KR20200034774A - 농도 기반 dna 시퀀싱 기기 - Google Patents
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Abstract
DNA 시퀀싱이라는 용어는 일반적으로 DNA 분자에서 뉴클레오티드 염기 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민의 순서를 결정하는데 사용되는 몇 가지 방법 및 기술에 적용된다. 이는 진단, 생명 공학, 법의학 생물학 및 생물학적 체계, 인간 게놈 시퀀싱 및 인간 게놈 프로젝트와 같은 수많은 응용 분야에 적용된다. 제시된 기기에서, DNA 샘플 단편은 일반적인 PCR 기술에 의해 증폭된다. 개개 뉴클레오티드들은 초기 DNA에 추가된다. 뉴클레오티드가 테스트된 DNA 단편에 대해 상보적인 경우, 추가되는 뉴클레오티드의 농도 변화가 추적될 수 있다. 이러한 변화는 상보적 뉴클레오티드를 표시하는 임의의 방법에 의해 탐지될 수 있다. 마지막으로, 조합된 데이터를 사용하여 컴퓨터 시스템에 의한 서열 판독을 생성한다.
Description
기술 분야:
본 출원은 반응 전후에 추가되는 뉴클레오티드의 농도 변화 측정에 기초한 DNA 시퀀싱 방법론에 관한 것이다.
배경 기술:
시퀀싱 원리:
DNA 시퀀싱을 위해 기존에 개발된 두 가지 주요 방법론들은 다음과 같다:
1 - 합성에 의한 시퀀싱:
- 생거/다이데옥시 사슬 종결 (Life Technologies, Applied Biosystems)
- 파이로시퀀싱 (Roche/454)
- 가역적 터미네이터 (Illumina )
- 제로 모드 웨이브가이드 (Zero Mode Waveguide) (Pacific Biosciences) 3세대 시퀀싱
2- 올리고 결찰 탐지에 의한 시퀀싱
- SOLiD (Applied Biosystems)
이러한 방법들에 관하여 아래에서 더욱 상세히 설명한다:
1 - 사슬 종결 (생거) 시퀀싱:
이 방법에서, 포스포다이에스터 결합의 형성에 필요한 3'-OH 그룹과 디데옥시뉴클레오티드에 의해 사슬 성장이 종결되는 변형된 DNA 복제 반응이 ddNTPs에 없다. 효소 (DNA 중합효소)를 추가하면서, 프라이머는 ddNTP를 만날 때까지 연장된다. 사슬은 ddNTP의 통합과 함께 끝나게 될 것이다. 적절한 dNTP:ddNTP 비율에서, 사슬은 주형 길이 전체에 걸쳐 종결할 것이다. 모든 종결된 사슬들은 그 반응에 추가되는 ddNTP로 끝날 것이다. 생성된 종결된 사슬들은 전기영동법에 의해 분해된다. 4가지 ddNTP 각각에 대하여 구별되는 염료 또는 "색"이 사용된다. 종결 뉴클레오티드는 색으로 구별될 수 있기 때문에, 4가지 반응 모두가 하나의 시험관에서 실시될 수 있다.
2- 파이로시퀀싱:
각 뉴클레오티드가 각 주기에 차례로 추가된다. 이어서 4가지 중 하나 만이 약한 신호를 생성할 것이다. 다음 주기로의 준비를 위해, 잔부 뉴클레오티드는 효소적으로 제거된다. 약한 신호는 파이로그램에 기록된다.
파이로시퀀싱은 뉴클레오티드 추가시 파이로포스페이트 (PPi)의 방출을 통한 약한 신호 생성에 기반한다.
■ DNA + dNTP → DNA n+1 + PPi
■ PPi는 아데노신 포스포설페이트 (APS)로부터 ATP를 생성하기 위하여 사용된다.
■ APS + PPi → ATP
ATP 및 루시페아제는 루시페린의 옥시루시페린으로의 전환에 의해 빛을 생성한다.
3- 제로 모드 웨이브가이드:
이 방법은 성장하는 DNA 가닥으로 혼입된 직후 각 뉴클레오티드의 동일성 탐지에 기초한 단일 분자 실시간 시퀀싱이다.
4- 결찰에 의한 시퀀싱:
중합효소 대신 연결효소를 사용하여, 프로브 서열들 (올리고뉴클레오티드 대신 DNA 단편들)을 결합한다. 프로브가 추가되면, 형광 신호가 생성된다. 형광에 기반하여 뉴클레오티드의 동일성을 추론할 수 있다. 시퀀싱 방법은 단 하나의 염기에서 이전과 다른 하나 이상의 프라이머를 포함한다.
5- 나노포어 시퀀싱
매우 작은 부피의 공간을 통해 폴리머 분자들을 순차적인 모노머 순서에 따라 이동시키는 나노크기 장치를 사용한다. 이동하는 폴리머의 특징적 특성을 전기 신호로 직접 전환시키는 탐지장치를 포함한다. 변환 및 인식은 실시간으로, 분자별로 발생한다. 이는 수 분 내에 수 천 개의 상이한 분자들을 탐색할 수 있다. 이는 매우 긴 길이의 DNA를 탐색할 수 있다.
6- 합성에 의한 시퀀싱 (Sequencing-By-Synthesis, SBS):
SBS는 중합효소 반응에서 성장하는 DNA 가닥에 혼입된 직후 각각의 뉴클레오티드의 동일성을 탐지하는 것을 포함한다. SBS는 "형광 인 시튜 시퀀싱" (fluorescent in situ sequencing, FISSEQ) 및 파이로시퀀싱 방법을 포함한다.
상이한 형광단이 4가지 염기 각각에 광분해성 링커를 통해 연결된다. DNA 중합효소는 상보적인 단일-뉴클레오티드 유사체를 혼입시킨다. 혼입된 nt에 따라 특유한 형광 방출이 탐지되었다. 형광단은 광화학적으로 후속하여 제거되고 3-OH 기가 화학적으로 재생되어 순환이 진행된다.
본 출원의 새로운 목적:
시퀀싱 원리 및 시퀀싱 기기는 매우 값비싼 툴 및 장치들을 포함한다. 또한, 이러한 기술을 우리의 실험실에서 얻는 것은 쉽지 않다. 이들 방법들 대부분은 어려우며 특정 효소 또는 특정 표지화 방법, 가령, 실험의 비용을 증가시키는 형광 염료를 필요로 한다. 이러한 이유로, 이러한 기술을 단순화시키고 관련 비용을 절감하기 위한 새로운 방법들이 개발 및 도입되어야 한다.
발명의 내용:
새로운 원리는 다음과 같다:
DNA 시퀀싱이라는 용어는 일반적으로 DNA 분자에서 뉴클레오티드 염기 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민의 순서를 결정하는데 사용되는 몇 가지 방법 및 기술에 적용된다. 이는 진단, 생명 공학, 법의학 생물학 및 생물학적 체계, 인간 게놈 시퀀싱 및 인간 게놈 프로젝트와 같은 수많은 응용 분야에 적용된다. 제시된 기기에서, DNA 샘플 단편은 일반적인 PCR 기술에 의해 증폭된다. 개개 뉴클레오티드들은 초기 DNA에 추가된다. 뉴클레오티드가 테스트된 DNA 단편에 대해 상보적인 경우, 추가되는 뉴클레오티드의 농도 변화는 임의의 방법으로 추적될 수 있다.
상기 장치의 상세한 설명:
게놈 DNA 단편들을 고체 담체에 고정시킨다. 각 DNA 단편을 PCR 기술로 증폭시켜, DNA 클러스터를 생성한다. PCR 기술에서, 반응 혼합물의 온도는 PCR 주기 중에, 95℃에서 40-60℃까지, 그리고 특정 수의 주기 동안 최종적으로 72℃까지 변화하여야 한다. 단일 DNA 단편으로부터 유래한 각 클러스터는 단일 시퀀싱 반응으로서 작용한다. 시퀀싱 반응에서, DNA 클러스터는 한 번에 하나의 뉴클레오티드를 추가하여 테스트된다. 뉴클레오티드가 상보적인 경우, 추가되는 dNTP의 농도 변화가 추척될 수 있다. 이러한 변화는 시퀀싱 챔버의 임의의 부분에서 직접 테스트 될 수 있다.
시퀀싱 챔버의 상세한 설명:
1. 증폭되어 상보적 뉴클레오티드에 대해 테스트될 게놈 DNA 단편들을 보유하는 고체 지지체. 이 챔버에는 전기 가열 및 냉각 시스템이 구비되어 있다.
2. 각 DNA 단편을 PCR 기술로 증폭시켜, DNA 클러스터를 생성한다. PCR 기술에서, 반응 혼합물의 온도는 PCR 주기 중에, 95℃에서 40-60℃까지, 그리고 특정 수의 주기 동안 최종적으로 72℃까지 변화하여야 한다.
3. 증폭된 DNA 클러스터에 4가지 유형의 뉴클레오티드 중 하나를 추가함에 필요한 성분들 모두를 각각 보유하는 4가지 상이한 용액들을 4개의 상이한 용기에 넣는다.
4. 시퀀싱 반응에서, DNA 클러스터는 한 번에 하나의 뉴클레오티드를 추가하여 테스트된다. 뉴클레오티드가 상보적인 경우, 농도 변화가 추적될 수 있다. 이러한 변화는 시퀀싱 챔버 내부 또는 외부의 임의의 부분에서 직접 테스트 될 수 있다.
도면의 간단한 설명:
1 - 임의의 방법으로 증폭될 게놈 DNA 단편들을 보유하는 고체 지지체를 함유하는 반응 챔버 (1)
2- 반응 챔버의 온도를 제어하기 위한 임의의 유형의 가열 및 냉각 시스템 (2)
3 - 소프트웨어 프로그래밍을 위한 입력 유닛 및 데이터를 수집하여 제어 유닛에 보내는 반응 챔버 내부 또는 외부의 센서들 (5), (6)에 연결된, 반응 챔버에서 수행되는 모든 과정들을 제어하기 위한 제어 유닛 (4)
4 뉴클레오티드들 중 하나를 한번에 추가하고 세척함으로써 DNA 클러스터를 상보적 뉴클레오티드에 대해 테스트함에 필요한 모든 용액들을 운반하는 액체 및 물 이송 (3) 시스템
5- 뉴클레오티드가 상보적인지 아닌지 테스트함에 그리고 추적될 수 있는 농도 변화를 탐지함에 필요한 모든 유형들의 센서들을 포함하는 센서 (5) 및 (6)에 연결된 측정 유닛 이러한 변화는 시퀀싱 챔버 내부 또는 외부에서 테스트될 수 있다. 이어서 데이터를 수집하고 이를 주 제어 유닛에 보낼 수 있다.
1 - 임의의 방법으로 증폭될 게놈 DNA 단편들을 보유하는 고체 지지체를 함유하는 반응 챔버 (1)
2- 반응 챔버의 온도를 제어하기 위한 임의의 유형의 가열 및 냉각 시스템 (2)
3 - 소프트웨어 프로그래밍을 위한 입력 유닛 및 데이터를 수집하여 제어 유닛에 보내는 반응 챔버 내부 또는 외부의 센서들 (5), (6)에 연결된, 반응 챔버에서 수행되는 모든 과정들을 제어하기 위한 제어 유닛 (4)
4 뉴클레오티드들 중 하나를 한번에 추가하고 세척함으로써 DNA 클러스터를 상보적 뉴클레오티드에 대해 테스트함에 필요한 모든 용액들을 운반하는 액체 및 물 이송 (3) 시스템
5- 뉴클레오티드가 상보적인지 아닌지 테스트함에 그리고 추적될 수 있는 농도 변화를 탐지함에 필요한 모든 유형들의 센서들을 포함하는 센서 (5) 및 (6)에 연결된 측정 유닛 이러한 변화는 시퀀싱 챔버 내부 또는 외부에서 테스트될 수 있다. 이어서 데이터를 수집하고 이를 주 제어 유닛에 보낼 수 있다.
Claims (8)
- 다음을 포함하는 DNA 시퀀싱 장치: 핵산 샘플을 수용하도록 구성된 샘플 홀더, 샘플 온도를 상승시키기 위해 구성된 가열 시스템, 샘플 온도를 낮추기 위해 구성된 냉각 시스템, 그리고 가열 시스템 및 냉각 시스템을 제어하여 원하는 시간-온도 프로파일을 통해 장치를 순환시키기 위해 구성된 제어장치, 또한, 적합한 액체 및 물 이송 시스템을 사용한 각 뉴클레오티드의 추가 전과 후의 dNTP 농도에 대한 정보를 제공하는 임의의 유형의 센서들이 반응 챔버 내부 또는 외부의 임의의 부분에 배치될 수 있음.
- 청구항 1에 있어서, 온도, 및 다른 요인들을 포함한 반응 챔버 내 샘플들의 상태에 관한 정보를 제공하는 임의의 유형의 센서들이 반응 챔버 내부 또는 외부의 임의의 부분에 배치될 수 있음을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 반응 챔버에서 수행되는 모든 과정들을 제어하기 위한 제어 유닛이 소프트웨어 프로그래밍을 위한 입력 유닛 및 데이터를 수집하여 제어 유닛에 보내는 반응 챔버 내부 및 외부의 센서들에 연결됨을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 상기 입력 유닛은 소프트웨어 프로그래밍 및 매개변수 선택을 위한 기기 내부에 배치됨을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 반응 챔버의 온도는 반응 챔버의 온도를 제어하기 위한 임의의 유형의 가열 및 냉각 시스템에 의해 제어됨을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 결과의 보다 큰 정확성 및 재현성을 위해 많은 대조 샘플들이 반응 챔버 내부에 배치될 수 있음을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 각 뉴클레오티드의 추가 전과 후의 농도에 관한 정보를 제공하는 임의의 유형의 센서들이 반응 챔버 내부 또는 외부의 임의의 부분에 배치될 수 있음을 특징으로 하는 장치.
- 청구항 1에 있어서, 특정 수의 샘플들이 존재하지 않음을 특징으로 하는 장치.
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