CN115461444A - 通过改进的物质传输控制来规模化组织生产 - Google Patents

通过改进的物质传输控制来规模化组织生产 Download PDF

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CN115461444A CN202180021758.1A CN202180021758A CN115461444A CN 115461444 A CN115461444 A CN 115461444A CN 202180021758 A CN202180021758 A CN 202180021758A CN 115461444 A CN115461444 A CN 115461444A
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Abstract

一种形成组织的方法。所述方法包括提供包含内皮细胞的前组织组合物的来源。所述方法还包括使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到前组织组合物中以形成组织，其中内皮细胞被配置为通过血管生成形成次级通道。

Description

通过改进的物质传输控制来规模化组织生产
相关申请的交叉引用
本申请基于2020年2月18日提交的名称为“通过改进的物质传输控制来规模化组织生产”的美国临时申请序列号62/978,279，要求其优先权并通过引用将其整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在政府支持下由能源部给予的资助DE-AR0001233完成的。政府对本发明有一定的权利。
技术背景
产生大尺寸组织的主要挑战是营养物质和O2扩散到体外产生的构建体内部的细胞受到限制。据估计，营养物质和氧气的有效扩散距离只有100-200微米，因此位于大的构建体内部的细胞在没有适当的营养物质/氧气内部输送系统来维持它们的情况下无法保持存活。因此，真实再现天然组织体系的体外组织重建通常仅限于微米和毫米级的构建体。然而，许多应用非常期望更大的构建体。
一种用于生产能存活的大尺寸组织的先前策略纳入了允许培养基流入组织内部的通道。这已在骨骼肌组织工程中进行，其中用中空纤维(多孔管)灌注10x10x1.9mm的组织。在另一个示例中，添加生物打印通道
Figure BDA0003848726720000011
支持在1cm厚的组织中的成纤维细胞和成骨间充质干细胞。然而，这些纳入的通道的大尺寸严重减少了组织产量。对于中空纤维(HF)系统，紧密的HF间隔和大的HF直径(480μm)导致按体积仅为肌肉21％的肌肉构建体。其他改进这一缺点的尝试集中在使用更小的
Figure BDA0003848726720000012
血管化通道来灌注脂肪组织，理论上它可能只占培养组织的1-1.5％(假设通道之间的间隔为1mm)。不幸地，尽管有这种改进，但这样的系统相当复杂，需要估计2500个通道来灌注5x5cm横截面的3D组织。
用于灌注大尺寸组织的另一种潜在技术是与内皮细胞进行共培养。在3D培养中，内皮细胞能够形成类似于体内微脉管系统的可灌注的毛细血管样血管。已将这种现象用来改善植入后各种工程化肌肉和脂肪组织的性能和存活，并且已有研究报告了宿主和工程化组织脉管系统之间的成功吻合。虽然内皮并入成功地使工程化组织血管化，但这些研究仅限于小的构建体(毫米级)，可能是因为当构建体体积较大时，血管网络形成并输送营养物质到内部细胞需要太多时间。此外，用毛细管大小的小血管灌注大的构建体也可能导致物质传输(mass transport)并发症，其中通过构建体的介质量不足以维持其所有细胞。
因此，需要的是能够灌注大的组织工程化构建体同时保持高组织产量，且还降低由于使用大量通道而导致的系统复杂性的新系统和方法。
发明概述
本公开通过提供使用独特灌注布置来形成和灌注大的组织工程化构建体的新系统和方法来解决上述缺点，所述独特灌注布置采用两种不同通道类型。
一方面，本公开提供了形成组织的方法。所述方法可包括提供包含内皮细胞的前组织(pre-tissue)组合物的来源。所述方法还可包括使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到前组织组合物中以形成组织，其中所述内皮细胞被配置为通过血管生成形成次级通道。
另一方面，本公开提供了灌注组织的方法。所述方法可包括使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中，其中所述组织包含被配置为通过血管生成形成次级通道的内皮细胞。
一方面，本公开提供了灌注组织的方法。所述方法可包括使用多个布置的初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中，其中培养基通过初级通道提供给组织，并且其中一个或多个次级通道在空间上从初级通道分支。
另一方面，本公开提供了形成组织的系统。所述系统可包括包含内皮细胞的前组织组合物的来源，所述内皮细胞被配置为通过血管生成形成次级通道。所述系统还可包括灌注系统，所述灌注系统被配置为使用多个初级通道向前组织组合物提供培养基以形成组织。
又一方面，本公开提供了灌注组织的系统。所述系统可包括灌注系统，其被配置为使用多个初级通道向组织提供培养基，其中所述组织包含被配置为通过血管生成形成多个次级通道的内皮细胞。
当结合附图时，本发明的这些和其他优点和特征将从以下对本发明的优选方面的详细描述中更加显而易见。
附图简述
本文描述的附图仅用于说明所选实施方案而非所有可能的实施方式的目的，并且不旨在限制各种实施方案中的任何一个的范围。应当理解，附图不是按比例绘制。
图1示出根据本公开一个方面的形成组织的方法的过程流程图。
图2示出根据本公开另一个方面的灌注组织的方法的过程流程图。
图3示出根据本公开一个方面的灌注组织的方法的过程流程图。
图4A示出使用本文所述方法和系统形成的组织的一部分的透视图的描绘。图4B示出使用本文所述方法和系统形成的组织的一部分的横截面图的描绘。
图5示出根据本公开多个方面的用于形成或灌注组织的系统的描绘。
图6示出使用本文所述方法和系统形成的组织的一部分的示意性横截面图。
图7A描绘在实施例1的实验中使用共培养培养基配方2获得的明场成像结果。图7B描绘在实施例1的实验中使用共培养培养基配方1获得的明场成像结果。图7C描绘在实施例1的实验中使用包含10nM地塞米松和30ng/ml IGF-1的共培养培养基配方1获得的明场成像结果。
图8A描绘在实施例1的实验中使用包含10nM地塞米松和30ng/ml IGF-1的共培养培养基配方1获得的BODIPY脂质染色结果。图8B示出描绘在实施例1的实验中使用包含10nM地塞米松和30ng/ml IGF-1的共培养培养基配方2获得的BODIPY脂质染色结果。图8C示出量化实施例1的实验中BODIPY脂质染色结果的图。
图9A描绘在实施例1的实验中使用具有地塞米松和IGF-1的共培养培养基配方1获得的GFP-HUVEC的CD31染色。图9B描绘在实施例1的实验中使用具有地塞米松、IGF-1和100ug/ml Intralipid的共培养培养基配方1获得的GFP-HUVEC的CD31染色。图9C示出量化实施例1的实验中CD31染色结果的图。
图10A描绘在实施例1的实验中获得的脂肪-内皮3D共培养的明场成像结果。图10B描绘在实施例1的实验中获得的脂肪-内皮3D共培养的CD31染色结果。
图11A描绘在实施例2的实验中使用常规的基于马血清的分化培养基获得的C2C12小鼠成肌细胞的肌球蛋白重链(MHC)染色结果。图11B描绘在实施例2的实验中使用开发的肌肉-内皮共培养培养基配方获得的C2C12小鼠成肌细胞的肌球蛋白重链(MHC)染色结果。图11C示出量化在图11A至图11B的染色结果中测量的肌管形成程度的图。
图12A描绘在实施例2的实验中用基于马血清的分化培养基进行3D肌肉培养的肌球蛋白重链(MHC)和DAPI核染色。图12B描绘在实施例2的实验中用开发的肌肉-内皮共培养培养基配方进行3D肌肉培养的肌球蛋白重链(MHC)和DAPI核染色。图12C描绘在实施例2的实验中用基于马血清的分化培养基进行3D肌肉培养的鬼笔环肽(phalloidin)染色结果。图12D描绘在实施例2的实验中用开发的肌肉-内皮共培养培养基配方进行3D肌肉培养的鬼笔环肽染色结果。
图13示出在实施例3的实验中使用的实验生物反应器循环灌注系统的示意图。
图14A描绘在由单个中空纤维通道系统灌注的水凝胶中培养的内皮细胞的活/死细胞染色。追随培养基流出可看到细胞生长。图14B描绘在由单个中空纤维通道系统灌注的水凝胶中培养的内皮细胞的活/死细胞染色。可观察到网络或原网络(proto-network)形成。
发明详述
在进一步详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的特定实施方案。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案而非限制的目的。本发明的范围将仅由权利要求限定。如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括多个/种实施方案，除非上下文另有明确规定。
公开了与大尺寸组织形成和灌注相关的特定结构、装置和方法。对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明概念的情况下，除了已描述的那些外，许多其他修改是可能的。在解释本公开内容时，应以与上下文一致的最广泛的方式解释所有术语。术语“包括/包含”的变体应解释为以非排他的方式指代要素、组件或步骤，因此所引用的要素、组件或步骤可与未明确表示的其他要素、组件或步骤组合。被称为“包括”某些要素的实施方案也考虑是“基本上由那些要素组成”和“由那些要素组成”。当列举特定值的两个或更多个范围时，本公开考虑了未明确列举的那些范围的上限和下限的所有组合。例如，对1至10或2至9的值的记载也涵盖1至9或2至10的值。
如本文所用，术语“灌注”具有其在本领域中的普通含义。例如，“灌注组织”可指将流体泵送通过组织。可将灌注测量为流体递送到组织的速率，或按照单位时间单位组织质量的流体体积。
如本文所用，术语“血管生成”具有其在本领域的普通含义。例如，“血管生成”可指当区域内没有预先存在的通道或血管时，新通道或血管的形成。
如本文所用，术语“生物相容的”是指与活组织(如，在体内)接触时不会对这类活组织造成显著伤害的材料。在某些实施方案中，如果材料对细胞无毒，则它们是“生物相容的”。在某些实施方案中，如果材料在体外添加到细胞中导致小于或等于20％的细胞死亡，和/或它们在体内的施用不会引起明显炎症或其他此类副作用，则材料是“生物相容的”。
如本文所用，术语“可生物降解的”是指当引入细胞时分解(如，通过细胞机制，例如通过酶促降解、通过水解和/或通过它们的组合)成细胞可重复使用或处理而不会对细胞产生明显毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中，由可生物降解的材料分解产生的组分是生物相容的，因此不会在体内诱导明显炎症和/或其他不良效应。
先前系统组织灌注策略已显示相当大的缺点。仅用通道灌注的大尺寸组织要么损失太多组织体积，要么需要大量的较小通道，而体外内皮血管为毛细管大小
Figure BDA0003848726720000051
且可在培养中自组装，但是缺乏运输能力来支持大尺寸组织生长。
本文描述了与产生大尺寸组织相关的系统和方法，其通过并入双重灌注策略，其中营养物和O2通过微通道和毛细管大小的内皮血管递送到大的组织(图6E)。将内皮细胞添加到通道灌注的组织允许更宽的通道间距、增加组织产量并通过减少灌注所需的通道数量来降低生物反应器的复杂性。由于来自共培养的内皮细胞的血管生成，离更分散布置太远的细胞通过毛细血管样血管连接到通道。同时，通道并入意味着在培养开始时3D组织中已经有部分灌注，细胞只需要等待内皮细胞将通道之间而不是整个构建体中的空间血管化。通道还确保足够的培养基灌注大尺寸组织构建体，从而克服了组织中的物质传输问题，否则只能通过毛细管大小的血管进行灌注。最后，从更大通道到小毛细血管的过渡更具仿生性，很像具有动脉和毛细管的人体循环系统中可见的大小等级。
以这种方式，本文的系统和方法缓解了与仅使用通道或内皮血管的系统相关的缺点。虽然内皮网络可能需要数天才能形成，但初级通道在培养开始时提供灌注。此外，内皮细胞毛细血管存在潜在的物质传输问题，并且较大直径的通道允许更多的介质流动。
本公开的双重灌注策略显著改进当前的大型组织工程技术，使体外生成的组织能够以足够大的规模生成来适用于许多领域/工业。例如，大尺寸肌肉组织的生产在治疗体积性肌肉损失的情况下可用作移植物，其中肌肉损伤严重到其自我再生成分也被破坏。大尺寸脂肪组织的产生允许修复患者中的软组织缺陷，或在美容/整形手术期间增加身体所需区域的大小/体积(bulk)。体外肉类(其中在体外产生组织来生产用于食用而无需屠宰动物的肉)的新兴领域也将从本公开中受益，因为该领域基于大规模生产肌肉和脂肪组织的能力。除了这些示例性用途之外，本领域技术人员将容易地认识到进一步的应用。
图1描绘形成组织的方法100。该方法包括提供包含内皮细胞的前组织组合物的来源的第一步骤102；以及使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到前组织组合物中以形成组织的第二步骤104，其中内皮细胞被配置为通过血管生成形成次级通道。
所述方法100的初级通道可具有小于800、500、400、300、200、150、100或50μm的平均外径。可将初级通道布置成以基本上平行的构造延伸通过前组织组合物。初级通道可以以适合于向前组织组合物的所有区域提供培养基的充分灌注的模式布置。例如，可将通道布置成网格状模式，彼此之间具有大致等距的间距。组织的平均横截面通道密度可定义为垂直于初级通道的截面上单位面积的初级通道数量。组织的平均横截面通道密度可小于每平方厘米100、50、30、20、10、8或4个初级通道。多个初级通道的体积可构成小于产物组织的总体积的20％、10％、5％、3％、2％、1％或0.5％。
所述方法100的初级通道可由生物相容性或生物可降解材料形成。例如，初级通道可由生物相容性聚合物形成。初级通道可具体包括再生的丝丝心蛋白。通道可在方法开始之前具体预先形成，并且灌注培养基的方法步骤可在形成次级通道之前最初仅通过初级通道进行。通道可以是延伸通过前组织组合物的中空纤维膜。初级通道可以是多孔的，以允许培养基的灌注。备选地，通道可以是无孔的并且依靠扩散来灌注组织。
所述方法100的次级通道可小于初级通道并且可具有小于70、50、40或30μm的平均外径。次级通道可具体具有5μm至70μm、10μm至50μm、20μm至40μm或约30μm的平均外径。一个或多个次级通道可从一个或多个初级通道延伸到前组织组合物的通道间空间中，其中通道间是指初级通道之间的组织空间。以这种方式，次级通道可用于扩大初级通道的灌注范围，从而允许增加这些较大通道之间的间距。在一些情况下，一个或多个次级通道可流体地连接一个或多个初级通道。
次级通道可由内皮细胞启动血管生成的能力形成。例如，内皮前体细胞可能迁移和分化以响应局部信号，例如组织内的生长因子和细胞外基质，以形成类似毛细管的新通道。然后这些血管树可通过血管生成在组织中延伸。前组织组合物可包含特定量的内皮细胞以允许培养基的充分灌注。其他生物分子如生长因子可包含在前组织组合物中或之后添加，以支持次级通道的形成。
培养基可用营养物和O2配制以支持组织中的细胞生长。培养基可具有与组织的遗传来源的典型动脉血大致相同的初始氧浓度。可在设定时间段内将培养基连续灌注到前组织组合物或直到达到特定组织体积。备选地，可以一致地或按需要地以分批脉冲的形式提供培养基。可监测组织细胞并相应地调整灌注速率。类似地，培养基的组成可以随时间而调整，以解决细胞健康的顾虑。例如，可按需要增加培养基中的生长因子浓度。
通过所述方法形成的组织可取决于初始细胞类型和存在于前组织组合物中的量。产物组织可由哺乳动物细胞形成。组织可以是用于各种应用的人组织，例如用于皮肤移植或器官移植。组织可以主要是肌肉组织。组织可由非人细胞形成，并专门为作为食品消费而制作。本领域技术人员将认识到适用于本发明组织形成技术的许多其他应用。
图2描绘灌注组织的方法200。所述方法包括使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中的第一步骤202，其中所述组织包含被配置为通过血管生成形成次级通道的内皮细胞。灌注方法200可利用本文所述方法或系统的任何要素的任何组成、配置和/或方法步骤。
图3描绘灌注组织的另一种方法300。所述方法包括使用多个布置的初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中的第一步骤302，其中培养基通过初级通道提供给组织，并且其中一个或多个次级通道在空间上从初级通道分支。灌注方法300可利用本文所述方法或系统的任何要素的任何组成、配置和/或方法步骤。
图4A和图4B描绘使用本文所述方法和/或系统形成的组织400的一部分的分别视图。部分400包含延伸通过通道间组织402的几个初级通道404。还描绘组织402内的许多次级通道406。可看到次级通道406从初级通道404分支出来，连接初级通道404，在组织402内作为独立通道存在，或将该部分的外部连接到通道间组织402。
图5描绘被配置为形成或灌注组织508的系统500。一方面，系统500被配置为形成组织508。系统500包括前组织组合物的来源(未描绘，因为组织已经形成)，其包含被配置为通过血管生成形成次级通道的内皮细胞。所述系统还包括灌注系统502，其被配置为使用多个初级通道504向前组织组合物提供培养基以形成组织508。
另一方面，系统500被配置为灌注组织508。在这个方面，系统500包括灌注系统502，其被配置为使用多个初级通道504向组织508提供培养基，其中组织508包括被配置为通过血管生成形成多个次级通道的内皮细胞。
在这两个方面，系统500可包括培养箱510，其被配置为在适合生长的条件下容纳组织。培养箱可包括适合细胞生长或维持的培养基512。培养箱510可被配置为维持初级通道504的基本上平行的布置。在这两个方面，系统可包括培养基的来源和/或泵，该泵被配置为使用初级通道504向组织提供培养基。这样的泵可被配置为连续地向前组织组合物提供培养基。初级通道504可被布置成以基本上平行的构造延伸通过组织。初级通道504可以是管状构建体。组织508的平均横截面通道密度可小于每平方厘米20个初级通道，或小于每平方厘米10个初级通道。前组织组合物或组织508可包括人组织细胞。备选地，前组织组合物或组织508可包括牛、猪或家禽组织细胞。
在这两个方面，系统500均可利用本文所述方法的任何要素的任何组成或配置。
实施例
提供以下实施例是为了证明和进一步说明本公开的某些实施方案和方面，并且不应解释为限制本公开的范围。
进行概念验证实验以证明本文所述系统和方法的功效。在这些实验中，建立了用于共培养脂肪和内皮细胞、以及肌肉和内皮细胞的特定技术。这些实验结果为用于在灌注的3D组织培养中有效培养内皮细胞与肌细胞或脂肪细胞提供了基础知识。
实施例1
进行实验以建立用于脂肪和内皮细胞的适合培养条件和共培养的培养基配方。开发了多种前组织组合物(又被称为细胞培养支架配方)和共培养培养基配方。
细胞培养支架配方1包括0.5mg/ml GrowDex(纳米纤维纤维素水凝胶)、1mg/mlMatrigel、1mg/ml纤维蛋白和1.25U/ml凝血酶。细胞培养支架配方2包括1.25mg/mlMatrigel、1.25mg/ml纤维蛋白和1.25U/ml凝血酶。共培养培养基配方1包括内皮细胞生长培养基MV 2(Promocell)，另外还有9.5ng/ml VEGF165、1X不含动物成分的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(Invitria)、0.5mg/ml AlbuMAX I(Gibco)、100ug/ml Intralipid或160uM油酸-甲基-β-环糊精复合物、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。任选地，10nM-1uM地塞米松和30ng/ml IGF-1可包含在共培养培养基配方1中。共培养培养基配方1中使用的内皮细胞生长MV 2包含EBM、5％FBS、5ng/ml EGF、10ng/ml FGFb、20ng/ml IGF-1、0.5ng/ml VEGF165、1ug/ml抗坏血酸、0.2ug/ml氢化可的松，其中EBM是来自Promocell的内皮基础培养基。任选地，共培养培养基配方1可用MCDB 131代替EBM。EBM预计可提供约30nM d-生物素、17μM L-抗坏血酸磷酸盐、0.03μM亚硒酸盐和5.55mM葡萄糖，并且不含BSA、油酸、胰岛素或转铁蛋白。共培养培养基配方2包括EBM，具有10％FBS、10ug/ml胰岛素、100ug/ml Intralipid或160uM油酸-甲基-β-环糊精复合物、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素，其中Intralipid是源自大豆油的无菌脂质乳剂。
图7A至图7C描绘在共培养培养基配方1和2中培养的3T3-L1脂肪形成细胞的明场成像。该实验使用500万个3T3-L1，并且对于MFG凝胶在7天后采集图像。图7A描绘配方2的结果。图7C描绘配方1的结果，其包括10nM地塞米松和30ng/ml IGF-1。图7B描绘未添加地塞米松、IGF-1和油酸-甲基-β-环糊精复合物/intralipid的配方1的结果。描绘的比例尺为50微米。
图8A至图8C描绘图7A至图7C相同实验(涉及在共培养培养基配方1和2中培养的3T3-L1脂肪形成细胞)的使用DAPI的BODIPY脂质染色。该实验使用500万个3T3-L1，并且对于MFG凝胶在21天后进行BODIPY脂质染色。图8A描绘配方1的结果。图8B描绘配方2的结果。描绘的比例尺为100微米。图8C描绘量化的BODIPY脂质染色结果，其中“共培养”柱指的是未添加地塞米松、IGF-1和油酸-甲基-β-环糊精复合物/intralipid的配方1。
图9A至图9C描绘显示血管网络形成的GFP-HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的CD31染色。该实验使用每ml 200万个GFP-HUVEC、400,000个10T1/2，并且对于MFG凝胶在7天后进行染色。图9A描绘使用具有地塞米松和IGF-1的配方1的结果。图9B描绘使用具有地塞米松、IGF-1和100ug/ml Intralipid的配方1的结果。描绘的比例尺为200微米。图9C描绘实验的量化结果，其中网络长度以任意单位给出。这些结果证实，向共培养培养基配方中添加脂质不影响血管形成。
图10A至图10B描绘脂肪-内皮3D共培养的明场成像和CD31染色。该实验使用每ml500万个3T3-L1、300万个HUVEC和600,000个10T1/2，并且对于Matrigel-纤维蛋白凝胶在7天后进行成像和染色。脂肪-内皮3D共培养。图10A描绘许多脂质微滴的明场成像，示例用箭头突出显示。图10B描绘内皮血管网络形成的CD31染色。描绘的比例尺为200微米。
实施例2
进行实验以建立肌肉和内皮细胞的合适培养条件和共培养培养基配方。开发了前组织组合物(又被称为支架配方)和共培养培养基配方。
肌肉-内皮支架配方包括1.25mg/ml Matrigel、1.25mg/ml纤维蛋白和1.25U/ml凝血酶。肌肉-内皮细胞共培养培养基配方包括内皮细胞生长培养基MV 2(Promocell)，添加9.5ng/ml VEGF165、1X不含动物成分的胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(Invitria)、0.5mg/mlAlbuMAX I(Gibco)、30ng/ml IGF-1、10nM地塞米松和100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。任选地，肌肉-内皮共培养培养基配方还可包含250nM-1uM鞘氨醇-1-磷酸和10-200ng/ml前列腺素E2或100nM SW033291。
实验结果表明，仅通过培养基的优化，实现了在肌管形成程度(融合指数)和3D培养构建体的大小方面对肌生成的显著改善。
图11A至图11C描绘C2C12小鼠成肌细胞的肌球蛋白重链(MHC)染色的实验结果。该实验使用40,000个细胞/cm2，对于2D培养7天后进行染色。图11A描绘常规的基于马血清的分化培养基的结果。图11B描绘具有250nM鞘氨醇-1-磷酸的肌肉-内皮共培养培养基配方的结果。描绘的比例尺为200微米。图11C量化图11A至图11B中测量的肌管形成程度，其中将肌肉-内皮共培养培养基配方标记为“低葡萄糖共培养+补充剂”。
图12A至图12D描绘用于比较传统的基于马血清的分化培养基与肌肉-内皮共培养培养基配方的染色结果。该实验使用浓度为1000万/ml的C2C12小鼠成肌细胞，对于1.25mg/ml Matrigel和1.25mg/ml纤维蛋白的3D培养在14天后进行染色。图12A描绘用基于马血清的分化培养基进行3D肌肉培养的肌球蛋白重链(MHC)和DAPI核染色。图12B描绘用开发的具有250nM鞘氨醇-1-磷酸的肌肉-内皮共培养培养基配方进行3D肌肉培养的肌球蛋白重链(MHC)和DAPI核染色。图12C至图12D描绘除了通过鬼笔环肽可视化肌动蛋白细胞骨架外与图12A至图12B相同的视图，其中图12C是基于马血清的培养基，图12D是开发的肌肉-内皮共培养培养基配方。在图12D中可看出，一旦肌肉3D构建体的尺寸增加，由于营养物和氧气转移限制，内部的细胞经历生长减少(由减少的细胞骨架存在暗示)。
实施例3
为了进一步测试本文所述的技术，开发了实验性单通道生物反应器系统来观察并入3D共培养水凝胶中的通道周围的血管网络形成。
图13描绘实验性生物反应器循环灌注系统1300的示意图，开发该系统来研究单通道周围的血管网络形成。实验系统1300包括包含内皮细胞(特别是具有内皮细胞的水凝胶基质)的前组织组合物的来源1302。灌注系统1304将培养基从培养基来源1306提供到前组织组合物1302，其使用中空纤维室1310中的个体通道1308。个体通道1308的放大标注视图显示灌注到水凝胶的入口培养基和被去除的出口培养基。泵1312是具有高流速的蠕动泵或具有低流速的注射泵，用于确保培养基通过灌注系统1304的恒定循环。气体交换器1316用于维持实验过程中培养基的适用性。
图14A至图14B描绘在由图13的系统的单个中空纤维通道灌注的水凝胶中培养的活/死内皮细胞染色。具体地，对于1mg/mL纤维蛋白、1mg/mL Matrigel和0.5mg/mL GrowDex形成的水凝胶，将浓度为300万个细胞/mL的人真皮微血管内皮细胞(HMEC-1)和浓度为60万个细胞/mL的大鼠平滑肌细胞(A10)以4μL/min的流速灌注。如图14A所示，可看到细胞生长追随培养基从中空纤维的流出。此外，如图14B所示，可在中空纤维周围观察到网络或原网络形成。
本公开已经描述了一个或多个优选实施方案，并且应当理解的是，除了明确说明的那些之外，许多等同物、替代物、变体和修改都是可能的并且在本发明的范围内。

Claims (62)

1.一种形成组织的方法，所述方法包括：
提供包含内皮细胞的前组织组合物的来源；和
使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到所述前组织组合物中以形成组织，其中所述内皮细胞被配置为通过血管生成形成所述次级通道。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述初级通道具有小于400μm的平均外径。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述初级通道具有小于150μm的平均外径。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道被布置成以基本上平行的构造延伸通过所述前组织组合物。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述次级通道从一个或多个所述初级通道延伸到所述前组织组合物的通道间空间中。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述次级通道以流体方式连接一个或多个所述初级通道。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米20个初级通道。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米10个初级通道。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道是多孔的。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述次级通道具有10μm至50μm的平均外径。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述灌注培养基的方法步骤最初在所述次级通道形成之前仅通过所述初级通道进行。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将培养基连续灌注到所述前组织组合物。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织主要是肌肉组织。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个初级通道的体积占产物组织的总体积的小于5％。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多个初级通道的体积占产物组织的总体积的小于1％。
16.一种灌注组织的方法，所述方法包括：
使用多个初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中，其中所述组织包含被配置为通过血管生成形成所述次级通道的内皮细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述初级通道具有小于400μm的平均外径。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述初级通道具有小于150μm的平均外径。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道被布置成以基本上平行的构造延伸通过所述组织。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述次级通道从一个或多个所述初级通道延伸到所述组织的通道间空间中。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述次级通道以流体方式连接一个或多个所述初级通道。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米20个初级通道。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米10个初级通道。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道是多孔的。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述次级通道具有10μm至50μm的平均外径。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基具有与所述组织的遗传来源的典型动脉血大致相同的初始氧浓度。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将培养基连续灌注到所述组织。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织主要是肌肉组织。
29.一种灌注组织的方法，所述方法包括：
使用多个布置的初级通道和多个次级通道将培养基灌注到组织中，其中培养基通过所述初级通道提供给所述组织，并且其中一个或多个所述次级通道在空间上从所述初级通道分支。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述次级通道具有小于所述初级通道的平均直径。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述初级通道具有100μm至400μm的平均外径。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述次级通道具有10μm至50μm的平均外径。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道被布置成以基本上平行的构造延伸通过所述组织。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中一个或多个所述次级通道以流体方式连接一个或多个所述初级通道。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米20个初级通道。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米10个初级通道。
37.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述初级通道是多孔的。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基具有与所述组织的遗传来源的动脉血大致相同的初始氧浓度。
39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将培养基连续灌注到所述组织。
40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组织主要是肌肉组织。
41.一种使用前述权利要求中任一项所述的方法形成的组织。
42.一种形成组织的系统，所述系统包含：
包含内皮细胞的前组织组合物的来源，所述内皮细胞被配置为通过血管生成形成次级通道；和
灌注系统，其被配置为使用多个初级通道向所述前组织组合物提供培养基以形成组织。
43.如权利要求42所述的系统，其还包括：
培养箱，其被配置为在适合生长的条件下容纳所述组织。
44.如权利要求43所述的系统，其中所述培养箱被配置为保持所述初级通道的基本上平行的布置。
45.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述灌注系统包括：
培养基的来源；和
泵，其被配置为使用所述多个初级通道向所述组织提供所述培养基。
46.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述泵被配置为连续地向所述前组织组合物提供所述培养基。
47.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述初级通道被布置成以基本上平行的构造延伸通过所述组织。
48.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述初级通道为管状构建体。
49.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米20个初级通道。
50.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米10个初级通道。
51.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述前组织组合物包括人组织细胞。
52.如权利要求42至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述前组织组合物包括牛、猪或家禽组织细胞。
53.一种灌注组织的系统，所述系统包括：
灌注系统，其被配置为使用多个初级通道向组织提供培养基，其中所述组织包含被配置为通过血管生成形成多个次级通道的内皮细胞。
54.如权利要求53所述的系统，其还包括：
培养箱，其被配置为在适合细胞维持的条件下容纳所述组织。
55.如权利要求54所述的系统，其中所述培养箱被配置为保持所述初级通道的基本上平行的布置。
56.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述灌注系统包括：
培养基的来源；和
泵，其被配置为使用所述多个初级通道向所述组织提供所述培养基。
57.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述初级通道被布置成以基本上平行的构造延伸通过所述组织。
58.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述初级通道为管状构建体。
59.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米20个初级通道。
60.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中平均横截面通道密度小于每平方厘米10个初级通道。
61.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述前组织组合物包括人组织细胞。
62.如权利要求53至前一项权利要求中任一项所述的系统，其中所述前组织组合物包括牛、猪或家禽组织细胞。
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