CN111094321A - 用于抑制Toll样受体(TLR)的肽和包含该多肽的药物组合物 - Google Patents

用于抑制Toll样受体(TLR)的肽和包含该多肽的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抑制TLR1/2、TLR2/6、TLR7、TLR8和TLR9信号传导通路以及Toll样受体4(TLR4)和TLR3的融合多肽，以及用于预防或治疗介导的TLR通路介导的疾病的药物组合物。本发明的融合肽具有抑制TLR4和各种TLR通路的优异效果，并且可以通过抑制TLR介导的免疫反应有效地用于预防和治疗由信号传导通路引起的各种TLR通路介导的疾病，例如自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病。

Description

用于抑制Toll样受体(TLR)的肽和包含该多肽的药物组合物
技术领域
本发明涉及抑制Toll样受体(TLR)1/2、TLR2/6、TLR7、TLR8和TLR9以及TLR4和TLR3的信号传导通路的融合肽，以及包含该融合肽的用于预防或治疗TLR通路介导的疾病的药物组合物。
背景技术
固有免疫是哺乳动物免疫系统抵御细菌感染的第一道防线，并且通过模式识别受体(例如Toll样受体(TLR))识别病原相关分子模式(PAMP)或危险相关分子模式(DAMP)来激活。
TLR在固有免疫反应中起重要作用，可分为胞外TLR和胞内TLR，胞外TLR作用于质膜且包括TLR1，TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11，胞内TLR作用于细胞内部如内体且包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。从结构上讲，TLR在胞外域的N端具有被配体或辅助分子识别的富含亮氨酸的重复(LRR)位点，并且在胞内部分的C端具有转导信号的Toll/白介素1受体(TIR)域。
特别是，TLR4是TLR家族中首个被确认的受体，并且激活固有免疫信号，该信号通过髓样分化88(MyD88)依赖性信号传导通路和MyD88非依赖性信号传导通路放大。相比之下，TLR3仅激活MyD88非依赖性信号传导通路。由于TLR的这种作用，人们对旨在将TLR用作治疗各种免疫疾病的靶标的研究越来越感兴趣。
TLR4的MyD88依赖性信号传导是凭借LPS通过辅助分子(例如分化簇14(CD14)和髓样分化因子2(MD2))识别而引发的。LPS结合后，TLR4二聚化，这使得TLR4的TIR域和TIR域衔接子蛋白(TIRAP或MyD88衔接子样(MAL))的TIR域彼此结合，从而与MyD88形成复合体，从而激活其信号传导通路。激活的TLR4通过Myd88依赖性信号传导过程诱导NFκB的早期激活、迁移至细胞核以及MAPK的激活。NFκB和MAPK的激活分泌炎性细胞因子，例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)。TLR4和TLR3的MyD88非依赖性信号传导过程是通过每个TLR的TIR域与含TIR域的衔接子诱导性干扰素-β(TRIF)/TRIF相关的衔接子分子(TRAM)复合体的TIR域之间的结合而启动的，并且通过干扰素调节因子(IRF)的激活来分泌1型干扰素。另外，在巨噬细胞中，TLR4活化产生氧化应激源，例如NO和ROS。
如此，由于TLR可以作为治疗各种疾病例如自说不通我能身免疫性疾病、炎性疾病和癌症的靶标，已经进行了对靶向TLR的物质和用于治疗与TLR有关的疾病的药物组合物的研究。特别地，通过修饰脂质A的主要骨架结构，已经获得了许多TLR4启动子和拮抗剂，并且已发现依立托仑(eritoran)、脂质A和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroids)脂质A(RsLA)可以抑制LPS和MD2之间的相互作用，并预防LPS诱发的小鼠休克。另外，据报道，LPS诱导的TLR4信号传导通路与NLRP3炎性小体的形成有关，因此与退行性神经疾病如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病密切相关。
另一方面，通过使用诱饵肽积极地对与病原体相关分子模式(PAMP)相似或相反的肽进行研究，所述诱饵肽使用蛋白质的结合域的一部分，并通过替代该蛋白质与本来要与之相互作用的蛋白质结合来控制信号传导。已知肽比常见的小分子治疗剂具有更少的副作用，并且更容易修饰和质量控制，并且由于细胞穿透肽(CPP)的发展，其低细胞渗透性也得到改善。
发明内容
技术问题
本发明人已经确认了，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的新型肽(诱饵肽1)以及其中所述新型肽与细胞穿透肽的N端连接的融合肽(Toll样受体抑制肽1，TIP1)抑制脂多糖(LPS)诱导的TLR4信号传导通路，从而不仅抑制细胞因子(IL-6、TNF-α、IFN-β)、NO和ROS的分泌以及NF-κB和MAPK的激活，还缓解了动物中TLR4活性过高、败血症和类风湿性关节炎导致的肾脏和肝脏损伤。本发明人还已经证明，该新型肽和融合肽抑制了由Poly(I:C)诱导的TLR3信号传导通路和由LPS/ATP诱导的NLRP3炎性小体的形成，从而完成了本发明。另外，通过细胞实验确认了，新型肽和融合肽还部分抑制TLR1/2、TLR2/6、TLR7、TLR8和TLR9。
因此，本发明的目的是提供一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽，以及一种融合肽，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
另外，本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，该至少一种TLR通路介导的疾病选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组，该药物组合物包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽作为活性成分。
解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。
另外，本发明提供了一种融合肽，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽连接至细胞穿透肽的N端。
另外，本发明提供了用于预防或治疗至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述至少一种TLR通路介导的疾病选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组，该药物组合物包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述至少一种TLR通路介导的疾病选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组，该药物组合物包含融合肽作为活性成分，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸序列组成的肽连接至细胞穿透肽的N-末端。
有益效果
本发明的融合肽具有抑制包括TLR4在内的各种TLR的信号传导通路的优异效果，因此阻碍了由TLR介导的免疫应答，所以该融合肽可以有效地用于预防和治疗由信号传导通路导致的各种TLR通路介导的疾病，例如自身免疫性疾病、炎性疾病或退行性神经疾病。
附图说明
图1(a)示出了在用不同浓度的TIP(TIP1、TIP2，其中以TIP2作为对照)以及LPS处理HEK-Blue TM hTLR4(人TLR4)细胞的情况下，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)活性被TIP1降低。
图1(b)示出了通过测量未连接CPP序列的TIP1(TIP1W/O CPP)和TIP2(TIP2W/OCPP)的SEAP活性而获得的结果。
图2(a)示出了在用TIP1以及LPS处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，通过蛋白质印迹法确认NF-κB(p65)和IRF3活性而获得的结果。图2(b)示出了在相同条件下通过蛋白质印迹确认MAPK活性而获得的结果。
图3示出了在用TIP1以及LPS处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，用共聚焦激光扫描显微镜确认NF-κB活性(p-p65，绿色)而获得的结果，表明p-p65的入核迁移被TIP1阻断。
图4示出了在用不同浓度的TIP1以及LPS处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，通过确认细胞因子分泌水平而获得的结果。图4(a)、4(b)和4(c)分别示出了TNF-α、IL-6和IFN-β的分泌水平。
图5示出了在用TIP1以及LPS处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，通过确认NO和ROS的生成水平而获得的结果。图5(a)、5(b)和5(c)分别示出了细胞质中NO的生成水平、细胞质中ROS的生成水平和分泌出细胞外的NO的水平。
图6示出了在用TIP1以及LPS处理小鼠骨髓来源的巨噬细胞(mBMDM)的情况下，通过确认细胞因子和NO的生成水平而获得的结果。图6(a)、6(b)、6(c)和6(d)分别示出了TNF-α、IL-6、NO和IFN-β的生成水平。
图7示出了在用TIP1以及LPS处理细胞的情况下，通过蛋白质印迹法确认人外周血单核细胞(hPBMC)中p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、pp38、p38、p-p65和Iκ-Bα的表达水平而获得的结果，表明表达水平被TIP1抑制。
图8示出了在用TIP1以及与相应的TLR对应的配体PAM3CSK4(TLR1/2)、FSL-1(TLR2/6)、Poly(I:C)(TLR3)、R848(TLR7/8)或CpG-ODN(TLR9)处理细胞的情况下，通过测量小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞中TNF-α的分泌水平而获得的结果，表明分泌水平被TIP1抑制。
图9示出了在用TIP1以及Poly(I:C)处理小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，通过ELISA确认IFN-β的分泌水平而获得的结果，表明TIP1使分泌水平减少。
图10(a)示出了通过在THP1细胞中确认与通过LPS和ATP处理诱导的含NPST、LRR和PYD域蛋白3(NLRP3)介导的炎性小体形成有关的分子被TIP1抑制而获得的结果。图10(b)示出了通过在相同条件下以mBMDM细胞进行实验获而得的结果。
图11(a)示出了在处于通过LPS和ATP处理诱导的NLRP3介导的炎性小体的状态执行用TIP1处理的情况下，通过确认THP1细胞中IL-1β的分泌被抑制而获得的结果。图11(b)示出了通过在相同条件下以mBMDM细胞进行实验而获得的结果。
图12示出了通过确认具有TIP1的全部或部分氨基酸序列的肽的NF-κB活性和NO分泌水平而获得的结果。图12(a)和12(b)分别示出了SEAP活性和NO分泌水平。
图13示出了在用与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的TIP1(TIP1-FITC)处理或用TIP1-FITC以及LPS处理人单核细胞THP1细胞的情况下，通过使用共聚焦激光扫描显微镜观察TIP1(绿色)、TLR4(红色)和MyD88(蓝色)之间的相互作用而获得的结果，从而确认TIP1与TRL4结合。
图14示出了通过使C57BL/6J小鼠接受磷酸盐缓冲盐水(PBS)与LPS、或TIP1与LPS联合处理，然后通过在处理后1小时或2小时所收集的血液确认细胞因子分泌水平而获得的结果。图14(a)、14(b)和14(c)分别示出了TNF-α、IL-12p40和IL-6的分泌水平。
图15示出了在C57BL/6J小鼠接受PBS与LPS、或TIP1与LPS联合处理的情况下，通过确认小鼠的肝组织中细胞因子分泌水平而获得的结果。图15(a)示出了通过蛋白质印迹确认TNF-α和IL-6的分泌水平而获得的结果，图15(b)图示了对蛋白质印迹条带强度的定量。
图16示出了通过使C57BL/6J小鼠接受PBS与LPS、或TIP1与LPS联合处理，然后通过在处理后24小时所收集的血液确认TIP1对肾脏和肝脏损伤的作用而获得的结果。图16(a)和16(b)分别示出了TNF-α和IL-6的分泌水平。图16(c)和16(d)分别示出了肾脏损伤标志物血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的分泌水平。图16(e)和16(f)分别示出了肝脏损伤标志物天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的分泌水平。
图17示出了通过使C57BL/6J小鼠接受PBS与LPS、或TIP1与LPS联合处理，然后使用处理后24小时所收集的肾脏组织，用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色确认TIP1对肾脏凋亡的作用而获得的结果，从而表明TIP1降低了细胞凋亡。
图18示出了在使BALB/c小鼠接受LPS处理或接受TIP1与LPS联合处理的情况下，LPS诱导的败血症模型小鼠的存活率提高。
图19(a)示出了使用DAB-1J小鼠的胶原蛋白诱导的关节炎(CIA)(胶原蛋白诱导的类风湿性关节炎)模型来确认TIP1对类风湿性关节炎的治疗作用的实验设计。图19(b)示出了在用TIP1进行处理的情况下的治疗作用的视觉观察，从而表明治疗了类风湿性关节炎。
图20示出了在用TIP1处理DAB-1J小鼠的CIA类风湿性关节炎模型的情况下，通过确认治疗作用而获得的结果。图20(a)、20(b)、20(c)和20(d)分别示出了通过观察体重、吱吱声(小鼠发出的)、足肿胀程度和关节炎指数获得的结果。
图21示出了通过使CIA模型的DAB-1J小鼠接受TIP1处理，然后使用微计算机断层扫描(Micro-CT)测量3D图像和骨矿物质密度(BMD)所获得的结果，从而表明治疗了关节炎。
图22示出了通过使DAB-1J小鼠的CIA模型接受TIP1处理，对膝关节区域进行苏木精和曙红(H&E)染色，以及比较常规治疗剂泼尼松龙(prednisolone)的治疗程度，从而表明TIP显示出极好的治疗作用。
图23示意性地示出了TLR4诱导的信号传导过程和TIP1控制的位点。
具体实施方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供了一种由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽。
如本文所用，术语“肽”是指氨基酸残基通过肽键彼此结合而形成的线性分子。肽可以根据本领域已知的化学合成方法来制备。肽可以优选地根据固相合成技术来制备，但是方法不限于此。
如本文所用，术语“TLR4”是指由TLR4基因编码并且属于Toll样受体(充当病原体感染的监测者的跨膜蛋白家族，TLR)的蛋白，TLR4也被称为分化簇284(CD284)。TLR4对于固有免疫系统的激活非常重要，因为它可以识别各种病原相关分子模式(PAMP)，包括革兰氏阴性细菌的LPS。
如本文所用，术语“TLR3”是指由TLR3基因编码并且属于Toll样受体(充当病原体感染的监测者的跨膜蛋白家族，TLR)的蛋白，TLR3也被称为分化簇283(CD283)。TLR3对于固有免疫系统的激活非常重要，因为它可以识别各种PAMP，包括病毒双链RNA(dsRNA)。
如本文所用，术语“NLRP3炎性小体”是指调节半胱天冬酶-1的激活的固有免疫系统的受体和传感器；NLRP3炎性小体是响应于微生物感染等而导致炎症的一类炎性小体，并且响应于各种刺激而被激活。NLRP3需要引发(priming)，例如LPS与TLR4结合。LPS的TLR4信号传导通路与ATP一起促进NLRP3炎性小体的形成。异常激活的NLRP3炎性小体会导致各种炎性疾病，尤其是退行性神经疾病的发展。最近的研究表明，被认为是阿尔茨海默氏病主要病因的β淀粉样蛋白(淀粉样β)积累与NLRP3炎性小体之间存在直接联系，并且还报道了，NLRP3炎性小体与帕金森氏病的关联。
如本文所用，术语“由TLR4介导的信号传导通路”是指经由TLR4的信号传导通路。该通路可以是依赖于由TLR4和MD2形成的TLR4/MD2复合体的LPS响应，信号通过该复合体来转导。TLR4通过几种衔接子蛋白来转导信号，并通过Mal(也称为TIRAP)和MyD88、TRAM和TRIF等进行操作。激活的TLR4通过Myd88依赖性信号传导过程激活NF-κB，从而使NF-κB迁移至细胞核，从而诱导MAPK激活。由于NF-κB和MAPK的激活，在巨噬细胞中分泌出炎性细胞因子例如TNF-α、IL-1β和IL-6，并且产生氧化应激源，例如一氧化氮(以下称为NO)和活性氧簇(下文中称为ROS)。此外，TRAM/TRIF、干扰素调节因子(IRF)和NF-κB的激活诱导了MyD88非依赖性信号传导过程，从而分泌了1型干扰素。
如本文所用，术语“TIR域”是指具有三个高度保守区域并介导TLR与其他信号传导分子之间的相互作用的用于胞内信号传导的域。激活的TIR域诱导MyD88的结合并激活TLR信号通路。
如本文所用，术语“抑制”是指由于缺乏、不均衡和许多其他原因导致生物作用或信号传导活性变差的现象，并且该现象可以是部分地或完全地阻断、降低或预防TLR激活、延迟TLR激活、或使TLR失活或下调的现象。根据本发明的实施方式，提供了根据本发明的肽或融合肽用于抑制TLR4和TLR3信号传导通路和NLRP3炎性小体的用途。另外，提供了根据本发明的肽或融合肽用于部分抑制TLR1/2、TLR2/6、TLR7、TLR8和TLR9的用途。
在本发明中，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽中的S-H-C-R序列(SEQ IDNO:2)的特征在于与Toll样受体(TLR)的Toll/白介素-1受体(TIR)域特异性结合。
在与TLR4的TIR域结合时，根据本发明的由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的肽具有序列特异性。本发明人搜索了TIP1的与TLR4的TIR域结合的最小氨基酸区域，并检查了该区域是否可以有效抑制TLR4的信号传导通路。即，根据本发明的实施方式，诱饵肽选自TIRAP的TIR域。使用其氨基酸序列S-H-C-R-V-L-L-I，将序列S-H-C-R(诱饵肽1-2，SEQ IDNO:2)和V-L-L-I(诱饵肽1-3，SEQ ID NO:7)分别与实施例1-1中所使用的相同的CPP序列的N端结合。用所得的各产物以及LPS处理HEK-BlueTM-hTLR4细胞和hPBMC细胞，然后测量各细胞的NF-κB活性和NO分泌水平。结果，确认了SHCR(诱饵肽1-2)序列对于产生抑制作用是重要的。
另外，本发明提供了一种融合肽，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
在本发明中，融合肽可以抑制由Toll样受体(TLR)介导的信号传导通路，其中Toll样受体(TLR)可以是选自由Toll样受体1/2(TLR1/2)、Toll样受体2/6(TLR2/6)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体4(TLR4)、Toll样受体7(TLR7)、Toll样受体8(TLR8)和Toll样受体9(TLR9)组成的组中的任一种。TLR的特征可以为优选Toll样受体4(TLR4)或Toll样受体3(TLR3)，更优选为Toll样受体4(TLR4)。
另外，在本发明中，融合肽对TLR信号传导通路的阻断可导致抑制TNF-α、IL-6或IFN-β表达；抑制NO或ROS的分泌；或抑制NF-κB、MAPK或NLRP3炎性小体的活性；并且融合肽的特征可以为抑制MyD88依赖性TLR4信号传导通路和MyD88非依赖性TLR4信号传导通路。
如本文所用，术语“细胞穿透肽(CPP)”是指一类信号肽，该信号肽是一类用于将高分子物质例如蛋白质、DNA或RNA递送入细胞内的目的的特定氨基酸序列组合。迄今为止，细胞穿透肽已经用于将各种低分子化合物、高分子物质，例如蛋白质、肽、RNA或DNA递送入细胞内。
本发明的融合肽使用细胞穿透肽。细胞穿透肽没有特别的限制，只要细胞穿透肽具有通过内吞作用机制进入细胞的特征即可。优选地，可以从表1中列出的细胞穿透肽或其变体中选择细胞穿透肽并使用该细胞穿透肽。
[表1]
Figure BDA0002356873390000081
Figure BDA0002356873390000091
Figure BDA0002356873390000101
Figure BDA0002356873390000111
同时，在表1中的细胞穿透肽中，转运蛋白包括以以下变体形式使用的那些：AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2(TP10,PepFect 3,SEQ ID NO:13)、AGYLLGKINLKALAALAKKIL-NH2(TP10,PepFect 6,SEQ ID NO:14)、AGYLLGKLLOOLAAAALOOLL-NH2(TP10,PepFect 14,SEQID NO:15)、AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(NickFect 1,SEQ ID NO:16)、AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(NickFect 2,SEQ ID NO:17)和AGYLLGKTNLKALAALAKKIL-NH2(Nickfect 3,SEQ ID NO:18)。
此外，在由表1中的SEQ ID NO:37组成的氨基酸序列(MPP)中，r是指d-精氨酸，SEQID NO:37的氨基酸序列中的第2和第6个氨基酸对应于d-精氨酸。另外，表1中的SEQ ID NO:41和42是彼此的侧链，并且构成具有以下特征的肽：分支通过连接SEQ ID NO:41的氨基酸序列中的第14个Lys残基(K)与SEQ ID NO:42的氨基酸序列中的第13个Gln残基(Q)形成。此外，在表1中由SEQ ID NO:43组成的氨基酸序列(Cyclat Tat)中，r是指d-精氨酸，SEQ IDNO:43的氨基酸序列中的第4、第6和第10个氨基酸对应于d-精氨酸。同样地，k表示d-赖氨酸，SEQ ID NO:43的氨基酸序列中的第8个氨基酸对应于d-赖氨酸。SEQ ID NO:43的特征在于为环肽。
在本发明的实施方式中，通过在表1的细胞穿透肽中选择Penetratin序列(RQIKIWFQNRRMKWKK，SEQ ID NO:9)进行实验，对于本领域技术人员显而易见的是，即使在除了实际使用的细胞穿透肽以外的细胞穿透肽与本发明的肽融合的情况下，也表现出与本发明相似的效果。
在本发明中，其中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接的融合肽的特征在于优选由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。另外，氨基酸序列的变体也可以被包括在本发明的范围内。具体而言，变体可以包括与SEQ ID NO:3或4分别具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，再更优选至少98％，最优选至少99％的序列同源性的所有肽。术语“同源性”意指与野生型氨基酸序列或野生型核酸序列的相似程度。
根据本发明的实施方式，根据本发明的融合肽抑制脂多糖(LPS)诱导的TLR4信号传导通路，从而表现出优异的效果，不仅抑制细胞因子(IL-6、TNF-α、IFN-β)，NO和ROS的分泌以及NF-κB和MAPK的激活，还缓解了TLR4活性过高、动物败血症和类风湿性关节炎导致的肾脏和肝脏损伤，并抑制了由Poly(I:C)诱导的TLR3信号传导通路和LPS/ATP诱导的NLRP3炎性小体的形成。因此，融合肽可有效地用于预防和治疗由信号传导通路引起的自身免疫性疾病、炎性疾病或由NLRP3炎性小体引起的退行性神经疾病。
另外，在本发明中，根据本发明的融合肽可用作TLR4、TLR3和NLRP3炎性小体的抑制剂。
如本文所用，术语“抑制剂”是指通过任何机制部分或完全地阻碍其他分子(例如受体或细胞内介体)的作用的分子。
如本文所用，术语“TLR4、TLR3和NLRP3炎性小体的抑制剂”是指可以直接或间接或基本上干扰、降低或阻碍TLR4、TLR3和NLRP3炎性小体的生物活性的物质。优选地，与TLR4、TLR3反应的肽是指可以直接结合TLR4、TLR3的TIR域并中和TLR4、TLR3的活性，从而阻断TLR4、TLR3信号传导通路，因此引起NF-κB和MAPK激活减少以及NLRP3炎性小体减少，从而降低炎性细胞因子、NO和ROS的分泌。
另外，本发明提供了用于预防或治疗选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组中的至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽作为活性成分。
另外，本发明提供了用于预防或治疗选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组中的至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含融合肽作为活性成分，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。融合肽的特征可以为，优选由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，并且所述氨基酸序列的变体也可以包括在本发明的范围内。
如本文所用，术语“通路介导的疾病”是指其中一个或多个TLR和TLR介导的信号传导通路的激活是起作用的因素的任何病理学病症。所述疾病的特征可以为，优选为选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性疾病组成在组中的至少一种。但是，病症不限于此。
如本文所用，术语“自身免疫性疾病”是指由发生如下现象的过程引起的疾病：诱导或维持自我耐受中出现问题，导致对自身抗原的免疫反应，从而攻击人体自身的组织。自我耐受是指对构成自身的抗原性物质没有有害反应的免疫学无反应性。本发明的自身免疫性疾病包括但不限于胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生病、早熟绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯丘综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、潜伏性肝硬化、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、多肌炎/皮肤肌炎、盘状LE和系统性红斑狼疮。
另外，如本文所用，术语“炎性疾病”是指由炎性因子(炎性细胞因子)例如TNF-α、IL-1、IL-6、前列腺素、白三烯或NO引起的疾病，所述炎性因子在免疫系统由于有害刺激例如炎症诱导因子或辐射而使免疫系统过度增强的情况下由免疫细胞例如巨噬细胞分泌。本发明中的炎性疾病包括但不限于哮喘、湿疹、牛皮癣、过敏、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、特应性皮炎、痤疮、特应性鼻炎、肺炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎、溃疡、慢性支气管炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、败血症、血管炎、滑囊炎、狼疮、类风湿性多肌痛、颞动脉炎、多发性硬化症、实体瘤、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、肥胖症和病毒感染。
如本文所用，术语“退行性神经疾病”是指由于神经细胞功能的降低或丧失而导致的运动控制能力、认知功能、知觉功能、感觉功能和自主神经功能异常。退行性神经疾病主要根据临床特征分类，其中分类是基于主要症状和受侵袭部位。本发明中的退行性神经疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、路易氏痴呆、皮质基底膜退化症、帕金森氏病、多系统萎缩、亨廷顿氏病、进行性核上性麻痹、卢伽雷氏病、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩。
本发明的药物组合物可单独包含药学有效量的肽或包含药学有效量的肽与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合。药学有效量是指足以预防、改善和治疗自身免疫性疾病症状的量。
术语“药学上可接受的”是指生理上可接受的并且在给药至人的情况下通常不引起胃肠道疾病、过敏反应(例如头晕)或类似反应的组合物。载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
另外，本发明的药物组合物可以进一步包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、香料、乳化剂、防腐剂等。
另外，本发明的药物组合物可包含对自身免疫性疾病、炎性疾病或退行性神经疾病具有治疗作用的至少一种已知的活性成分以及所述的肽。
可以使用本领域已知的方法来配制本发明的药物组合物，使得该药物组合物在给药至哺乳动物后可以提供活性成分的快速、持续或延迟释放。该制剂可以是粉末、颗粒剂、片剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、软或硬明胶胶囊、无菌注射溶液、无菌粉末的形式。
本发明的药物组合物可以通过包括口服、透皮、皮下、静脉内或肌内途径的各种途径来给药，并且可以根据各种因素(给药途径、患者年龄、性别、体重和患者病症的严重程度)适当地选择活性成分的剂量。药物组合物可以与具有预防、改善或治疗自身免疫性疾病、炎性疾病或退行性神经疾病的症状的作用的已知化合物组合给药。
另外，本发明提供了一种预防或治疗TLR通路介导的疾病的方法，该方法包括：向有需要的个体给药由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽的步骤。
另外，本发明提供了一种预防或治疗TLR通路介导的疾病的方法，该方法包括：向有需要的个体给药融合肽的步骤，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
该个体优选是包括人类在内的哺乳动物，并且包括所有需要治疗TLR通路介导的疾病的患者，例如正在针对TLR通路介导的疾病进行治疗的患者、已经针对TLR通路介导的疾病进行治疗的患者、需要针对TLR通路介导的疾病进行治疗的患者，和已经接受外科手术以治疗TLR通路介导的疾病的患者也包括在内。
另外，本发明的由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽或其中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接的融合肽可以与用于治疗TLR途径介导的疾病的其他常规药物或方法同时/依次应用。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例和实验例更详细地描述本发明。以下实施例和实验例仅用于说明本发明，本发明的范围不受以下实施例和实验例的限制。
实施例1.测试样品的制备
1-1.与TLR4的TIR域特异性结合的肽的选择
为了选择与TLR4的TIR域特异性结合的肽，本发明人从TIRAP的TIR域中选择了两种序列(诱饵肽1、2)，并将源自果蝇触足同源域的细胞穿透肽(CPP)与每种序列的N端连接，从而合成新的肽TIP1和TIP2。本实施例中使用的所有肽的序列示于表2。
[表2]
名称 序列 SEQ ID NO
诱饵肽1(TIP1W/O CPP) SHCRVLLI 1
TIP1 RQIKIWFQNRRMKWKK<u>SHCRVLLI</u> 3
诱饵肽2(TIP2W/O CPP) TIPLLS 5
TIP2 RQIKIWFQNRRMKWKK<u>TIPLLS</u> 6
CPP RQIKIWFQNRRMKWKK 9
*诱饵肽序列加有下划线。
1-2.细胞培养与制备
将HEK-BlueTM-hTLR4细胞(InvivoGen,San Diego,CA,USA)添加到补充有1％青霉素/链霉素、10％胎牛血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)和0.2％normocin(InvivoGen)的DMEM(杜氏改良伊格尔培养基)(Thermo Fisher ScientificInc.)中，进行培养。将小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞(Korean Cell Line Bank,Seoul,Korea)添加到补充有1％青霉素/链霉素和10％FBS(Thermo Fisher Scientific，Inc.)的低葡萄糖DMEM中，进行培养。在补充有1％青霉素/链霉素、10％FBS(Thermo FisherScientific，Inc.)的RPMI1640中培养人单核细胞THP1细胞，然后使用10nM佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)(Sigma-Aldrich Co.LLC.,St.Louis,MO,USA)处理24小时诱导分化为巨噬细胞。在补充有2.05mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和10％FBS的RPMI 1640(Thermo Fisher Scientific Inc.)中培养人外周血单核细胞hPBMC细胞(PromoCell,Heidelberg，德国)。在补充有1％青霉素/链霉素和10％FBS的DMEM(Thermo FisherScientific Inc.)中培养小鼠骨髓来源的巨噬细胞mBMDM细胞。所有细胞在培养系统(Thermo Fisher Scientific Inc.)中于37℃，5％CO2的湿润条件下培养，每16小时进行培养基更换。PAM3CSK4、Poly(I:C)、R848和CpG-ODN购自Thermo Fisher Scientific,Inc.；FSL-1购自InvivoGen；LPS(大肠杆菌0111:B4)，ATP购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO,USA)；实验中使用的所有肽均由Peptron,Inc.(Daejeon,Korea)合成并从Peptron,Inc.(Daejeon,Korea)购买。
实施例2.测定方法
2-1.MTT测定
HEK-BlueTM-hTLR4细胞以5×104个细胞/孔的细胞数分配至96孔板(BDBiosciences,San Jose,CA,USA)，RAW264.7细胞以2×105个细胞/孔的细胞数分配到96孔板。孵育过夜。随后，使用1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基甲酰胺(MTT)溶液(Sigma-Aldrich Co.LLC)进行MTT分析。
2-2.SEAP活性测定
HEK-BlueTM-hTLR4细胞以2×105个细胞/孔的细胞数分配至24孔板(BDBiosciences)中，孵育过夜。第二天，移出培养物并更换培养基。然后，将一部分培养物(200μl)转移至微量离心管中，并使用加热块(FINEPCR.Co.,Seoul,Korea)在65℃下加热10分钟。随后，将培养物转移至96孔板(BD Biosciences)，并使用HEK-BlueTM检测试剂盒(InvivoGen)和酶标仪分光光度计(Molecular Devices Inc.,Silicon Valley,CA,USA)测量405nm吸光度，分析SEAP(分泌型碱性磷酸酶)的表达水平。
2-3.蛋白质印迹
为了进行蛋白质印迹，将蛋白提取前液(M-PER，Thermo Fisher ScientificInc.)与蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物混合，然后添加到RAW 264.7细胞或hPBMC细胞团块中。团块冷却10分钟，然后将裂解物在16000×g下离心10分钟。然后，分别使用NE-PER核和细胞质提取试剂(Thermo Fisher Scientific Inc.)提取细胞质和核蛋白，并使用BCA试剂盒(Sigma-Alderich Co.LLC)测量蛋白质的浓度。随后，在SDS聚丙烯酰胺凝胶上使相同量的蛋白质显影，并使用Mini-PROTEAN Tetra Cell二维电泳系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)进行了电泳。通过在4℃温度下温和振摇过夜，用一抗对膜进行免疫印迹(其中一抗是针对p-p65、p-JNK、p-IRF3、ERK、p38和人IL-1β(Cell Signaling TechnologyInc.,Danvers,MA,USA)；p-ERK、p-p38、Iκ-Bα、JNK、ATF3、COX2、半胱天冬酶-1和β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA,USA)；iNOS(BD Biosciences)；IL-6和小鼠IL-1β(R&D Systems Inc.,Minneapolis,MN,USA)；TNF-α(Thermo FisherScientific,Inc.)；NLRP3(Adipogen,San Diego,CA,USA)的抗体)。然后，使用PBST，充分振荡后，将膜与抗小鼠/兔HRP缀合的二抗(Thermo Fisher Scientific Inc.)一起孵育2小时；然后用SuperSignal West Pico ECL溶液(Thermo Fisher Scientific Inc.)检测蛋白质，并用Fuji LAS-3000系统(Fujifilm,Tokyo,Japan)进行可视化。
2-4.共聚焦显微镜
将RAW 264.7细胞和THP1细胞以2×105个细胞/孔的细胞数分配到24孔板中，然后在培养箱中过夜生长。随后，进行了TIP1和LPS联合处理。24小时后，将RAW 264.7细胞和THP1细胞用3.7％甲醛(Sigma-Aldrich Co.LLC)固定15分钟，然后浸入0.2％Triton X-100(AMRESCO,Solon,OH,USA)中15分钟。然后，用PBS洗涤3次，并用2％BSA溶液阻断。将阻断的细胞与TIP1-FITC((25μM；Peptron,Inc.,Daejeon,Korea)、p-p65、TLR4、Myd88、TOM20(1:1000；Santa Cruz Biotechnology Inc.)和NLRP3(Adipogen)抗体孵育2小时。然后，用PBS洗涤3次。随后，将细胞与AlexaFluor 408和/或488和/或546缀合的二抗(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)孵育1小时，并用PBS洗涤3次。随后，使用5μM Hoechst 33258(Sigma-Aldrich Co.)在室温下将细胞染色15分钟，并使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM-700，CarlZeiss MicroImaging GmbH)对荧光染色的细胞数进行计数。使用Zen 2009软件分析图像。
2-5.TNF-α、IL-6、IFN-β和IL-1β的测定
将RAW 264.7细胞、THP1细胞和mBMDM细胞以2×105个细胞/孔的细胞数分配到96孔板中，或以5×105个细胞/孔的细胞数分配到24孔板中。孵育过夜。随后，进行了TIP1和LPS联合处理。24小时后，使用LEGEND MAXTM小鼠IL-6预包被的ELISA试剂盒(BioLegend)、小鼠IL-6Platinum ELISA(eBiosciences)和小鼠TNF-αELISA Ready SET-Go！试剂盒(eBiosciences)来测量IFN-β、IL-6和TNF-α的分泌水平。使用酶标仪分光光度计(Molecular Devices)测量450nm吸光度，并使用Softmax Pro 5.3软件(MolecularDevices Inc.)分析结果。
2-6.细胞质内NO和ROS测定
将RAW 264.7细胞以1×106细胞/孔的细胞数分配到6cm培养皿(SPL LifeSciences.,Pocheon,Korea)中，孵育过夜。随后，用TIP1处理，并分别用DAF-FM和DCF-DA(Thermo Fisher Scientific,Inc.)染色。然后，孵育1小时。此后，通过以200×g离心5分钟收集细胞，转移至棕色管中，在4℃温度下储存在PBS中。使用具有Diva软件(BDBiosciences)的FACSAria III测量DAF-FM、DCF-DA荧光材料的强度，并进行定量。
2-7.NO分泌水平测定
将RAW 264.7细胞和mBMDM细胞以2×105个细胞/孔的细胞数分配至96孔板(BDBiosciences)，孵育过夜。然后，使用NO检测试剂盒(iNtRON Biotechnology Inc.，韩国城南)测量培养物上清液的NO水平。使用酶标仪分光光度计(Molecular Devices Inc.)测量550nm吸光度，并使用Softmax Pro 5.3软件(Molecular Devices Inc.)分析结果。
2-8.表面等离子体共振(SPR)分析
使用具有ProteOn NLC传感器芯片的ProteOn XPR36仪器(Bio-RadLaboratories，Inc.)进行表面等离振子体共振测定。具体地，使用与GLC聚合物层结合的NeutrAvidin将编码TIR域的BB环(RDFIPGVAIAA)和C端区域(EGTVGTGCNWQEATSI)的合成肽固定在NLC传感器芯片的表面上。对于对照，使补充有0.05％Tween 20的运行缓冲液PBS流动。各种类型的TIP1、TIP1-1、TIP1-2和TIP1-3(50μM)和不同浓度的TIP1(12.5、25和50μM)流动至芯片上，以确认它们与固定的肽的结合亲和力。测量之后，使用0.85％的磷酸或PBST使传感器芯片的表面再生。使用ProteOn managerTM软件(2.0版)计算解离常数，并将从各种剂量的TIP1获取的数据分组以与运动速率常数(Ka和Kd)匹配。平衡解离常数KD用方程式KD＝Kd/Ka计算。
实验例1.确认TIP的TLR4结合亲和力
为了确认实施例1-1中制备的TIP(TIP1、TIP2)的TLR4结合亲和力，测量了在实施例1-2中培养的HEK-BlueTM-hTLR4细胞的NF-κB活性。为此，将诱导性分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告基因置于IL-12p40最小启动子的控制下(IL-12p40在刺激TLR4后通过激活NF-κB和AP-1(激活蛋白1)产生)，该启动子中包含NF-κB和AP-1的DNA结合的位点。然后，以12.5μM、25μM、50μM的不同浓度的TIP或未连接CPP的TIP(TIP W/O CPP)处理HEP-BlueTM-hTLR4细胞，然后计算SEAP活性的平均值以测量TLR4活性。结果如图1所示。
如图1(a)所示，可以确认在仅添加TIP的情况下，未观察到SEAP活性有大的变化；然而，在用TIP处理然后用LPS刺激TLR4的情况下，与TIP2不同的是，TIP1以浓度依赖的方式降低LPS诱导的SEAP活性。此外，如图1(b)所示，可以确定在未连接CPP序列的情况下，TIP1(TIP1W/O CPP)和TIP2(TIP2W/O CPP)均未改变SEAP活性。从这些结果中，确定本发明的TIP1一旦与CPP连接并由此转移到细胞中，就会干扰信号传导通路下游的衔接子分子，并阻断由LPS诱导的TLR4介导的信号传导通路的激活，这使得TIP1能够用作有效的TLR4抑制剂。
实验例2.TIP1对TLR信号传导通路的体外抑制作用
LPS诱导的TLR4介导的反应诱导TIRAP的TIR域与MyD88之间的直接相互作用，从而激活MyD88依赖性信号传导通路。此外，TLR4介导的反应诱导TRAM的TIR域和TRIF之间的相互作用，从而也激活了MyD88非依赖性信号传导通路。在MyD88依赖性信号通路中，NF-κB的初始活性诱导促炎性细胞因子(例如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6))的分泌。另一方面，在MyD88非依赖性信号传导通路中，诱导了I型干扰素(IFN)例如IFN-α和IFN-β的晚期分泌反应，包括IRF3和IRF7的活性。为了检查TIP1对TLR4信号传导通路的作用，本发明人使RAW 264.7细胞接受LPS处理，然后进行了以下实验。
2-1.NF-κB和MAPK的蛋白质印迹
根据实施例2-3中所述的方法进行蛋白质印迹，以确认实施例1-1中制备的TIP1对NF-κB和MAPK活性的影响。结果如图2所示。
如图2(a)所示，确认了用作对照的小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞在仅用LPS处理的情况下，NF-κB活性增加，因此Iκ-Bα被降解，并且IRF3和ATF3活性增加；然而，已经确认的是，在用LPS与TIP1一起处理的情况下，NF-κB活性被抑制，从而Iκ-Bα的降解程度降低，并且IRF3和ATF3的活性降低。另外，如图2(b)所示，确认了仅用LPS处理的情况下，MAPK活性增加，ERK、JNK和p38被磷酸化；然而，已确认了，在用LPS和TIP1一起处理的情况下，MAPK活性被抑制，从而使酶的磷酸化程度降低。从这些结果中，确定了根据本发明的TIP1与TLR4的TIR域结合，从而抑制了由LPS诱导的MyD88依赖性信号传导通路以及MyD88非依赖性信号传导通路。
2-2.NF-κB活化的确认
根据实施例2-4中所述的方法进行共聚焦激光显微镜检查，以确认实施例1中制备的TIP1对NF-κB活性的影响。结果如图3所示。
如图3所示，确认了仅用LPS处理的情况下，核中表达了活化的NF-κB(p-p65)。然而，确认了，在用LPS和TIP1一起处理的情况下，由于LPS诱导的核中p65磷酸化水平的降低，NF-κB活性降低。
实验例3.TIP1对细胞因子、NO和ROS分泌的影响
进行以下实验以确认在用实施例1-1中制备的TIP1处理实施例1-2中培养的小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞的情况下，细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-β)和一氧化氮(NO)以及细胞质中活性氧簇(ROS)的生成是否被抑制。
3-1.TIP1对细胞因子分泌的影响
根据实施例2-5中所述的方法使用小鼠TNF-α、IL-6、IFN-βReady-SET-Go！ELISA试剂盒测定RAW 264.7细胞培养物上清液中的TNF-α、IL-6、IFN-β水平。结果如图4所示。
如图4所示，确认了在进行了TIP1和LPS联合处理的情况下，TNF-α、IL-6、IFN-β的分泌以浓度依赖的方式减少。从这些结果，确定了根据本发明的TIP1抑制LPS诱导的细胞因子的分泌。
3-2.TIP1对NO和ROS分泌的影响
为了鉴定TIP1对细胞质中NO和活性氧簇(ROS)的生成的影响，根据实施例2-6中所述的方法，将RAW 264.7细胞用TIP1处理并分别用DAF-FM(Invitrogen Corp.，CA，USA)和DCF-DA(Invitrogen Corp.)染色，以分别对细胞质NO和ROS进行定量。另外，根据实施例2-7中所述的方法，使用NO检测试剂盒测量RAW 264.7细胞的培养物上清液中的NO水平。结果如图5所示。
如图5(a)至5(c)所示，在进行TIP1和LPS联合处理的情况下，TIP1有效地降低了NO的胞外分泌以及细胞质中NO和ROS的生成水平。从这些结果，确认了根据本发明的TIP1抑制LPS诱导的氧化应激。
实验例4.确认TIP1对原代细胞的作用
进行以下实验以确认在用实施例1中制备的TIP1处理小鼠骨髓来源的巨噬细胞mBMDM细胞和人外周血单核细胞hPBMC细胞的情况下，细胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-β)和一氧化氮(NO)的分泌以及TLR信号蛋白的激活是否受到抑制。
4-1.TIP1对mBMDM细胞的作用
根据实施例2-5中所述的方法使用小鼠TNF-α、IL-6、IFN-βReady-SET-Go！ELISA试剂盒测定mBMDM细胞培养物上清液中的TNF-α、IL-6、IFN-β水平，并且根据实施例2-7中所述的方法测量上清液中的NO水平。结果如图6所示。
如图6(a)至6(d)所示，TIP1降低了LPS诱导的TNF-α、IL-6和NO的分泌水平，并抑制了Poly(I:C)诱导的IFN-β的生成。从这些结果中，确认，根据本发明的TIP1抑制了小鼠骨髓来源的巨噬细胞中LPS或Poly(I:C)诱导的细胞因子和NO的分泌。
4-2.TIP1对hPBMC细胞的作用
为了确认TIP1对hPBMC细胞中NF-κB和MAPK活性的影响，根据实施例2-3中所述的方法进行蛋白质印迹，并使蛋白质可视化。结果如图7所示。
如图7所示，在作为对照的仅用LPS处理人外周血单核细胞hPBMC细胞的情况下，NF-κB活性增加，使得Iκ-Bα被降解，而在LPS与TIP1一起处理的情况下，NF-κB活性受到抑制，使得Iκ-Bα降低较少。另外，确认了，在仅用LPS处理的情况下，MAPK活性增加，使得ERK、JNK、p38被磷酸化。然而，已经确定的是，在用LPS和TIP1一起处理的情况下，MAPK活性被抑制，使得酶的磷酸化程度降低。
从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1抑制永生化细胞系以及直接从动物中提取的原代细胞中的TLR4信号传导通路。
实验例5.TIP1对其他TLR信号传导通路的影响
为了确认TIP1对除TLR4以外的TLR家族成员的信号传导通路的影响，使用实施例2-5中的方法测量了RAW 264.7细胞培养物上清液中的由不同TLR配体诱导的TNF-α水平。结果在图8中示出。另外，使用Ready-SET-Go！ELISA试剂盒测量RAW 264.7细胞的培养物上清液中的IFN-β水平。结果如图9所示。
如图8所示，确认了在用TIP1以及PAM3CSK4(TLR1/2)或FSL-1(TLR2/6)或Poly(I:C)(TLR3)或R848(TLR7/8)或CpG-ODN(TLR9)一起处理的情况下，TNF-α的分泌水平降低；特别是TIP1对TLR3信号传导具有高抑制作用(在50μM时降低92％)。另外，如图9所示，确认了在用TIP1和Poly(I:C)一起处理的情况下，IFN-β的分泌水平降低。从这些结果中，确认了在TLR1/2、TLR2/6、TLR3、TLR7/8、TLR9以及TLR4中，根据本发明的TIP1对细胞因子分泌具有抑制作用。
实验例6.TIP1对退行性神经疾病的作用
LPS诱导的TLR4信号传导通路激活导致NF-κB活性，从而立即导致巨噬细胞中NOD样受体(NLR)、NACHT、LRR和含PYD域的蛋白3(NLRP3)和IL-1β的表达。在这些条件下，ATP和钾外流剂降低细胞内钾水平，并诱导通过NLRP3炎性小体生成成熟IL-1β。
注意到TLR4信号传导通路的活性与NLRP3炎性小体的形成之间的这种相关性，本发明人对人单核细胞THP1细胞和小鼠骨髓来源的巨噬细胞mBMDM THP1细胞进行LPS/ATP处理，或TIP1和LPS/ATP联合处理，然后根据实施例2-3所述的方法通过蛋白质印迹使NLRP3、半胱天冬酶-1前体(45kDa)、活性半胱天冬酶-1(10kDa)、IL-1β前体(35kDa)、成熟IL-1β(17kDa)的蛋白表达可视化。结果如图10所示。
另外，为了确认在诱导NLRP3炎性小体时TIP1对细胞因子分泌的作用，对THP1细胞和mBMDM细胞进行LPS/ATP处理，或TIP1和LPS/ATP联合处理，然后根据实施例2-5所述的方法使用人和小鼠IL-1βReady-SET-Go！ELISA试剂盒测量培养物上清液中的IL-1β的水平。结果如图11所示。
如图10(a)和10(b)所示，确定了TIP1和mBMDM细胞中LPS和ATP诱导的NLRP3、半胱天冬酶-1、IL-1β的表达受到TIP1的抑制。具体而言，确认了TIP1显著降低了NLRP3、活性半胱天冬酶-1(10kDa)和成熟的IL-1β(17kDa)的胞内表达水平，并最终抑制了IL-1β的分泌。另外，如图11所示，确认在进行了TIP1和LPS/ATP联合处理的情况下，IL-1β的分泌水平降低。从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1阻断TLR4信号传导通路，并因此抑制了NLRP3炎性小体的活化。
NLRP3炎性小体在被异常激活的情况下会引起各种炎性疾病，尤其是退行性神经疾病。因此，可以预期能够有效抑制NLRP3炎性小体活性的那些通过抑制炎症反应而被用作退行性神经疾病的治疗剂。因此，从这些结果，本发明人确认了根据本发明的TIP1可以对退行性神经疾病表现出预防或治疗作用。
实验例7.TIP1序列特异性的确认
为了确认与TLR4的TIR域结合的TIP1的最小氨基酸区域，使用实施例1-1中制备的诱饵肽的氨基酸序列S-H-C-R-V-L-L-I(SEQ ID NO:1)，本发明人将序列S-H-C-R(诱饵肽1-2，SEQ ID NO:2)和V-L-L-I(诱饵肽1-3，SEQ ID NO:7)各自与如实施例1中使用的相同CPP序列的N端结合。表3列出了本实验实施例中使用的所有肽。
[表3]
名称 序列 SEQ ID NO
诱饵肽1(TIP1W/O CPP) SHCRVLLI 1
诱饵肽1-2 SHCR 2
TIP1 RQIKIWFQNRRMKWKK<u>SHCRVLLI</u> 3
TIP1-2 RQIKIWFQNRRMKWKK<u>SHCR</u> 4
诱饵肽1-3 VLLI 7
TIP1-3 RQIKIWFQNRRMKWKK<u>VLLI</u> 8
将实施例1-2中培养的HEK-BlueTM-hTLR4细胞用表3中的TIP1(CPP-SHCRVLLI)、TIP1-1(CPP)、TIP1-2(CPP-SHCR)和TIP1-3(CPP-VLLI)与LPS一起处理，然后使用实验例1中的方法测量NF-κB活性。另外，将实施例1-2中培养的hPBMC细胞用TIP1(CPP-SHCRVLLI)、TIP1-1(CPP)、TIP1-2(CPP-SHCR)和TIP1-3(CPP-VLLI)与LPS一起处理，然后使用实施例2-7中的方法测量NO的分泌水平。结果如图12所示。如图12(a)所示，确认了TIP1对NF-κB活性具有最高的抑制作用，并且TIP1-2也降低了NF-κB活性，而在用TIP1-1或TIP1-3处理的情况下未观察到变化或观察到微不足道的变化。另外，如图12(b)所示，确认了TIP1对NO分泌水平的降低作用最大，并且TIP1-2也抑制NO分泌，而在用TIP1-1或TIP1-3处理的情况下未观察到变化或观察到微不足道的变化。从这些结果中，确认了在根据本发明的TIP1的序列中，S-H-C-R序列对于产生抑制作用是重要的。
实验例8.识别TIP1和TLR4以及MyD88之间的相互作用
进行蛋白质-蛋白质对接以分析TLR4的TIR域和TIP1之间的结合界面。结果，预期TIP1会结合到TLR4的TIR域中的BB环、DD环和C端尾部。为了确认这一点，根据实施例2-8中所述的方法进行了表面等离子体共振分析。
此外，为了确认TIP1与TLR4的结合，通过将异硫氰酸荧光素(FITC)与TIP1的N端结合来制备TIP1-FITC。使实施例1-2中的THP1细胞接受TIP1(TIP1-FITC)处理或用LPS和TIP1联合处理，然后根据实施例2-4中所述的方法使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜对荧光染色的细胞计数，从而分析蛋白质之间的相互作用。结果如图13所示。
如图13所示，确认了在进行了TIP1-FITC和LPS联合处理的情况下，TIP1-FITC(绿色)和TLR4(红色)组合形成复合体，而MyD88(蓝色)没有结合于复合体位点。另一方面，确认了，在不存在LPS的情况下，TLR4在质膜中表达，而MyD88则在细胞内扩散；在用LPS处理细胞的情况下，TLR4和TIP1-FITC均通过内吞作用被引入细胞内，而MyD88聚集在质膜上而不散布在细胞内。此外，确认了TIP1-FITC-TLR4彼此牢固结合，而MyD88与TIP1-FITC形成弱键。从这些结果中，确认了TIP1对TLR4信号传导通路的抑制作用是由于TIP1与TLR4的TIR域中的C端尾部和BB环结合，而同时TIP1和MyD88之间的相互作用被抑制，从而最终导致TLR4信号传导过程受阻。
实验例9.TIP1对小鼠体内细胞因子分泌的作用
所有动物实验均在实验动物护理和使用委员会(KHNMC AP 2016-006)的批准下进行。为了确认TIP1的体内作用，从OrientBio，Inc.(韩国首尔)购买了8周龄的C56BL/6(20至25g，n＝8)小鼠并用于实验。向小鼠腹膜内注射TIP1(10nmol/g动物体重)，并在1小时后注射LPS(5μg/g动物体重)2小时。对照注射相同体积的PBS。随后，通过离心从小鼠血液中分离血浆，并在-80℃下保存直至分析分泌水平。使用小鼠TNF-α、IL-12p40、IL-6ELISAMAXDeluxe ELISA试剂盒(BioLegend,San Diego,CA,USA)测量血浆中TNF-α、IL-12p40(以1：100稀释)和IL-6(以1:100稀释)的水平。使用酶标仪分光光度计(Molecular DevicesIn。)测量450nm吸光度，并使用Softmax Pro 5.3软件(Molecular Devices Inc.)分析结果。结果如图14所示。
如图14(a)至图14(c)所示，在进行了TIP1和LPS联合处理的情况下，TNF-α、IL-12p40和IL-6的分泌水平显著降低。从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1抑制TLR4信号传导通路，并因此在体内以及体外抑制细胞因子的分泌。
实验例10.TIP1对败血症的作用
为了确认TIP1对败血症的作用，对C57BL/6J和BALB/c小鼠进行PBS与LPS联合处理或TIP1与LPS联合处理，然后进行以下实验以确定肾脏和肝脏损伤的变化以及生存率。
10-1.TIP1对肝脏细胞因子分泌的影响
使C57BL/6J小鼠接受PBS与LPS联合处理或TIP1与LPS联合处理(2小时)。然后，使用含有M-PER哺乳动物蛋白质提取试剂以及蛋白酶抑制剂混合物(Thermo FisherScientific,Inc.)的Kontes Pellet Pestle Cordless Motor(Thermo FisherScientific,Inc.)提取肝脏组织并使肝脏组织匀浆化。然后，根据制造商的方案提取蛋白质。随后，根据实施例2-3中所述的方法，通过蛋白质印迹使IL-6、TNF-α和β-肌动蛋白的蛋白质表达可视化，并以图形表示条带强度。结果如图15所示。
如图15(a)和图15(b)所示，在进行LPS与TIP1联合处理的情况下，小鼠肝脏组织中LPS诱导的TNF-α和IL-6的表达水平显著降低。
10-2.TIP1对肾脏和肝脏损伤的影响
为了更准确地确认小鼠败血症模型中TIP1的抗炎作用，以与上述相同的方式进行了实验。具体地，使C57BL/6J小鼠接受PBS与LPS联合处理或TIP1与LPS联合处理(24小时)，然后通过离心从小鼠血液中分离血浆。使用分离的血浆，通过实验例9中的方法测量TNF-α和IL-6的分泌水平，通过VETTEST-8008系统(IDEXX)分析肾脏损伤标志物血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的分泌水平变化以及肝脏损伤标志物天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的变化。结果如图16所示。
如图16(a)至图16(f)所示，确认了在进行了TIP1与LPS联合处理的情况下，TNF-α和IL-6以及BUN、Cr、AST和ALT的分泌水平明显降低。从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1可以抑制TLR4信号传导通路，并因此缓解肾脏和肝脏损伤以及细胞因子的分泌。
10-3.TIP1对肾脏细胞凋亡的影响
使8周龄的C56BL/6(20至25g，n＝8)小鼠接受TIP1和LPS联合处理或PBS和LPS联合处理(24小时)。随后，使用电子天平(ER-180A,A&D Company,Tokyo,Japan)分离肾脏组织并称重；然后切成矢状面以制成切片。将切片在10％福尔马林溶液中放置过夜，然后通过倒入石蜡中将其固化。使用显微镜用薄片切片机(microtome)将所得物制成4μm的薄片并固定。为了确认TIP1对固定的肾脏组织的细胞凋亡的影响，使肾脏组织接受TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记)染色(Merck Millipore,Billerica,MA,USA)，并使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM-700,Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Jena，德国)对荧光染色的细胞计数。使用Zen 2009软件(Carl Zeiss MicroImaging GmbH.)分析图像。结果如图17所示。
如图17所示，在仅进行LPS处理的情况下，TUNEL阳性的肾细胞显著增加，即肾脏组织的细胞凋亡(绿点)增加，而在进行TIP1和LPS联合处理的情况下，由LPS引起的肾脏组织中增加的细胞凋亡(绿点)减少。
10-4.TIP1对存活率的影响
为了检查TIP1对LPS诱导的败血症的影响，使8周龄的BALB/c(20至25g，n＝8)的雄性小鼠接受LPS处理(5μg/g动物体重或10μg/g动物体重)，接受进行TIP1(每克动物体重10nmol)和LPS联合处理，然后测量其存活率5天。对照注射相同体积的PBS。结果如图18所示。
如图18所示，确认了与仅进行LPS处理的情况相比，在进行TIP1和LPS联合处理的情况下，观察到生存率提高。具体而言，在通过用5μg/g LPS处理获得的轻度败血症模型的情况下，存活率在短短3天内降低了100％。在LPS与TIP1一起处理的情况下，可以在5天里维持30％的存活率。此外，在通过用10μg/g LPS处理获得的严重败血症模型的情况下，存活率仅一天就降低了70％，两天后所有小鼠死亡；而在用LPS和TIP1一起处理的情况下，尽管诱发了严重的败血症，但是存活率仍维持在100％一天，两天后降低了90％。从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1抑制TLR4信号传导通路以减轻早期炎症，从而减少了细胞因子的分泌以及肾脏和肝脏损害，因而最终缓解了败血症。
实验例11.TIP1对类风湿性关节炎的作用
为了确认TIP1对类风湿性关节炎的作用，通过对6至7周龄的DBA/1J(20g至23g)雄性小鼠应用胶原蛋白诱导性关节炎(CIA)模型来诱导关节炎。具体地，将鸡II型胶原蛋白(Sigma-Aldrich Co.LLC)和完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich Co.LLC)以1:1混合并乳化。然后，将100μg乳化的胶原蛋白溶液皮内注射到小鼠尾巴中以诱导初次免疫，指定为第0天。在初次免疫的14天后，将乳化的胶原蛋白溶液再次皮内注射到小鼠尾巴中以诱导二次免疫(增强)。
随后，设计了以下两个TIP1处理计划：①该计划中，在二次免疫后(第15天)，每天注射TIP1(2.5、5和10nmol/g)，或用作阳性对照的5mg/kg泼尼松龙(熟知的常规关节炎治疗剂)，持续30天；以及②该计划中，在完全诱导关节炎后(第35天)，注射10nmol/g的TIP1持续10天。这些计划总共包括七个实验组(n＝8)，并命名如下：(1)未处理的正常组(正常)；(2)对照(溶媒处理的)(CIA，n＝8)；(3)2.5nmol/g TIP1处理组(CIA-TIP1(2.5nmol/g))；(4)5nmol/g TIP1处理组(CIA-TIP1(5nmol/g))；(5)10nmol/g TIP1处理组(CIA-TIP1(10nmol/g))；(6)5μg/g泼尼松龙(常规关节炎治疗剂)处理组(CIA-泼尼松龙(5μg/g))；(7)关节炎后阶段(PAP)的10nmol/g TIP1处理组(PAP CIA-TIP1(10nmol/g))。将TIP1和泼尼松龙溶解在盐水中并腹膜内注射。然后，分析了行为发展和疾病的变化，例如明显的症状和体重、小鼠的吱吱声、足体积和关节炎指数。结果在图19和20中示出。
如图19所示，从视觉上确认，在用TIP1处理的情况下，CIA模型所表现出的严重肿胀的足部减轻到与正常小鼠相似。此外，如图20所示，确认TIP1将因关节炎引起的体重减轻、吱吱声和足部体积增大以及关节炎指数增加抑制至与常规关节炎治疗剂泼尼松龙相同的水平。另外，已经通过CIA模型诱导有关节炎的DAB-1J小鼠每天注射一次TIP1和泼尼松龙，持续30天。然后，在第45天处死小鼠并对关节组织取样。随后，通过微计算机断层扫描(Micro-CT)分析关节组织的3D图像和骨矿物质密度(BMD)。另外，对小鼠的膝关节区域进行苏木精和曙红(H&E)染色，并且在软骨、软骨下骨、股骨、胫骨和半月板中观察到滑膜增生的变化。结果在图21和22中示出。
如图21和图22所示，在进行了TIP1处理的情况下，CIA模型所破坏的骨骼缓解到与正常小鼠相似，软骨(C)、软骨下骨(S)、股骨(F)、胫骨(T)和半月板(M)的组织病理学改变也减少了。从这些结果中，确认了根据本发明的TIP1有效地抑制了TLR4信号传导通路，因此可以有效地用作包括类风湿性关节炎的各种急性或慢性炎性疾病的治疗剂。
提供本发明的前述描述用于说明。本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地进行各种改变和修改。因此，应当理解，上述实施例在所有方面都是示例性的，而不是限制性的。
序列表
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<221> MOD_RES
<222> (21)
<223> Amidation on the C-terminal end
<400> 14
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 15
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TP10, PepFect 14
<220>
<221> MOD_RES
<222> (18)
<223> Amidation on the C-terminal end
<400> 15
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 16
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NickFect 1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)
<223> Amidation on the C-terminal end
<400> 16
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Thr Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 17
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NickFect 2
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)
<223> Amidation on the C-terminal end
<400> 17
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Thr Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NickFect 3
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)
<223> Amidation on the C-terminal end
<400> 18
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Thr Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1 5 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu
20
<210> 19
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MPG
<400> 19
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep-1
<400> 20
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAP
<400> 21
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R6/W3
<400> 22
Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polyarginine(R8)
<400> 23
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polyarginine(R9)
<400> 24
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP22
<400> 25
Asn Ala Lys Thr Arg Arg His Glu Arg Arg Arg Lys Leu Ala Ile Glu
1 5 10 15
Arg
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YTA2
<400> 26
Tyr Thr Ala Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> YTA4
<400> 27
Ile Ala Trp Val Lys Ala Phe Ile Arg Lys Leu Arg Lys Gly Pro Leu
1 5 10 15
Gly
<210> 28
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M918
<400> 28
Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 29
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CADY
<400> 29
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Arg Ala
20
<210> 30
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAP
<400> 30
Val Arg Leu Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Leu Pro Pro Pro Val Arg
1 5 10 15
Leu Leu Pro Pro Pro
20
<210> 31
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SAP(E)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Acetylation on the N-terminal end
<400> 31
Cys Gly Gly Trp Val Glu Leu Pro Pro Pro Val Glu Leu Pro Pro Pro
1 5 10 15
Val Glu Leu Pro Pro Pro
20
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CyLoP-1
<400> 32
Cys Arg Trp Arg Trp Lys Cys Cys Lys Lys
1 5 10
<210> 33
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gH 625
<400> 33
His Gly Leu Ala Ser Thr Leu Thr Arg Trp Ala His Tyr Asn Ala Leu
1 5 10 15
Ile Arg Ala Phe
20
<210> 34
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GALA
<400> 34
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
1 5 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
20 25 30
<210> 35
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CADY
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Acetylation on the N-terminal end
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)
<223> X = cysteamide
<400> 35
Gly Leu Trp Arg Ala Leu Trp Arg Leu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Leu
1 5 10 15
Leu Trp Arg Ala Xaa
20
<210> 36
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> L17E
<400> 36
Ile Trp Leu Thr Ala Leu Lys Phe Leu Gly Lys His Ala Ala Lys His
1 5 10 15
Glu Ala Lys Gln Gln Leu Ser Lys Leu
20 25
<210> 37
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MPPs
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> X = cyclohexylalanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)
<223> X = cyclohexylalanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)
<223> X = cyclohexylalanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> X = cyclohexylalanine
<400> 37
Xaa Arg Xaa Lys Xaa Arg Xaa Lys
1 5
<210> 38
<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RR5-APP
<400> 38
Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Arg Arg Ala Pro
1 5 10 15
Val Glu Asp Leu Ile Arg Phe Tyr Asn Asp Leu Gln Gln Tyr Leu Asn
20 25 30
Val Val Thr Arg His Arg Tyr Cys
35 40
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RR4-APP
<400> 39
Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Arg Arg Ala Pro Val Glu
1 5 10 15
Asp Leu Ile Arg Phe Tyr Asn Asp Leu Gln Gln Tyr Leu Asn Val Val
20 25 30
Thr Arg His Arg Tyr Cys
35
<210> 40
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RR3-APP
<400> 40
Gly Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly Arg Arg Ala Pro Val Glu Asp
1 5 10 15
Leu Ile Arg Phe Tyr Asn Asp Leu Gln Gln Tyr Leu Asn Val Val Thr
20 25 30
Arg His Arg Tyr Cys
35
<210> 41
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TATp-D-1
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Acetylation on the N-terminal end
<400> 41
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln Lys Lys
1 5 10 15
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TATp-D-2
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)
<223> Acetylation on the N-terminal end
<400> 42
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cyclic Tat
<400> 43
Lys Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Glu
1 5 10
<210> 44
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K10(QW)6
<400> 44
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gln Trp Gln Trp Gln Trp
1 5 10 15
Gln Trp Gln Trp Gln Trp
20
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TAT(49-57)
<400> 45
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DPV1047
<400> 46
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 47
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARF(1-22)
<400> 47
Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 48
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BPrPr(1-28)
<400> 48
Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
1 5 10 15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro
20 25
<210> 49
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> p28
<400> 49
Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp
20 25
<210> 50
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VT5
<400> 50
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr
1 5 10 15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
20 25
<210> 51
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C105Y
<400> 51
Cys Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Tyr Leu
1 5 10 15
Ile
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PFVYLI
<400> 52
Pro Phe Val Tyr Leu Ile
1 5
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep-7
<400> 53
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1 5 10 15

Claims (17)

1.一种肽，由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽的S-H-C-R序列(SEQ ID NO:2)与Toll样受体(TLR)的Toll/白介素-1受体(TIR)域特异性结合。
3.一种融合肽，其中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
4.根据权利要求3所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽抑制由Toll样受体(TLR)介导的信号传导通路。
5.根据权利要求4所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽抑制由Toll样受体4(TLR4)介导的信号传导通路。
6.根据权利要求4所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽抑制选自由Toll样受体1/2(TLR1/2)、Toll样受体2/6(TLR2/6)、Toll样受体3(TLR3)、Toll样受体7(TLR7)、Toll样受体8(TLR8)和Toll样受体9(TLR9)组成的组中的任一种所介导的信号传导通路。
7.根据权利要求3所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽对TLR信号传导通路的阻断导致抑制TNF-α、IL-6或IFN-β表达；抑制NO或ROS的分泌；或抑制NF-κB、MAPK或NLRP3炎性小体的活性。
8.根据权利要求3所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽抑制MyD88依赖性和MyD88非依赖性TLR4信号传导通路。
9.根据权利要求3所述的融合肽，其特征在于，所述融合肽由SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4的氨基酸序列组成。
10.一种用于预防或治疗至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述至少一种TLR通路介导的疾病选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组，所述药物组合物包含以下作为活性成分：
由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽。
11.一种用于预防或治疗至少一种TLR通路介导的疾病的药物组合物，所述至少一种TLR通路介导的疾病选自由自身免疫性疾病、炎性疾病和退行性神经疾病组成的组，所述药物组合物包含以下作为活性成分：
融合肽，在所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述融合肽由SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的氨基酸序列组成。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述自身免疫性疾病是选自由以下组成的组中的至少一种：胰岛素依赖型糖尿病、多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、实验性自身免疫性关节炎、重症肌无力、甲状腺炎、实验性葡萄膜炎、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、甲状腺中毒、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、爱迪生病、早熟绝经、男性不育、儿童糖尿病、古德帕斯丘综合征、寻常型天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体性葡萄膜炎、自身免疫性溶血性贫血、特发性白细胞减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎Hbs-ve、潜伏性肝硬化、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、韦格纳肉芽肿病、多肌炎/皮肤肌炎、盘状LE和系统性红斑狼疮。
14.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述炎性疾病是选自由以下组成的组中的至少一种：哮喘、湿疹、牛皮癣、过敏、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、特应性皮炎、痤疮、特应性鼻炎、肺炎、过敏性皮炎、慢性鼻窦炎、接触性皮炎、脂溢性皮炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎、溃疡、慢性支气管炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、败血症、血管炎、滑囊炎、狼疮、类风湿性多肌痛、颞动脉炎、多发性硬化症、实体瘤、阿尔茨海默氏病、动脉粥样硬化、肥胖症和病毒感染。
15.根据权利要求10至12中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述神经退行性疾病是选自由以下组成的组中的至少一种：阿尔茨海默氏病、额颞叶痴呆、路易氏痴呆、皮质基底膜退化症、帕金森氏病、多系统萎缩、亨廷顿氏病、进行性核上性麻痹、卢伽雷氏病、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩。
16.一种预防或治疗TLR通路介导的疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的个体给药由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽的步骤。
17.一种预防或治疗TLR通路介导的疾病的方法，所述方法包括：
向有需要的个体给药融合肽的步骤，所述融合肽中由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的肽与细胞穿透肽的N端连接。
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