JP2020519260A - マイクロ流体力学ベースの３ｄバイオプリンティングのためのデバイスおよび方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、バイオインク溶液、バイオインク溶液のゲル化を誘導することができる緩衝液、マイクロ粒子および／またはナノ粒子を含む分散物を混合し、形成されたヒドロゲルをノズルから排出することによる、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび方法に関する。本発明は、さらに、ヒドロゲルを得る方法に関する。本発明は、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび方法であって、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび３Ｄ物体を構築するための方法が先行技術の１つまたは複数の問題を克服する、デバイスおよび方法を提供する。

Description

技術分野
本発明は、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび方法に関する。本発明は、さらに、ヒドロゲルを得る方法に関する。

背景
３Ｄプリンティングテクノロジーを、例えば、医薬分野および組織工学分野において組織様構造体を構築するために適用することができる。一般に、これらの方法は、３Ｄバイオプリンティングと呼ばれる。典型的には、合成（例えば、ポリマー）または天然のプリンティングインクが使用される。また、アルギネートなどの植物由来材料を使用することができる。特に、天然材料を使用する場合、バッチ毎に大きなばらつきがある可能性があり、このばらつきは、バイオプリントされた３Ｄ構造体の再現性および持続可能性に影響を及ぼす。

３Ｄバイオプリンティングでは、通常、３Ｄでプリントするためにプレポリマー粘稠溶液が使用され、プリント後、３Ｄ構築物の重合のためにイニシエーターまたは（ＵＶまたは可視）光のいずれかが使用される。バイオインクが３Ｄバイオプリンティングに適切であるためには、いくつかの重要な要因がある。これらの要因には、生体適合性、生物模倣構造、生分解性、多孔度、および機械的強度が含まれる。

近年、３Ｄバイオプリンティングは進歩しているが、３Ｄ物体をプリントするためのデバイスおよび方法は依然として改善の余地がある。

発明の概要
本発明の目的は、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび方法であって、３Ｄ物体を構築するためのデバイスおよび３Ｄ物体を構築するための方法が先行技術の１つまたは複数の問題を克服する、デバイスおよび方法を提供することである。

本発明の第１の態様は、メモリに保存された物体の描写（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）から３Ｄ物体を構築するためのデバイスであって、
−バイオインク溶液、特にペプチド溶液を取り込むように構成された第１の入口、
−前述のバイオインク溶液のゲル化、好ましくは、前述のバイオインク溶液の即時ゲル化を誘導することができる緩衝液を取り込むように構成された第２の入口、
−分散物を取り込むように構成された第３の入口、
−ヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを得るために前述のバイオインク溶液、前述の緩衝液、および前述の分散物を混合するための流体ダクト、および
−前述の３Ｄ物体を構築するためにヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを排出するように構成されたノズル
を含むデバイスを提供する。

デバイスは、所望の三次元構造を有する３Ｄ物体を構築するようにノズルをガイドする３Ｄアームを含み得る。物体の描写を保存するメモリは、デバイスの一部であり得る。他の実施形態では、メモリは、デバイスの外部メモリである。

好ましくは、デバイスは、２つまたはそれを超えるアームを含み、これらのアームは、三次元に移動することができ、少なくとも２つまたは３つの軸を含み得る。複数のロボットアームを組み込むことにより、異なる材料を同時にプリントすることが可能であり、したがって、総プリント時間を短縮することができる。

実施形態では、第１の入口を、バイオインク溶液を有するタンクに取り付けることができ、そして／または第２の入口を、緩衝液を有するタンクに取り付けることができる。緩衝液は、特に、リン酸緩衝液であり得る。

バイオインクは、細胞外基質環境を模倣する材料を指す。バイオインクは、哺乳動物細胞の接着、増殖、および分化を支持するのに適切であり得る。バイオインクは、さらなる製造プロセス（例えば、３Ｄプリンティング）中にフィラメントとして堆積する能力を有し得る。

バイオインク溶液は、ペプチドが天然アミノ酸配列ではなく合成アミノ酸配列から作製されたペプチド溶液であり得る。かかるバイオインクは、身体様材料に酷似させることができ、したがって、免疫学的問題および炎症の可能性が回避される。

流体ダクトは、マイクロ流体チャネルであり得る。特に、流体ダクトの直径は、１０００μｍ未満、好ましくは２００μｍ未満であり得る。

第１の態様のデバイスを、ペプチドベースのバイオインクと共に使用することができ、このデバイスは、３Ｄバイオプリンティングのための固有かつ新規の組み合わせを提供する。ペプチドベースのバイオインクの利点は、これらのインクが合成アミノ酸配列であり、身体様材料に酷似していることである。特に、即時ゲル化が可能な優れた物理的および化学的性質を有する、天然ではない合成の、対費用効果の高いペプチドバイオインクを提供することができる。

物体の描写は、バイオインク溶液と緩衝液との間の混合レベルについての情報を含み得る。例えば、描写は、物体の第１の領域において、バイオインク溶液と緩衝液との間で２：１の比を使用すべきであり、第２の領域の領域において、バイオインク溶液と緩衝液との間で１：１の比を使用すべきであるという情報を含み得る。

描写はまた、ペプチドヒドロゲルを排出するために使用すべき圧力または流速についての情報を含み得る。

第１の態様のデバイスを使用して、適切なｐＨ、イオン組成、および容積モル濃度を用いた最適な生理学的環境で３Ｄの組織足場または構造体を作製することができ、したがって、ネイティブな細胞の機能が保護され、化学的イニシエーターまたは光重合（ＵＶ光または可視光での処理）を使用する既存の印刷デバイスを超える利点が得られる。

ペプチドバイオインクはまた、３Ｄ構造体中に、種々の機能を果たすことができる異なる材料（例えば、ペプチド微粒子（マイクロ粒子）またはナノ粒子、金ナノ粒子または銀ナノ粒子、ナノワイヤ、グラフェン、カーボンナノチューブ、および量子ドット）をプリントすることが可能である。例えば、構築された構造体を、ペプチドヒドロゲルの画像化、センシング、触媒作用、および機械的性質の変化のために使用することができる。ナノ材料プリントの多用途性は、量子ドットのプリントおよび３Ｄプリントされた構造体中の銀ナノ粒子のｉｎ−ｓｉｔｕ合成によって証明される。

第１の態様のデバイスは、材料科学分野および生体医用工学分野（再生医学、組織工学、創傷治癒（創傷部位でのプリンティング）、組織および臓器のプリンティング、補綴学、医療移植片、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、ならびに薬物試験およびバイオセンシングのための３Ｄ組織モデルなど）において適用することができる。

第１の態様のデバイスを、プリントした組織構築物を直ちに必要とする患者に提供するために、手術室で手術中に直接使用することもできる。第１の態様のデバイスに基づいたプラットフォームは、プリンティングデバイスが物体の画像を撮影し、これを使用者の仕様にしたがってプリントすることが可能な３Ｄ画像再構築システムも含み得る。

好ましくは、ノズルは流体ダクトを含む。好ましくは、流体ダクトは、ノズル内に配置されている。例えば、流体ダクトを、ノズルの軸に沿って配置することができる。流体ダクトを、ノズルの内側で終了するように配置することができる。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスの第１の実装では、流体ダクトは、バイオインク−分散物混合物を得るためにバイオインク溶液および分散物を混合するための第１の領域ならびにバイオインク−分散物混合物を緩衝液と混合するための第２の領域を含む。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスの第２の実装では、分散物は、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、例えば、初代ヒト皮膚線維芽細胞を含むことができる。

好ましくは、細胞培養培地は、複数の細胞型を含む。他の実施形態では、細胞培養培地は、たった１つの細胞型を含む。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスの第３の実装では、分散物は、マイクロ粒子および／またはナノ粒子、好ましくはペプチドマイクロ粒子、ペプチドナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、ナノワイヤ、量子ドット、および／またはカーボンナノチューブを含む。

異なる薬物を装填したペプチドマイクロ粒子またはナノ粒子を、３Ｄプリントした構造体中の薬物送達を制御するために使用することができる。銀ナノ粒子、金ナノ粒子、ナノワイヤ、量子ドット、およびカーボンナノチューブなどの他のタイプのナノ粒子を使用する利点は、これらのナノ粒子が３Ｄプリントしたペプチドヒドロゲル構造体に画像化能、センシング能、および触媒能を付与することができることである。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスの第４の実装では、複数の細胞型がペプチドマイクロ粒子中に封入され、そして／またはペプチドマイクロ粒子上、特に、ペプチドマイクロ粒子表面上に固定化される。

ペプチドマイクロビーズ中の複数の細胞の封入およびその後のペプチドヒドロゲルを用いた３Ｄプリンティングの利点により、３Ｄ構築物中に異なる細胞型を正確に配置可能である。これにより、３Ｄバイオプリントした構築物に必要な３Ｄプリントした構築物の血管新生を増加させることが可能である。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスのさらなる実装では、デバイスは、マイクロ流体の流体ダクトを加熱するように構成された加熱モジュールをさらに含む。

加熱モジュールは、ノズルまたは加熱ジャケット周囲を包むように巻きつけたコイルを含み得る。加熱モジュールを、流体ダクトを６０℃超、好ましくは８０℃超まで加熱するように構成することができる。

第１の態様のデバイスのさらなる実装では、デバイスは、マイクロミキサーをさらに含む。前述のマイクロミキサーを使用して、３Ｄバイオプリントした構築物の全域に細胞がより均一に分布するようにペプチド／バイオインク溶液および細胞の混合を強化することができる。前述のマイクロミキサーを、バイオインク溶液および細胞／分散物を混合するために流体ダクト中、特に、前述の第１の領域中に配置して、バイオインク−分散物混合物を得ることができる。

デバイスはまた、加熱モジュールおよびマイクロミキサーを含み得る。

第１の態様のデバイスのさらなる実装では、デバイスは、マイクロ流体の流体ダクトを照射するように構成された１つまたは複数の発光体をさらに含む。

発光体を、他の構成要素を加熱することなくペプチドヒドロゲルを加熱するように構成することができるか、より迅速なゲル化のための化学的プロセスを開始するために使用することができる。特に、流体ダクトを、発光体からの光が流体ダクトを通過することができるか、ノズル出口の端部に光の焦点を合わせることができるように透明な材料で取り囲むことができる。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスのさらなる実装では、発光体は、第１の波長を有する第１のＬＥＤおよび前述の第１の波長と異なる第２の波長を有する第２のＬＥＤを含む。

デバイスを、第１および第２のＬＥＤを個別に切り替えられるように構成することができる。したがって、異なる光吸収スペクトルを有する流体ダクト中の異なる構成要素を、個別に加熱または活性化することができる。

第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスのさらなる実装では、バイオインク溶液は、１つまたはいくつかのペプチドを含み、前述のペプチドは、好ましくは、以下：
ａ）Ｚ_ｏ−Ｘ_ｎＢＸ_ｍＷ−Ｚ’_ｐ、および
ｂ）Ｚ_ｏ−ＷＸ_ｍＢＸ_ｎ−Ｚ’_ｐ、
（式中、
ＺはＮ末端保護基であり、Ｚ’はＣ末端保護基であり、ここで、ｏおよびｐは、０および１から独立して選択され；
Ｘは、各存在で独立して、イソロイシン、ノルロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、ホモアリルグリシン、およびホモプロパルギルグリシンから選択される脂肪族アミノ酸であり、ここで、ｎおよびｍは、０、１、および２から独立して選択される整数であり、但し、ｍ＋ｎ≦２であり、
Ｂは、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択される芳香族アミノ酸であるか、前述の芳香族アミノ酸の脂肪族対応物であり、前述の脂肪族対応物は、シクロヘキシルアラニン、４−ヒドロキシ−シクロヘキシルアラニン、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルアラニンから選択され、

Ｗは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、トレオニン、アロトレオニン、セリン、ホモセリン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、リジン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリジン、ヒスチジン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、およびＮ（６）−カルボキシメチルリジンから選択される極性アミノ酸であり、
前述の極性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、および２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択される）から選択される一般式を有する。

かかるペプチドの例は、ＩＶＺＫ、ＩＶＦＫ、ＩＶＹＫ、およびＦＩＶＫなどである。アルギネートも使用することができる。

実験において、これらの構成要素が３Ｄプリンティングに特に適切であることが示された。

本発明の第２の態様は、３Ｄ物体をプリントする方法、好ましくは、３Ｄ物体をプリントするｉｎ ｓｉｔｕ方法を指す。前述の方法は、
−バイオインク溶液、特にペプチド溶液、細胞培養培地、および前述のバイオインク溶液のゲル化を誘導することができる緩衝液を混合して、ヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを得る、混合する工程、および
−前述のヒドロゲル、特に前述のペプチドヒドロゲルをノズルから排出させて、３Ｄ物体を構築する、排出する工程を含む。

本発明の第２の態様の方法を、本発明の第１の態様の３Ｄ物体をプリントするためのデバイスによって実施することができる。本発明の第２の態様の方法のさらなる特徴または実装により、本発明の第１の態様およびその異なる実装形態にしたがって３Ｄ物体をプリントするためのデバイスの機能を発揮することができる。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法の第１の実装では、混合する工程を、流体ダクト、特にマイクロ流体チャネル中で実施し、ここで、好ましくは、ノズルは流体ダクトを含む。

流体ダクトは、構成要素間の混合が改善される要素を流体ダクト内に含み得る。例えば、要素を、流体ダクト内に乱流が生じて混合を改善することができるように構成することができる。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法自体の第２の実装において、または第２の態様の第１の実装によれば、ノズルは、マイクロ流体の流体ダクトを含む。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法自体の第３の実装において、または第２の態様の前述の実装のうちのいずれかによれば、ペプチドヒドロゲルを排出するために空気圧および／またはマイクロ流体ポンプを使用する。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法自体の第４の実装において、または第２の態様の前述の実装のうちのいずれかによれば、前述の方法は、３Ｄソース物体をスキャンする初期工程をさらに含む。

３Ｄソース物体の３Ｄスキャンを得ることにより、前述の方法は、ソース物体に酷似する標的物体を作製することができ、したがって、３Ｄコピー法としての役割を果たし得る。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法自体の第５の実装において、または第２の態様の前述の実装のうちのいずれかによれば、細胞培養培地は複数の細胞型を含む。

第２の態様の３Ｄ物体をプリントする方法のさらなる実装では、分散物は、マイクロ粒子および／またはナノ粒子、好ましくは、ペプチドマイクロ粒子、ペプチドナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、ナノワイヤ、量子ドット、および／またはカーボンナノチューブを含む。

好ましい実施形態では、本発明の方法を、生理学的条件下で行う。

本発明の方法で用いる即時ゲル化を誘導することができる緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水または塩（単数または複数）（塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなど）を含む緩衝液（単数または複数）であり得る。

３Ｄ物体をｉｎ ｓｉｔｕでプリントする方法の１つの実装では、バイオインク溶液は、上記定義のペプチド溶液である。

本発明のさらなる態様は、ヒドロゲルを得る方法であって、
−バイオインク溶液、特にペプチド溶液を、第１の入口（４１０）を介して第１のエアブラシ（４０１）中に供給する工程、
−前述のバイオインク溶液のヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルへの即時ゲル化を誘導することができる緩衝液を、第２の入口（４２０）を介して第２のエアブラシ（４０２）中に供給する工程、および
−前述のバイオインク溶液および前述の緩衝液を、前述の第１のおよび前述の第２のエアブラシ（４０１、４０２）のノズル（４１１、４２１）を介して、表面上の同一部位に同時に吹き付け、それにより、前述のヒドロゲル、特に前述のペプチドヒドロゲルを作製する、吹き付ける工程
を含む方法を指す。

ヒドロゲルを得る方法の第１の実装では、バイオインク溶液は、本明細書の上記に規定されるペプチド溶液である。

ヒドロゲルを得る方法のさらなる実装では、即時ゲル化を誘導することができる緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水または塩（単数または複数）（塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなど）を含む緩衝液（単数または複数）である。

ヒドロゲルを得る方法のさらなる実装では、エアブラシを、本発明の第１の態様として本明細書の上記に規定されるデバイスと共に使用する。

エアブラシを、本明細書中に規定される本発明のデバイスと共に使用することができる。エアブラシを、ハンドヘルドデバイスとして使用することもできる。

バイオインク溶液および緩衝液を、好ましくは、ヒドロゲルを形成する表面（創傷部位など）上に直接噴霧する。

特に、エアブラシを、表面（創傷部位など）上へのペプチドヒドロゲルの直接噴霧のための図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示すロボットアームなどのデバイスと共に使用することができる。エアブラシアセンブリを、表面（創傷部位など）上にペプチドヒドロゲルを直接噴霧するためのハンドヘルドデバイスとして使用することもできる。

発明の実施形態の技術的特徴をより明確に例証するために、実施形態の説明のために提供した添付の図面を以下に示す。以下の説明中の添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態にすぎず、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく、これらの実施形態の修正が可能である。
図１Ａは、３Ｄバイオプリンターを使用したペプチドヒドロゲル形成の略図である。図１Ｂは、マイクロ流体ポンプに取り付けることができる３つの異なる入口を含むマイクロ流体プリントノズルの２枚の写真である。図１Ｃは、ロボットアーム上に装着した特別に設計されたホルダー中のマイクロ流体プリンティングデバイスを示す。図１Ｄは、３Ｄバイオプリンターを使用したＩＶＺＫペプチドバイオインクおよびヒト皮膚線維芽細胞を含むプリントした構造体を示す。 図１Ｅは、３Ｄ物体を構築するためのデバイスの略図である。 図２は、３Ｄ物体を構築するための２つのデバイスを示し、ここで、第１のデバイスは加熱ユニットを含み、第２のデバイスは光処理モジュールを含む。 図３Ａは、図１Ａにも示したペプチドバイオインクの３Ｄバイオプリンティングのために開発したデバイス／ノズルの略図である。図３Ｂは、３Ｄバイオプリントした構築物の全域に細胞がより均一に分布するようにペプチドおよび細胞の混合を強化するために使用することができるマイクロミキサー（２４０）を含むデバイス／ノズルの略図である。図３Ｃ〜Ｈは、デバイス／ノズルの異なる領域、すなわち、以下： （Ｃ）マイクロミキサー（２４０）および主ノズル、 （Ｄ）マイクロミキサー（２４０）、緩衝液ノズル、および主ノズル、 （Ｅ）緩衝液ノズルおよび主ノズル、 （Ｆ）ヒドロゲルを形成するための細胞、ペプチド、および緩衝液の混合、（Ｇ）および（Ｈ）必要に応じてペプチドゲル化プロセスの温度を制御するための、デバイス／ノズル（Ａ）および（Ｂ）上のマイクロヒーター（２２０）分解図を示す。 図４Ａは、異なるペプチドまたは細胞型のプリントのための複数のノズルを備えた複数のロボットアームを含む３Ｄバイオプリンタープラットフォームの略図である。 図４Ｂ ロボットアーム３Ｄバイオプリンティングの装備。この図は、バイオセーフティキャビネット内の、マイクロ流体ポンプ、ロボットアーム、およびプリンティングノズルを示すロボット３Ｄバイオプリンターの写真を示す。全てのバイオプリンティング実験を、バイオセーフティキャビネット内で実施した。 図４Ｃ ３Ｄ構造体を作製するための、市販のデュアルアームロボットシステム上に設置し、マイクロ流体ポンプと一体化したバイオプリンティングノズルの模式図。３Ｄスキャナは、構造体をスキャンし、情報をコンピュータに送信し、コンピュータ内のソフトウェアが３Ｄ構造体の画像を再構築する。次いで、ロボットアームが３Ｄ構造体のデザインにしたがってノズルを移動させて最終的な３Ｄ形状を作製する。ステージは温度制御されており、可動式で異なる方向に移動し、異なる方向に回転することもできる。 図５は、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫ）の円形、四角形、格子、およびレター／テキストなどの異なる形状への印刷適性を示す。全図中のスケールバーは１０ｍｍである。 図６Ａおよび６Ｂは、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用してバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の蛍光共焦点顕微鏡法の２Ｄおよび３Ｄ画像である。 図７は、バイオインクとしてＩＶＦＫペプチド、ＩＶＺＫペプチド、およびアルギネートを使用して３Ｄバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞におけるＡＴＰレベルから測定した細胞生存度アッセイである。 図８ ３Ｄバイオプリントしたペプチドヒドロゲル中のナノ材料のｉｎ−ｓｉｔｕ合成および封入。図８Ａは、３ＤバイオプリントしたＩＶＺＫペプチドバイオインクの内側にｉｎ−ｓｉｔｕで生成した銀ナノ粒子を示す。１ｍＭ硝酸銀溶液をＩＶＺＫバイオインクと混合後、ＵＶ曝露によるバイオプリンティングを２５４ｎｍで１０分間行った。バイオプリントされたテキストの黄色がかった色は、銀ナノ粒子の形成に起因する。図８Ｂ、Ｃは、銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）画像を示す。ｉｍａｇｅＪを使用してＴＥＭ画像から計算した平均直径は４．４ｎｍであった。図８Ｄ、Ｅ ３６５ｎｍでのＵＶ励起を使用しない場合（Ｄ）および使用した場合（Ｅ）の、ペプチド溶液中に緑色量子ドットを封入した後の３ＤバイオプリントしたＩＶＺＫペプチドバイオインク。図８Ｆ 足場内側のペプチド繊維上に吸着している緑色量子ドットからの放出を示し、３Ｄバイオプリントしたペプチドバイオインク（ＩＶＺＫ）の繊維状網を明確に示している共焦点顕微鏡法画像。 図９は、ヒト皮膚線維芽細胞の代表的な蛍光共焦点顕微鏡法画像を示す。 図９は、ヒト皮膚線維芽細胞の代表的な蛍光共焦点顕微鏡法画像を示す。 図１０は、３Ｄプリントしたペプチドヒドロゲル構築物の走査型電子顕微鏡法研究を示す。 図１１Ａ 異なる細胞培養日数でＩＶＦＫ、ＩＶＺＫ、およびアルギネート−ゼラチンの各バイオインクを使用して３ＤバイオプリントしたＨＤＦｎ細胞の蛍光共焦点顕微鏡法画像（核を青色で示し、Ｆ−アクチンを赤色で示し、ビンキュリンを緑色で示す）。 図１１Ｂ 細胞を培地中で２１日間培養した後の１日目および２１日目にプリントしたヒドロゲルの写真。図１１Ｃ 種々の時点でＩＶＦＫ、ＩＶＺＫ、およびアルギネート−ゼラチンの各バイオインクで３ＤバイオプリントしたＨＤＦｎ細胞の３Ｄ細胞生存度アッセイ。 図１２Ａ 異なる細胞培養日数でＩＶＺＫバイオインクおよびアルギネート−ゼラチンバイオインクを使用して３Ｄバイオプリントしたヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）の蛍光共焦点顕微鏡法画像（核を青色で示し、Ｆ−アクチンを赤色で示し、ビンキュリンを緑色で示す）。図１２Ｂ 種々の時点でＩＶＺＫバイオインクおよびアルギネート−ゼラチンバイオインクで３ＤバイオプリントしたＢＭ−ＭＳＣ細胞の３Ｄ細胞生存度アッセイ。 図１３Ａ エアブラシを使用してペプチドおよびリン酸緩衝液の両方を噴霧するための作用様式の略図。エアブラシのノズルは、ペプチド溶液およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の両方の流れがノズルから排出され、一定の位置で組み合わされてペプチドヒドロゲルが作製されるような角度に整列されている。 図１３Ｂ Ｐｅｒｓｐｅｘシートから作製されたケーシング中に、両ノズルからの流れが１つの位置で合流するような角度で組み立てられた２つのエアスプレーブラシのノズルの写真。１つのノズルはペプチド溶液（５ｍｇ／ｍｌ ＩＶＺＫ）を含み、第２のノズルはリン酸緩衝液（１０×）を含んでいた。 図１３Ｃ シリコン表面に噴霧したペプチドヒドロゲルの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）。ＳＥＭ画像により、ペプチド繊維網の形成が確認された。

実施形態の詳細な説明
図１Ａは、３Ｄバイオプリンターを使用したペプチドヒドロゲル形成の略図である。バイオインク溶液および異なる細胞型を含む細胞培養培地を、第１の領域で混合する。次いで、混合物を、マイクロ流体の流体ダクトである第２の領域中にて緩衝液と混合してゲル化を誘導し、ペプチドヒドロゲルを形成する。次いで、ペプチドヒドロゲルを出口ノズルから排出する。緩衝液は、リン酸緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））であり得る。

生物学的適用のためにペプチドバイオインクを使用する利点には、非身体様材料（例えば、ポリマー）または天然であるがヒトをバックグラウンドとしない不明確な材料（甲殻類、植物などに由来するアルギネート）（バッチ毎に大きなばらつきがあり、バイオプリントした３Ｄ構造体の持続可能性に影響を及ぼす）と比較して、天然の身体様特徴に類似することが含まれる。また、生体官能化は、ポリマー構造体よりもペプチド化合物に円滑に適合し、付与することができる。ペプチドバイオインクはまた、異なる材料（例えば、ペプチドマイクロ粒子またはナノ粒子、金ナノ粒子または銀ナノ粒子、ナノワイヤ、グラフェン、カーボンナノチューブ、および量子ドット）に添加し、引き続いて３Ｄ構造体にプリントすることが可能であり、それにより、種々の機能を発揮することができる。例えば、構築された構造体を、ペプチドヒドロゲルの画像化、センシング、薬物送達、触媒、および機械的性質の調整のために使用することができる。

図１Ｂは、マイクロ流体ポンプに取り付けることができる３つの異なる入口を含むマイクロ流体プリントノズルの写真である。３Ｄ構築物全体に細胞を均一に分布させるためのノズルを取り付けた内径２５０μｍの管ループ中に細胞を予め装填した。

図１Ｃは、３Ｄ構造体をプリントすることができる市販のロボットアーム上に装着した特別に設計されたホルダー中のマイクロ流体プリンティングデバイスを示す。ペトリ皿に接近したノズルニードルは、ペプチドヒドロゲルバイオインクを３Ｄ円形にプリントするために使用される。

図１Ｄは、３Ｄバイオプリンティングデバイスを使用してプリントしたＩＶＺＫペプチドバイオインクおよびヒト皮膚線維芽細胞を含む構造体を示す。

図１Ｅは、３Ｄ物体を構築するためのデバイス１００を詳細に示す。このデバイスは、バイオインク溶液、リン酸緩衝生理食塩水、および分散物（例えば、細胞培養培地）を取り込むための３つの入口１１２、１１４、１１６を含む。３つの入口１１２、１１４、１１６は、流体ダクト１１０に取り付けられており、流体ダクト１１０は、第１の部分１１０Ａおよび第２の部分１１０Ｂを含む。第１の入口１１２由来のバイオインク溶液および第３の入口１１６由来の分散物が共に第１の部分１１０Ａに運ばれる。次いで、これら２つの構成要素の混合物が第２の部分１１０Ｂを押し進み、第２の入口１１４由来のリン酸緩衝液と合流する。第２の部分１１０Ｂは、出口ノズル１２２に向かうマイクロ流体の流体ダクトを形成し、ここで混合物がデバイス１００から排出される。本明細書中の流体ダクトという用語は、バイオインクおよび他の構成要素を導くか運搬し、他の構成要素（単数または複数）と混合することができる任意の管、カナル、パイプ、または導管を指す。

図２は、３Ｄ物体を構築するための２つのデバイス２００Ａ、２００Ｂを示す。両方のデバイスは、バイオインク溶液を取り込むための第１の入口２１２、リン酸緩衝生理食塩水を取り込むための第２の入口２１４、および細胞培養培地に溶解した異なる細胞型を取り込むための第３の入口２１６を含む。デバイス２００Ａ、２００Ｂはまた、ノズル２２２内に配置した流体ダクト２１０を含む。流体ダクト２１０は、バイオインク溶液、リン酸緩衝生理食塩水、および細胞培養培地を受け取る。３つの構成要素を流体ダクト内で混合してペプチドヒドロゲルを得る。次いで、ペプチドヒドロゲルがノズル２２２の出口から排出される。

第１のデバイス２００Ａは、加熱ユニット２２０を含み、この加熱ユニットは、ノズル２２２周囲を包み、したがって、流体ダクト２１０を包んでいる加熱ワイヤを含む。

第２のデバイス２００Ｂは、発光体２３０を含み、この発光体は、ノズル内の流体ダクト２１０を照射するように構成されている。ノズル２２２は、完全に透明な材料から作製されている。他の実施形態では、流体ダクト内の材料に光を照射することができるように、ノズル２２２の一部のみが透明である。

図３は、デバイス／ノズルの異なるデザインを示す。２タイプのデバイス／ノズルを使用してペプチドを３Ｄバイオプリントすることができる。デバイス／ノズル１（図３Ａ、図１Ａにも示す）は、２つの混合領域を含む。第１の領域では、ペプチド溶液および細胞を含む細胞培養培地が混合され、第２の領域では、ＰＢＳが導入されてペプチドの即時ゲル化が誘導され、その結果、細胞がペプチドヒドロゲル内に封入される（図３Ａ）。原理上は、この方法を使用して任意の細胞型を３Ｄバイオプリンティングのために使用することができる。デバイス／ノズル２（図３Ｂ）は、マイクロミキサー（２４０）を含み、このマイクロミキサーは、ペプチドおよび細胞の混合を強化して３Ｄ構築物の内側により均一に細胞を分布させることができる。図３Ｃ〜Ｆは、異なるデバイス／ノズル領域のさらなる詳細を示す。図３Ｇおよび図３Ｈは、図３Ａおよび図３Ｂに示すデバイス／ノズル上の、デバイス／ノズルの温度を制御するためのマイクロヒーター（２２０）のアセンブリを示す。

図４Ａは、異なるペプチド型または細胞型のプリントのためのプリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂを備えた２つのロボットアーム３４２Ａ、３４２を含む３Ｄバイオプリンティングプラットフォーム３００の略図である。図４Ａに示すプリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂを、図２に示すように実装することができる。

３Ｄバイオプリンティングプラットフォーム３００は、プリントすべき物体３１０をスキャンするように構成された３Ｄスキャナ３２０を含む。物体３１０のスキャン後、３Ｄスキャナは、物体の描写３２２を、ロボットアーム３４２Ａ、３４２Ｂ、マイクロ流体ポンプ３４０、およびプリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂを制御するための制御モジュール３３０に伝送する。プリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂは、加熱および冷却する自動化ステージ３５０上に標的物体３５２をプリントするように配置されている。自動化ステージ３５０は、例えば、ペトリ皿または多穴プレート中にプリントするための複数のホルダーを含み得る。本発明の３Ｄプリンティングおよびデバイスおよび方法が任意の特定のまたは具体的な３Ｄパターンや３Ｄ物体に制限されないことに留意されたい。本発明を、任意の３Ｄ物体のために使用することができる。

プリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂは、フレキシブルチューブ３４６を介してマイクロ流体ポンプに取り付けられている。３つの構成要素をプリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂ中で混合することができるように、３つの構成要素の各々に１つの管が存在する。

他の実施形態では、単一のロボットアームは、複数のノズルを備えることができる。２つのみのロボットアームを図４Ａに示す。複数の細胞型をプリントするためのさらなるロボットアームを含めることができる。

プリンティングプラットフォーム３００を、ペプチドベースのバイオインクと組み合わせて使用することができ、異なる細胞型または他の生体化合物を優れた生体適合性を有する３Ｄ構造体に連続的にプリントすることが可能である。

プリンティングプロセスは、マイクロ流体ポンプまたは空気圧を使用してバイオインク溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および異なる細胞型（例えば、ヒト皮膚線維芽細胞）を含む細胞培養培地を個別の流体ダクト中に移動させ、混合後、細胞を含むペプチドベースのヒドロゲルが３Ｄバイオプリンティング用のノズルまたは出口から押し出される工程に基づき得る。

ロボットアーム３４２Ａ、３４２Ｂは、ノズルから押し出されたペプチドバイオインクを使用して、３Ｄスキャナによって送信された物体情報をプリンするために、３Ｄデザインに応じてＸ、Ｙ、およびＺ方向に移動する。２つから３つまたはそれを超えるロボットアームの組み合わせを使用して、複数のペプチドバイオインクを並行してプリントすることができるか、複数の細胞型を同時または異なる時間間隔で１つずつプリントすることができる。さらに、３Ｄ構造体をプリントするために、１つのロボットアーム上に、例えば、２つまたは３つのノズルを装着することができる。このような方法で、機能が完全な臓器／組織構築物に必要な複数の細胞機能を単一の３Ｄバイオプリントした構造体中に導入することができる。

ロボットアーム３４２Ａ、３４２Ｂの各々は、４つのヒンジ３４５Ａ、３４５Ｂを含み、したがって、プリンティングデバイス３４４Ａ、３４４Ｂを配置するときに高い可動性が得られる。

現在利用できる３Ｄバイオプリンターは、主にリニアシステム（インクジェットバイオプリンターシステムなど）に基づいており、このシステムは三次元ｘｙｚ移動に制限される。したがって、これらのシステムにより３自由度（ＤＯＦ）または３軸システムが得られる。ロボットシステムは、ＤＯＦ数を増加させることによって可動性を増大させることができるというリニアシステムを超える利点を有する。ロボットシステムは、３軸ロボットから４軸ロボットなど、最大７軸ロボットにすることが可能である。図４Ａのシステムは、２つのロボットアームを有し、したがって、さらなる自由度が得られ、リニアシステムまたは１ロボットアームシステムと比較したときに移動角度を追加することが可能である。図４Ａのシステムの変形形態では、ロボットアームのベースもアーム自体の周囲を回転することができ、１３軸または１４軸のプリンティングシステムに可動性が増大される。

ロボットアームに迅速な回転運動が組み込まれているので、本システムは、より迅速で円滑なプリントが可能である。自由度を追加することにより、プリントされたバイオマテリアルの品質が向上する。複数のロボットアームに、異なるタイプのバイオインクまたは細胞型をプリントするための複数のノズルを具備することができる。ロボットアームはまた、既存の３Ｄバイオプリンターよりも小型であり、より容易に運搬できる。これは、異なる手術室で操作する場合のプリンターの輸送において有利である。このシステムを、形成手術、再建手術、および美顔整形手術に適用するために使用することができる。

図４Ｂは、ポンプを使用した市販のロボットアーム上のデバイス／ノズルの別の組込み例を示す。さらなる例としてこの装備を使用してヒト皮膚線維芽細胞をＩＶＺＫおよびＩＶＦＫペプチド溶液と共に３Ｄバイオプリントした。

より詳細には、ロボットアーム３Ｄバイオプリンターを使用して、正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ）の３Ｄバイオプリンティングを行った。マイクロ流体ポンプ、プリンティングノズル、およびロボットアームを一体化することによってバイオプリンターを開発した（図４Ｂ）。市販のロボットアーム３Ｄプリンター（Ｄｏｂｏｔ Ｍａｇｉｃｉａｎ，Ｄｏｂｏｔ）を、ロボットアームのポリマー押出し機をバイオプリンティングノズルと交換することによってバイオプリンターに変換した。マイクロ流体プリントノズルを、異なる内径を有する２つの異なる注射針を使用して調製した（図４Ｂ）。主ニードル（１８ゲージ）は内径＝８４０μｍを有し、上部ニードルは、内径８０μｍ（３４ゲージ）および外径１９０μｍを有する。主ニードルの側部に２つの穴を作製し、細胞を流すためのＰＴＦＥ管の外径と同一のサイズの穴を作製することにより、内径３０４μｍのＰＴＦＥ管（ＰＴＦＥ＃３０ＡＷＧ薄肉チューブ，Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）を、主ノズルの片側から挿入した。ニードルの反対側に、内径５５０μｍのＰＴＦＥ管（ＰＴＦＥ＃２４ＡＷＧ薄肉チューブ、Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）を挿入し、ペプチド溶液を流すために使用した。透明なエポキシを使用して管および上部ノズルを密封した。プリンティングノズルは、３つの入口および１つの出口を有する。異なる直径のニードルの組み合わせを使用して、異なる直径を有する異なるプリンティングノズルを調製することもできる。ペプチド溶液および細胞培養培地（異なる細胞型を含む）の入口のための管を、両方の流体をこの領域で混合することができるように主ニードルの側壁に挿入した。第２のニードル（３４Ｇ）を、このニードル由来の溶液（１０×ＰＢＳ）が他の２つの溶液と混合して主ニードルの端部付近にペプチドヒドロゲルが作製されるように、上部から主ニードル（１８ゲージ）の内側に挿入した。主ニードルの長さは２．５ｃｍであり、細胞を有する緩衝液およびペプチドの混合領域は、およそ２．０ｃｍであった。細胞を有する緩衝液およびペプチドの混合領域を、ペプチドヒドロゲルが作製されるように調整することができる。長さ２．０ｃｍは、ノズル内側のペプチドヒドロゲルの形成に応じて変動させることができる。

３Ｄ構造体を作製するためにマイクロ流体ポンプと一体化した市販のデュアルアームロボットシステムを使用したさらなる装備を図４Ｃに示す。３Ｄスキャナは、構造体をスキャンし、情報をコンピュータに送信し、コンピュータ内のソフトウェアが３Ｄ構造体の画像を再構築する。次いで、ロボットアームが３Ｄ構造体のデザインにしたがってノズルを移動させて最終的な３Ｄ形状を作製する。ステージは温度制御されており、可動式で異なる方向に移動し、異なる方向に回転することもできる。

さらに、ＩＶＺＫおよびＩＶＦＫなどのペプチドを、エアスプレーノズルの組み合わせを使用して、異なる表面上に直接噴霧することもできる。図１３Ａは、両方の溶液（ペプチド溶液およびリン酸緩衝生理食塩水）が一定の位置で合流してペプチドヒドロゲルを形成するような角度で２つのエアブラシノズルを使用して噴霧するシステムの略図を示す。図１３Ｂは、かかるエアスプレーノズルの例を示す。図１３Ｃは、シリコンウエハー上に噴霧したＩＶＺＫペプチドの走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像を示す。ＳＥＭ画像は、エアスプレーノズルを使用したペプチド繊維網の形成を明確に示していた。異なるペプチドを単独か異なる細胞型と組み合わせて創傷表面上に自動的に直接コーティングするために、スプレーノズルを、ロボットアームシステム（図４Ａ〜Ｃに示すシステムなど）上に組み込むことができる。スプレーノズルを、創傷上に直接噴霧するためのハンドヘルドデバイスとして使用することもできる。

３Ｄ／４Ｄバイオプリンティング法を使用した技術の例を示すための実験を行った。

ペプチド溶液およびリン酸緩衝液の調製
全てのペプチド（Ｂａｃｈｅｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液を、異なる量のペプチド（ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫ）を１ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解し、ボルテックスによって３０秒間混合して均一な溶液を得ることによって新たに調製した。この実施例では、１５ｍｇの各ペプチドをＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０倍濃縮）をＳｉｇｍａから入手し、プリンティングプロセスで入手時の状態で使用した。

ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫペプチドの相対分子質量はそれぞれ５４６．７１および５５２．７６であり、純度は９７．１％および９７．２％（ＨＰＬＣ法によって決定）であった。

細胞培養
新生児ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ、Ｃ００４５Ｃ）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡから購入した。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足した培地１０６（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して最初に培養した。Ｔ１７５またはＴ７５の細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）を使用して、９５％空気および５％ＣＯ_２を有する加湿インキュベーター中にて３７℃で細胞を維持した。およそ８０％コンフルエンスでのトリプシン処理によって細胞を継代した。細胞培養培地を４８時間毎に置換した。

マイクロ流体プリントノズルの作製
マイクロ流体プリントノズルを、直径１００μｍ、１５０μｍ、２３０μｍ、３００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、６００μｍ、７００μｍ、８００μｍ、１ｍｍ、および１．２ｍｍから選択される異なる内径を有する４つの異なる注射針を使用して調製した。プリンティングノズルは、３つの入口および１つの出口を有する。各溶液（粘度）に応じて、または、書き込まれている構造体よりも薄いか広い構造体がプリントされる結果に応じて、異なる直径のニードルの組み合わせを使用して、異なる直径を有する異なるプリンティングノズルを調製することができる。出口を含む中央のニードルの両側面に２つの穴を作製した。ペプチド溶液および細胞培養培地（異なる細胞型を含む）の入口のためのニードルを、両方の流体をこの領域で混合することができるように主ニードルに挿入した。特定の長さを有する第３のニードルを、このニードル由来の溶液（１０×ＰＢＳ）が他の２つの溶液と混合してペプチドヒドロゲルが作製されるように、上部から挿入した。

プリンティング手順
プリンティングは、ペプチド溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および異なる細胞型などの３つの異なる構成要素を含む。ペプチドに関して、異なる濃度のＩＶＺＫペプチドまたはＩＶＦＫペプチドの溶液を、異なる量のペプチド（例えば、１５ｍｇ）を秤量し、１ｍｌ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解することによって調製した。第２の溶液は、１０×ＰＢＳを含んでいた。第３の溶液は、細胞培養培地中に初代ヒト皮膚線維芽細胞を含んでいた（例えば、５００μｌのＤＭＥＭ細胞培養培地中に４００万個の細胞を含む）。初代ヒト皮膚線維芽細胞を使用して細胞プリンティングを示した。初代ヒト皮膚線維芽細胞の場合について記載のように、他の細胞型をプリンティングプロセスに同様に組み込むことができる。３つ全ての溶液を、異なる流速でシリンジポンプを使用してノズルに圧送した。バイオインクをゲル化させる界面で３つの溶液が合流し、プリンティングノズルの出口からペプチドヒドロゲルが排出されるように流速を調整した。特定の実験では、使用した流速は、皮膚線維芽細胞を含む細胞培養培地については２０μｌ／分、ペプチド溶液については２５μｌ／分、および１０×ＰＢＳについては２０μｌ／分であった。直径約１０ｍｍおよび厚さ約２ｍｍの簡潔な環構造が、多層様式でのペプチドヒドロゲルの堆積によってプリントされた。異なる構造、例えば、円形および四角形および格子を、３Ｄプリンターまたはロボットアーム３Ｄプリンターを移動させることによって直ちにプリントした。

図５は、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫ）の円形および四角形、格子、またはレター／テキストなどの異なる形状への印刷適性を示す。

構築物を、３５ｍｍ組織培養ペトリ皿上にプリントした。バイオプリンティング後、構築物を、ペプチドバイオインクの自己集合をさらに促進するためにバイオセーフティキャビネット中に３分間入れた。次いで、構築物を、培養培地で２回または３回穏やかに洗浄した。各皿に、３ｍＬの培養培地を添加し、加湿インキュベーター中にて３７℃、５％ＣＯ_２で培養した。予め決定していた時点で、構築物を取り出し、３Ｄアッセイおよび蛍光共焦点顕微鏡法研究のための細胞の細胞骨格染色を実施した。

走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）分析
ＳＥＭ分析のために、ペプチドヒドロゲルリングを、シリコンウエハー小片（２０×２０ｍｍ）上に直接３Ｄプリントした。試料を最初に３．７％パラホルムアルデヒド溶液を用いて３０分間固定した。次いで、ペプチドヒドロゲルリングを、異なる濃度のエタノール（１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９９．８％）で逐次洗浄してヒドロゲルから水を除去した。試料を、臨界点乾燥機で乾燥させてエタノールを蒸発させ、ヒドロゲルの構造を保存した。この後にスパッタコーターを使用して４ｎｍのＰｔ／Ｐｄ金属でコーティングした。最後に、それぞれ１０ｋＶおよび２ｋＶの加速電圧を使用したＱｕａｎｔａ ３Ｄ ＦＥＧ ＳＥＭ／ＦＩＢ顕微鏡およびＭａｇｅｌｌａｎ（商標）ＸＨＲ ＳＥＭを使用して試験した。

細胞骨格染色
ヒト皮膚線維芽細胞を含む３Ｄ円形構築物の細胞骨格染色を、培養１、３、７、および１４日後に異なる時間間隔で行った。簡潔に述べれば、３Ｄ構築物を３．７％パラホルムアルデヒド溶液で３０分間処理して細胞を固定した。その後、細胞を冷細胞骨格緩衝液（３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００ｍＭスクロース、および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ溶液）中で１０分間インキュベートして細胞膜を透過処理した。透過処理した細胞を、ブロッキング緩衝液（５％ＦＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中にて３７℃で３０分間インキュベートし、その後にＦＩＴＣ−ファロイジン（１：２００）中にて３７℃で１時間インキュベートした。さらに、構築物をＤＡＰＩ中にて３７℃で１時間インキュベートして、細胞の核を対比染色した。蛍光共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０倒立共焦点顕微鏡，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、３Ｄ構築物中の標識したヒト皮膚線維芽細胞を画像化した（図６を参照のこと）。

図６Ａは、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用してバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の蛍光共焦点顕微鏡法画像を示す。図６Ｂは、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用してバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の蛍光共焦点顕微鏡法３Ｄ画像を示す。

１４日間にわたる進捗を、図９に示す。特に、図９は、ペプチドベースのバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用してバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の代表的な蛍光共焦点顕微鏡法画像（左パネル）およびペプチドベースのバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用してバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の蛍光共焦点顕微鏡法３Ｄ画像（右パネル）を示す。細胞を、蛍光顕微鏡法研究のためにＦ−アクチン（緑色）および核（青色）について染色した。ＩＶＺＫを使用してプリントした構造体を、１、３、５、７、および１４日間培養した。２Ｄおよび３Ｄの共焦点顕微鏡法画像を、同一試料上の異なる位置で撮影した。

さらなる実験では（図１１Ａおよび図１２Ａを参照のこと）、培養１、３、７、１４、および２１日後に免疫染色を実施した。簡潔に述べれば、細胞を３．７％パラホルムアルデヒド溶液で３０分間固定し、冷細胞骨格緩衝液（３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３００ｍＭスクロース、および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳ溶液）中で１０分間インキュベートして細胞膜を透過処理した。透過処理した細胞を、ブロッキング緩衝液中にて３７℃で３０分間インキュベートした。ブロッキング緩衝液は、５％ＦＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳを含む。次の工程では、細胞を、抗ビンキュリン（１：１００）溶液中にて３７℃で１時間インキュベートし、抗マウスＩｇＧ（全分子）−ＦＩＴＣおよびローダミン−ファロイジン（１：２００）中にて３７℃で１時間さらにインキュベートした。最後に、細胞を、ＤＡＰＩ中にて３７℃で１０分間インキュベートして、核を対比染色した。蛍光色素処理した細胞を、レーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０倒立共焦点顕微鏡，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して画像化した。（Ｓｕｎｄａｒａｍｕｒｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖ．，２０１５，５，６９２０５‐６９２１４）。

３Ｄ細胞増殖アッセイ
図７は、バイオインクとしてＩＶＦＫペプチド、ＩＶＺＫペプチド、およびアルギネートを使用して３Ｄバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞におけるＡＴＰレベルから測定した細胞生存度アッセイを示す。

ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光３Ｄ細胞生存度アッセイを、異なる培養日数後（１、３、７、および１４日後）にヒト皮膚線維芽細胞を含む３Ｄプリントした構築物に対して行った。この方法を使用したＡＴＰの定量により、構築物中に存在する代謝的に活性な細胞についての情報が得られる。各時点後、３Ｄ構築物を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で２回洗浄した。等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光試薬および新鮮な細胞培養培地を試料に添加した。内容物を２分間混合して３Ｄヒドロゲル構築物を消化し、さらに１０分間インキュベートした。最後に、プレートリーダー（ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を記録した（図７を参照のこと）。

また、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光３Ｄ細胞生存度アッセイを実施して、３Ｄヒドロゲル中のヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）の生存数を決定した。各時点後、ｈＢＭＳＣと共に培養したヒドロゲルを、ＤＰＢＳで２回洗浄した。新鮮な培地を各ウェルに添加し、等量のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光試薬もゲルに添加した。内容物を５分間混合してヒドロゲルを消化し、次いで、３０分間インキュベートした。インキュベーション後、プレートリーダー（ＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して発光を記録した（図１２Ｂを参照のこと）。

３Ｄ構築物中のナノ材料の組込みおよびｉｎ ｓｉｔｕ合成
本発明者らは、ペプチドバイオインク内にナノ材料をプリントすることによる、四量体ペプチドを使用した３Ｄバイオプリンティング法の多用途性を示す。図８Ａは、３Ｄバイオプリントした構築物の内側への銀ナノ粒子のｉｎ−ｓｉｔｕ合成を示す。ペプチドバイオインクにより銀イオンに十分な核形成部位が得られ、ＵＶ照射後、３Ｄ構築物の内側に銀ナノ粒子が形成された。銀ナノ粒子の形成は、透明なバイオプリントしたテキストと比較して（図５、下のパネル）、３Ｄバイオプリントしたテキストにおいて黄色がかった色として出現した（図８Ａ）。

図８Ｂおよび８Ｃは、ＩＶＦＫペプチドバイオインクの３Ｄプリントした構築物中の銀ナノ粒子のｉｎ−ｓｉｔｕ合成によって調製された銀ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を示す。３Ｄ構造体を、ＩＶＦＫペプチドおよび硝酸銀（１ｍＭ）の混合物を使用してプリントし、その後にＵＶ光照射を使用して、銀ナノ粒子を生成した。

図８Ｆは、プリントした構造体に異なるナノ材料を組み込むことができることを示す、ペプチドバイオインク（ＩＶＺＫ）を使用して３Ｄプリントした緑色量子ドットの蛍光共焦点顕微鏡法画像を示す（図８Ｄおよび８Ｅも参照のこと）。これは、ペプチドベースのバイオインクを使用して３Ｄプリントした構造体中にナノ材料をｉｎ−ｓｉｔｕ合成することができることを示す。

量子ドットおよびナノ粒子などの異なるナノ材料を、このプリンティング法を使用して３Ｄペプチドヒドロゲル中に組み込むことができる。一例として、ストレプトアビジン修飾ＣｄＳｅ／ＺｎＳ量子ドット（ＱＤ５２５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をペプチド溶液と混合し、前述と同一の手順を使用して３Ｄプリントした。蛍光共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０倒立共焦点顕微鏡，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、構築物中の量子ドットの存在を確認した（図８Ｆ）。量子ドットの励起波長は４０５ｎｍであり、発光極大波長は５２５ｎｍであった（緑色）。別の例では、銀ナノ粒子を、ＵＶ処理（２５４ｎｍ）を使用して３Ｄペプチドヒドロゲル構築物中にｉｎ ｓｉｔｕで生成した。硝酸銀溶液（ＡｇＮＯ_３、１ｍＭ）をペプチド溶液と混合し、プリント後、ＵＶ光（２５４ｎｍで１０分間）を使用して、構築物中に銀ナノ粒子を生成した（図８Ｂおよび８Ｃ）。この場合、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の代わりに１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ８．５）を使用した。

透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）研究
ＴＥＭ研究を、３００ｋＶ放出銃を備えたＦＥＩ Ｔｉｔａｎ Ｇ２ ８０−３００ＣＴを使用して行った。ｉｎ ｓｉｔｕで生成した銀ナノ粒子を含む３Ｄ構築物のＴＥＭ試料を、清潔な綿棒を使用して炭素コーティングした銅格子上に３Ｄ構築物のほんの一部を移すことによって調製した。格子を、通常の風乾で一晩乾燥後、画像化した（図８Ｂおよび８Ｃ）。

図１０は、３Ｄプリントしたペプチドヒドロゲル構築物の走査型電子顕微鏡法研究を示す。環を示すための低倍率画像を得るために（上）、Ｑｕａｎｔａ ３Ｄ ＦＥＧ ＳＥＭ／ＦＩＢ顕微鏡を使用した（１０ｋＶ）。高解像度画像を得るために、Ｍａｇｅｌｌａｎ（商標）ＸＨＲ ＳＥＭを使用した（２ｋＶ）。

さらに、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦｎ）を、直径約８ｍｍおよび厚さ１．２ｍｍの簡潔な環状構造体に多層様式で３Ｄバイトプリントした。３Ｄバイオプリントした構築物を、２１日目まで培養して、ペプチドバイオインクの生体適合性を試験した。コントロールとして、市販の３Ｄバイオプリンターを用いて、ＨＤＦｎを、バイオインクとしてアルギネート−ゼラチン使用して同一の３Ｄ円形に３Ｄバイオプリントした。蛍光共焦点顕微鏡法画像は、３Ｄバイオプリントしたヒト皮膚線維芽細胞の細胞骨格染色を示した（図１１Ａ）。アクチン網から明らかなように、ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫでバイオプリントしたＨＤＦｎ細胞が、アルギネート−ゼラチンと比較して、培養２１日後の拡大が優れていることが認められた（図１１Ａ）。培養１４日後および２１日後に、ＩＶＺＫにおいて、Ｆ−アクチンは、十分に拡大し、進展し、明白であったが、ＩＶＦＫにおいては、Ｆ−アクチンは高密度であったが、あまり明白ではなかった。培養１４日後および２１日後に、アルギネート−ゼラチンにおけるＦ−アクチン発現は、ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫと比較して、相対的に低く、あまり明白ではなかった。

細胞培養後の３Ｄバイオプリントした構築物の形状忠実性は、３Ｄバイオプリントした構築物の品質を査定するための別の極めて重要なパラメーターである。ペプチドバイオインクを用いてプリントした環構造体は、その形状を培養２１日後に維持していた（図１１Ｂ）。さらに、３Ｄ細胞生存度アッセイ（図１１Ｃ）を実施して、バイオプリントした構築物が３ＤでＨＤＦｎ細胞の増殖を支持する可能性を定量的に評価した。これらの結果は、全てのバイオプリントした構築物が時間依存性に細胞増殖が増加することを示した。細胞数は、ＩＶＺＫ、ＩＶＦＫ、およびアルギネート−ゼラチンの間で培養７日目まで類似していた（図１１Ｃ）。培養１４日後および２１日後に、ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫ中の細胞増殖は類似していたが、アルギネート−ゼラチンよりは高かった。これは、アルギネート−ゼラチンバイオインクと比較してＩＶＦＫおよびＩＶＺＫのナノ繊維状構造体が未変性ＥＣＭに類似することに起因して、ＩＶＦＫおよびＩＶＺＫが細胞に自然な指示を送り、分裂および成長のためのより広い表面積を提供することを示す。また、これらのペプチドヒドロゲルは、より多くの細胞に適応し、そして生存度を維持するのに十分な多孔度を有する。対照的に、アルギネート−ゼラチンは、ナノ繊維状の構造を保有せず、また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでより迅速に分解する。

本発明者らの３Ｄバイオプリンティング法の多用途性および他の細胞型にも使用される可能性を示すために、本発明者らは、ＩＶＺＫバイオインクを使用してヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＢＭＳＣ）を３Ｄバイオプリントし、これをアルギネート−ゼラチンバイオインクと比較した。蛍光共焦点顕微鏡法および３Ｄ生存度アッセイは、ペプチドバイオインクがアルギネート−ゼラチンバイオインクと比較してより良好に細胞増殖させることを示した（図１２）。

ペプチドスプレー
２つのエアスプレーブラシのノズルを、Ｐｅｒｓｐｅｘシートから作製されたケーシング中に、両ノズルからの流れが１つの位置で合流するような角度で組み立てた（図１３ＡおよびＢ）。１つのノズルはペプチド溶液（５ｍｇ／ｍｌ ＩＶＺＫ）を含み、第２のノズルはリン酸緩衝液（１０×）を含んでいた。両方の流れがシリコンウエハー表面上で遭遇したときにペプチドヒドロゲルが形成された。噴霧したペプチド足場を乾燥させ、最後に、走査型電子顕微鏡法を使用して画像化して、ペプチドヒドロゲルの繊維状網を研究した（図１３Ｃ）．

図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃに示すように、創傷部位などの表面上にペプチドヒドロゲルを直接噴霧するために、エアブラシを、ロボットアームなどのデバイスと共に使用することができる。エアブラシアセンブリを、表面（創傷部位など）上にペプチドヒドロゲルを直接噴霧するためのハンドヘルドデバイスとして使用することもできる。

前述の説明は本発明の実装様式のみを記載しており、本発明の範囲をこれに制限しない。当業者は、任意の変形または置換を容易に行うことができる。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲の保護範囲の影響下にあるものとする。

Claims (24)

1. メモリに保存された描写から３Ｄ物体（３５２）をプリントするためのデバイス（１００、２００Ａ、２００Ｂ、３４４Ａ、３４４Ｂ）であって、
   −バイオインク溶液、特にペプチド溶液を取り込むように構成された第１の入口（１１２、２１２）、
   −前記バイオインク溶液のゲル化、好ましくは、前記バイオインク溶液の即時ゲル化を誘導することができる緩衝液を取り込むように構成された第２の入口（１１４、２１４）、
   −分散物を取り込むように構成された第３の入口（１１６、２１６）、
   −ヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを得るために前記バイオインク溶液、前記緩衝液、および前記分散物を混合するための流体ダクト（１１０Ａ、１１０Ｂ、２１０）、および
   −前記３Ｄ物体（３５２）を構築するためにヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを排出するように構成されたノズル（１２２、２２２）
   を含む、デバイス。
2. 前記流体ダクト（１１０、２１０）が、バイオインク−分散物混合物を得るために前記バイオインク溶液および分散物を混合するための第１の領域ならびに前記バイオインク−分散物混合物を前記緩衝液と混合するための第２の領域を含む、請求項１に記載のデバイス。
3. 前記分散物が細胞培養培地を含み、好ましくは、前記細胞培養培地が複数の細胞型を含む、請求項１または２に記載のデバイス。
4. 前記分散物が、マイクロ粒子および／またはナノ粒子、好ましくは、ペプチドマイクロ粒子、ペプチドナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、ナノワイヤ、量子ドット、および／またはカーボンナノチューブを含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のデバイス。
5. 複数の細胞型が、ペプチドマイクロ粒子中に封入され、そして／またはペプチドマイクロ粒子表面上に固定化される、請求項４に記載のデバイス。
6. 前記流体ダクト（１１０Ａ、１１０Ｂ、２１０）を加熱するように構成された加熱モジュール（２２０）をさらに含み、
   そして／または好ましくは前記流体ダクト（１１０Ａ、１１０Ｂ、２１０）中にマイクロミキサー（２４０）をさらに含む、前述の請求項のいずれか１項に記載のデバイス。
7. 前記流体ダクト（２１０）を照射するように構成された１つまたは複数の発光体（２３０）をさらに含む、請前述の請求項のいずれか１項に記載のデバイス。
8. 前記発光体（２３０）が、第１の波長を有する第１のＬＥＤおよび前記第１の波長と異なる第２の波長を有する第２のＬＥＤを含む、請求項７に記載のデバイス。
9. 前記バイオインク溶液が、１つまたはいくつかのペプチドを含み、前記ペプチドが、以下：
   ａ）Ｚ_ｏ−Ｘ_ｎＢＸ_ｍＷ−Ｚ’_ｐ、および
   ｂ）Ｚ_ｏ−ＷＸ_ｍＢＸ_ｎ−Ｚ’_ｐ
   （式中、
   ＺはＮ末端保護基であり、Ｚ’はＣ末端保護基であり、ここで、ｏおよびｐは、０および１から独立して選択され；
   Ｘは、各存在で独立して、イソロイシン、ノルロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、グリシン、ホモアリルグリシン、およびホモプロパルギルグリシンから選択される脂肪族アミノ酸であり、ここで、ｎおよびｍは、０、１、および２から独立して選択される整数であり、但し、ｍ＋ｎ≦２であり、
   Ｂは、フェニルアラニンおよびトリプトファンから選択される芳香族アミノ酸であるか、前記芳香族アミノ酸の脂肪族対応物であり、前記脂肪族対応物は、シクロヘキシルアラニン、４−ヒドロキシ−シクロヘキシルアラニン、３，４−ジヒドロキシシクロヘキシルアラニンから選択され、
   Ｗは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、５−Ｎ−エチル−グルタミン（テアニン）、シトルリン、チオ−シトルリン、システイン、ホモシステイン、メチオニン、エチオニン、セレノメチオニン、テルロメチオニン、トレオニン、アロトレオニン、セリン、ホモセリン、チロシン、ヒスチジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、リジン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリジン、ヒスチジン、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、およびＮ（６）−カルボキシメチルリジンから選択される極性アミノ酸であり、
   前記極性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、セリン、トレオニン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン（Ｏｒｎ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、および２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）からなる群から選択される）から選択される一般式を有する、前述の請求項のいずれか１項に記載のデバイス。
10. ３Ｄ物体（３５２）をプリントするｉｎ ｓｉｔｕ方法であって、
    −バイオインク溶液、特にペプチド溶液、分散物、および前記バイオインク溶液の即時ゲル化を誘導することができる緩衝液を混合して、ヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルを得る、混合する工程、および
    −前記ヒドロゲル、特に前記ペプチドヒドロゲルをノズル（１２２、２２２）から排出させて、３Ｄ物体（３５２）を構築する、排出する工程
    を含む、方法。
11. 前記混合する工程を、マイクロ流体チャネル（１１０Ｂ、２１０）中で実施し、ここで、好ましくは、前記ノズル（１２２、２２２）が、マイクロ流体チャネル（１１０Ｂ、２１０）を含む、請求項９に記載の方法。
12. 空気圧および／またはマイクロ流体ポンプ（３４０）を使用してペプチドヒドロゲルを排出する、請求項１０および１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ３Ｄソース物体（３１０）をスキャンする初期工程をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記細胞培養培地が複数の細胞型を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記分散物が、マイクロ粒子および／またはナノ粒子、好ましくは、ペプチドマイクロ粒子、ペプチドナノ粒子、銀ナノ粒子、金ナノ粒子、ナノワイヤ、量子ドット、および／またはカーボンナノチューブを含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記即時ゲル化を誘導することができる緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水または塩（単数または複数）（塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなど）を含む緩衝液（単数または複数）である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記方法を生理学的条件下で行う、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記バイオインク溶液が、請求項９に規定されるペプチド溶液である、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ヒドロゲルを得る方法であって、
    −バイオインク溶液、特にペプチド溶液を、第１の入口（４１０）を介して第１のエアブラシ（４０１）中に供給する工程、
    −前記バイオインク溶液のヒドロゲル、特にペプチドヒドロゲルへの即時ゲル化を誘導することができる緩衝液を、第２の入口（４２０）を介して第２のエアブラシ（４０２）中に供給する工程、および
    −前記バイオインク溶液および前記緩衝液を、前記第１のおよび前記第２のエアブラシ（４０１、４０２）のノズル（４１１、４２１）を介して、表面上の同一部位に同時に吹き付け、それにより、前記ヒドロゲル、特に前記ペプチドヒドロゲルを作製する、吹き付ける工程
    を含む、方法。
20. 前記バイオインク溶液が、請求項９に規定されるペプチド溶液である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記即時ゲル化を誘導することができる緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水または塩（単数または複数）（塩化ナトリウムまたは塩化カルシウムなど）を含む緩衝液（単数または複数）である、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記エアブラシを、請求項１〜８のいずれか１項に規定されるデバイスと共に使用する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記エアブラシをハンドヘルドデバイスとして使用する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記バイオインク溶液および緩衝液を、ヒドロゲルを形成する表面（創傷部位など）上に直接噴霧する、請求項２２または２３に記載の方法。