JP2020528414A - ソホロリピッドの飼料添加物としての使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[0001]本発明は、1つ又は複数のソホロリピッドを含有する飼料添加物組成物と、動物の腸内細菌叢を調節するため及び/又は免疫系機能を支援するための方法であって、1つ又は複数のソホロリピッドを、それを必要としている動物に投与することを含む方法とに関する。より具体的には、本発明は、コクシジウム症、及びクロストリジウム種によって引き起こされる疾患を1つ又は複数のソホロリピッドで処置又は予防するための方法に関する。また本発明は、少なくとも1つのソホロリピッドを含む飼料添加物又は飼料プレミックス組成物にも関する。
[0009]本発明は、動物飼料又は飼料添加物の成分としてのソホロリピッド、並びにそれを含有する組成物、飼料添加物及び飼料に関する。好ましい実施形態では、1つ又は複数のソホロリピッドは経口的に投与される。1つ又は複数のソホロリピッドは、飼料添加物組成物の形態であり得る。別の実施形態では、1つ又は複数のソホロリピッドは、飼料プレミックス製品に添加される。
[0022]本開示をさらに説明する前に、以下に記載される本開示の特定の実施形態は変化させることが可能であり、それでも添付の特許請求の範囲内に包含され得るので、本開示は、これらの特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。また、使用される用語は特定の実施形態を説明することを目的としており、限定することは意図されないことも理解されるべきである。代わりに、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲によって確立されることになる。
[0060]別の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、任意選択的に、1つ又は複数の酵素を含む。酵素は、NC−IUBMBからのハンドブック「Enzyme Nomenclature」(1992)に基づいて分類することができ、インターネット:http://www.expasy.ch/enzyme/のENZYMEサイトも参照されたい。ENZYMEは、酵素の命名に関する情報の宝庫である。これは、主として、International Union of Biochemistry and Molecular Biology(IUB−MB)のNomenclature Committeeの推奨(Academic Press,Inc.,1992)に基づいており、これには、EC(Enzyme Commission)番号が提供された、特徴付けされた各種類の酵素が記載されている(Bairoch A.The ENZYME database,2000,Nucleic Acids Res 28:304−305)。このIUB−MB Enzyme命名法は、その基質特異性と、時折、その分子機構とに基づき;このような分類は、これらの酵素の構造的特徴を反映しない。
[0066]実施形態において、動物飼料組成物は、1つ又は複数の付加的な微生物をさらに含む。特定の実施形態では、動物飼料組成物は、以下の属:ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、バチルス(Bacillus)、ペディオコッカス(Pediococcus)、エンテロコッカス(Enterococcus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、カルノバクテリウム(Carnobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、クロストリジウム(Clostridium)及びメガスフェラ(Megasphaera)又はこれらの任意の組合せのうちの1つ又は複数からの細菌をさらに含む。
[0076]本発明の飼料組成物はさらに、1つ又は複数のアミノ酸を含み得る。動物飼料で使用されるアミノ酸の例は、リジン、アラニン、ベータ−アラニン、スレオニン、メチオニン及びトリプトファンである。
[0078]別の実施形態では、動物飼料は、1つ又は複数のビタミン、例えば、1つ又は複数の脂溶性ビタミン及び/又は1つ又は複数の水溶性ビタミンを含み得る。別の実施形態では、動物飼料は、任意選択的に、1つ又は複数のミネラル、例えば、1つ又は複数の微量ミネラル及び/又は1つ又は複数の多量ミネラルを含み得る。
[0088]本発明の飼料組成物はさらに、着色剤、安定剤、成長改善添加物及び芳香化合物/香味料、多価不飽和脂肪酸(PUFA);活性酸素発生種、抗菌ペプチド及び抗真菌ポリペプチドを含み得る。
[00113]ソホロリピッドは、例えば、HPLC、LC−MS又はNMR分光法によって分析することができる。適切なNMR分光法は以下の通りである:約5mgのソホロリピッド及び内部標準(ジメトキシベンゼン)を4mlバイアル中に秤量することができる(微量天秤により0.001mg以内まで)。サンプルを2mlのMeOD中に溶解させることができる。1HNMRスペクトルは、30秒のパルス間遅延及び16スキャンにより、300Kのプローブ温度で測定される低温プローブを備えた700MHz NMRにおいて記録することができる。適切なLC−MS法は以下の通りである:カラム:逆相(C18)UPLCカラム(1.7μm、100x2.1mm(LxID)及び勾配溶離。カラムは50℃に保たれる。勾配溶離は、水中0.1%のギ酸(A)及びアセトニトリル中0.1%のギ酸を以下のように混合することによって実施される:0〜14分、40%B〜100%B;14〜17分、100%B;17〜17.1分、100%B〜40%B、及び17.1〜20分、40%B。流速は400ul/分である。これらの化合物のイオン化モードとして正イオンAPCIモードが選択され、高分解能質量分析より同定が実施される。定量化は、内部標準補正と組み合わせて外部較正曲線によって実施される。
[00115]種々の濃度(1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、及び20μm)の6つのソホロリピッド:LSL(6’Ac,6’’Ac);ESL(6’OH,6’’Ac);ESL(6’OH,6’’OH);ESL(6’Ac,6’’Ac);BSL(6’OH,6’’OH);及びBSL(6’Ac,6’’Ac)において、Alamar Blueにより細胞生存率を測定した。
[00118]PBLをヒト血液から単離した。異なる濃度(1μm、5μm、及び10μm)の6つのソホロリピッド:LSL(6’Ac,6’’Ac);ESL(6’OH,6’’Ac);ESL(6’OH,6OH);ESL(6’Ac,6’’Ac);BSL(6’OH,6OH);及びBSL(6’Ac,6’’Ac)の存在下で、PBLをLPSで処理して炎症反応を誘発した。
[00122]E22ラット由来の初代ミクログリア培養物からミクログリア細胞を得た。1日目に、ミクログリア細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間接着させた。3日目に、ミクログリア細胞をソホロリピッドで24時間前処理した(n=11)。4日目に、ミクログリア細胞をリポ多糖(LPS)で刺激した。5日目に、上清を採取し、対象のサイトカインについて分析した。
[00125]HT−29細胞(結腸腺癌細胞株)はインビトロで成熟腸細胞と似ているので、これらの細胞を使用した。種々の濃度(1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、及び20μm)の6つのソホロリピッド:LSL(6’Ac,6’’Ac);ESL(6’OH,6’’Ac);ESL(6’OH,6’’OH);ESL(6’Ac,6’’Ac);BSL(6’OH,6’’OH);及びBSL(6’Ac,6’’Ac)において、Alamar Blueにより細胞生存率を測定した。
[00128]動物飼料プレミックス組成物は、20gの少なくとも1つのソホロリピッド組成物を以下のプレミックス(プレミックス1キロ当たり)に添加することによって調製される。
[00130]以下の組成(%,w/w)を有するブロイラー飼育食餌は、成分を混合することによって調製される。小麦、ライ麦及びSBM48は、Moulin Moderne Hirsinque,Hirsingue,Franceから入手可能である。混合した後、飼料は所望の温度、例えば約70℃でペレット化される(3x25mm)。
[00133]概要:食餌のSL処理は、種々の免疫学的分析に基づいて、この試験で使用した用量範囲において成長期の商業用ブロイラー家禽に対して明白な免疫調節性及び有益な効果を示した。SL4は明らかにインビボでの抗寄生虫効果を示し、予備的なインビトロデータはこの結論を裏付けた。さらに、SL処理には腸内の免疫応答及び腸の完全性に対して明白な免疫調節性効果があった。
[00135]商業用ブロイラーニワトリを用いるARSコクシジウム症及び壊死性腸炎(NE)疾患モデルを用いて、DSMからの4つの異なるソホロリピッド(SL)サンプルを評価した。各試験について、負の対照(非感染及び未処置)と、コクシジウム症及びNEの未処置感染対照とを含めた。
[00141][ニワトリ:]
[00142]全部で672羽の1日齢のRoss708雄ブロイラーニワトリ(新たに孵化)をLongeneckerの孵化場(Elizabethtown,PA)から購入した。Beltsville ARS施設に到着したらすぐに、これらを完全無作為化法で12の群に分け、Beltsville Animal Careガイドラインに従ってPetersimeスターターケージに入れ、飼料及び水を自由に与えた。トリを育雛器の囲いの中に14日齢まで保持し、動物福祉のために毎日調査し、実験期間の最後まで保持されるPetersimeフィニッシャーケージに移した。輸送及び感染に関する全ての実験手順は、BARC Small Animal Care Committeeにより承認を受けた。
[00144]全てのニワトリに、1日目から7日目まで、抗生物質を含まない低タンパク質食餌(18%の粗タンパク質、乾燥物質ベース)を与え、7日目から実験の最後まで、高タンパク質食餌(24%の粗タンパク質、乾燥物質ベース)(ARS施設で製造)を与えた。飼料及び水を自由に与えた。補充処理食餌の給餌は0日齢から開始し、実験期間を通して行った。処置レジメンに従って表1に示されるように抗菌製品を飼料に補充した。
[00146]100gのジメチルスルホキシド中に溶解された60gの各ソホロリピッドサンプルに大豆油を添加して、サンプル当たり2000gの総液体量を得た。これに、200ppm(0.02%)の最終濃度に到達するように、5kgの飼料に対して1gのSLをゆっくり添加した。週1回ベースで、200gの大豆油を使用して6gのSLを溶解させ、30kgの飼料混合物を作った。
[00148]15日齢において、トリ1羽につき1x104のE.マキシマ(E.maxima)(Beltsville株41)オーシストで、トリを経口的に感染させた。E.マキシマ(E.maxima)オーシストは、毎月、10,000の胞子形成E.マキシマ(E.maxima)オーシストで2週齢ブロイラーニワトリを経口的に感染させることによって維持され、その純度についてDNA検査が実施される。腸の病変を誘発させるため、及び最適なオーシストの排出を得るために、通常、10,000の胞子形成オーシストを感染に使用し、糞中オーシストの排出は、5dpi〜7dpiのオーシストを毎日集めることによって調べられる。
[00150]実験用NEモデルはARSで開発され、Park et al.,(2008)によって記載されている。15日齢において、トリ1羽につき1x104のE.マキシマ(E.maxima)(Beltsville株41)オーシストで、トリを経口的に感染させた後、4日後(19日齢)に経口的にC.ペルフリンゲンス(C.perfringens)感染(1x109CFU/トリ、netB+del1株)を行い、臨床NE感染を誘発させた。トリを19日齢から高タンパク質食餌に切り替えて、NEの発症を促進した。
[00152]E.マキシマ(E.maxima)感染後5〜7日間、各群からの糞サンプルを採取し、寄生虫の生存に対するソホロリピッドの効果を評価した。McMasterカウンティングチャンバを用いて各処置群についてのオーシストの低減速度を計算した。
[00154]コクシジウム症:E.マキシマ(E.maxima)感染の5日後に、病変スコアを実施した。1つの群につき8羽のトリを安楽死させ、憩室の前方及び後方10cmに延在する約20cmの空腸部分を得た。6人の独立した観察者により盲検的な方法で、腸部分をNE病変について0(なし)〜4(高)のスケールでスコア化した。
[00157]各サンプリング日に安楽死の直後に心臓穿刺によって血液サンプルを採取した(8羽/trt)。4℃において1000rpmで20分間の遠心分離によって血清を分離し、さらに使用するまで血清画分を−20℃で貯蔵した。血清中のニワトリα−1酸性糖タンパク質(α−1−AGP)を、製造業者の説明書に従ってELISA(Life Diagnostics Inc.,West Chester,PA)により測定した。自動マイクロプレートリーダー(Bio−Rad,Richmond,CA)を用いてOD450値を決定した。
[00160]各サンプリング日に処置群につき8羽のトリを無作為に選択し、RNA抽出用腸サンプル(回腸)の採取のために使用して、サイトカイン/ケモカイン及び結合タンパク質発現を測定した。トリを頸椎脱臼により安楽死させ、すぐに腸を取り外した。各トリからの回腸の小部分を無菌で採取し、さらなる使用のために−20℃のRNAlater(登録商標)(Applied Biosystems,Foster City,CA)中で貯蔵した。
[00162]qRT−PCRのために使用したオリゴヌクレオチドプライマー配列は表3に示される。回腸においてその差次的発現が評価される種々のサイトカイン及び腸密着結合タンパク質には、インターロイキン(IL)1β、IL2、IL4、IL6、IL8、IL10、IL13、IL17F、インターフェロン(IFN)γ、腫瘍壊死因子スーパーファミリー(TNFSF)15、結合接着分子(JAM)2、オクルディン、ゾナオクルデンス(zona occludens)(ZO)1、及びムチン2(MUC2)が含まれる。TJタンパク質及びMUC2のプライマー配列は、出典がChen et al.,2015であり、表3Aに示されている。ニワトリサイトカイン/ケモカイン及び密着結合タンパク質の機能の簡単な説明は表3Bに示されている。参照遺伝子として、グリセルアルデヒド−3−ホスファートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)を使用した。Stratagene Mx3000P qPCRシステム(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA)及びRT2SYBR Green qPCRマスターミックス(Qiagen)を用いて、増幅及び検出を実行した。各サンプルをトリプリケートで分析し、テンプレートなしの対照を含めることにより、プライマーの非特異的増幅を点検した。log10希釈RNAを用いて標準曲線を作成し、個々の転写物のレベルは、Q遺伝子プログラムを用いてGAPDHのレベルに対して正規化され得る(Muller et al.,2002)。
[00164]家禽エイメリア・アセルブリナ(Eimeria acervulina)のスポロゾイトを胞子形成オーシストから新たに精製して、Dr.Lillehojの研究室で開発された方法を用いて、生きているスポロゾイトに対するSLの細胞毒性効果を評価した。簡単に、Mini−bead beater(Biospec Products,USA)を用いて、新たな胞子形成オーシストを0.5mmガラスビーズで破壊した。放出されたスポロシストを、Percollグラジエント中の等密度遠心分離により精製し、氷冷Hank平衡塩類溶液(HBSS)中で洗浄し、41℃において0.25%のトリプシン及び0.014Mのタウロコール酸(Sigma,USA)で処理して、生きているスポロゾイトを放出させた。新たに調製されたスポロゾイトをろ過により集め、3,000xg、4℃で10分間、HBSSにより3回洗浄し、HBSS中で1.0x106/mlに再懸濁させた。CO2インキュベーター中、41Cで3時間、種々の濃度のSLサンプルと共に、又は陽性対照としてNKペプチドと共に(NKリジンペプチドはDr.Lillehojの研究室で作られ、スポロゾイトを死滅させる)、集めたスポロゾイトを41℃でインキュベートした。スポロゾイトの生存率を評価するために、FITCで染色した生きているスポロゾイトを用いて、CyQuant直接細胞増殖アッセイ(Thermo Fisher Scientific,USA)を実行し、Synergy HTX(Biotek,USA)を用いて、蛍光を485/528nmで測定した。
[00170][1.エイメリア・マキシマ(Eimeria maxima)誘発性コクシジウム症]
[00185]図5は、壊死性腸炎の2日後の回腸における炎症誘発性サイトカインの発現を示す。
Claims (10)
- 動物の腸内細菌叢を調節するため、及び/又は免疫系機能を支援するための方法であって、1つ又は複数のソホロリピッドを、それを必要としている動物に投与することを含む方法。
- 前記動物が、ニワトリ、ブロイラー、産卵ニワトリ、メンドリ及びヒヨコからなる群から選択される家禽動物である、請求項1に記載の方法。
- コクシジウム症、及びクロストリジウム種によって引き起こされる疾患を軽減、治癒又は予防するために、1つ又は複数のソホロリピッドを含む飼料添加物又はプレミックス組成物を前記動物に投与することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のソホロリピッドが、エチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’’−アセタート;エチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’−アセタート;エチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’−6’’−ジアセタート;ブチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’’−アセタート;ブチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’−アセタート;及びブチル−17−L−[(2’−O−β−D−グルコピラノシル−β−D−グルコピラノシル)−オキシ]−シス−9−オクタデセノアート−6’−6’’−ジアセタートからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 前記1つ又は複数のソホロリピッドが、飼料添加物又は飼料プレミックス組成物の形態で前記動物に投与される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記飼料プレミックス組成物がさらに、
a)1つ又は複数の担体;
b)1つ又は複数の付加的な酵素;
c)1つ又は複数の微生物;
d)1つ又は複数のビタミン;
e)1つ又は複数のミネラル;
f)1つ又は複数のアミノ酸;
g)1つ又は複数の有機酸;及び
h)1つ又は複数の他の飼料成分
からなるリストから選択される1つ又は複数の成分を含む、請求項6に記載の方法。 - 請求項6又は7に記載の少なくとも1つソホロリピッドと、
a)少なくとも1つの脂溶性ビタミン、及び/又は
b)少なくとも1つの水溶性ビタミン、微量ミネラル、及び及び/又は
c)少なくとも1つのミネラル
からなる群から選択される少なくとも1つの付加的な成分とを含む動物プレミックス組成物。 - a)1つ又は複数のアミノ酸;
b)1つ又は複数のプレバイオティクス;
c)1つ又は複数の有機酸;
d)1つ又は複数の付加的な酵素;
e)1つ又は複数のプロバイオティクス
からなるリストから選択される1つ又は複数の成分をさらに含む、請求項8に記載の動物プレミックス組成物。 - 飼料1kg当たり50〜800gの粗タンパク質含量を有し、請求項8若しくは9に記載の少なくとも1つのソホロリピッド、又は請求項7〜9のいずれか一項に記載のソホロリピッドを含有するプレミックスを含む、動物飼料組成物。
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