培養に適用される。従って、本発明の一態様は、複数のコンパートメントを有するバイオリアクターで培養されたＣＢＳＣからエキソソームを産生する方法を提供する。エキソソームが採取される細胞は、典型的に少なくとも１週間、典型的には少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日間、例えば、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間又はそれ以上、例えば少なくとも３週間、４週間、５週間、６週間以上培養される。治療用エキソソームを産生するために、エキソソームが採取される細胞は、１０週間超培養され得る。
治療法
本発明は、部分的には、ＣＢＳＣ由来のエキソソームが虚血性心臓に注射された際、アポトーシスを防ぎかつ、心筋修復を促進することに有効であるという発見に基づいている。
一実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、心筋修復、筋形成、血管形成、又はそれらの組み合わせを促進することができる。従って、本発明のエキソソームは、傷害又は疾患に起因する損傷を受けた心臓組織を治療するために使用され得る。本明細書で使用される治療という用語は、修復、置換、増強、改善、救助、再増殖、又は再生するを含むことを当業者は理解するだろう。
心血管疾患及び／又は障害は、限定されないが、心膜の疾患及び／又は障害、心弁膜症（すなわち、弁の不能、狭窄弁、リウマチ性心疾患、僧帽弁逸脱、大動脈弁逆流）、心筋（冠動脈疾患、心筋梗塞、心不全、虚血性心筋症、狭心症）、血管（すなわち、動脈硬化、動脈瘤）又は静脈（すなわち、静脈瘤、痔疾患）を含む。特定の実施形態において、心疾患は、限定されないが、冠動脈疾患（すなわち、動脈硬化、アテローム性動脈硬化症、及びその他の動脈、細動脈及び毛細血管の疾患、又は関連する訴え）、急性心筋梗塞、心筋梗塞の組織化、虚血性心筋症、不整脈、左心室拡張、塞栓、心不全、うっ血性心不全、心内膜下繊維症、左又は右心室肥大、及び心筋炎を含む。さらに、当業者は、心血管疾患及び／又は障害が、先天的欠陥、遺伝的欠陥、環境的要因（すなわち、食事の影響、ライフスタイル、ストレス等）、及び他の血管又は影響に起因する可能性があることを認識する。
一実施形態において、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、心血管疾患及び障害を治療するために用いられ得る。本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、損傷及び筋細胞アポトーシスを低減及び／又は最小化し、損傷後の心筋又は心臓血管の修復及び再生を促進することに寄与することができるいくつかの特性を有する。本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、例えば図２Ｂに概説されているように、特定のｍｉＲの発現レベルを増加させる可能性がある。
従って、本発明の一態様において、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、ドナーのＣＢＳＣに由来し、損傷又は変性した心筋又は他の心血管組織に対する治療的な利益を引き出すために使用される。患者は、医師又は他の臨床試験者によって実行される以下の手順の１つ以上によって、心筋の損傷又は疾患を評価するために査定され得る：患者の健康履歴、身体検査、及び限定されないがＥＫＧ、血清心臓酵素プロファイル、心エコー検査を含む客観的データ。
ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、心筋機能が損なわれる何れかの状況で患者に投与され得る。そのような状況の例は、限定されないが、とりわけ、急性心筋梗塞（心臓発作）、うっ血性心不全（治療又は移植への橋渡しとして）、及び冠動脈バイパス移植手術の補充を含む。エキソソームは、事前に採取され、凍結保存された状態で保管されるか、又は定義された必要時又はその前後に採取される。本明細書で開示されるように、エキソソームは、さらなる処理の有無に関わらず、エキソソームをさらに精製、改変、刺激、又はそうでなければ変更することで患者に投与され得るか、又は損傷組織に直接適用されるか、又は損傷組織に近接して適用される。
エキソソームは、意図する治療効果を強化、制御、又はそうでなければ方向付けるために添加剤と共に適用され得る。例えば、一実施形態において、抗体媒介性陽性及び／又は陰性選択を使用してエキソソームは、さらに精製され得、その集団を富化して有効性を高め、罹患率を減らし、又は手順を容易にすることができる。同様に、エキソソームは、移植されたエキソソームの運命を支持及び／又は方向付けることにより、ｉｎ ｖｉｖｏ組織操作を容易にする生体適合性マトリックスと共に適用され得る。
一実施形態において、本発明の方法は、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームの心筋内移植を含む。そのような治療方法は、例えば、急性心筋梗塞及び／又は他の虚血性又は血流再開に関連した傷害の後に、損傷した心筋を修復及び再生し、心機能を回復させることが可能である。方法は一般に、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームを含む組成物を心筋組織又は細胞と接触させることを含む。
方法の１つによれば、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームを含む組成物は、対象の心筋組織又は所望の部位に導入される。簡単に説明すると、この方法は、次のように実行され得る。本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、皮質骨細胞組織から単離される。一旦単離されると、本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームは、精製され得る。次いで、本発明の単離されたＣＢＳＣ由来のエキソソームは、例えば、医薬的に許容された賦形剤、担体又は希釈剤と共に本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームを含む組成物として製剤化され得る。次いで、そのように形成された組成物は、対象の心臓組織に導入され得る。対象は、通常、心臓の病状、疾患、又は障害を有する、又はそのリスクがあると診断されている。組成物の導入は、当該技術分野で一般的に知られている方法に従うことができる。例えば、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム組成物は、直接注射送達又はカテーテル送達により対象の心臓に投与され得る。ＣＢＳＣ由来のエキソソームの導入は、単回の場合又は医師によって選択された期間にわたり連続して行われる場合もある。対象の心臓へのＣＢＳＣ由来のエキソソーム移植の時間経過及び発生回数は、心臓組織の生成及び／又は再生を監視することによって決定され得、このような治療過程の評価方法は、主治医の行い得る範囲内である。
本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソームを導入され得る心臓組織は、限定されないが、心臓の心筋（心筋繊維、結合組織（子宮内膜）、神経線維、毛細血管、及びリンパ管を含む）；心臓の心内膜（内皮、結合組織、及び脂肪細胞を含む）； 心臓の心外膜（線維弾性結合組織、血管、リンパ管、神経線維、脂肪組織、及び扁平上皮細胞からなる中皮膜を含む）；及び心臓に見られる追加の結合組織（心膜を含む）、血管、リンパ管、脂肪細胞、前駆細胞（例えば、副集団前駆細胞）、及び神経組織、を含む。心筋繊維は、介在板で端と端がつながった、連続した心筋細胞の塊、又は「心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）」で構成される。これらの板には、２種類の細胞接合部位がある：横断部分に沿って伸びる拡張デスモソーム、及びその最大の伸長が縦断部分に沿うギャップ結合部。上記の各組織は、ＣＢＳＣ由来のエキソソームを個別に、又は他の組織と組み合わせてのどちらかで導入するための標的部位として選択され得る。
治療の必要性の決定は、通常、問題の心筋の欠陥、障害、又は傷害と一致する病歴及び身体検査によって評価される。治療の必要性が確認された対象は、損傷又は変性した心臓組織（すなわち、病的状態を示す心臓組織）と診断された対象を含む。心臓組織の損傷及び／又は編成の原因は、限定されないが、慢性心損傷、慢性心不全、傷害又は外傷に起因する損傷、心毒素に起因する損傷、放射線又は酸化フリーラジカルに起因する損傷、血流の減少による損傷、及び心筋梗塞（心臓発作等）が含まれる。一実施例において、本明細書に記載の方法による治療を必要とする対象は、心筋梗塞又は心不全から生じる変性心臓組織を伴うと診断される。対象は、限定されないが、哺乳類、爬虫類及び鳥類、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、トリ、及びヒトを含む動物であり得る。
本発明の方法は、疾患を効果的に治療又は予防するために、既存の心筋の治療法と組み合わせて容易に実施され得ると理解されるべきである。本発明の方法、組成物、及び装置は、非生物学的及び／又は生物学的薬物、手術、又は他の治療法による同時又は連続治療を含むことが可能である。
本明細書に記載の方法によるＣＢＳＣ由来のエキソソームの心臓移植を受ける対象は、通常、心臓の病状、疾患、又は障害を有する、又はそのリスクがあると診断されている。本発明の方法は、通常、異常な細胞／組織損傷に関連する障害、虚血障害、及び血流再開に関連する障害等の様々な障害の症状を緩和するために有用であり得る。例えば、当該方法は、心筋梗塞、慢性冠動脈虚血、動脈硬化、うっ血性心不全、拡張型心筋症、再狭窄、冠動脈疾患、心不全、不整脈、狭心症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、又は心筋肥大の症状を緩和することに有用である。病状、疾患、又は障害は、通常、標準的な方法論を使用して医師により診断及び／又は監視され得る。病状、疾患、又は障害の１つ以上症状の緩和は、組成物が、以下の症状の１つ以上を減少等の臨床的利益をもたらすことを示す：息切れ、体液貯留、頭痛、めまい、共通、左肩又は腕の疼痛、及び心室機能障害。
心臓細胞組織の損傷は、最終的な細胞死につながる可能性のある心臓タイプの特徴的な１つ以上の細胞機能の喪失を特徴とされる。例えば、心臓細胞の細胞損傷により、細胞の収縮機能が失われ、心臓組織の心室機能が失われる。虚血又は血流再開に関連した傷害は、組織の壊死及び瘢痕形成を生じる。傷害を受けた心筋組織は、例えば、心臓組織の壊死、瘢痕化、又は黄色の軟化によって定義される。傷害を受けた心筋組織は、心室機能欠陥、順方向心拍出量の低下、並びに心臓の周囲の内膜の炎症（心膜炎）等のいくつかの機械的合併症の１つ以上を引き起こす。従って、本明細書に記載の方法によって損傷した心筋組織を再生することは、組織の組織学的及び機能学的回復をもたらし得る。
本発明の方法は、対象における心臓組織の生成及び／又は再生を促進し、及び／又は心臓組織の内因性心筋再生を促進することが可能である。心臓組織の生成の促進は、一般に、心臓組織の成長及び／又は増殖の活性化、強化、促進、増加、誘導、開始、又は刺激することを含、並びに、心筋細胞の分化、成長、及び／又は増殖の活性化、増強、促進、増加、誘導、開始、又は刺激することを含む。従って、当該用語は、心臓組織生成の開始、並びに既に進行中の心臓組織の生成の促進又は強化を含む。分化は一般に、発生過程に細胞が構造的及び機能的に特化する細胞プロセスとして理解される。本明細書において使用される増殖及び成長は、一般に、心臓組織の質量、体積、及び／又は厚さの増加、並びに心臓組織細胞の直径、質量、又は数の増加を指す。生成という用語は、新規な心臓組織の生成及び心臓組織が以前に存在していた心臓組織の再生を含むと理解される。
本明細書に記載の治療方法から生じる、新規心臓組織の生成及び心臓組織の再生は、当該技術分野で公知の手順によって測定又は検出され得る。そのような手順は、限定されないが、心臓特異的タンパク質のウェスタンブロッティング、形態計測と組み合わせた電子顕微鏡、細胞増殖速度を測定するための簡単なアッセイ（トリパンブルー染色、プロメガ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）製ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ細胞生存率アッセイ、ＡＴＣＣ由来のＭＴＴ細胞増殖アッセイ、フルオレセイン二酢酸及びエチジウムブロマイド／ヨウ化プロピジウムでの分染法、ＡＴＰレベルの推定、フローサイトメトリー分析等を含む）、及び本明細書に開示される方法、分子手順、及びアッセイの何れかを含む。
一実施形態において、意図した利益のためにその部位へのエキソソームの直接投与が例示される。これは、心臓の外表面（心外膜）への直接注射、適切なカニューレの挿入による内表面（心内膜）からの心筋への直接注入、動脈又は静脈注入（逆流メカニズムを含む）、又は当該技術分野で終止の他の手段によって達成され得る。当業者に周知の投与経路は、限定されないが、静脈内、冠動脈内、心筋内、心外膜、心室内、後洞又は血管内を含む。
本明細書の何れかの箇所で開示されるように、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、静脈又は動脈注入（逆流注入を含む）による全身投与又は心臓への直接注射を含むいくつかの経路によって適用され得る。特に末梢静脈アクセスによる全身投与は、心臓の本来の潅流及び損傷部位を標的とするＣＢＳＣ由来のエキソソーム能力に依存する低侵襲性であるという利点がある。エキソソームは、１回の大量瞬時投与、ゆっくりした注入、又は数時間間隔で交互に適用する、又はエキソソームが適切に保存されていることを条件に数日又は数週間で注射され得る。エキソソームは、エキソソームの心臓への第１の通過が、バルーンを使用して心筋血流を管理することにより強化されるように、カテーテル挿入を使用しても適用され得る。末梢静脈アクセスの場合と同様に、エキソソームは、カテーテルから単一のボーラス又は複数の一定分量で注射され得る。エキソソームは、心外膜注射により心筋に直接適用され得る。これは、開胸手術（例えば、冠動脈バイパス移植手術等）又は心室補助装置の設置の状況で直接見ることができる状況下で使用され得る。針を備えたカテーテルを使用して、エキソソームを心内膜様式で心筋層に直接送達することができ、これにより、より侵襲性の低い直接適用手段が可能になる。
一実施形態において、送達経路は、標準的な末梢静脈カテーテル、中心静脈カテーテルを介した静脈内送達、又は肺動脈カテーテルを介した送達を含む。他の実施形態において、エキソソームは、冠動脈内経路を介して送達され、現在許容されている方法が利用可能である。エキソソームの流れは、患者の血管内にある遠位及び近位バルーンの連続的な膨張／収縮によって制御され得、それによって、細胞生着又は細胞治療作用を促進する一次的な流動が無い領域を作成する。他の実施形態において、エキソソームは、互換性のあるカテーテルの使用及び目的の標的組織を画像化又は検出する能力を必要とし得る心内鏡（心腔の内面）法により送達される。あるいは、エキソソームは、心外膜（心臓の外表面）法により送達される。この送達は、開胸手術時の直接的な視覚化、又は特殊なエキソソーム送達装置を必要とする胸腔鏡アプローチにより達成される。さらに、エキソソームは、単独で、又は上記アプローチの１つ以上と組み合わせて、以下の経路で送達され得る：皮下、筋肉内、舌下、逆流性冠動脈潅流、冠動脈バイパス装置、体外膜酸素化（ＥＣＭＯ）装置及び心膜開窓術を介する。
一実施形態において、エキソソームは、血管内大量瞬間投与又は時限式注入として患者に投与される。他の実施形態において、エキソソームは、患者に投与される前に人工又は天然の培地又は組織スキャフォールドに再懸濁され得る。
一実施形態において、エキソソーム送達療法の効果は、限定されないが、以下の臨床的手段の何れかによって実証される：心臓駆出率の増加、心不全の割合の減少、高速サイズの減少、関連する罹患率（肺浮腫、腎不全、不整脈）の減少、運動耐性又は他の生活の質の測定値の改善、及び死亡率の減少。エキソソーム療法の効果は、術後数日〜数週間又は数か月にわたり明らかになり得る。しかしながら、有益な効果は、手術後数時間で観察され、少なくとも数年間持続する場合がある。
治療方法は、約、少なくとも約、又は多くても約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４５、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５２５、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６２５、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７２５、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７７５、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８２５、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８７５、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９２５、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９７５、９８０、９９０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００ナノグラム（ｎｇ）、マイクログラム（μｇ）、ミリグラム（ｍｇ）、又はグラムのエキソソーム、又はその何れかの範囲の誘導物、を含む組成物を投与することを含み得る。上記数値は、ｎｇ／ｋｇ、ｍｇ／ｋｇ、又はｇ／ｋｇとして表される患者の体重に基づいて患者に投与され得る量、及びそれらの値から導き出される何れかの範囲であり得る。
あるいは、組成物は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５２５、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５７５、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６２５、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６７５、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７２５、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７７５、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８２５、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８７５、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９２５、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９７５、９８０、９９０、１０００ｎｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｍｌ、又はｇ／ｍｌ、又はそれらの値から導き出される何れかの範囲である、エキソソームの濃度を有し得る。
組成物は、患者に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、又はより多い回数、又はそこから導き出される何れかの範囲で投与（又は摂取）され得、それらは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、又は１、２、３、４、５、６、７日間、又は１、２、３、４、５週間、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月間、又はそれらの値から導き出される何れかの範囲で投与され得る。組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、又は１日６回（又はそこから導き出される何れかの範囲）及び／又は必要に応じて患者に投与され得ることが特に意図される。あるいは、組成物は、２、４、６、８、１２又は２４時間ごとに（又はそこから導き出される何れかの範囲で）患者に又は患者によって投与され得る。いくつかの実施形態において、患者は、疾患又は障害の症状を経験した後、患者は特定の期間又は特定の回数の投与で組成物が投与される。
特定の実施形態において、単離されたエキソソームは、１種類又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の異なるタイプのエキソソームを含み得る。エキソソームのタイプは、それらの組成、例えば、関心のある核酸及び／又はタンパク質又は効果のタイプによって特徴付けられ得る。
医薬組成物
本発明のＣＢＳＣ由来のエキソソーム、及び本発明のＲＮＡは、治療において有用であり、従って、単独又は組み合わせて医薬組成物として製剤化され得る。医薬的に許容される組成物は、典型的に、本発明のエキソソーム及び/又はＲＮＡに加えて、少なくとも１つの医薬的に許容される担体、希釈剤、ビヒクル及び/又は賦形剤を含む。適切な担体の例は、乳酸リンゲル溶液である。このような成分の詳細な説明は、以下の文献で提供される：Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. ２０版。
「医薬的に許容される」という語句は、合理的な利益／リスク比に見合った過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題又は合併症を伴わずヒト及び動物の組織と接触することに使用するための健全な医学的判断の範囲内である、化合物、材料、組成物、及び/又は剤形を指すために本明細書で用いられる。
組成物は、必要に応じて、少量のｐＨ緩衝剤も含み得る。担体は、米国ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．から市販されているＨｙｐｏｔｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）等の保存培地を含み得る。適切な医薬担体の例は、Ｅ Ｗ Ｍａｒｔｉｎの「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載される。そのような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体と共に、予防的又は治療的有効量の予防的又は治療的エキソソームを好ましくは精製形態で含む。製剤は、投与方法に適したものでなければならない。好ましい実施形態において、医薬組成物は、無菌であり、対象、好ましくは動物対象、より好ましくは哺乳動物対象、最も好ましくはヒト対象への投与に適した形態である。
本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらには、例えば、凍結乾燥製剤、液体溶液又は懸濁液、注射可能及び注入可能溶液等の半固体及び液体剤形が含まれる。医薬組成物は、注射可能であり得る。本発明のエキソソームの特定の利点は、それらが得られる幹細胞と比較して改善された堅牢性である。従って、エキソソームは、凍結乾燥等の幹細胞に適さない製剤化に供され得る。これは、本発明のＲＮＡ組成物の利点でもある。
本発明の方法、医薬及び組成物及びエキソソームは、心疾患及び/又は傷害の治療することのため、及び／又はこれら疾患及び障害に付随する1つ以上の症状の治療、調節、予防、及び／又は改善のために使用されることが例示される。
医薬組成物は、一般に水性形態である。組成物は、防腐剤及び／又は抗酸化剤を含み得る。
浸透圧を制御するために、医薬組成物は、ナトリウム塩等の生理学的塩を含むことが可能である。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、例示であり、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム及び塩化カルシウムが含まれ得る。
組成物は、1つ以上の緩衝液を含み得る。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液；トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液；又はクエン酸緩衝液、を含む。緩衝液は、通常、５〜２０ｍＭの範囲の濃度で含まれる。組成物のｐＨは、一般に５〜８の間であり、より典型的には６〜８の間、例えば６．５〜７．５の間、又は７．０〜７．８の間である。
組成物は、無菌であり得る。組成物は、グルテンを含まないことがあり得る。組成物は、非発熱性であり得る。
医薬組成物は、治療される疾患又は病状に応じて当業者に周知である何れかの適切な経路によって投与され得る。典型的な投与経路は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、頭蓋内、鼻腔内又は腹腔内を含む。心臓の障害の治療のための1つの選択肢は、エキソソーム又はＲＮＡを損傷又は疾患の部位に投与することである。
エキソソーム又はＲＮＡは、当業者に明らかであろう治療上又は予防上有効な用量で投与され得る。エキソソームの免疫原性が低い又は存在しないため、有害な免疫応答を誘発することなく反復投与を行うことが可能である。
本発明は、以下の実施例を参照することによりさらにより詳細に説明される。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に記載がない限り、限定することを意図したものではない。従って、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、本明細書で提供される開示の結果として明らかになるあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
さらなる説明を必要とすることなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な例を使用して、本発明を作製及び利用し、特許請求の範囲の方法を実施できると考えられる。従って、以下の実施例は、本開示の残りを何れかの形で限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１： ＣＢＳＣエキソソームの分離及び特性評価
内因性心筋、血管新生による心臓保護、及び修復を促進する内因性幹細胞の補充を増強するパラクリン因子の分泌は、幹細胞を介した心臓修復の可能性のあるメカニズムの1つである（Tang et al., 2010, Circulation 121:293-305; Rota et al., 2008, Circ Res 103:107-116; Zeng et al., 2007, Circulation 115:1866-1875; Li et al., 2012, J Am Coll Cardiol 59:942-953）。従って、パラクリン効果の主要部分であると思われるエキソソームは、治療薬としての細胞の使用に変わるものを提供する。
エキソソームは、３０〜１００ｎｍの小さな細胞外膜小胞であり、標的細胞の分子プロセスを調節する能力を有するため大きな関心を集めている（De Jong et al., 2014, Frontiers in Immunology, 5:608）。エキソソームは、親細胞及びそれらの環境条件に特異的であると思われる様々なｍｉＲ、他の非コードＲＮＡ及びタンパク質で富化され得る（Ung et al., 2014, Cancer Sci., 105(11):1384-92）。また、細胞及びそれらの微小環境との相互作用を媒介することが知られている（Wang et al., 2015, Oncotarget, 6(41):43992-4004）。エキソソーマルｍｉＲは、特に心筋梗塞（ＭＩ）及び心不全（ＨＦ）を含む心疾患における細胞間クロストークの重要なメディエーターである（Ibrahim et al., 2015, Annu Rev Physiol., 78:67-83）。
これらの実験で使用された材料及び方法について記載する。
ＣＢＳＣエキソソームの単離
ＣＢＳＣは、以前に報告されているように（Duran et al., 2013, Circ Res., 113(5):539-52; Mohsin et al., 2015, Circ Res., 117(12):1024-33）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離され、順化培地（基本培地＋エキソソームを含まないＦＢＳ）で維持された。スクロース勾配超遠心分離によりエキソソームが、ＣＢＳＣ培地から採取された（Khan et al., 2015, Circ Res., 117(1):52-64）。透過型電子顕微鏡及び動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、エキソソームのサイズが確認された（図１Ａ〜図１Ｃ）。
実験の結果を以下に記載する。
ＣＢＳＣに由来するエキソソームは、心筋細胞を細胞死誘導刺激から保護し、ＨＵＶＥＣＳの管形成を促進する
ＭＩ後の幹細胞が媒介する心機能の改善のメカニズムに関して、いくつかの重要な仮説が浮上している（Baraniak et al., 2010, Regen Med., 5(1):121-43）。可能性の高いメカニズムの１つは、宿主の筋細胞、特にＭＩ境界部の筋細胞の保護又は救済である。ＭＩコアを囲む領域での筋細胞の死滅は、梗塞の拡大に繋がり、これらの筋細胞の保護は、心機能の改善及び心収縮性量の増加をもたらすと考えられる。この保護が、エキソソームを介して達成されるという概念の証拠を提供するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験が行われた。新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）は、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソームで処理され、その後、細胞死を誘導するために酸化ストレスに曝された。ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソームの両方で処理すると、タネル陽性（アポトーシス）ＮＲＶＭＳの数が減少した（図１Ｄ〜１Ｇ）。
ＣＢＳＣは、ＭＩ後の心臓で血管新生を誘導することも示されている。ＣＢＳＣ由来のエキソソームがこの効果に含まれるか否かを決定するために、マトリゲルでメッキされたＨＵＶＥＣＳにＣＢＳＣ由来のエキソソームを加え、ＣＢＳＣエキソソーム含有量の血管新生効果と一致する管形成の増強が観察された（図１Ｈ〜図１Ｊ）。
マウスＭＩモデルにおけるＣＢＳＣに由来するエキソソームの効果
マウスでの研究は、永久性閉塞ＭＩを使用して実施された（Makarewich et al., 2014, Circ Res., 115(6):567-580; Duran et al., 2013, Circ Res., 113(5):539-52）。心臓傷害後、マウスＣＢＳＣに由来するエキソソームが、単離され、定量化された（Khan et al., 2015, Circ Res., 117(1):52-64）。ベースライン心エコー検査（ＥＣＨＯ）（Duran et al., 2013, Circ Res., 113(5):539-52）の後、ＭＩが誘導された（０日目）。ＣＢＳＣに由来するエキソソーム（６０〜１２０μｇタンパク質）は、以前に報告されたように、ＭＩ境界部に直接注射された（Duran et al., 2013, Circ Res., 113(5):539-52）。ＭＩの時点でミニポンプを含むＥｄＵが挿入され、７日後に取り外し、以前の研究の報告のように、増殖細胞を特定した（Duran et al., 2013, Circ Res., 113(5):539-52）。動物は、ＭＩの１週間及び６週間後に屠殺された。ＥＣＨＯ分析は、これらの時点で全ての動物で実施された。ＭＩ傷害モデルを用いた研究は、ＣＢＳＣに由来するエキソソームがＭＩ後のマウスにおいてＣＢＳＣと同じ有益な効果を発揮できることを示唆する（図２Ａ〜図２Ｂ、図３）。同様に、ＣＢＳＣに由来するエキソソームは、血管を形成する能力を有することが示された。エキソソームが注射されたマウスでは、血管密度が増加した（図４）。同様に、ＣＢＳＣ又はＣＢＳＣに由来するエキソソームで処理したマウスは、ＭＩ後に、生理食塩水で処理した動物と比較して線維化の減少を示した（図２Ｃ〜Ｄ）。加えて、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソームは、ＭＩ後２日目のタネル染色細胞の減少により実証された心臓保護を示した（図２Ｅ〜図２Ｆ）。これらの結果は、ＣＢＳＣ由来のエキソソームが、少なくとも部分的に、ＣＢＳＣの抗繊維症、血管新生、及び心臓保護機能の原因であるという見解を強く支持する。
ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソームは、心臓傷害後の自然免疫応答を調節する。
傷害を受けた心筋は、死滅した細胞を除去し、瘢痕形成を調節する免疫細胞を引き付ける多くの抗炎症促進細胞を放出する（Frangogiannis, 2006, Antioxid Redox Signal, 8:1907-1939; Pfeffer and Braunwald, 1990, Circulation 81:1161-1172）。移植された幹細胞が心臓の炎症／免疫反応に及ぼす影響が、修復特性に関与しているという見解は、重要な研究の領域である。本明細書に提示されたデータは、ＣＢＳＣセクレトーム（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）が、心臓免疫反応を調節して障害後の修復を増強する能力を有する心臓保護因子からなることを示唆する。組織学的分析は、ＭＩ後７日目に生理食塩水で処理した動物を比較して、ＣＢＳＣ処理後、ＣＤ８６（炎症誘発性マクロファージのマーカー）の発現が、３．７倍減少したことが示された（図５Ｃ）。さらに、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソーム処理動物の血清分析は、サイトカインプロファイラーアレイ（Ｒ＆Ｄシステム）で測定した生理食塩水コントロールと比較して、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ９を含む炎症誘発性サイトカインの発現が有意に少ないことを示した（図５Ｂ及び図５Ｃ）。並行して、ＳＤＦ−１及びＭ−ＣＳＦの発現は、ＣＢＳＣ動物で上昇した。これらの発見は、ｍＲＮＡ発現分析によってさらに検証され、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣに由来するエキソソームで処理された動物の境界部において炎症誘発性因子の有意な減少及び抗炎症性サイトカイン発現増加を示した（図５Ａ）。加えて、全血球増殖性のマーカーであるＣＤ４５の発現は、ＦＡＣＳ分析によって測定されたＭＩの７日後(図６Ｂ）及び１４日後（図６Ｅ）のＣＢＳＣ由来のエキソソームと生理食塩水で処理した動物の間で変化しなかった。これは、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、全体の細胞数を変化させず、免疫細胞サブセットのバランスを抗炎症状態にシフトさせる可能性があることを示唆する（図６Ｃ〜図６Ｄ及び図６Ｆ〜図６Ｇ）。まとめると、ＣＢＳＣ由来のエキソソームは、心筋細胞の生存を促進し、ＭＩ後の心臓の心臓免疫応答を調節することによって、心機能を強化する。心臓免疫細胞を単離するための手順を図６Ａに示す。ＭＩの１４日後に心臓にＣＢＳＣを移植した後、ＣＤ３＋細胞の発現が減少した（図７Ａ）。同様に、ＣＤ４＋陽性細胞の発現は、生理食塩水で処理した動物に対するＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ−Ｅｘｏ移植動物におけるＦＡＣＳ分析により測定されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの数の減少と共に増加した（図７Ｃ〜Ｄ）。興味深いことに、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ−Ｅｘｏの心臓では、ｆｏｘｐ３＋細胞が増加している（図７Ｂ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫調節の能力をテストするために、骨髄から単離されたマクロファージ（ＢＭＤＭΦ）をトランスウェルシステムでＬＰＳの存在下でＣＢＳＣと４時間共培養し、未処理のＢＭＤＭΦをコントロールとして使用した。ＣＢＳＣは、ＢＭＤＭΦの抗炎症表現型を促進するＣＢＳＣの心保護因子の能力を示す抗炎症サイトカインＩＬ−１０の発現の増加と並行して、ＬＰＳ治療と比較してＢＭＤＭの炎症促進性因子の有意な減少を誘導した（図８Ａ）。同時に、ＬＰＳ処理と比較して、ＣＢＳＣ培地で処理したＢＭＤＭΦにおいて、ＰＥコンジュゲート食作用ビーズのトロ込みの増加が観察された（図８Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＣＢＳＣ及びＣＢＳＣ由来のエキソソームが、心筋傷害後の心臓の心臓免疫細胞応答を調節することを示唆する。
エキソソームは、親ＣＢＳＣの標識心臓保護用カーゴを送達する
ＣＢＳＣに由来するエキソソームが、従来の研究で観察された有益な効果の原因となる心臓保護因子を送達するか否かを判断することは非常に重要である。ＣＢＳＣは、心臓修復性パラクリン因子が包含された新規幹細胞である（Mohsin et al., 2015, Circ Res., 117(12):1024-33）。最近の研究では、損傷した心臓への注射後数日で注射された細胞が消失することが示唆されている（Gallina et al., 2015, Stem Cells Int., 2015:765846）。従って、有益な効果は、これらの細胞に由来するエキソソームの存在による可能性がある。ＣＢＳＣ（親細胞）とＣＢＳＣに由来するエキソソームを比較して得られた現在のデータは、エキソソーム内のｍｉＲのパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）を示した（図９Ａ、図９Ｂ）。ＣＢＳＣに由来するエキソソームは、他の幹細胞型の内皮前駆細胞（ＥＰＣ）由来のエキソソームと比較され、それらはＣＢＳＣに由来するエキソソームとは異なるタイプと量のｍｉＲが含まれる（図９Ｂ）。これらの結果は、ＣＢＳＣに由来するエキソソームが、ＭＩ後の心臓に特定の効果をもたらす一連の特徴的な分子を送達することを示す。
ブタＩＲ ＩＭモデルにおけるＣＢＳＣに由来するエキソソームの効果
げっ歯類を除く患者の心機能を改善する治療法を開発するため、ＣＢＳＣが、臨床的に適切な設定で大型動物モデルに盲検法で注射された。ＭＩの誘導技術は、大型動物の中心実験室（ｌａｒｇｅ ａｎｉｍａｌ ｃｏｒｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）において確立されている（Khan et al., 2015, Circ Res., 117(1):52-64; Baraniak et al., 2010, Regen Med., 5(1):121-43）。簡単に説明すると、ＭＩは、ミニブタで９０〜１２０分間、第１対角枝直後に左前下行枝を閉塞するために使用されるバルーンカテーテルの経皮挿入によって誘導された。バルーン閉塞は、血管造影によって確認された。閉塞期間の後、バルーンを収縮させ、動物を回復させた。偽薬の動物は、バルーンが膨らまなかったことを除いて手順が同じだった。これらの手法は、近年の他の研究で使用されている。心臓の構造及び機能は、局所歪み分析を含むＥＣＨＯ、及びＭＩ前後に行われた侵襲的血行動態（圧力及び容積）測定で評価された。梗塞サイズは、ＭＩ誘導後の左心室の心内膜表面のＮＯＧＡマッピング（図１０Ａ、図１０Ｂ）によって決定された。ＭＩ後ＮＯＧＡマップを使用して、ＣＢＳＣのＭＩ境界領域への注射を先導した。記載されるように、梗塞の境界付近で１０回の注射が行われた（Taghavi et al., 2012, Am J Transl Res., 4(2):240-6）。動物は、ＭＩ後１か月間評価された。ＣＢＳＣを注射した動物は、瘢痕サイズの減少を示した（図１０Ｃ）。
本明細書に引用されるありとあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、本発明の他の実施形態及び変形が、本発明の本質及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような全ての実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図している。

Claims (13)

  1. 単離された皮質骨幹細胞（ＣＢＳＣ）由来のエキソソームを含む、対象の心血管疾患又は障害を治療するための組成物。
  2. 少なくとも１つのＲＮＡ分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の組成物。
  4. 医薬的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  5. 少なくとも１つのＲＮＡ分子を含む、対象の心血管疾患又は障害を治療するための組成物。
  6. 前記ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載の組成物。
  7. 医薬的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  8. 対象における少なくとも１つの心血管疾患又は障害を治療する方法であって、ＣＢＳＣ由来のエキソソーム及びＲＮＡ分子からなる群から選択される少なくとも１つを含む、治療有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  9. 前記ＲＮＡ分子が、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−９、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−３２２、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−１２５、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−８７２、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−１９、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１９６、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−２３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１０６、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−５０３、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−４６７、ｍｉＲ−９９、ｍｉＲ−８８０、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−４８８、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２９１、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−５４１、ｍｉＲ−３０２、ｍｉＲ−１８３、ｍｉＲ−４１１、ｍｉＲ−２９５、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−７４４、ｍｉＲ−３９、ｍｉＲ−１４２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１４２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４−３ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−９−５ｐ、ｌｅｔ−７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３２２−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−８７２−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２８ｃ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５０３−５ｐ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、ｍｉＲ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−３１−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４４−３ｐ、ｍｉＲ−４６７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−８８０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−２９１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−５４１−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−４１１−５ｐ、ｍｉＲ−２９５−３ｐ、ｍｉＲ−１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−２１８−５ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−１０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４１−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−４６７ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３９−３ｐ、ＳＮＯＲＤ６１、ＳＮＯＲＤ６８、ＳＮＯＲＤ７２、ＳＮＯＲＤ９５、ＳＮＯＲＤ９６Ａ、ＲＮＵ６−６Ｐ、その変異体、派生物、及び組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記心血管疾患が、心筋傷害である、請求項８に記載の方法。
  11. 前記心筋傷害が、動脈疾患、アテローム、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、冠動脈疾患、不整脈、狭心症、うっ血性心疾患、虚血性心筋症, 心筋梗塞、脳卒中、一過性脳虚血発作、大動脈瘤、心臓心膜炎、感染症、炎症、弁閉鎖不全症、血管凝固欠陥、及びそれらの組み合わせ、からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記組成物が、直接注射、静脈注入、及び動脈注入からなる群から選択される少なくとも１つによって前記対象に投与される、請求項８に記載の方法。
  13. 前記組成物が、医薬的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤をさらに含む、請求項８に記載の方法。
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