JP2020529865A - 濃度に基づくdnaシーケンシングマシン - Google Patents
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Abstract
Description
DNAシーケンシング用に以前開発された2つの主な方法:
1−合成によるシーケンシング:
−サンガー/ジデオキシチェーンターミネーション(Life Technologies、Applied Biosystems)
−パイロシーケンシング(Roche/454)
−可逆化ターミネータ(Illumina)
−ゼロモードウェーブガイド(Zero Mode Waveguide)(Pacific Biosciences)第3世代シーケンシング
2−オリゴライゲーション検出によるシーケンシング
−SOLiD(Applied Biosystems)
以下は、これらの方法のより詳細な説明である。
この方法では、ジデオキシヌクレオチド、およびddNTPにホスホジエステル結合の形成に必要な3’−OH基がないことによって鎖の成長が終結されている、改変されているDNA複製反応。酵素(DNAポリメラーゼ)の添加により、プライマーが、ddNTPに遭遇するまで伸長される。鎖は、ddNTPの組み込みで終了する。適切なdNTP:ddNTP比により、鎖はテンプレート全体の長さで終結する。終結された鎖すべては、その反応で添加されたddNTPで終了する。得られた終結された鎖を、電気泳動によって解析する。4つのddNTP各々に対して、別個の染料または「色素」が使用される。ヌクレオチドの末端は色素によって区別することができるため、4つすべての反応は、単一の管で実施することができる。
各ヌクレオチドが、各サイクルで順番に添加される。そのとき4つのうちの1つのみが光シグナルを生成する。次のサイクルを準備するために、酵素を用いて残りのヌクレオチドを除去する。光シグナルをピログラムで記録する。
・PPiは、アデノシンホスホ硫酸(APS)からのATPの生成に使用される。
ATPおよびルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの変換によって光を生成する。
この方法は、各ヌクレオチドが、DNAの成長鎖に組み込まれた直後に各ヌクレオチドの同一性を検出することに基づく、単一分子リアルタイムシーケンシングである。
プローブシーケンス(オリゴヌクレオチドの代わりにDNA断片)に結合するリガーゼをポリメラーゼの代わりに使用する。プローブを添加すると、蛍光シグナルが産生される。蛍光に基づき、ヌクレオチドの同一性を推測することができる。シーケンシング方法は、一塩基のみに従来とは異なる2つ以上のプライマーを含む。
モノマーが配列しているポリマー分子を、非常に小さい体積の空間に順番に通して移動させるナノスケールのデバイスを利用する。移動させるポリマーの特徴的な特色を電気シグナルに直接変換する検出器を含む。1分子ごとのベースで、変換および識別がリアルタイムで行われる。これは、数千の異なる分子を数分でプローブすることができる。非常に長いDNAの長さをプローブすることができる。
SBSは、各ヌクレオチドをポリメラーゼ反応中のDNAの成長鎖に組み込んだ直後に各ヌクレオチドの同一性を検出することを含む。SBSは、「蛍光インサイチュシーケンシング」(FISSEQ)およびパイロシーケンシング方法を含む。
シーケンシング原理およびシーケンシングマシンは、非常に高価なツールおよび機器を含む。加えて、一般的な研究施設では、かかる技術を入手することは容易ではない。これらの方法のうちのほとんどは、困難であり、これらの実験の費用を増加させる、特殊な酵素または蛍光染料など特殊な標識方法を必要とする。これらの理由から、これらの技術を簡易化し、関連費用を減少させるために、新規の方法を開発および導入する必要がある。
新規の原理:
DNAシーケンシングという用語は、一般的に、DNA分子中のヌクレオチド塩基である、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順序を決定するために使用されているいくつかの方法および技術に適用されている。ヒトゲノムのシーケンシングにおける、およびヒトゲノムプロジェクトにおける診断、バイオテクノロジー、法生物学、および生物学的体系学などの、多数の分野に適用される多くの用途を有する。本発明のマシンでは、通常のPCR技法によってDNA試料断片を増幅する。個々のヌクレオチドを、新生短鎖DNAに添加する。試験されるDNA断片にヌクレオチドが相補的である場合、添加されたヌクレオチドの濃度の変化は、任意の方法によって調べることができる。
1.増幅され、次いで相補的ヌクレオチドについて試験されるゲノムDNA断片を担持する固体支持体このチャンバは、電熱器および冷却システムを備える。
Claims (8)
- DNAシーケンシング用のデバイスであって、核酸試料を受容するように構成されている試料ホルダと、前記試料の温度を上昇させるように構成されている加熱システムと、前記試料の温度を下げるように構成されている冷却システムと、所望の時間−温度プロファイルを通じて前記デバイスがサイクルを行うように前記加熱システムおよび前記冷却システムを制御するように構成されている制御器と、を含む、デバイス。加えて、任意の種類のセンサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、好適な液体および水移動システムを使用して、各ヌクレオチドの添加前後のdNTP濃度についての情報を提供することができる。
- 任意の種類の前記センサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、温度および他の要素を含む、前記反応チャンバ内の前記試料の状態についての情報を提供することができる、請求項1に記載のデバイス。
- ソフトウェアプログラミング用の入力ユニットに接続されている、前記反応チャンバで実行されるすべてのプロセスを制御するための前記制御ユニット、および前記データを収集し、前記制御ユニットに前記データを送信する、前記反応チャンバ内側または外側の前記センサ、請求項1に記載のデバイス。
- 前記入力ユニットが、ソフトウェアプログラミングおよびパラメータの選択用にマシン内側に設置されている、請求項1に記載のデバイス。
- 前記反応チャンバの前記温度が、任意の種類の加熱および冷却システムによって制御されて、前記反応チャンバの前記温度を制御する、請求項1に記載のデバイス。
- より正確かつ再現性の高い結果のために、多くの対照試料が、前記反応チャンバの内側に設置され得る、請求項1に記載のデバイス。
- 任意の種類のセンサが、前記反応チャンバの任意の内側部分または外側部分に設置されて、各ヌクレオチドの添加前後の前記濃度についての情報を提供することができる、請求項1に記載のデバイス。
- 試料の数が限定されない、請求項1に記載のデバイス。
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