JP2020521782A

JP2020521782A - ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の治療

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Publication number: JP2020521782A
Application number: JP2019565866A
Authority: JP
Inventors: ヴェロニークリバン，; マルクヴェルレイ，; ゲルン，マリー−エマニュエルル
Original assignee: Biocodex SAS
Current assignee: Biocodex SAS
Priority date: 2017-05-30
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-07-27
Anticipated expiration: 2038-05-30
Also published as: CA3065417A1; JP7395358B2; EP3630093A1; WO2018220068A1; US20200179335A1

Abstract

本発明は、個体におけるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、以下の式（Ｉ）：の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物に関連する。【選択図】なし

Description

本発明は、結節性硬化症等のｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防及び治療に有用な方法及び組成物に関する。

結節性硬化症は、主に脳、心臓、腎臓、腸、皮膚及び肺に良性腫瘍を形成して複数の臓器に影響を及ぼす常染色体優性の遺伝性疾患である。この疾患の発生率は、６０００個体あたりおよそ１個体である。結節性硬化症は、主に、ハマルチンをコードする腫瘍抑制遺伝子ＴＳＣ１、又はツベリンをコードするＴＳＣ２の変異を介して発生する。

腫瘍抑制遺伝子ＴＳＣ１及びＴＳＣ２は、細胞の成長、増殖及び生存並びにタンパク質翻訳を含む、細胞制御プロセスにおいて不可欠な役割を果たす哺乳動物のラパマイシン標的（ｍＴＯＲ）経路の負の制御因子として作用する。結果として、ＴＳＣ１又はＴＳＣ２のいずれかの機能の喪失は、ｍＴＯＲ経路の活動亢進を引き起こす場合があり、それ自体が不適切に制御された細胞成長、異常分化、細胞増殖及び腫瘍発生を引き起こす。

ｍＴＯＲ経路の調節異常により作成された腫瘍は、一般的に過誤腫であり、転移しない。しかしながら、過誤腫に関連する罹患率及び死亡率は、それらの部位に応じて有意であり得る。

結節性硬化症を有する個体に処方される現在の治療剤は、主に症状を緩和及び抑制することを目的としているが、これらの障害の経過には影響を及ぼさない。これらの薬剤は、とりわけ、ラパマイシン及びエベロリムスを含む（Serra et. Al. (2013) Forum Med. Suisse, 13: 696-702）。

よって、ｍＴＯＲ調節異常、特に結節性硬化症又はその原因に対処する代替的な治療剤が依然として必要である。

スチリペントール（Diacomit, １−ペンテン−３−オール，１−（１，３−ベンソジオキソール）−４，４−ジメチル又は４−ジメチル−１−［３，４−メチレンジオキシ−３，４）−フェニル］−１−ペンテン−３−オール）は、他の抗てんかん薬とは構造的に関係のないラセミアリルアルコールである。

スチリペントールは、複数の動物モデルで抗けいれん活性を示してきたが、その臨床活性の範囲は比較的狭い。スチリペントールは、５０ｍｇ／ｋｇ／日の用量でＳＭＥＩ患者において高い奏効率を呈している。最近では、スチリペントールは、二つの二重盲検制御臨床試験において高い有効性を示し、欧州医薬品庁から承認を受けている（Chiron (2000) Lancet 356:1638, 2000）。

本発明は、スチリペントールが成体ラットにおける薬理的に活性化されたｍＴＯＲ経路を阻害することができるという予想外の発見から生じた。

よって、本発明は、個体におけるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、
以下の式（Ｉ）：
［上式中：
- ｎは、１又は２を表し、
- Ａ_１、Ａ_２及びＡ_３は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子又は１から４個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状アルキル基を表し、
- Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、水素原子又は１から４個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状アルキル基を表し、且つ
- Ｙは、−ＯＨ、＝Ｏ又は−ＳＨを表す］
の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物に関連する。

本発明は、予防的又は治療的有効量の少なくとも一つの上記の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物を個体に投与することを含む、個体におけるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療のための方法にも関する。

本発明はまた、ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療を目的とする医薬の製造のための、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物の使用にも関する。

本発明はまた、ｍＴＯＲ経路の少なくとも一つの他の阻害剤と組み合わせた、上記の使用のための上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物にも関する。

本発明はまた、個体におけるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、少なくとも一つの上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、及び任意選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は添加剤を活性物質として含む薬学的組成物にも関する。

本発明の実施態様では、上記の使用のための薬学的組成物は、活性成分として、少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤をさらに含む。

本発明はまた、少なくとも一つの上記の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、並びに、任意選択的に薬学的に許容される担体又は添加剤に関連する、ウォルトマニン、ラパマイシン及びラパマイシンのアナログ、例えばテムシロリムス及びエベロリムスからなる群より選択される少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤を活性物質として含む薬学的組成物にも関する。

本発明はまた、ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における同時、別個又は逐次的な使用のための組み合わせ調製物としての、
- 少なくとも一つの上記の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、及び
- 少なくとも一つの上記のｍＴＯＲ経路の他の阻害剤、
を含有する製品にも関する。

Ｔｗｅｅｎ及び生理食塩水で処理されたコントロールラット（コントロール）、ペンチレンテトラゾールで処理され、ビヒクルで前処理されたラット（ＰＴＺ）、ペンチレンテトラゾールで処理され、スチリペントールで前処理されたラット（ＰＴＺ＋ＳＴＰ）、及びペンチレンテトラゾールで処理され、ウォルトマニンで前処理されたラット（ＰＴＺ＋Ｗｏｒｔ）の海馬のリン酸化Ａｋｔ（Ｐ−Ａｋｔ）と総Ａｋｔの含有量のウェスタンブロット分析を表す。ベータ−アクチンはコントロールとして使用。Ｔｗｅｅｎで前処理されたＮａＣｌで処理された成体ラット（ｎ＝５、白色の棒）、スチリペントールで前処理されたＮａＣｌで処理された成体ラット（ｎ＝５、斜線の棒）、Ｔｗｅｅｎで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝４、黒色の棒）、スチリペントールで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝５、ドット付きの棒）、及びウォルトマニンで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝３、ダイアモンドの棒）の海馬におけるリン酸化Ａｋｔの総Ａｋｔに対する比（縦軸）を表す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。星印（＊）は、Ｔｗｅｅｎ又はスチリペントールのいずれか内のペンチレンテトラゾール対ＮａＣｌのｐ＜０，０５を表す（二元配置ＡＮＯＶＡ、その後Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較）。ハッシュ記号（＃）は、ペンチレンテトラゾール−Ｔｗｅｅｎと比較したペンチレンテトラゾール−ウォルトマニンのｐ＜０，０５を表す（スチューデントｔ検定）。Ｔｗｅｅｎ及び生理食塩水で処理されたコントロールラット（コントロール）、ペンチレンテトラゾールで処理されたラット（ＰＴＺ）、ペンチレンテトラゾールで処理され、スチリペントールで前処理されたラット（ＰＴＺ＋ＳＴＰ）、及びペンチレンテトラゾールで処理され、ウォルトマニンで前処理されたラット（ＰＴＺ＋Ｗｏｒｔ）の海馬のリン酸化Ｓ６（Ｐ−Ｓ６）と総Ｓ６の含有量のウェスタンブロット分析を表す。ベータ−アクチンはコントロールとして使用。Ｔｗｅｅｎで前処理されたＮａＣｌで処理された成体ラット（ｎ＝５、白色の棒）、スチリペントールで前処理されたＮａＣｌで処理された成体ラット（ｎ＝５、斜線の棒）、Ｔｗｅｅｎで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝５、黒色の棒）、スチリペントールで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝４、ドット付きの棒）、及びウォルトマニンで前処理されたペンチレンテトラゾールで処理された成体ラット（ｎ＝３、ダイアモンドの棒）の海馬におけるリン酸化Ｓ６の総Ｓ６に対する比（縦軸）を表す。データは、平均±平均の標準誤差として表される。星印（＊）は、Ｔｗｅｅｎグループ内のペンチレンテトラゾール対ＮａＣｌ、及びペンチレンテトラゾールグループ内のスチリペントール対ビヒクルのｐ＜０，０５を表す（二元配置ＡＮＯＶＡ、その後Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較）。ハッシュ記号（＃）は、ペンチレンテトラゾール−Ｔｗｅｅｎと比較したペンチレンテトラゾール−ウォルトマニンのｐ＜０，０５を表す（スチューデントｔ検定）。

本明細書で意図される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の意味を有し、これは、物体が一又は複数の要素を「含む」場合、言及した要素以外の要素も物体に含めることができることを意味する。反対に、物体が一又は複数の要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｏｆ）」と言われるとき、物体は、列挙された要素に限定され、言及した以外の要素を含めることはできない。

化合物
好ましくは、式（Ｉ）の上記の化合物は、以下の式（ＩＩ）：
［上式中、ｎ、Ａ_１、Ａ_２、Ａ_３及びＲ_１は上記の通りである。］
で表される。

より好ましくは、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の上記の化合物は、以下の式（ＩＩＩ）、すなわちスチリペントール：
で表される。

本発明による好ましいアルキル基は、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基及びｔ−ブチル基を包含する。

Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ又はＦ原子は、本発明による好ましいハロゲン原子である。

参照により本明細書に援用されているフランス特許第２１７３６９１号は、スチリペントールの、特にメチレンジオキシ−３，４−フェニル−１−ジメチル−４，４−ペンテン−１−オン−３から出発する合成を記載している。この教示から式（Ｉ）の他の化合物を合成することは、十分に当業者の通常の技術の範囲内である。

当業者には明らかであるように、上記の式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）は、これらの式に包含される様々な立体異性体又はそれらの混合物、特にそれらのラセミ混合物のいずれかを表す。

よって、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩａ）の化合物、式（ＩＩＩｂ）の化合物、又は式（ＩＩＩａ）の化合物と式（ＩＩＩｂ）の化合物の混合物、特にそれらのラセミ混合物であり得る。

予防及び治療
本明細書で意図される場合、「ｍＴＯＲ経路」は、細胞周期を制御し、ｍＴＯＲタンパク質を伴う細胞内シグナル伝達経路に関する。「ｍＴＯＲ」は、機構的又は哺乳動物のラパマイシン標的に関連し、ＦＫ５０６−結合タンパク質１２−ラパマイシン関連タンパク質１（ＦＲＡＰ１）としても知られている。ｍＴＯＲは、ＭＴＯＲ遺伝子によりコードされる。当業者によく知られているように、ｍＴＯＲは他のタンパク質と結合し、二つの異なるタンパク質複合体、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）及びｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）のコア成分として機能し、異なる細胞プロセスを制御する。特に、両方の複合体のコア成分として、ｍＴＯＲは、細胞成長、細胞増殖、細胞運動、細胞生存、タンパク質合成、オートファジー、及び転写を制御するセリン／トレオニンタンパク質キナーゼとして機能する。ｍＴＯＲＣ２のコア成分として、ｍＴＯＲは、インスリン受容体及びインスリン様成長因子１受容体の活性化を促進するチロシンタンパク質キナーゼとしても機能する。ｍＴＯＲＣ２はまた、アクチン細胞骨格の制御及び維持にも関与している。ｍＴＯＲ経路の上流制御因子、すなわちｍＴＯＲの上流制御因子の例には、特にＰＩ３Ｋ−ＡＫＴが包含される。ｍＴＯＲ経路の下流エフェクター、すなわちｍＴＯＲの下流エフェクターの例には、特にリボソームタンパク質Ｓ６をリン酸化するＳ６キナーゼが包含される。

本明細書で意図される場合、「ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患」という表現は、ｍＴＯＲ経路の制御が損なわれているか又は存在しない任意の疾患に関する。好ましくは、本発明によるｍＴＯＲ経路の調節異常は、ｍＴＯＲ経路の活性化、特に構成的活性化若しくは過剰活性化、又はｍＴＯＲ経路の阻害の不存在、特に阻害の構成的不存在に関する。好ましくは、ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患は、ｍＴＯＲ経路の調節異常に起因するか又はそれにより引き起こされる疾患でもある。

好ましくは、本発明によるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患は、過誤腫症候群である。より好ましくは、本発明によるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患は、結節性硬化症、ＰＴＥＮ関連過誤腫症候群及びポイツ・ジェガース症候群からなる群より選択される。

「結節性硬化症」（ＴＳ）は、当業者によく知られている。それは、「ブルヌヴィーユ結節性硬化症」（ＢＴＳ）、「ブルヌヴィーユ病」又は「結節性硬化症」（ＴＳＣ）としても知られている。

例として、結節性硬化症は、世界保健機構の国際疾病分類第１０版（ＩＣＤ−１０）の段落Ｑ８５．１に分類されている。

その上、結節性硬化症の診断は、確定診断、推定診断又は可能性診断として分類することができ、次のように実行することができる：
- 確定診断：二つの大基準、又は一つの大基準及び二つの小基準。
- 推定診断：一つの大基準及び一つの小基準。
- 可能性診断：一つの大基準、又は少なくとも二つの小基準。

大基準：
・顔面又は額プレートの血管線維腫
・非外傷性爪線維腫又は爪周辺線維腫
・低色素性白斑（３個超）
・粒起革様斑又は複数の膠原腫
・多発性網膜過誤腫
・皮質結節^（ａ）
・上衣下結節
・上衣下巨細胞星状細胞腫
・単一又は複数の心横紋筋腫
・リンパ脈管筋腫症又は腎血管筋脂肪腫^（ｂ）

小基準
・エナメル質にランダムに分布するピット
・過誤腫性腎臓ポリープ^（ｃ）
・骨嚢胞^（ｄ）
・白質遊走線^{（ａ，ｄ，ｅ）}
・歯肉線維腫
・非腎性過誤腫^（ｃ）
・網膜無色斑
・「散在性」皮膚病変
・多発性腎嚢胞
^（ａ）大脳皮質異形成と白質遊走線の共存を基準とみなす。
^（ｂ）リンパ脈管筋腫症と腎血管筋脂肪腫の共存を基準とみなす。
^（ｃ）組織学的確認が推奨される。
^（ｄ）放射線診断で十分である。

結節性硬化症は常染色体優性疾患である。そのため、本発明による結節性硬化症は、好ましくは、ＴＳＣ１遺伝子及び／又はＴＳＣ２遺伝子における突然変異に関係している。

本明細書で意図される場合、「ＰＴＥＮ」は、ホスファターゼ・テンシンホモログに関する。当該技術分野で知られているように、「ＰＴＥＮ関連過誤腫症候群」は、腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮの突然変異から生じる常染色体優性疾患である。本発明によるＰＴＥＮ関連過誤腫症候群は、特に、Ｃｏｗｄｅｎ症候群（ＣＳ）、Ｂａｎｎａｙａｎ−Ｒｉｌｅｙ−Ｒｕｖａｌｃａｂａ症候群（ＢＲＲＳ）、ＰＴＥＮ関連プロテウス症候群（ＰＳ）、及びプロテウス様症候群を含める。

ポイツ・ジェガース症候群は、当該技術分野でよく知られており、ＳＴＫ１１腫瘍抑制遺伝子における突然変異から生じる。

個体
本発明による個体は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。また、好ましくは、本発明による個体は小児又は幼児である。

本発明による個体は、好ましくは、ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の一又は複数の症候を有する。

好ましくは、本発明による個体は、ｍＴＯＲ経路の調節異常を示す。

好ましくは、本発明による個体は、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＰＴＥＮ及びＳＫ１１遺伝子から選択される遺伝子において少なくとも一つの突然変異を示す。

また好ましくは、本発明による個体は、結節性硬化症の少なくとも一つの症候を示す。最も好ましくは、本発明による個体は、確定した結節性硬化症、又は推定される結節性硬化症、又は可能性のある結節性硬化症と診断される。

また好ましくは、本発明による個体は、ＰＴＥＮ関連過誤腫症候群の少なくとも一つの症候を示す。より好ましくは、本発明による個体は、Ｃｏｗｄｅｎ症候群（ＣＳ）及び／又はＢａｎｎａｙａｎ−Ｒｉｌｅｙ−Ｒｕｖａｌｃａｂａ症候群（ＢＲＲＳ）の少なくとも一つの症候及び／又はＰＴＥＮ関連プロテウス症候群（ＰＳ）の少なくとも一つの症候及び／又はプロテウス様症候群の少なくとも一つの症候からなる群より選択される少なくとも一つの症候を有する。

投与
好ましくは、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物は、１００ｍｇから１０００ｍｇ又は５ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの単位用量で投与される。また好ましくは、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物は、１０ｍｇ／ｋｇ／日から２００ｍｇ／ｋｇ／日の投薬レジメンで投与される。

好ましくは、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、上記の使用のための薬学的組成物、上記の薬学的組成物又は上記の医薬は、経口経路による投与に適した形態である。また好ましくは、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、上記の使用のための薬学的組成物、上記の薬学的組成物又は上記の医薬は、粉末、サシェ剤、錠剤又はカプセルの形態である。

本明細書で意図される場合、「薬学的に許容される担体又は添加剤」とは、薬学的組成物に適した任意の材料を指す。好ましくは、本発明による薬学的に許容される担体又は添加剤は、経口投与に適している。好ましくは、本発明による薬学的に許容される担体又は添加剤は、限定されないが、水、グリセリン、アルコール、油性エマルション、水性エマルション、緩衝生理食塩溶液、防腐剤、安定剤及び湿潤剤等の当業者に知られる標準的な薬学的組成物のいずれかを含める。

追加の化合物
本明細書で意図される場合、「ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤」という表現は、症候の一又は複数を緩和すること又はｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患を治療若しくは予防することを目的とする任意の化合物に関する。好ましくは、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤は、ウォルトマニン、ラパマイシン及びラパマイシンのアナログ、例えばテムシロリムス及びエベロリムスからなる群より選択される。

本明細書で意図される場合、「組み合わされた（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）」又は「組み合わせて（ｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、上記の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、特にスチリペントールが、追加の化合物と一緒に、すなわち同じ投与部位で、若しくは別々で、のいずれかで同時に、又は、上記の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物が、個体に対してその薬理的効果を与える期間と、追加の化合物が個体に対してその薬理的効果を与える期間とが、少なくとも部分的に交差することを条件として異なるときに、投与されることを意味する。

本発明は、以下の非限定的な図面及び実施例によりさらに記載される。

本発明による化合物、特にスチリペントールによるｍＴＯＲ経路の調節を調査し、ｍＴＯＲ経路の薬理的阻害剤であるウォルトマニンと比較した。
ｍＴＯＲ経路を二つのレベル：（ｉ）ｍＴＯＲ経路のモジュレーターであるＰＩ３Ｋ−Ａｋｔでの制御の上流レベル、及び（ｉｉ）ｍＴＯＲ経路の直接的な下流エフェクターである、Ｓ６キナーゼの基質の、リボソームタンパク質Ｓ６の下流レベルで調査した。

Ａ．物質及び方法
１．動物
オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｎｖｉｅｒ、２２０−２５０ｇ、ｎ＝２４、生後７週）をこの調査に使用した。それらを１つのケージにつき２匹収容し（Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ参照番号１２９１）、１２時間の明／暗サイクル（午前７時にライトをＯＮにする）で維持した。食料及び水は不断給餌した。
実験動物の使用及び管理のためのEuropean Recommendations （指令２０１０／６３／ＥＵ）に従って、実験を行った。実験プロトコールは、倫理委員会により承認された。

２．薬理学的治療
０．９％ＮａＣｌ中ペンチレンテトラゾール（バッチＭＫＢＶ０７５１Ｖ、ＳＩＧＭＡ）８０ｍｇ／ｋｇを５ｍＬ／ｋｇの注入容量で皮下投与した。

３．試験化合物
ペンチレンテトラゾールの投与の３０分前に、０．９％のＮａＣｌ中１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ中ウォルトマニン（Ｓｉｇｍａ）２．４ｍｇ／ｋｇ、又は５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ８０中スチリペントール（Ｂｉｏｃｏｄｅｘ）３００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射した（１０ｍＬ／ｋｇ）。

４．ウェスタンブロット
ペンチレンテトラゾールの投与の３０分後に動物を屠殺し、海馬を半分に二つに分け、ホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤の混合物を含有する（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０１１１９）ＲＩＰＡバッファー（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５６０３４）中で均一にし、液体窒素中で冷凍した。

各試料のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した。
タンパク質抽出物合計をゲル電気泳動（Ｂｉｏｒａｄ１０％プレキャストゲル、参照番号５６７１０３５、１４μＬ沈殿）により等量（２０μｇ）に分け、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ参照番号１６２０１６７）に移した。

Ｓ６ＲｉｂｏｓｏｍａｌＰｒｏｔｅｉｎ（５Ｇ１０）（ウサギｍＡｂ、１：１０００、Cell Signaling Technology, Danvers, MA）、又はＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６ＲｉｂｏｓｏｍａｌＰｒｏｔｅｉｎ（Ｄ６８Ｆ８）（Ｓｅｒ２４０／２４４）（ウサギｍＡｂ、１：１，０００、Cell Signaling Technology, Danvers, MA）、Ａｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）（ウサギｍＡｂ、１：１０００、Cell Signaling Technology, Danvers, MA）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）（ＸＰウサギｍＡｂ、Cell Signaling）に対する一次抗体で膜を４℃で一晩インキュベートした。

その後、二次抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ結合抗体を使用した。

酵素化学発光（ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔＦｕｓｉｏｎＦＸ５システム）によりシグナルを検出し、Ｂｉｏ−１Ｄソフトウェア（Vilber Lourmat、フランス）を用いて定量分析した。リンタンパク質レベルのシグナルを、総タンパク質に正規化した。

また、各膜を剥離して（ＲｅｓｔｏｒｅＴＭウェスタンブロット剥離バッファー、Thermoscientific）、再プローブして沈殿したタンパク質の総量のコントロールである、ベータ−アクチンタンパク質レベルを検出した。

５．データ分析
データは、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として表される。グループ間の差異は、二元配置ＡＮＯＶＡとその後のＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較によって評価した（前処理因子＝Ｔｗｅｅｎ又はＳＴＰ、処理因子＝ＮａＣｌ又はＰＴＺ）。

Ｔｗｅｅｎ−ペンチレンテトラゾールグループ（ｎ＝５）とウォルトマニン−ペンチレンテトラゾールグループ（ｎ＝３）との間のｔ検定比較により、ウォルトマニンの効果を評価した。
全ての試験について、有意性をｐ＜０．０５に設定した（ＳｉｇｍａＳｔａｔ、ｖ３．５、SPSS, Chicago, USA）。

Ｂ．結果
１．海馬におけるＡｋｔタンパク質リン酸化レベルに対する急性スチリペントール投与の効果
ウェスタンブロット分析は、ビヒクルで前処理されたペンチレンテトラゾールのグループ又はスチリペントールで前処理されたペンチレンテトラゾールのグループのいずれかにおけるリン酸化Ａｋｔの強力なバンドを明らかにした（図１）。反対に、ウォルトマニンで前処理されたペンチレンテトラゾールのグループでは、バンドは見られなかった。総Ａｋｔレベルは、グループ間の統計的な差異を示さず、基準点を提供して全てのデータを正規化した（全グループについて中央値＝３０）。

スチリペントールでの前処理は、総Ａｋｔに関するリン酸化Ａｋｔの比におけるペンチレンテトラゾールに誘導される増加を修正しなかったが（スチリペントール−ペンチレンテトラゾール（２．４６）とＴｗｅｅｎ−ペンチレンテトラゾール（１．８１）との間には統計的な差異はなかった。二元配置ＡＮＯＶＡの後にＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較が続く。）、一方、ウォルトマニンでの処理は、ペンチレンテトラゾールグループ（ｐ＜０．０５、ウォルトマニン−ペンチレンテトラゾール（０．４０）で処理された動物対ビヒクル−ペンチレンテトラゾール（１．８１）で処理された動物、スチューデントｔ検定、図２）における総Ａｋｔに関するペンチレンテトラゾールＡｋｔの比を統計的に有意に減少させる。

２．海馬におけるＳ６タンパク質リン酸化レベルに対する急性スチリペントール投与の効果
ウェスタンブロット分析は、ＰＴＺグループにおけるリン酸化Ｓ６タンパク質のバンドを明らかにした（図３）。ウォルトマニンで前処理されたＰＴＺグループ又はスチリペントールで前処理されたＰＴＺグループのいずれにおいても、バンドは見られなかった。総Ｓ６レベルは、グループ間の差異を示さず、基準点を提供して全てのデータを正規化した（平均値０．９から１．３）。

ＳＴＰでの前処理は、総Ｓ６タンパク質に関するリン酸化Ｓ６の比における増加を統計的に有意にブロックした（ｐ＜０．０５、ＰＴＺグループ内のＳＴＰ（０．３６）で処理された動物対ビヒクル（０．７９）で処理された動物、二元配置ＡＮＯＶＡの後にＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較が続く。）。

同様に、ウォルトマニンでの前治療は、ＰＴＺグループにおけるＳ６リン酸化レベルの増加をブロックした（ｐ＜０．０５、ウォルトマニン−ＰＴＺ（０．３０）で治療された動物対ビヒクル−ＰＴＺ（０．７９）で治療された動物、スチューデントｔ検定、図４）。

これらの結果は、スチリペントールが、Ａｋｔレベルの下流で、特定のレベルでｍＴＯＲ経路を阻害することができたことを示唆している。

Claims

個体におけるｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、以下の式（Ｉ）：
［上式中：
- ｎは、１又は２を表し、
- Ａ_１、Ａ_２及びＡ_３は、同一であっても異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子又は１から４個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状アルキル基を表し、
- Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、独立して、水素原子又は１から４個の炭素原子を有する直鎖状若しくは分岐状アルキル基を表し、且つ
- Ｙは、−ＯＨ、＝Ｏ又は−ＳＨを表す。］
の化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩ）：
［上式中、ｎ、Ａ１、Ａ２、Ａ３及びＲ１は、請求項１に規定される通りである。］
のものである、請求項１に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
式（Ｉ）の化合物が式（ＩＩＩ）：
のものである、請求項１又は２に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患が過誤腫症候群である、請求項１から３のいずれか一項に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
ｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患が、結節性硬化症、ＰＴＥＮ−関連過誤腫症候群及びポイツ・ジェガース症候群からなる群より選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤と組み合わされた、請求項１から５のいずれか一項に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
ウォルトマニン、ラパマイシン、及びラパマイシンのアナログ、例えばテムシロリムス及びエベロリムスからなる群より選択された少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤と組み合わされた、請求項１から６のいずれか一項に記載の、使用のための化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物。
個体における請求項１、４及び５のいずれか一項に記載のｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、
- 活性成分として、少なくとも一つの、請求項１から３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、及び
- 任意選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は添加剤
を含む、薬学的組成物。
- 活性成分として、少なくとも一つの、請求項１から３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、及び
- 活性成分として、少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤、及び
- 任意選択的に少なくとも一つの薬学的に許容される担体又は添加剤
を含む、薬学的組成物。
少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤が、ウォルトマニン、ラパマイシン及びラパマイシンのアナログ、例えばテムシロリムス及びエベロリムスからなる群より選択される、請求項９に記載の薬学的組成物。
個体における請求項１、４及び５のいずれか一項に記載のｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における使用のための、請求項９又は１０に記載の薬学的組成物。
個体における請求項１、４及び５のいずれか一項に記載のｍＴＯＲ経路の調節異常に関連する疾患の予防又は治療における同時、別個又は逐次使用のための組み合わされた調製物としての、
- 少なくとも一つの、請求項１から３のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、及び
- 少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤、
を含有する製品。
少なくとも一つの、ｍＴＯＲ経路の他の阻害剤が、ウォルトマニン、ラパマイシン及びラパマイシンのアナログ、例えばテムシロリムス及びエベロリムスからなる群より選択される、請求項１２に記載の製品。
化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物がｍＴＯＲ経路を阻害する、請求項１から８又は１１から１３のいずれか一項に記載の、使用のための、化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、薬学的組成物、又は製品。
個体が、ＴＳＣ１遺伝子及び／又はＴＳＣ２遺伝子において少なくとも一つの突然変異を示す、請求項１から８又は１１から１４のいずれか一項に記載の、使用のための、化合物又はその薬学的に許容される塩、水和物若しくは溶媒和物、薬学的組成物、又は製品。