JP2020518679A - トール様受容体（ｔｌｒ）阻害のためのペプチドおよびそれを含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９シグナル伝達経路、およびトール様受容体４（ＴＬＲ４）およびＴＬＲ３を阻害する融合ペプチド、ならびにＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。本発明の融合ペプチドは、ＴＬＲ４およびさまざまなＴＬＲの経路を阻害する優れた効果を示し、該シグナル伝達経路により引き起こされる、ＴＬＲ経路により仲介されるさまざまな疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患を、ＴＬＲが仲介する免疫応答を抑制することよって予防および治療するのに有用でありうる。
Description
本発明は、トール様受容体（ＴＬＲ）１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９、およびＴＬＲ４およびＴＬＲ３のシグナル伝達経路を阻害する融合ペプチド、ならびにそれを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。
自然免疫は、哺乳動物の免疫系において細菌感染に対する第一線の防御であり、病原体関連分子パターン（pathogen-associated molecular pattern；ＰＡＭＰ）または危険関連分子パターン（danger-associated molecular pattern；ＤＡＭＰ）を、トール様受容体（ＴＬＲ）のようなパターン認識受容体が認識することによって活性化される。
ＴＬＲは自然免疫応答において重要な役割を果たすものであり、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６およびＴＬＲ１１を包含する、細胞膜上で機能する細胞外ＴＬＲと、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９を包含する、エンドソームのような細胞内部で機能する細胞内ＴＬＲに分類されうる。構造的には、ＴＬＲは、リガンドまたはアクセサリー分子によって認識されるロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）部位を細胞外ドメインのＮ末端に有し、シグナルを伝達するトール／インターロイキン１受容体（ＴＩＲ）ドメインを細胞内部分のＣ末端に有する。
特に、ＴＬＲ４は、ＴＬＲファミリーの中で最初に同定された受容体であり、ミエロイド分化８８（ＭｙＤ８８）依存性および非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路によって増幅される自然免疫シグナルを活性化する。一方、ＴＬＲ３は非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路のみを活性化する。ＴＬＲがこのような役割を有することから、さまざまな免疫疾患の処置の標的としてＴＬＲを利用するための研究に対する関心が高まっている。
ＴＬＲ４によるＭｙＤ８８依存性シグナル伝達は、クラスター・オブ・ディファレンシエーション（cluster of Differentiation）１４（ＣＤ１４）およびミエロイド分化因子２（ＭＤ２）のようなアクセサリー分子を介するＬＰＳ認識により開始される。ＬＰＳが結合すると、ＴＬＲ４は二量体化し、これが、ＭｙＤ８８との複合体を形成するように、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインとＴＩＲドメインアダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰまたはＭｙＤ８８アダプター様（ＭＡＬ））のＴＩＲドメインとの結合を可能にし、それによってシグナル伝達経路を活性化する。活性化されたＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達プロセスを介して、ＮＦκＢの初期活性化、核内移行、およびＭＡＰＫ活性化を誘導する。ＮＦκＢおよびＭＡＰＫの活性化により、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）のような炎症性サイトカインが分泌される。ＴＬＲ４およびＴＬＲ３の非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達プロセスは、各ＴＬＲのＴＩＲドメインと、ＴＩＲドメイン含有アダプター−インターフェロン−β誘導（ＴＲＩＦ）／ＴＲＩＦ関連アダプター分子（ＴＲＡＭ）複合体のＴＩＲドメインとの結合により開始され、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）の活性化によって１型インターフェロンを分泌させる。さらに、ＴＬＲ４活性化は、マクロファージにおけるＮＯおよびＲＯＳのような酸化ストレッサーの産生をもたらす。
したがって、ＴＬＲはさまざまな疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患および癌の処置のための標的でありうるので、ＴＬＲを標的とする物質、およびＴＬＲが関与する疾患を処置するための医薬組成物について、研究がなされている。特に、リピドＡの主骨格構造の改変によってＴＬＲ４プロモーターおよびアンタゴニストが多数得られており、エリトラン、リピドＡおよびロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroids）リピドＡ（ＲｓＬＡ）が、ＬＰＳとＭＤ２の間の相互作用を阻害し、マウスにおいてＬＰＳ誘発性のショックを防止しうることがわかっている。さらに、ＬＰＳによって誘導されるＴＬＲ４シグナル伝達経路は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの形成に関与し、したがって神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病に大きく関連することが報告されている。
一方、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と同様の、またはそれとは反対の作用を示すペプチドに関する研究が、デコイペプチド（これは、タンパク質の結合ドメインの一部を用いており、該タンパク質の代わりに、それと本来相互作用するタンパク質への結合によってシグナル伝達を制御する）を用いることによって、盛んに行われている。ペプチドは、一般的な小分子治療剤と比較して、副作用が少なく、改変および品質調節が容易であることが知られており、また、その低い細胞透過性は、細胞膜透過ペプチド（cell-penetrating peptide；ＣＰＰ）の開発によって改善される。
本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列からなる新規ペプチド（デコイペプチド１）、および該新規ペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結した融合ペプチド（トール様受容体阻害ペプチド１、ＴＩＰ１）が、リポ多糖（ＬＰＳ）が誘導するＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害し、それによって、サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β）分泌、ＮＯおよびＲＯＳ生成、ならびにＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫ活性化を抑制するだけでなく、動物において、ＴＬＲ４の過剰活性によって引き起こされる腎および肝障害や、敗血症および関節リウマチを軽減することを確認した。本発明者はまた、該新規ペプチドおよび融合ペプチドは、ポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するＴＬＲ３シグナル伝達経路、およびＬＰＳ／ＡＴＰが誘導するＮＬＲＰ３インフラマソーム形成を抑制することを証明して、本発明を完成した。さらに、該新規ペプチドおよび融合ペプチドはＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９を部分的に阻害することも、細胞実験により確認された。
したがって、本発明の課題は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、および配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結した融合ペプチドを提供することである。
本発明のさらなる課題は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される少なくとも１つのＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供することである。
上記課題を解決するために、本発明は配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
本発明はさらに、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結した融合ペプチドを提供する。
本発明はさらに、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される少なくとも１つの、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結した融合ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、少なくとも１つのＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
本発明の融合ペプチドは、ＴＬＲ４を包含するさまざまなＴＬＲのシグナル伝達経路の阻害の優れた効果を示し、したがってＴＬＲが仲介する免疫応答を抑制するので、ＴＬＲシグナル伝達経路によって引き起こされるさまざまなＴＬＲ経路仲介疾患、例えば自己免疫疾患、炎症性疾患または神経変性疾患を予防または治療するのに有用でありうる。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
本書において、用語「ペプチド」は、ペプチド結合によるアミノ酸残基どうしの結合によって形成される線状分子を指す。ペプチドは、当分野で知られる化学合成法によって合成されうる。ペプチドは好ましくは固相合成法によって合成されうるが、方法はそれに限定されない。
本書において、用語「ＴＬＲ４」は、病原体感染の監視役として機能する膜貫通型タンパク質のファミリーであるトール様受容体（ＴＬＲ）に属する、ＴＬＲ４遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、これはクラスター・オブ・ディファレンシエーション２８４（ＣＤ２８４）とも称される。ＴＬＲ４は、グラム陰性細菌のＬＰＳを包含するさまざまな病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するので、自然免疫系の活性化のために非常に重要である。
本書において、用語「ＴＬＲ３」は、病原体感染の監視役として機能する膜貫通型タンパク質のファミリーであるトール様受容体（ＴＬＲ）に属する、ＴＬＲ３遺伝子によってコードされるタンパク質を指し、これはクラスター・オブ・ディファレンシエーション２８３（ＣＤ２８３）とも称される。ＴＬＲ３は、ウイルスの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を包含するさまざまなＰＡＭＰを認識するので、自然免疫系の活性化のために非常に重要である。
本書において、用語「ＮＬＲＰ３インフラマソーム」は、カスパーゼ−１の活性化を調節する内因性免疫系の受容体およびセンサーを指す。ＮＬＲＰ３インフラマソームは、微生物感染等に応答して炎症を引き起こすインフラマソームの１種であり、さまざまな刺激に応答して活性化される。ＮＬＲＰ３はプライミングを必要とし、その例はＴＬＲ４へのＬＰＳの結合である。ＡＴＰと共にＬＰＳによるＴＬＲ４シグナル伝達経路は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの生成を促進する。異常に活性化されたＮＬＲＰ３インフラマソームは、さまざまな炎症性疾患、特に神経変性疾患の発症をもたらす。最近の研究により、アルツハイマー病の主因と考えられるベータアミロイド（アミロイドβ）の蓄積とＮＬＲＰ３インフラマソームとが直接関連することが示されており、パーキンソン病にＮＬＲＰ３インフラマソームが関与することも報告されている。
本書において、用語「ＴＬＲ４が仲介するシグナル伝達経路」とは、ＴＬＲ４を介するシグナル伝達経路を指す。この経路は、シグナルを伝達する、ＴＬＲ４とＭＤ２とによって形成されるＴＬＲ４／ＭＤ２複合体に依存するＬＰＳ応答でありうる。ＴＬＲ４は、いくつかのアダプタータンパク質によってシグナルを伝達し、Ｍａｌ（ＴＩＲＡＰとも称される）およびＭｙＤ８８、ＴＲＡＭおよびＴＲＩＦ等を介して機能する。活性化されたＴＬＲ４は、Ｍｙｄ８８依存性のシグナル伝達プロセスを介してＮＦ−κＢを活性化し、それによってＮＦ−κＢの核内移行を引き起こし、それによってＭＡＰＫの活性化を誘導する。ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性化により、炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６が分泌され、酸化ストレッサー、例えば一酸化窒素（以下、ＮＯという）および反応性酸素種（以下、ＲＯＳという）がマクロファージにおいて産生される。さらに、ＴＲＡＭ／ＴＲＩＦ、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ）およびＮＦ−κＢの活性化は、１型インターフェロンが分泌されるように非Ｍｙｄ８８依存性のシグナル伝達プロセスを誘導する。
本書において、用語「ＴＩＲドメイン」とは、３つの高度に保存された領域を有し、ＴＬＲと他のシグナル伝達分子との間の相互作用を仲介する、細胞内シグナル伝達のためのドメインを指す。活性化されたＴＩＲドメインはＭｙＤ８８の結合を誘導し、ＴＬＲシグナル伝達経路を活性化する。
本書において、用語「阻害」とは、生物学的作用またはシグナル伝達活動が、欠乏、不均衡、および他の多くの原因のために低下する現象を指し、該現象は、ＴＬＲの活性を部分的または完全に阻止、低下または抑制するか、その活性化を遅延するか、またはＴＬＲを不活性化もしくはダウンレギュレートする現象でありうる。本発明の一態様においては、ＴＬＲ４およびＴＬＲ３シグナル伝達経路およびＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害のための、本発明のペプチドまたは融合ペプチドの使用が提供される。さらに、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９の部分的な阻害のためのその使用が提供される。
本発明において、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド中のＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ配列（配列番号２）は、トール様受容体（ＴＬＲ）のトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインに特異的に結合することによって特徴付けられる。
ＴＬＲ４のＴＩＲドメインへの結合において、本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドは配列特異性を有する。本発明者は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに結合するＴＩＰ１の最小アミノ酸領域を探索し、その領域がＴＬＲ４のシグナル伝達経路を効果的に阻害しうるかを調べた。すなわち、本発明の一態様により、ＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインからデコイペプチドを選択した。そのアミノ酸配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｉを用いて、配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ（デコイペプチド１−２、配列番号２）および配列Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｉ（デコイペプチド１−３、配列番号７）のそれぞれを、実施例１−１で用いた同じＣＰＰ配列のＮ末端に連結した。得られた各生成物とＬＰＳとで、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞およびｈＰＢＭＣ細胞を処理し、その後、それぞれの細胞からＮＦ−κＢ活性およびＮＯ生成のレベルを測定した。その結果、阻害作用をもたらすのにＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ（デコイペプチド１−２）配列が重要であることがわかった。
本発明はさらに、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結された融合ペプチドを提供する。
本発明において、融合ペプチドは、トール様受容体（ＴＬＲ）が仲介するシグナル伝達経路を阻害し得、ここで、該トール様受容体（ＴＬＲ）は、トール様受容体１／２（ＴＬＲ１／２）、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）、トール様受容体３（ＴＬＲ３）、トール様受容体４（ＴＬＲ４）、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、およびトール様受容体９（ＴＬＲ９）からなる群から選択される任意の１つでありうる。ＴＬＲは、好ましくはトール様受容体４（ＴＬＲ４）またはトール様受容体３（ＴＬＲ３）、より好ましくはトール様受容体４（ＴＬＲ４）であることによって特徴付けられうる。
さらに、本発明において、融合ペプチドによるＴＬＲシグナル伝達経路の阻害は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６もしくはＩＦＮ−βの発現の抑制、ＮＯもしくはＲＯＳの生成の抑制、またはＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫもしくはＮＬＲＰ３インフラマソームの活性の抑制をもたらしうる。また、本発明の融合ペプチドは、ＭｙＤ８８依存性および非ＭｙＤ８８依存性の両方のＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することによって特徴付けられうる。
本書において、用語「細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）」は、高分子物質、例えばタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞内に送達する目的で用いられる特異的アミノ酸配列の組み合わせの１種である、シグナルペプチドの１種を指す。従来、細胞膜透過ペプチドは、さまざまな低分子化合物、高分子物質、例えばタンパク質、ペプチド、ＲＮＡまたはＤＮＡを細胞内に送達するために用いられている。
本発明の融合ペプチドは、細胞膜透過ペプチドを用いている。エンドサイトーシスのメカニズムによって細胞内に移行する特性を有する限り、細胞膜透過ペプチドに特に制限はない。好ましくは、細胞膜透過ペプチドは、表１に挙げる細胞膜透過ペプチドまたはそのバリアントから選択され、用いられうる。
表１に挙げられる細胞膜透過ペプチドのうち、トランスポータンは、下記のバリアントの形態で用いられるものを包含する：ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（ＴＰ１０、ＰｅｐＦｅｃｔ ３、配列番号１３）、ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（ＴＰ１０、ＰｅｐＦｅｃｔ ６、配列番号１４）、ＡＧＹＬＬＧＫＬＬＯＯＬＡＡＡＡＬＯＯＬＬ−ＮＨ２（ＴＰ１０、ＰｅｐＦｅｃｔ １４、配列番号１５）、ＡＧＹＬＬＧＫＴＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（ＮｉｃｋＦｅｃｔ １、配列番号１６）、ＡＧＹＬＬＧＫＴＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（ＮｉｃｋＦｅｃｔ ２、配列番号１７）、およびＡＧＹＬＬＧＫＴＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ−ＮＨ２（Ｎｉｃｋｆｅｃｔ ３、配列番号１８）。
さらに、表１に挙げられる配列番号３７からなるアミノ酸配列（ＭＰＰ）において、ｒはｄ−アルギニンを意味し、配列番号３７のアミノ酸配列中、２および６番目のアミノ酸がこれに相当する。さらに、表１に挙げる配列番号４１および４２は、相互に分枝して１つのペプチド（ＴＡＴｐ−Ｄ）を構成するものであり、分枝が、配列番号４１のアミノ酸配列中の１４番目のＬｙｓ残基（Ｋ）の、配列番号４２のアミノ酸配列中の１３番目のＧｌｎ残基（Ｑ）への連結によって形成されることを特徴とする。さらに、表１に挙げる配列番号４３からなるアミノ酸配列（環状Ｔａｔ）において、ｒはｄ−アルギニンを意味し、配列番号４３のアミノ酸配列中、２、４、６および１０番目のアミノ酸がこれに相当する。同様に、ｋはｄ−リジンを意味し、配列番号４３のアミノ酸配列中、８番目のアミノ酸がこれに相当する。配列番号４３は環状ペプチドであることによって特徴付けられる。
本発明の一態様において、表１に挙げられる細胞膜透過ペプチドの中からペネトラチン配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、配列番号９）が選択され、実験が行われた。実際に用いられたこの細胞膜透過ペプチドとは異なる細胞膜透過ペプチドが本発明のペプチドと融合された場合にも同様の本発明の効果が示されることは、当業者には明らかであろう。
本発明において、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されたものからなる融合ペプチドは、好ましくは配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなることによって特徴付けられうる。さらに、該アミノ酸配列のバリアントも、本発明の範囲に含まれうる。特に、バリアントは、配列番号３または４との配列同一性が少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より一層好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であるすべてのペプチドを包含しうる。用語「同一性」は、野生型アミノ酸配列または野生型核酸配列との類似の程度をいうことが意図される。
本発明の一態様によると、本発明の融合ペプチドは、リポ多糖（ＬＰＳ）が誘導するＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害し、それによって、サイトカイン（ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β）分泌、ＮＯおよびＲＯＳの生成、ならびにＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性化を抑制するだけでなく、動物においてＴＬＲ４の過剰活性によって引き起こされる腎および肝障害や、敗血症および関節リウマチを軽減し、ポリ（Ｉ：Ｃ）が誘導するＴＬＲ３シグナル伝達経路、およびＬＰＳ／ＡＴＰが誘導するＮＬＲＰ３インフラマソーム生成を抑制する、という優れた効果を示す。したがって、本発明の融合ペプチドは、該シグナル伝達経路によって引き起こされる自己免疫疾患、炎症性疾患、またはＮＬＲＰ３インフラマソームによって引き起こされる神経変性疾患を予防または治療するために有用でありうる。
さらに、本発明において、本発明の融合ペプチドは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤として使用しうる。
本書において、用語「阻害剤」とは、他の分子、例えば受容体または細胞内メディエーターの作用を何らかのメカニズムで部分的または完全に阻害する分子を指す。
本書において、用語「ＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＮＬＲＰ３インフラマソームの阻害剤」とは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３およびＮＬＲＰ３インフラマソームの生物学的活性を、直接的もしくは間接的または実質的に、抑制、低下または阻害することのできる物質を指す。ＴＬＲ４、ＴＬＲ３と反応性のペプチドとは、好ましくは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３のＴＩＲドメインに直接結合してＴＬＲ４、ＴＬＲ３の活性を中和することができ、それによって、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３シグナル伝達経路を阻害することができ、それによってＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫならびにＮＬＲＰ３インフラマソームの低下された活性化をもたらし、炎症性サイトカイン分泌、ＮＯおよびＲＯＳ生成を低下することのできる物質を指す。
さらに、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される少なくとも１つの、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結された融合ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される少なくとも１つの、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療するための医薬組成物を提供する。該融合ペプチドは、好ましくは配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなることによって特徴付けられ得、該アミノ酸配列のバリアントもまた、本発明の範囲に含まれうる。
本書において、用語「経路により仲介される疾患」とは、１つまたはそれ以上のＴＬＲおよびＴＬＲが仲介するシグナル伝達経路の活性化が要因である任意の病的状態を指す。該状態は、好ましくは、自己免疫疾患、炎症性疾患および変性疾患からなる群から選択される少なくとも１つであることによって特徴付けられうる。しかしながら、該状態はそれに限定されない。
本書において、用語「自己免疫疾患」とは、自己寛容の誘導または維持における問題が発生した現象が生じていて、自己抗原に対する免疫応答が引き起こされ、したがって自身の組織が攻撃される、というプロセスによって引き起こされる疾患を指す。自己寛容とは、自己を構成する抗原性物質に対して有害に応答しない免疫不応答を指す。本発明における自己免疫疾患は、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的形態のブドウ膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、雄性不妊、小児糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Hbs-ve、潜在性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスを包含するが、それに限定されない。
さらに、本書において、用語「炎症性疾患」とは、免疫系が有害刺激、例えば炎症を誘導する因子または照射によって過度に刺激された場合に免疫細胞（例えばマクロファージ）によって分泌される炎症性物質（炎症性サイトカイン）、例えばＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、プロスタグランジン、ロイコトリエンまたはＮＯによって引き起こされる疾患を指す。本発明における炎症性疾患は、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、アトピー性鼻炎、肺炎、アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、敗血症、血管炎、滑液包炎、ループス、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、多発硬化症、固形腫瘍、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、肥満、およびウイルス感染症を包含するが、それに限定されない。
本書において、用語「神経変性疾患」とは、神経細胞機能の低下または喪失による、運動調節能、認知機能、知覚機能、感覚機能および自律神経機能の異常を指す。神経変性疾患は主に臨床的特徴により分類され、すなわち、分類は主な症状および冒された領域に基づく。本発明における神経変性疾患は、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、ルイ（Louis）認知症、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、多系統萎縮症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、ルー・ゲーリッグ病、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症を包含するが、それに限定されない。
本発明の医薬組成物は、薬学的有効量の本発明ペプチドを、単独で、または１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、賦形剤または希釈剤との組み合わせとして含みうる。薬学的有効量とは、自己免疫疾患の症状を予防、改善および治療するのに十分な量を指す。
用語「薬学的に許容しうる」とは、生理学的に許容しうる、典型的には、ヒトに投与されば場合に胃腸障害、アレルギー反応、例えばめまい、または同様の反応を引き起こさない組成物についていう。担体、賦形剤および希釈剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アラビアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱油が含まれうる。
本発明の医薬組成物は、増量剤、抗凝固剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、乳化剤、保存剤等をさらに含みうる。
さらに、本発明の医薬組成物は、本発明ペプチドのほかに、自己免疫疾患、炎症性疾患または神経変性疾患に対する処置効果を有する少なくとも１つの既知活性成分を含みうる。
本発明の医薬組成物は、当分野において知られた方法で、哺乳動物への投与後に活性成分の短時間での放出、持続的放出または遅延放出を提供しうるように調製しうる。製剤は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟または硬ゼラチンカプセル、注射用滅菌溶液、滅菌粉末の形態でありうる。
本発明の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内または筋肉内経路を包含するさまざまな経路で投与し得、活性成分の用量は、さまざまな因子、例えば投与経路、患者の年齢、性別、体重、状態の重篤度に基づいて適当に選択しうる。本発明の医薬組成物は、自己免疫疾患、炎症性疾患または神経変性疾患の症状の予防、改善または治療効果を有する既知化合物と組み合わせて投与しうる。
さらに、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法を提供する。
さらに、本発明は、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結された融合ペプチドを必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または処置する方法を提供する。
前記個体は好ましくは、ヒトを包含する哺乳動物であり、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置を必要とするいずれの患者をも包含し、例えば、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置中の患者、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置を受けてきた患者、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置を必要とする患者、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置のために外科手術を受けた患者も包含する。
さらに、本発明の配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１もしくは配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結された融合ペプチドは、ＴＬＲ経路により仲介される疾患の処置のための他の従来の薬剤または方法との組み合わせにおいて、それと同時／逐次に適用しうる。
本発明の実施形態
本発明を、以下、実施例および試験例によって、より詳細に説明する。下記の実施例および試験例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は下記実施例および試験例によって制限されない。
本発明を、以下、実施例および試験例によって、より詳細に説明する。下記の実施例および試験例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は下記実施例および試験例によって制限されない。
実施例１．試験サンプルの調製
１−１．ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに特異的に結合するペプチドの選択
ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに特異的に結合するペプチドを選択するために、本発明者は、ＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインから２つの配列（デコイペプチド１、２）を選び、その各配列のＮ末端にショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメイン由来の細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を連結させることにより、新規ペプチドＴＩＰ１およびＴＩＰ２を合成した。本実施例において使用したすべてのペプチドの配列を表２に示す。
１−１．ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに特異的に結合するペプチドの選択
ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに特異的に結合するペプチドを選択するために、本発明者は、ＴＩＲＡＰのＴＩＲドメインから２つの配列（デコイペプチド１、２）を選び、その各配列のＮ末端にショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメイン由来の細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）を連結させることにより、新規ペプチドＴＩＰ１およびＴＩＰ２を合成した。本実施例において使用したすべてのペプチドの配列を表２に示す。
１−２．細胞の培養および調製
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞（InvivoGen, San Diego, CA, USA）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）、および０．２％ノルモシン（normocin）（InvivoGen）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（Thermo Fisher Scientific Inc.）に播種し、培養を行った。マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞（Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を補充した低グルコースＤＭＥＭに入れ、培養を行った。ヒト単球であるＴＨＰ１細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養し、１０ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, MO, USA）を用いて２４時間にわたり、マクロファージへの分化を誘導した。ヒト末梢血単球であるｈＰＢＭＣ細胞（PromoCell, Heidelberg, Germany）を、２．０５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０（Thermo Fisher Scientific Inc.）中で培養した。マウス骨髄由来マクロファージであるｍＢＭＤＭ細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific Inc.）中で培養した。すべての細胞を、培養系（Thermo Fisher Scientific Inc.）において、５％ＣＯ２、３７℃で湿潤条件下に培養し、１６時間毎に培地交換を行った。ＰＡＭ３ＣＳＫ４、ポリ（Ｉ：Ｃ）、Ｒ８４８、およびＣｐＧ−ＯＤＮをThermo Fisher Scientific, Inc.から購入した; ＦＳＬ−１をInvivoGenから購入した; ＬＰＳ（Escherichia coli 0111: B4）およびＡＴＰをSigma-Aldrich Co.（St. Louis, MO, USA）から購入した。実験に使用したすべてのペプチドは、Peptron, Inc.（Daejeon, Korea）により合成され、そこから購入した。
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞（InvivoGen, San Diego, CA, USA）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA）、および０．２％ノルモシン（normocin）（InvivoGen）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）（Thermo Fisher Scientific Inc.）に播種し、培養を行った。マウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞（Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea）を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を補充した低グルコースＤＭＥＭに入れ、培養を行った。ヒト単球であるＴＨＰ１細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ（Thermo Fisher Scientific Inc.）を補充したＲＰＭＩ １６４０中で培養し、１０ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）（Sigma-Aldrich Co. LLC., St. Louis, MO, USA）を用いて２４時間にわたり、マクロファージへの分化を誘導した。ヒト末梢血単球であるｈＰＢＭＣ細胞（PromoCell, Heidelberg, Germany）を、２．０５ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０（Thermo Fisher Scientific Inc.）中で培養した。マウス骨髄由来マクロファージであるｍＢＭＤＭ細胞を、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（Thermo Fisher Scientific Inc.）中で培養した。すべての細胞を、培養系（Thermo Fisher Scientific Inc.）において、５％ＣＯ２、３７℃で湿潤条件下に培養し、１６時間毎に培地交換を行った。ＰＡＭ３ＣＳＫ４、ポリ（Ｉ：Ｃ）、Ｒ８４８、およびＣｐＧ−ＯＤＮをThermo Fisher Scientific, Inc.から購入した; ＦＳＬ−１をInvivoGenから購入した; ＬＰＳ（Escherichia coli 0111: B4）およびＡＴＰをSigma-Aldrich Co.（St. Louis, MO, USA）から購入した。実験に使用したすべてのペプチドは、Peptron, Inc.（Daejeon, Korea）により合成され、そこから購入した。
実施例２．アッセイ方法
２−１．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレート（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を５×１０４細胞／ウェルの細胞数で蒔き、ＲＡＷ２６４．７細胞は２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔いた。一晩インキュベーションを行った。その後、１−（４,５−ジメチルチアゾル−２−イル）−３,５−ジフェニルホルマザン（ＭＴＴ）溶液（Sigma-Aldrich Co. LLC）を用いてＭＴＴアッセイを行った。
２−１．ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレート（BD Biosciences, San Jose, CA, USA）に、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を５×１０４細胞／ウェルの細胞数で蒔き、ＲＡＷ２６４．７細胞は２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔いた。一晩インキュベーションを行った。その後、１−（４,５−ジメチルチアゾル−２−イル）−３,５−ジフェニルホルマザン（ＭＴＴ）溶液（Sigma-Aldrich Co. LLC）を用いてＭＴＴアッセイを行った。
２−２．ＳＥＡＰ活性のアッセイ
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を２４ウェルプレート（BD Biosciences）に２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。翌日、培養物を取り、培地交換を行った。次いで、培養物の一部（２００μｌ）をマイクロ遠心チューブに入れ、加熱ブロック（FINEPCR. Co., Seoul, Korea）を用いて６５℃に１０分間加熱した。その後、培養物を９６ウェルプレート（BD Biosciences）に移し、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）検出キット（InvivoGen）およびマイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定することにより、ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）の発現レベルを調べた。
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を２４ウェルプレート（BD Biosciences）に２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。翌日、培養物を取り、培地交換を行った。次いで、培養物の一部（２００μｌ）をマイクロ遠心チューブに入れ、加熱ブロック（FINEPCR. Co., Seoul, Korea）を用いて６５℃に１０分間加熱した。その後、培養物を９６ウェルプレート（BD Biosciences）に移し、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）検出キット（InvivoGen）およびマイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc., Silicon Valley, CA, USA）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定することにより、ＳＥＡＰ（分泌型アルカリホスファターゼ）の発現レベルを調べた。
２−３．ウエスタンブロッティング
ウエスタンブロッティングを行うために、プレタンパク質抽出液（Ｍ−ＰＥＲ、Thermo Fisher Scientific Inc.）を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物と混合し、ＲＡＷ２６４．７細胞またはｈＰＢＭＣ細胞のペレットに加えた。ペレットを１０分間冷却し、次いで溶解物を１６０００×ｇで１０分間遠心した。その後、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬（Thermo Fisher Scientific Inc.）を使用して細胞質および核のタンパク質をそれぞれ抽出し、ＢＣＡキット（Sigma-Alderich Co. LLC）を使用して該タンパク質の濃度を測定した。その後、タンパク質を同じ量で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に適用し、Mini-PROTEAN Tetra Cell二次元電気泳動システム（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を使用して電気泳動を行った。膜を一次抗体で、４℃の温度で一晩穏やかに振盪することによって免疫ブロットした（ここで、一次抗体は、以下のものに対する抗体であった：ｐ−ｐ６５、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＩＲＦ３、ＥＲＫ、ｐ３８、およびヒトＩＬ−１β（Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA）；ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８、Ｉκ−Ｂα、ＪＮＫ、ＡＴＦ３、ＣＯＸ２、カスパーゼ−１、およびβ−アクチン（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA）；ｉＮＯＳ（BD Biosciences）；ＩＬ−６およびマウスＩＬ−１β（R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA）；ＴＮＦ−α（Thermo Fisher Scientific, Inc.）；ＮＬＲＰ３（Adipogen, San Diego, CA, USA））。その後、ＰＢＳＴと共によく振盪した後、膜を、抗マウス／ウサギＨＲＰ標識二次抗体（Thermo Fisher Scientific, Inc.）と共に２時間インキュベートし、タンパク質をSuperSignal West Pico ECL溶液（Thermo Fisher Scientific Inc.）で検出し、Fuji LAS-3000システム（Fujifilm, Tokyo, Japan）を用いて可視化した。
ウエスタンブロッティングを行うために、プレタンパク質抽出液（Ｍ−ＰＥＲ、Thermo Fisher Scientific Inc.）を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物と混合し、ＲＡＷ２６４．７細胞またはｈＰＢＭＣ細胞のペレットに加えた。ペレットを１０分間冷却し、次いで溶解物を１６０００×ｇで１０分間遠心した。その後、ＮＥ−ＰＥＲ核および細胞質抽出試薬（Thermo Fisher Scientific Inc.）を使用して細胞質および核のタンパク質をそれぞれ抽出し、ＢＣＡキット（Sigma-Alderich Co. LLC）を使用して該タンパク質の濃度を測定した。その後、タンパク質を同じ量で、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上に適用し、Mini-PROTEAN Tetra Cell二次元電気泳動システム（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を使用して電気泳動を行った。膜を一次抗体で、４℃の温度で一晩穏やかに振盪することによって免疫ブロットした（ここで、一次抗体は、以下のものに対する抗体であった：ｐ−ｐ６５、ｐ−ＪＮＫ、ｐ−ＩＲＦ３、ＥＲＫ、ｐ３８、およびヒトＩＬ−１β（Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA）；ｐ−ＥＲＫ、ｐ−ｐ３８、Ｉκ−Ｂα、ＪＮＫ、ＡＴＦ３、ＣＯＸ２、カスパーゼ−１、およびβ−アクチン（Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA）；ｉＮＯＳ（BD Biosciences）；ＩＬ−６およびマウスＩＬ−１β（R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA）；ＴＮＦ−α（Thermo Fisher Scientific, Inc.）；ＮＬＲＰ３（Adipogen, San Diego, CA, USA））。その後、ＰＢＳＴと共によく振盪した後、膜を、抗マウス／ウサギＨＲＰ標識二次抗体（Thermo Fisher Scientific, Inc.）と共に２時間インキュベートし、タンパク質をSuperSignal West Pico ECL溶液（Thermo Fisher Scientific Inc.）で検出し、Fuji LAS-3000システム（Fujifilm, Tokyo, Japan）を用いて可視化した。
２−４．共焦点顕微鏡試験
ＲＡＷ２６４．７細胞およびＴＨＰ１細胞を２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、インキュベーター内で一晩増殖させた。次いで、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処理を行った。２４時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞およびＴＨＰ１細胞を、３．７％ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich Co. LLC）で１５分間固定し、０．２％Triton X-100（AMRESCO, Solon, OH, USA）中に１５分間浸漬した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回行い、２％ＢＳＡ溶液によるブロッキングを行った。ブロックした細胞を、ＴＩＰ１−ＦＩＴＣ（25μM; Peptron, Inc., Daejeon, Korea）、ｐ−ｐ６５、ＴＬＲ４、Ｍｙｄ８８、ＴＯＭ２０（１：１０００; Santa Cruz Biotechnology Inc.）、およびＮＬＲＰ３（Adipogen）の抗体と共に２時間インキュベートした。その後、ＰＢＳによる洗浄を３回行った。その後、細胞をAlexaFluor 408および／または488および／または546標識二次抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、５μＭのHoechst 33258（Sigma-Aldrich Co.）を用いて細胞を室温で１５分間染色し、蛍光染色された細胞の数を共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH）を用いて数えた。画像をZen 2009ソフトウェアを用いて解析した。
ＲＡＷ２６４．７細胞およびＴＨＰ１細胞を２４ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、インキュベーター内で一晩増殖させた。次いで、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処理を行った。２４時間後、ＲＡＷ２６４．７細胞およびＴＨＰ１細胞を、３．７％ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich Co. LLC）で１５分間固定し、０．２％Triton X-100（AMRESCO, Solon, OH, USA）中に１５分間浸漬した。次いで、ＰＢＳによる洗浄を３回行い、２％ＢＳＡ溶液によるブロッキングを行った。ブロックした細胞を、ＴＩＰ１−ＦＩＴＣ（25μM; Peptron, Inc., Daejeon, Korea）、ｐ−ｐ６５、ＴＬＲ４、Ｍｙｄ８８、ＴＯＭ２０（１：１０００; Santa Cruz Biotechnology Inc.）、およびＮＬＲＰ３（Adipogen）の抗体と共に２時間インキュベートした。その後、ＰＢＳによる洗浄を３回行った。その後、細胞をAlexaFluor 408および／または488および／または546標識二次抗体（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、５μＭのHoechst 33258（Sigma-Aldrich Co.）を用いて細胞を室温で１５分間染色し、蛍光染色された細胞の数を共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH）を用いて数えた。画像をZen 2009ソフトウェアを用いて解析した。
２−５．ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βおよびＩＬ−１βのアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞、ＴＨＰ１細胞およびｍＢＭＤＭ細胞を、９６ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの細胞数で、または２４ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔いた。一晩インキュベートした。次いで、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処理を行った。２４時間後、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌レベルを、LEGEND MAX（商標）マウスIL-6プレコートELISAキット（BioLegend）、マウスIL-6 Platinum ELISA（eBiosciences）、およびマウスＴＮＦ−α ELISA Ready SET-Go!キット（eBiosciences）を用いて測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、結果をSoftmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。
ＲＡＷ２６４．７細胞、ＴＨＰ１細胞およびｍＢＭＤＭ細胞を、９６ウェルプレートに２×１０５細胞／ウェルの細胞数で、または２４ウェルプレートに５×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔いた。一晩インキュベートした。次いで、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処理を行った。２４時間後、ＩＦＮ−β、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの分泌レベルを、LEGEND MAX（商標）マウスIL-6プレコートELISAキット（BioLegend）、マウスIL-6 Platinum ELISA（eBiosciences）、およびマウスＴＮＦ−α ELISA Ready SET-Go!キット（eBiosciences）を用いて測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、結果をSoftmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。
２−６．細胞質内ＮＯおよびＲＯＳのアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞を６-cmディッシュ（SPL Life Sciences., Pocheon, Korea）に１×１０６細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。次いで、ＴＩＰ１による処理を行い、それぞれＤＡＦ−ＦＭおよびＤＣＦ−ＤＡ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）による染色を行った。次いで、１時間インキュベートした。その後、２００×ｇで５分間の遠心によって細胞を集め、褐色管に入れ、ＰＢＳ中で４℃の温度で保存した。FACSAria IIIとDivaソフトウェア（BD Biosciences）を用いて、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＣＦ−ＤＡ蛍光物質の強度を測定し、定量した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を６-cmディッシュ（SPL Life Sciences., Pocheon, Korea）に１×１０６細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。次いで、ＴＩＰ１による処理を行い、それぞれＤＡＦ−ＦＭおよびＤＣＦ−ＤＡ（Thermo Fisher Scientific, Inc.）による染色を行った。次いで、１時間インキュベートした。その後、２００×ｇで５分間の遠心によって細胞を集め、褐色管に入れ、ＰＢＳ中で４℃の温度で保存した。FACSAria IIIとDivaソフトウェア（BD Biosciences）を用いて、ＤＡＦ−ＦＭ、ＤＣＦ−ＤＡ蛍光物質の強度を測定し、定量した。
２−７．ＮＯ放出レベルのアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞およびｍＢＭＤＭ細胞を９６ウェルプレート（BD Biosciences）に２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。次いで、ＮＯ検出キット（iNtRON Biotechnology Inc., Seongnam, Korea）を用いて培養物上清のＮＯレベルを測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc.）を用いて５５０ｎｍで吸光度を測定し、結果を、Softmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。
ＲＡＷ２６４．７細胞およびｍＢＭＤＭ細胞を９６ウェルプレート（BD Biosciences）に２×１０５細胞／ウェルの細胞数で蒔き、一晩インキュベートした。次いで、ＮＯ検出キット（iNtRON Biotechnology Inc., Seongnam, Korea）を用いて培養物上清のＮＯレベルを測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc.）を用いて５５０ｎｍで吸光度を測定し、結果を、Softmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。
２−８．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ
ProteOn XPR36装置（Bio-Rad Laboratories, Inc.）をProteOn NLCセンサーチップと共に使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを行った。具体的には、ＴＩＲドメインのＢＢループ（ＲＤＦＩＰＧＶＡＩＡＡ）およびＣ末端領域（ＥＧＴＶＧＴＧＣＮＷＱＥＡＴＳＩ）をコードする合成ペプチドを、ＮＬＣセンサーチップの表面上に、ＧＬＣポリマー層に結合されたNeutrAvidinによって固定した。対照として、ランニングバッファーである０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＰＢＳを流した。さまざまな種類のＴＩＰ１、すなわちＴＩＰ１−１、ＴＩＰ１−２およびＴＩＰ１−３（５０μＭ）、ならびに異なる濃度のＴＩＰ１（１２．５、２５および５０μＭ）を、固定したペプチドに対するその結合親和性を調べるために、チップ上に流した。測定後、センサーチップの表面を、０．８５％リン酸またはＰＢＳＴを用いて再生した。ProteOn manager（商標）ソフトウェア（バージョン2.0）を用いて解離定数を計算し、さまざまな用量のＴＩＰ１から得られたデータを、運動速度定数（ＫａおよびＫｄ）にマッチするようにグループ化した。平衡解離定数ＫＤを、式：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａを用いて計算した。Ｄ
ProteOn XPR36装置（Bio-Rad Laboratories, Inc.）をProteOn NLCセンサーチップと共に使用して、表面プラズモン共鳴アッセイを行った。具体的には、ＴＩＲドメインのＢＢループ（ＲＤＦＩＰＧＶＡＩＡＡ）およびＣ末端領域（ＥＧＴＶＧＴＧＣＮＷＱＥＡＴＳＩ）をコードする合成ペプチドを、ＮＬＣセンサーチップの表面上に、ＧＬＣポリマー層に結合されたNeutrAvidinによって固定した。対照として、ランニングバッファーである０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を補足したＰＢＳを流した。さまざまな種類のＴＩＰ１、すなわちＴＩＰ１−１、ＴＩＰ１−２およびＴＩＰ１−３（５０μＭ）、ならびに異なる濃度のＴＩＰ１（１２．５、２５および５０μＭ）を、固定したペプチドに対するその結合親和性を調べるために、チップ上に流した。測定後、センサーチップの表面を、０．８５％リン酸またはＰＢＳＴを用いて再生した。ProteOn manager（商標）ソフトウェア（バージョン2.0）を用いて解離定数を計算し、さまざまな用量のＴＩＰ１から得られたデータを、運動速度定数（ＫａおよびＫｄ）にマッチするようにグループ化した。平衡解離定数ＫＤを、式：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａを用いて計算した。Ｄ
試験例１．ＴＩＰのＴＬＲ４結合親和性の確認
実施例１−１において調製したＴＩＰ（ＴＩＰ１、ＴＩＰ２）のＴＬＲ４結合親和性を確認するために、実施例１−２において培養したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞においてＮＦ−κＢ活性を測定した。この目的のために、誘導可能な分泌型胚型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のＤＮＡが結合する部位を含むＩＬ−１２ ｐ４０最小プロモーターの制御下に配置した（ＩＬ−１２ ｐ４０は、ＴＬＲ４の刺激後、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）の活性化によって産生される）。次いで、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を、１２．５、２５、５０μＭのさまざまな濃度のＴＩＰまたはＣＰＰが連結されていないＴＩＰ（ＴＩＰ Ｗ／Ｏ ＣＰＰ）で処理した後、ＴＬＲ４活性の評価のためにＳＥＡＰ活性の平均値を計算した。結果を図１に示す。
実施例１−１において調製したＴＩＰ（ＴＩＰ１、ＴＩＰ２）のＴＬＲ４結合親和性を確認するために、実施例１−２において培養したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞においてＮＦ−κＢ活性を測定した。この目的のために、誘導可能な分泌型胚型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１のＤＮＡが結合する部位を含むＩＬ−１２ ｐ４０最小プロモーターの制御下に配置した（ＩＬ−１２ ｐ４０は、ＴＬＲ４の刺激後、ＮＦ−κＢおよびＡＰ−１（アクチベータータンパク質１）の活性化によって産生される）。次いで、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を、１２．５、２５、５０μＭのさまざまな濃度のＴＩＰまたはＣＰＰが連結されていないＴＩＰ（ＴＩＰ Ｗ／Ｏ ＣＰＰ）で処理した後、ＴＬＲ４活性の評価のためにＳＥＡＰ活性の平均値を計算した。結果を図１に示す。
図１（ａ）に示されるように、ＴＩＰのみを加えた場合にはＳＥＡＰ活性に大きな変化は見られなかったが、ＴＩＰで処理した後にＬＰＳでＴＬＲ４を刺激した場合は、ＴＩＰ２はそうではなかったがＴＩＰ１は、ＬＰＳにより誘導されるＳＥＡＰ活性を濃度依存的に低下したことが確認された。さらに、図１（ｂ）に示されるように、ＣＰＰ配列が連結されていない場合には、ＴＩＰ１（ＴＩＰ１ Ｗ／Ｏ ＣＰＰ）もＴＩＰ２（ＴＩＰ２ Ｗ／Ｏ ＣＰＰ）もＳＥＡＰ活性を変化させなかったことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＣＰＰと連結され、したがって細胞内に移行されると、シグナル伝達経路の下流のアダプター分子を阻害し、ＬＰＳによって誘導されるＴＬＲ４仲介シグナル伝達経路の活性化を阻害するので、ＴＩＰ１を有効なＴＬＲ４阻害剤として用い得ることが確認された。
試験例２．インビトロのＴＬＲシグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の阻害作用
ＬＰＳにより誘導されるＴＬＲ４仲介応答は、ＴＩＲＡＰとＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの直接の相互作用を誘導し、それによってＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路を活性化する。さらに、ＴＬＲ４仲介応答は、ＴＲＡＭとＴＲＩＦのＴＩＲドメインの相互作用をも誘導し、それによって非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路も活性化する。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路において、ＮＦ−κＢの初期活性化は、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）の分泌を誘導する。一方、非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路においては、ＩＲＦ３および７の活性を含む、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの後期分泌応答が誘導される。ＴＬＲ４シグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の効果を調べるために、本発明者は、ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳでの処理に付した後、下記の試験を行った。
ＬＰＳにより誘導されるＴＬＲ４仲介応答は、ＴＩＲＡＰとＭｙＤ８８のＴＩＲドメインの直接の相互作用を誘導し、それによってＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路を活性化する。さらに、ＴＬＲ４仲介応答は、ＴＲＡＭとＴＲＩＦのＴＩＲドメインの相互作用をも誘導し、それによって非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路も活性化する。ＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路において、ＮＦ−κＢの初期活性化は、炎症性サイトカイン、例えば腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン６（ＩＬ−６）の分泌を誘導する。一方、非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路においては、ＩＲＦ３および７の活性を含む、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）、例えばＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−βの後期分泌応答が誘導される。ＴＬＲ４シグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の効果を調べるために、本発明者は、ＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳでの処理に付した後、下記の試験を行った。
２−１．ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫのウエスタンブロッティング
実施例１−１において調製したＴＩＰ１の、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性に対する効果を確認するために、実施例２−３に記載した方法にしたがってウエスタンブロッティングを行った。結果を図２に示す。
実施例１−１において調製したＴＩＰ１の、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性に対する効果を確認するために、実施例２−３に記載した方法にしたがってウエスタンブロッティングを行った。結果を図２に示す。
図２（ａ）に示されるように、対照として用いたマウスマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞をＬＰＳのみで処理した場合には、ＮＦ−κＢ活性が上昇して、Ｉκ−Ｂαが分解され、ＩＲＦ３およびＡＴＦ３の活性が上昇したことが確認された。しかしながら、ＬＰＳと共にＴＩＰ１で処理した場合には、ＮＦ−κＢ活性は抑制され、Ｉκ−Ｂα分解ならびにＩＲＦ３およびＡＴＦ３の活性の程度が低下したことが確認された。さらに、図２（ｂ）に示されるように、ＬＰＳのみで処理した場合には、ＭＡＰＫ活性が上昇して、ＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８がリン酸化されたことが確認された。しかしながら、ＬＰＳと共にＴＩＰ１で処理した場合には、ＭＡＰＫ活性は抑制され、前記酵素のリン酸化の程度は低下したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに結合し、それによって、ＬＰＳにより誘導されるＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路、および非ＭｙＤ８８依存性のシグナル伝達経路を阻害することが確認された。
２−２．ＮＦ−κＢ活性化の確認
実施例１において調製したＴＩＰ１のＮＦ−κＢ活性に対する効果を確認するために、実施例２−４に記載した方法にしたがって共焦点レーザー顕微鏡試験を行った。結果を図３に示す。
実施例１において調製したＴＩＰ１のＮＦ−κＢ活性に対する効果を確認するために、実施例２−４に記載した方法にしたがって共焦点レーザー顕微鏡試験を行った。結果を図３に示す。
図３に示されるように、ＬＰＳのみで処理した場合には、活性化されたＮＦ−κＢ（ｐ−ｐ６５）が核内で発現されたことが確認された。しかしながら、ＬＰＳと共にＴＩＰ１で処理した場合には、核内でのＬＰＳが誘導するｐ６５リン酸化のレベルの低下によって、ＮＦ−κＢ活性が低下したことが確認された。
試験例３．サイトカイン分泌、ＮＯおよびＲＯＳ生成に対するＴＩＰ１の効果
実施例１−２において培養したマウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例１−１において調製したＴＩＰ１で処理した場合に、細胞質におけるサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β）の分泌、一酸化窒素（ＮＯ）および反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成が抑制されるかを確認するために、下記試験を行った。
実施例１−２において培養したマウスのマクロファージであるＲＡＷ２６４．７細胞を、実施例１−１において調製したＴＩＰ１で処理した場合に、細胞質におけるサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β）の分泌、一酸化窒素（ＮＯ）および反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成が抑制されるかを確認するために、下記試験を行った。
３−１．サイトカイン分泌に対するＴＩＰ１の効果
実施例２−５に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのReady-SET-Go! ELISAキットを用いて測定した。結果を図４に示す。
実施例２−５に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのReady-SET-Go! ELISAキットを用いて測定した。結果を図４に示す。
図４に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処理した場合には、濃度依存的にＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βの分泌が低下したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＬＰＳにより誘導されるサイトカイン分泌を抑制することが確認された。
３−２．ＮＯおよびＲＯＳの生成に対するＴＩＰ１の効果
細胞質におけるＮＯおよび反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、実施例２−６に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞をＴＩＰ１で処理し、サイトゾルＮＯおよびＲＯＳを定量するためにそれぞれについてＤＡＦ−ＦＭ（Invitrogen Corp., CA, USA）およびＤＣＦ−ＤＡ（Invitrogen Corp.）で染色した。さらに、実施例２−７に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清におけるＮＯレベルを、ＮＯ検出キットを用いて測定した。結果を図５に示す。
細胞質におけるＮＯおよび反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、実施例２−６に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞をＴＩＰ１で処理し、サイトゾルＮＯおよびＲＯＳを定量するためにそれぞれについてＤＡＦ−ＦＭ（Invitrogen Corp., CA, USA）およびＤＣＦ−ＤＡ（Invitrogen Corp.）で染色した。さらに、実施例２−７に記載した方法にしたがって、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清におけるＮＯレベルを、ＮＯ検出キットを用いて測定した。結果を図５に示す。
図５（ａ）〜５（ｃ）に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処理した場合には、ＴＩＰ１は細胞外ＮＯ放出ならびに細胞質内ＮＯおよびＲＯＳ生成のレベルを効果的に低下させたことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＬＰＳが誘導する酸化ストレスを抑制することが確認された。
試験例４．初代培養細胞に対するＴＩＰ１の効果の確認
実施例２において培養した、マウス骨髄由来マクロファージであるｍＢＭＤＭ細胞、およびヒト末梢血単核細胞であるｈＰＢＭＣ細胞を、実施例１において調製したＴＩＰ１で処理した場合に、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β）の分泌、一酸化窒素（ＮＯ）の生成、およびＴＬＲシグナル伝達タンパク質の活性化が抑制されるかを確認するために、下記試験を行った。
実施例２において培養した、マウス骨髄由来マクロファージであるｍＢＭＤＭ細胞、およびヒト末梢血単核細胞であるｈＰＢＭＣ細胞を、実施例１において調製したＴＩＰ１で処理した場合に、サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−β）の分泌、一酸化窒素（ＮＯ）の生成、およびＴＬＲシグナル伝達タンパク質の活性化が抑制されるかを確認するために、下記試験を行った。
４．１．ｍＢＭＤＭ細胞に対するＴＩＰ１の効果
実施例２−５に記載した方法にしたがって、ｍＢＭＤＭ細胞の培養上清におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのReady-SET-Go! ELISAキットを用いて測定し、実施例２−７に記載した方法にしたがって、該上清におけるＮＯレベルを測定した。結果を図６に示す。
実施例２−５に記載した方法にしたがって、ｍＢＭＤＭ細胞の培養上清におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＦＮ−βのReady-SET-Go! ELISAキットを用いて測定し、実施例２−７に記載した方法にしたがって、該上清におけるＮＯレベルを測定した。結果を図６に示す。
図６（ａ）〜６（ｄ）に示されるように、ＴＩＰ１は、ＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６分泌およびＮＯ生成のレベルを低下し、ポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されるＩＦＮ−β生成を抑制したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、マウス骨髄由来マクロファージにおいて、ＬＰＳまたはポリ（Ｉ：Ｃ）により誘導されるサイトカイン分泌およびＮＯ生成を抑制することが確認された。
４．２．ｈＰＢＭＣ細胞に対するＴＩＰ１の効果
ｈＰＢＭＣ細胞におけるＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、実施例２−３に記載した方法にしたがってウエスタンブロッティングを行い、タンパク質を可視化した。結果を図７に示す。
ｈＰＢＭＣ細胞におけるＮＦ−κＢおよびＭＡＰＫの活性に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、実施例２−３に記載した方法にしたがってウエスタンブロッティングを行い、タンパク質を可視化した。結果を図７に示す。
図７に示されるように、対照として用いたヒト末梢血単核細胞であるｈＰＢＭＣ細胞をＬＰＳのみで処理した場合には、ＮＦ−κＢ活性が上昇し、Ｉκ−Ｂαが分解されたが、ＬＰＳとＴＩＰ１とで処理した場合には、ＮＦ−κＢ活性が抑制され、Ｉκ−Ｂαの分解が少なかった。さらに、ＬＰＳのみで処理した場合には、ＭＡＰＫ活性が上昇して、ＥＲＫ、ＪＮＫ、ｐ３８がリン酸化されたことが確認された。しかしながら、ＬＰＳとＴＩＰ１とで処理した場合には、ＭＡＰＫ活性が抑制され、前記酵素のリン酸化の程度が低下することが確認された。
これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、不死化細胞系においても、動物から直接抽出された初代培養細胞においても、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害することが確認された。
試験例５．他のＴＬＲシグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の効果
ＴＬＲ４以外のＴＬＲファミリーメンバーのシグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、異なるＴＬＲリガンドによって誘導されたＴＮＦ−αのレベルを、実施例２−５に記載した方法を用いて測定した。結果を図８に示す。さらに、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、ＩＦＮ−βレベルを、Ready-SET-Go! ELISAキットを用いて測定した。結果を図９に示す。
ＴＬＲ４以外のＴＬＲファミリーメンバーのシグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、異なるＴＬＲリガンドによって誘導されたＴＮＦ−αのレベルを、実施例２−５に記載した方法を用いて測定した。結果を図８に示す。さらに、ＲＡＷ２６４．７細胞の培養上清において、ＩＦＮ−βレベルを、Ready-SET-Go! ELISAキットを用いて測定した。結果を図９に示す。
図８に示されるように、ＴＩＰ１と、ＰＡＭ３ＣＳＫ４（ＴＬＲ１／２）またはＦＳＬ−１（ＴＬＲ２／６）またはポリ（Ｉ：Ｃ）（ＴＬＲ３）またはＲ８４８（ＴＬＲ７／８）またはＣｐＧ−ＯＤＮ（ＴＬＲ９）とで処理した場合には、ＴＮＦ−α分泌レベルが低下したことが確認された。特に、ＴＩＰ１はＴＬＲ３シグナル伝達に対して高い阻害作用を示した（５０μＭで９２％低下）。さらに、図９に示されるように、ＴＩＰ１とポリ（Ｉ：Ｃ）とで処理した場合には、ＩＦＮ−β分泌レベルが低下したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４と同様、ＴＬＲ１／２、ＴＬＲ２／６、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９に関しても、サイトカイン分泌に対する阻害作用を示すことが確認された。
試験例６．神経変性疾患に対するＴＩＰ１の効果
ＬＰＳにより誘導されるＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性化は、ＮＦ−κＢ活性をもたらし、これは直ちに、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＮＡＣＨＴ,ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）、およびＩＬ−１βのマクロファージにおける発現を導く。そのような条件下に、ＡＴＰおよびカリウム流出因子により細胞内カリウムレベルが低下され、ＮＬＲＰ３インフラマソームによる成熟型ＩＬ−１β生成が誘導される。
ＬＰＳにより誘導されるＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性化は、ＮＦ−κＢ活性をもたらし、これは直ちに、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＮＡＣＨＴ,ＬＲＲおよびＰＹＤドメイン含有タンパク質３（ＮＬＲＰ３）、およびＩＬ−１βのマクロファージにおける発現を導く。そのような条件下に、ＡＴＰおよびカリウム流出因子により細胞内カリウムレベルが低下され、ＮＬＲＰ３インフラマソームによる成熟型ＩＬ−１β生成が誘導される。
ＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性とＮＬＲＰ３インフラマソーム生成の間のそのような関係を考慮して、本発明者は、ヒト単球であるＴＨＰ１細胞、およびマウス骨髄由来マクロファージであるｍＢＭＤＭ ＴＨＰ１細胞を、ＬＰＳ／ＡＴＰによる処理、またはＴＩＰ１とＬＰＳ／ＡＴＰとによる処理に付した後、実施例２−３に記載した方法にしたがってウエスタンブロッティングを行って、ＮＬＲＰ３、プロ−カスパーゼ−１（４５ｋＤａ）、活性型カスパーゼ−１（１０ｋＤａ）、プロ−ＩＬ−１β（３５ｋＤａ）、および成熟型ＩＬ−１β（１７ｋＤａ）のタンパク質発現を可視化した。結果を図１０に示す。
さらに、ＮＬＲＰ３インフラマソームが誘導されたときのサイトカイン分泌に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、ＴＨＰ１細胞およびｍＢＭＤＭ細胞を、ＬＰＳ／ＡＴＰによる処理、またはＴＩＰ１とＬＰＳ／ＡＴＰとによる処理に付した後、実施例２−５に記載した方法にしたがって、ヒトおよびマウスＩＬ−１βのReady-SET-Go! ELISAキット用いて、培養上清中のＩＬ−１βレベルを測定した。結果を図１１に示す。
図１０（ａ）および１０（ｂ）に示されるように、ＴＨＰ１およびｍＢＭＤＭ細胞において、ＬＰＳおよびＡＴＰにより誘導されるＮＬＲＰ３、カスパーゼ−１、ＩＬ−１βの発現は、ＴＩＰ１によって抑制されたことが確認された。特に、ＴＩＰ１は、ＮＬＲＰ３、活性型カスパーゼ−１（１０ｋＤａ）および成熟型ＩＬ−１β（１７ｋＤａ）の細胞内発現レベルを顕著に低下し、結局、ＩＬ−１β分泌を抑制したことが確認された。さらに、図１１に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳ／ＡＴＰとで処理した場合には、ＩＬ−１βの分泌レベルが低下した。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害して、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を抑制することが確認された。
ＮＬＲＰ３インフラマソームは、異常に活性化されると、さまざまな炎症性疾患や、特に神経変性疾患を引き起こす。したがって、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性を効果的に抑制することのできるものは、炎症応答の抑制による神経変性疾患の処置剤として有用であると考えられる。したがって、上記結果から、本発明者は、本発明のＴＩＰ１は、神経変性疾患に対し予防または治療効果を示すことができることを示した。
試験例７．ＴＩＰ１配列特異性の確認
実施例１−１において調製したデコイペプチドのアミノ酸配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｉ（配列番号１）を用いて、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに結合するＴＩＰ１の最小アミノ酸領域を確認するために、本発明者は、配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ（デコイペプチド１−２、配列番号２）およびＶ−Ｌ−Ｌ−Ｉ（デコイペプチド１−３、配列番号７）のそれぞれを、実施例１で用いた同じＣＰＰ配列のＮ末端に連結させた。本試験例において使用したすべてのペプチドを表３に挙げる。
実施例１−１において調製したデコイペプチドのアミノ酸配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｉ（配列番号１）を用いて、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインに結合するＴＩＰ１の最小アミノ酸領域を確認するために、本発明者は、配列Ｓ−Ｈ−Ｃ−Ｒ（デコイペプチド１−２、配列番号２）およびＶ−Ｌ−Ｌ−Ｉ（デコイペプチド１−３、配列番号７）のそれぞれを、実施例１で用いた同じＣＰＰ配列のＮ末端に連結させた。本試験例において使用したすべてのペプチドを表３に挙げる。
実施例１−２において培養したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ４細胞を、表３に挙げたＴＩＰ１（ＣＰＰ−ＳＨＣＲＶＬＬＩ）、ＴＩＰ１−１（ＣＰＰ）、ＴＩＰ１−２（ＣＰＰ−ＳＨＣＲ）およびＴＩＰ１−３（ＣＰＰ−ＶＬＬＩ）と、ＬＰＳとで処理し、次いで試験例１に記載の方法を用いてＮＦ−κＢ活性を測定した。さらに、実施例１−２において培養したｈＰＢＭＣ細胞を、ＴＩＰ１（ＣＰＰ−ＳＨＣＲＶＬＬＩ）、ＴＩＰ１−１（ＣＰＰ）、ＴＩＰ１−２（ＣＰＰ−ＳＨＣＲ）およびＴＩＰ１−３（ＣＰＰ−ＶＬＬＩ）と、ＬＰＳとで処理し、次いで実施例２−７の方法を用いてＮＯ生成レベルを測定した。結果を図１２に示す。
図１２（ａ）に示されるように、ＴＩＰ１はＮＦ−κＢ活性に対して最も高い抑制効果を示し、ＴＩＰ１−２もＮＦ−κＢ活性を低下したことが確認されたが、ＴＩＰ１−１またはＴＩＰ１−３で処理した場合には、変化または有意な変化は見られなかった。さらに、図１２（ｂ）に示されるように、ＴＩＰ１はＮＯ生成レベルに対して最も大きい低下効果を示し、ＴＩＰ１−２もＮＯ生成を抑制したことが確認されたが、ＴＩＰ１−１またはＴＩＰ１−３で処理した場合には、変化または有意な変化は見られなかった。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１の配列のなかで、阻害効果をもたらすのに重要なのはＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ配列であることが確認された。
試験例８．ＴＩＰ１とＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の間の相互作用の確認
ＴＬＲ４のＴＩＲドメインとＴＩＰ１の間の結合部分を解析するために、タンパク質−タンパク質の結合を行った。その結果、ＴＩＰ１は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインのＢＢループ、ＤＤループ、およびＣ末端テールに結合すると考えられ、それを確認するために、実施例２−８に記載した方法にしたがって表面プラズモン共鳴アッセイを行った。
ＴＬＲ４のＴＩＲドメインとＴＩＰ１の間の結合部分を解析するために、タンパク質−タンパク質の結合を行った。その結果、ＴＩＰ１は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインのＢＢループ、ＤＤループ、およびＣ末端テールに結合すると考えられ、それを確認するために、実施例２−８に記載した方法にしたがって表面プラズモン共鳴アッセイを行った。
さらに、ＴＬＲ４へのＴＩＰ１の結合を確認するために、ＴＩＰ１のＮ末端へのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）の連結によってＴＩＰ１−ＦＩＴＣを調製した。実施例１−２のＴＨＰ１細胞を、ＴＩＰ１（ＴＩＰ１−ＦＩＴＣ）による処理、またはＬＰＳとＴＩＰ１とによる処理に付した後、実施例２−４に記載した方法にしたがって免疫蛍光染色と共焦点顕微鏡を用いて、蛍光染色された細胞の数を数え、それによってタンパク質間の相互作用を調べた。結果を図１３に示す。
図１３に示されるように、ＴＩＰ１−ＦＩＴＣとＬＰＳとで処理した場合には、ＴＩＰ１−ＦＩＴＣ（緑）とＴＬＲ４（赤）とが複合体を形成したが、ＭｙＤ８８（青）はその複合体部位に結合しなかったことが確認された。一方、ＬＰＳが存在しない場合には、ＴＬＲ４は細胞膜において発現され、ＭｙＤ８８は細胞内に分布したこと；細胞をＬＰＳによる処理に付した場合には、ＴＬＲ４およびＴＩＰ１−ＦＩＴＣの両方がエンドサイトーシスのプロセスによって細胞内に導かれ、ＭｙＤ８８は細胞内に分布するよりもむしろ細胞膜上に集中したことが確認された。さらに、ＴＩＰ１−ＦＩＴＣ−ＴＬＲ４は互いに強く結合していたが、ＭｙＤ８８はＴＩＰ１−ＦＩＴＣに対し弱い結合を形成したことが確認された。これらの結果から、ＴＬＲ４シグナル伝達経路に対するＴＩＰ１の阻害作用は、ＴＬＲ４のＴＩＲドメインのなかのＣ末端テールおよびＢＢループへの結合によるものであること、そして、ＴＩＰ１とＭｙＤ８８の間の相互作用が阻害され、それによって最終的にＴＬＲ４シグナル伝達経路の阻害がもたらされることが確認された。
実施例９．マウスにおけるサイトカイン分泌に対するＴＩＰ１のインビボ効果
すべての動物実験を動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の承認の下に行った（KHNMC AP 2016-006）。ＴＩＰ１のインビボ効果を確認するために、８週齢のＣ５６ＢＬ/６マウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）をOrientBio, Inc.（Seoul, Korea）から購入して実験に使用した。マウスにＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ動物体重）を腹腔内注射し、１時間後にＬＰＳ（５μｇ／ｇ動物体重）を２時間注射した。対照には同体積のＰＢＳを注射した。その後、マウスの血液から遠心によって血漿を分離し、分泌レベルの解析まで−８０℃で保存した。血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０（１：１００希釈）、およびＩＬ−６（１：１００希釈）のレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６のELISA MAX Deluxe ELISAキット（BioLegend, San Diego, CA, USA）を用いて測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc.）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、結果をSoftmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。結果を図１４に示す。
すべての動物実験を動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）の承認の下に行った（KHNMC AP 2016-006）。ＴＩＰ１のインビボ効果を確認するために、８週齢のＣ５６ＢＬ/６マウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）をOrientBio, Inc.（Seoul, Korea）から購入して実験に使用した。マウスにＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ動物体重）を腹腔内注射し、１時間後にＬＰＳ（５μｇ／ｇ動物体重）を２時間注射した。対照には同体積のＰＢＳを注射した。その後、マウスの血液から遠心によって血漿を分離し、分泌レベルの解析まで−８０℃で保存した。血漿中のＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０（１：１００希釈）、およびＩＬ−６（１：１００希釈）のレベルを、マウスＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６のELISA MAX Deluxe ELISAキット（BioLegend, San Diego, CA, USA）を用いて測定した。マイクロプレートリーダー分光光度計（Molecular Devices Inc.）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定し、結果をSoftmax Pro 5.3ソフトウェア（Molecular Devices Inc.）を用いて解析した。結果を図１４に示す。
図１４（ａ）〜１４（ｃ）に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処理した場合には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０およびＩＬ−６の分泌レベルが顕著に低下したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、インビトロと同様インビボでも、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害し、したがってサイトカイン分泌を抑制することが確認された。
試験例１０．敗血症に対するＴＩＰ１の効果
敗血症に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ/ｃマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置に付した後、腎および肝障害における変化ならびに生存率を調べる下記試験を行った。
敗血症に対するＴＩＰ１の効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６ＪおよびＢＡＬＢ/ｃマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置に付した後、腎および肝障害における変化ならびに生存率を調べる下記試験を行った。
１０−１．肝臓におけるサイトカイン分泌に対するＴＩＰ１の効果
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置（２時間）に付した。その後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Fisher Scientific, Inc.）と共にＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬を含むKontes Pellet Pestle Cordless Motor（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を用いて、肝組織の抽出およびホモジナイズを行った。次いで、製造者のプロトコルにしたがってタンパク質を抽出した。次いで、実施例２−３に記載した方法にしたがうウエスタンブロッティングによって、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびβ−アクチンのタンパク質発現を可視化し、バンド強度をグラフに表した。結果を図１５に示す。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置（２時間）に付した。その後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Fisher Scientific, Inc.）と共にＭ−ＰＥＲ哺乳動物タンパク質抽出試薬を含むKontes Pellet Pestle Cordless Motor（Thermo Fisher Scientific, Inc.）を用いて、肝組織の抽出およびホモジナイズを行った。次いで、製造者のプロトコルにしたがってタンパク質を抽出した。次いで、実施例２−３に記載した方法にしたがうウエスタンブロッティングによって、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびβ−アクチンのタンパク質発現を可視化し、バンド強度をグラフに表した。結果を図１５に示す。
図１５（ａ）および１５（ｂ）に示されるように、ＬＰＳとＴＩＰ１とで処置した場合には、ＬＰＳが誘導する、マウス肝組織におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６発現のレベルが顕著に低下したことが確認された。
１０−２．腎および肝障害に対するＴＩＰ１の効果
マウス敗血症モデルにおけるＴＩＰ１の抗炎症作用をより精密に確認するために、上記と同様の方法で実験を行った。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置（２４時間）に付した後、マウス血液から遠心によって血漿を分離した。分離した血漿を用いて、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌レベルを、試験例９の方法で測定し、腎障害マーカーである血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒ）、ならびに肝障害マーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の分泌レベルの変化を、VETTEST-8008-システム（IDEXX）で調べた。結果を図１６に示す。
マウス敗血症モデルにおけるＴＩＰ１の抗炎症作用をより精密に確認するために、上記と同様の方法で実験を行った。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、ＰＢＳとＬＰＳとによる処置、またはＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置（２４時間）に付した後、マウス血液から遠心によって血漿を分離した。分離した血漿を用いて、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の分泌レベルを、試験例９の方法で測定し、腎障害マーカーである血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニン（Ｃｒ）、ならびに肝障害マーカーであるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の分泌レベルの変化を、VETTEST-8008-システム（IDEXX）で調べた。結果を図１６に示す。
図１６（ａ）〜１６（ｆ）に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処置した場合には、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６、ならびにＢＵＮ、Ｃｒ、ＡＳＴおよびＡＬＴの分泌レベルが顕著に低下したことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害し、それによりサイトカイン分泌を低下すると共に腎および肝障害を軽減できることが確認された。
１０−３．腎アポトーシスに対するＴＩＰ１の効果
８週齢のＣ５６ＢＬ／６マウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）を、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置、またはＰＢＳとＬＰＳとによる処置に付した（２４時間）。その後、腎組織を分離し、電子天秤（ER-180A, A&D Company, Tokyo, Japan）を用いて重量測定した後、矢状面に切断して切片を作製した。切片を１０％ホルマリン溶液中に一晩置いた後、パラフィンワックスを注ぐことによって固めた。それをミクロトームで４μｍの薄い切片とし、固定した。固定した腎組織においてアポトーシスに対するＴＩＰ１の効果を確認するために、腎組織をＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）（Merck Millipore, Billerica, MA, USA）染色に付し、蛍光染色された細胞の数を、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany）を用いて数えた。画像をZen 2009ソフトウェア（Carl Zeiss MicroImaging GmbH）を用いて解析した。結果を図１７に示す。
８週齢のＣ５６ＢＬ／６マウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）を、ＴＩＰ１とＬＰＳとによる処置、またはＰＢＳとＬＰＳとによる処置に付した（２４時間）。その後、腎組織を分離し、電子天秤（ER-180A, A&D Company, Tokyo, Japan）を用いて重量測定した後、矢状面に切断して切片を作製した。切片を１０％ホルマリン溶液中に一晩置いた後、パラフィンワックスを注ぐことによって固めた。それをミクロトームで４μｍの薄い切片とし、固定した。固定した腎組織においてアポトーシスに対するＴＩＰ１の効果を確認するために、腎組織をＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識）（Merck Millipore, Billerica, MA, USA）染色に付し、蛍光染色された細胞の数を、共焦点レーザー走査顕微鏡（LSM-700, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Jena, Germany）を用いて数えた。画像をZen 2009ソフトウェア（Carl Zeiss MicroImaging GmbH）を用いて解析した。結果を図１７に示す。
図１７に示されるように、ＬＰＳのみで処理した場合には、ＴＵＮＥＬ陽性腎細胞が顕著に増加した、すなわち、腎組織におけるアポトーシス（緑色スポット）が増加したが、ＬＰＳにより腎組織において増加するアポトーシス（緑色スポット）は、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処置した場合には減少したことが確認された。
１０−４．生存率に対するＴＩＰ１の効果
ＬＰＳにより誘導される敗血症に対するＴＩＰ１の効果を調べるために、８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）を、ＬＰＳ（５または１０μｇ／ｇ動物体重）による処置、およびＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ動物体重）とＬＰＳとによる処置に付した後、５日間にわたり生存率を調べた。対照には同体積のＰＢＳを注射した。結果を図１８に示す。
ＬＰＳにより誘導される敗血症に対するＴＩＰ１の効果を調べるために、８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（２０〜２５ｇ、ｎ＝８）を、ＬＰＳ（５または１０μｇ／ｇ動物体重）による処置、およびＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ動物体重）とＬＰＳとによる処置に付した後、５日間にわたり生存率を調べた。対照には同体積のＰＢＳを注射した。結果を図１８に示す。
図１８に示されるように、ＴＩＰ１とＬＰＳとで処置した場合には、ＬＰＳのみで処置した場合と比較して、生存率の向上が見られたことが確認された。具体的には、５μｇ／ｇのＬＰＳによる処置によって得た軽度の敗血症モデルの場合、生存率の１００％低下がわずか３日で見られたが、ＬＰＳと共にＴＩＰ１で処置した場合には５日後まで３０％の生存率が維持された。さらに、１０μｇ／ｇのＬＰＳによる処置によって得た重度の敗血症モデルの場合、生存率はわずか１日で７０％低下し、２日後にはすべてのマウスが死亡したが、ＬＰＳと共にＴＩＰ１で処置した場合には、重度敗血症の誘導にもかかわらず、１００％の生存率が１日間維持され、生存率は２日後に９０％低下した。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を阻害して初期炎症を抑制し、サイトカイン分泌ならびに腎および肝障害を低減し、それによって最終的に敗血症を軽減することが確認された。
試験例１１．関節リウマチに対するＴＩＰ１の効果
関節リウマチに対するＴＩＰ１の効果を確認するために、６〜７週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（２０〜２３ｇ）にコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルを適用することにより、関節炎を誘導した。具体的には、ニワトリＩＩ型コラーゲン（Sigma-Aldrich Co. LLC.）および完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を１：１で混合し、乳化した。次いで、乳化したコラーゲン液１００μｇをマウス尾部に皮内注射して、一次免疫を誘導し、これを０日目とした。一次免疫の１４日後に、乳化コラーゲン液を再びマウス尾部に皮内注射して、二次免疫を誘導した（追加免疫）。
関節リウマチに対するＴＩＰ１の効果を確認するために、６〜７週齢の雄ＤＢＡ／１Ｊマウス（２０〜２３ｇ）にコラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）モデルを適用することにより、関節炎を誘導した。具体的には、ニワトリＩＩ型コラーゲン（Sigma-Aldrich Co. LLC.）および完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を１：１で混合し、乳化した。次いで、乳化したコラーゲン液１００μｇをマウス尾部に皮内注射して、一次免疫を誘導し、これを０日目とした。一次免疫の１４日後に、乳化コラーゲン液を再びマウス尾部に皮内注射して、二次免疫を誘導した（追加免疫）。
その後、次の２つのＴＩＰ１処置計画を設計した：計画(1)：二次免疫（１５日目）の後、ＴＩＰ１（２．５、５および１０ｎｍｏｌ／ｇ）、または陽性対照として、従来知られる関節炎治療剤であるプレドニゾロン５ｍｇ／ｋｇを、３０日間毎日注射する；および計画(2)：関節炎の完全な誘発（３５日目）の後、１０ｎｍｏｌ／ｇのＴＩＰ１を１０日間注射する。これら計画は、下記の全部で７つの試験群（ｎ＝８）を含んだ：（１）未処置正常群（正常）；（２）対照（賦形剤で処置）（ＣＩＡ、ｎ＝８）；（３）２．５ｎｍｏｌ／ｇ ＴＩＰ１処置群（ＣＩＡ−ＴＩＰ１（２．５ｎｍｏｌ／ｇ））；（４）５ｎｍｏｌ／ｇ ＴＩＰ１処置群（ＣＩＡ−ＴＩＰ１（５ｎｍｏｌ／ｇ））；（５）１０ｎｍｏｌ／ｇ ＴＩＰ１処置群（ＣＩＡ−ＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ））；（６）５μｇ／ｇプレドニゾロン（従来の関節炎治療剤）処置群（ＣＩＡ−プレドニゾロン（５μｇ／ｇ））；（７）関節炎後の時期（post-arthritis phase；ＰＡＰ）の１０ｎｍｏｌ／ｇ ＴＩＰ１処置群（ＰＡＰ ＣＩＡ−ＴＩＰ１（１０ｎｍｏｌ／ｇ））。ＴＩＰ１およびプレドニゾロンは生理食塩液に溶解して腹腔内注射した。その後、行動発現および障害における変化、例えば見掛けの症状および体重、マウスの鳴声、脚体積、および関節炎指数の変化を調べた。結果を図１９および２０に示す。
図１９に示されるように、ＣＩＡモデルによって示された脚の重度の腫脹が、ＴＩＰ１で処置した場合には、正常マウスと同等に軽減されたことが視覚的に確認された。さらに、図２０に示されるように、ＴＩＰ１は、関節炎の誘導によって引き起こされる体重減少、鳴声および脚体積ならびに関節炎指数上昇を、従来の関節炎治療剤であるプレドニゾロン投与の場合と同等のレベルに抑制したことが確認された。
さらに、ＣＩＡモデルによって関節炎を誘導したＤＡＢ−１Ｊマウスに、ＴＩＰ１およびプレドニゾロンを１日１回、３０日間にわたり注射した。次いで、４５日目にマウスを殺し、関節組織のサンプルを採取した。その後、該関節組織の３Ｄ画像および骨塩密度（ＢＭＤ）をマイクロコンピューター断層撮影（マイクロＣＴ）によって解析した。さらに、マウスの膝関節領域をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色に付し、軟骨、軟骨下骨、大腿骨、脛骨および半月板における滑膜過形成における変化を観察した。結果を図２１および２２に示す。
図２１および２２に示されるように、ＴＩＰ１により処置した場合には、ＣＩＡモデルによる骨の損傷が正常マウスと同等に軽減され、軟骨（Ｃ）、軟骨下骨（Ｓ）、大腿骨（Ｆ）、脛骨（Ｔ）および半月板（Ｍ）における組織病理学的変化も低減されたことが確認された。これらの結果から、本発明のＴＩＰ１は、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を効果的に阻害し、関節リウマチを包含するさまざまな急性または慢性の炎症性疾患の処置剤として有用でありうることが確認された。
上記した本発明の説明は、例示説明のために供されるものである。本発明の技術的な精神または本質的な特徴から外れることなく容易にさまざまな変化および変更を加えうることは、当業者に理解される。したがって、上記の例はあらゆる面で例示説明のためのものであって、限定のためのものではないと理解すべきである。
本発明の態様を下記項にさらに記載する：
［項１］
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
［項２］
前記ペプチドのＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ配列（配列番号２）が、トール様受容体（ＴＬＲ）のトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインに結合する、上記項１に記載のペプチド。
［項３］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチド。
［項４］
前記融合ペプチドが、トール様受容体（ＴＬＲ）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項５］
前記融合ペプチドが、トール様受容体４（ＴＬＲ４）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項４に記載の融合ペプチド。
［項６］
前記融合ペプチドが、トール様受容体１／２（ＴＬＲ１／２）、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）、トール様受容体３（ＴＬＲ３）、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、およびトール様受容体９（ＴＬＲ９）からなる群から選択される任意の１つが仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項４に記載の融合ペプチド。
［項７］
前記融合ペプチドによるＴＬＲシグナル伝達経路の阻害が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６もしくはＩＦＮ−βの発現の抑制、ＮＯもしくはＲＯＳの発生の抑制、またはＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫもしくはＮＬＲＰ３インフラマソームの活性の抑制をもたらす、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項８］
前記融合ペプチドが、ＭｙＤ８８依存性および非ＭｙＤ８８依存性のＴＬＲ４シグナル伝達経路の両方を阻害する、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項９］
前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項１０］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［項１１］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［項１２］
前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、上記項１１に記載の医薬組成物。
［項１３］
前記自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的形態のブドウ膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、雄性不妊、小児糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Hbs-ve、潜在性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１４］
前記炎症性疾患が、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、アトピー性鼻炎、肺炎、アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、敗血症、血管炎、滑液包炎、ループス、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、多発硬化症、固形腫瘍、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、肥満、およびウイルス感染症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１５］
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、ルイ（Louis）認知症、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、多系統萎縮症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、ルー・ゲーリッグ病、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１６］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
［項１７］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
本発明の実施形態
本発明を、以下、実施例および試験例によって、より詳細に説明する。下記の実施例および試験例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は下記実施例および試験例によって制限されない。
［項１］
配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
［項２］
前記ペプチドのＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ配列（配列番号２）が、トール様受容体（ＴＬＲ）のトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインに結合する、上記項１に記載のペプチド。
［項３］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチド。
［項４］
前記融合ペプチドが、トール様受容体（ＴＬＲ）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項５］
前記融合ペプチドが、トール様受容体４（ＴＬＲ４）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項４に記載の融合ペプチド。
［項６］
前記融合ペプチドが、トール様受容体１／２（ＴＬＲ１／２）、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）、トール様受容体３（ＴＬＲ３）、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、およびトール様受容体９（ＴＬＲ９）からなる群から選択される任意の１つが仲介するシグナル伝達経路を阻害する、上記項４に記載の融合ペプチド。
［項７］
前記融合ペプチドによるＴＬＲシグナル伝達経路の阻害が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６もしくはＩＦＮ−βの発現の抑制、ＮＯもしくはＲＯＳの発生の抑制、またはＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫもしくはＮＬＲＰ３インフラマソームの活性の抑制をもたらす、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項８］
前記融合ペプチドが、ＭｙＤ８８依存性および非ＭｙＤ８８依存性のＴＬＲ４シグナル伝達経路の両方を阻害する、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項９］
前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、上記項３に記載の融合ペプチド。
［項１０］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［項１１］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
［項１２］
前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、上記項１１に記載の医薬組成物。
［項１３］
前記自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的形態のブドウ膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、雄性不妊、小児糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Hbs-ve、潜在性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１４］
前記炎症性疾患が、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、アトピー性鼻炎、肺炎、アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、敗血症、血管炎、滑液包炎、ループス、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、多発硬化症、固形腫瘍、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、肥満、およびウイルス感染症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１５］
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、ルイ（Louis）認知症、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、多系統萎縮症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、ルー・ゲーリッグ病、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される少なくとも１つである、上記項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
［項１６］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
［項１７］
配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
本発明の実施形態
本発明を、以下、実施例および試験例によって、より詳細に説明する。下記の実施例および試験例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲は下記実施例および試験例によって制限されない。
Claims (17)
- 配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド。
- 前記ペプチドのＳ−Ｈ−Ｃ−Ｒ配列（配列番号２）が、トール様受容体（ＴＬＲ）のトール／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインに結合する、請求項１に記載のペプチド。
- 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドが、トール様受容体（ＴＬＲ）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項３に記載の融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドが、トール様受容体４（ＴＬＲ４）が仲介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項４に記載の融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドが、トール様受容体１／２（ＴＬＲ１／２）、トール様受容体２／６（ＴＬＲ２／６）、トール様受容体３（ＴＬＲ３）、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、およびトール様受容体９（ＴＬＲ９）からなる群から選択される任意の１つが仲介するシグナル伝達経路を阻害する、請求項４に記載の融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドによるＴＬＲシグナル伝達経路の阻害が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６もしくはＩＦＮ−βの発現の抑制、ＮＯもしくはＲＯＳの発生の抑制、またはＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫもしくはＮＬＲＰ３インフラマソームの活性の抑制をもたらす、請求項３に記載の融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドが、ＭｙＤ８８依存性および非ＭｙＤ８８依存性のＴＬＲ４シグナル伝達経路の両方を阻害する、請求項３に記載の融合ペプチド。
- 前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の融合ペプチド。
- 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
- 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを有効成分として含む、自己免疫疾患、炎症性疾患および神経変性疾患からなる群から選択される、ＴＬＲ経路により仲介される少なくとも１つの疾患を予防または治療するための医薬組成物。
- 前記融合ペプチドが、配列番号３または配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項１１に記載の医薬組成物。
- 前記自己免疫疾患が、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的形態のブドウ膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、雄性不妊、小児糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Hbs-ve、潜在性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェゲナー肉芽腫症、多発性筋炎／皮膚筋炎、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記炎症性疾患が、喘息、湿疹、乾癬、アレルギー、関節リウマチ、乾癬性関節炎、アトピー性皮膚炎、ざ瘡、アトピー性鼻炎、肺炎、アレルギー性皮膚炎、慢性副鼻腔炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、潰瘍、慢性気管支炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、敗血症、血管炎、滑液包炎、ループス、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎、多発硬化症、固形腫瘍、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化、肥満、およびウイルス感染症からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
- 前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、ルイ（Louis）認知症、大脳皮質基底核変性症、パーキンソン病、多系統萎縮症、ハンチントン病、進行性核上性麻痺、ルー・ゲーリッグ病、原発性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の医薬組成物。
- 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
- 配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドが細胞膜透過ペプチドのＮ末端に連結されている融合ペプチドを、必要とする個体に投与するステップを含む、ＴＬＲ経路により仲介される疾患を予防または治療する方法。
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