JP2020512016A - 自閉症スペクトラム障害の分析 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年3月21日出願の仮特許出願第62/474,339号、2017年4月11日出願の同第62/484,357号、2017年4月11日出願の同第62/484,332号、2017年5月5日出願の同第62/502,124号、2017年9月5日出願の同第62/554,154号、2017年11月24日出願の同第62/590,446号、及び2018年1月26出願の同第62/622,341号の優先権を主張し、これらの文献の内容は、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
エクソソームならびに他の微小胞及び親油性担体を介するmiRNAの細胞外輸送は、細胞が近位及び遠位の細胞の遺伝子発現を変えるための、確立されたエピジェネティック機構である。こうした微小胞及び担体は、それが細胞に結合及び侵入し得る場所である細胞外空間へと押し出され、mRNAからタンパク質への翻訳を遮断する(Hu et al.,2012)。さらに、こうした微小胞及び担体は、さまざまな体液(血液及び唾液など)に存在するため(Gallo et al.,2012)、単に唾液を採取することによって、中枢神経系(CNS)を起源とし得るエピジェネティック材料を測定することが可能となる。実際、唾液において検出されるmiRNAの多くが、舌及び唾液腺を神経支配する感覚神経求心性終末及び運動神経遠心性終末を介して口腔に分泌され、それによって、ASD個体のCNSにおいて制御不全にあり得るmiRNAをアッセイするための比較的直接的なウィンドウが得られると本発明者らは考えている。エピジェネティックデータには、miRNAに関するデータが含まれる。
ASDでは腸−脳軸が役割を担うという証拠が蓄積してきており、マイクロバイオームプロファイルの異常が中枢作用性の神経ペプチドの変動を促進し、自閉症行動を誘導するということさえ示唆されている(Mulle et al.,2013)。
自閉症スペクトラム障害(「ASD」)もしくはASDと関連することが知られていない発達遅延(「DD」)を有すると疑われる対象、またはASDもしくは前記発達遅延の症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び/またはマイクロバイオームデータを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ASDまたはDDを有さないことが判明しており、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける1つもしくは複数のマイクロRNA(「miRNA」)のリード数、及び/または1つもしくは複数の微生物トランスクリプトーム配列のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び/または微生物データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、1つまたは複数の不変miRNAまたは他の不変RNAを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたmiRNAデータ及び微生物トランスクリプトーム配列データに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のmiRNA及び微生物RNAの存在量レベルを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに
前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物RNAの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する1つもしくは複数の対照miRNA及び/または1つもしくは複数の対照微生物RNAの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象のmiRNA及び/または微生物RNAのうちの前記1つまたは複数の前記存在量を、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは1人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物RNAと比較したときの、前記存在量の増加または減少によって、前記対象がASDを有し得るか、またはASD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有するか、あるいは前記対象がDDを有し得るか、またはDD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。miRNAまたは微生物RNAの増加または減少は、1人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する1人もしくは複数人の対象、1人もしくは複数人のASD対象、または1人もしくは複数人のDD対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
実施形態1に記載の方法は、実施形態2〜31によって記載される1つまたは複数の限定を伴って実施され得る。
自閉症スペクトラム障害(「ASD」)を検出または診断するための方法であって、前記方法が、
(a)ヒト対象から採取された唾液サンプルにおける1つまたは複数のマイクロRNA(「miRNA」)の存在量レベルまたは濃度レベル(複数可)を決定すること、及び
(b)前記1つまたは複数のmiRNAの前記決定された存在量レベルまたは濃度レベル(複数可)を、同一の1つまたは複数のmiRNAの正常レベル(複数可)と比較することであって、前記正常(または対照)レベルが、1人の非ASD対象に見られるもの、2人以上の非ASD対象に由来する平均値、またはASDの1つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された存在量レベルもしくは濃度レベル(複数可)である、前記比較すること、及び
(c)前記1つまたは複数のmiRNAの異常レベルを有する対象を、ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとして選択すること、
を含み、
前記1つまたは複数のmiRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、hsa−miR−146a−3p、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183、miR−183−3p、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、miR−3074−5p、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、let−7e−5p、miR−620、miR−1277−5p、miR−584−5p、let−7a−5p、mir−944、及びmiR−655からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、前記方法。補完または代替の実施形態では、miRNAまたは微生物RNAの増加または減少は、1人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する1人もしくは複数人の対象、1人もしくは複数人のASD対象、または1人もしくは複数人のDD対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
前記miRNA存在量レベルが、RNA存在量レベルが実質的に不変の1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子の存在量レベルもしくは平均存在量レベルに正規化され、及び/または前記miRNAレベルが、前記1つもしくは複数のmiRNAレベルの前記存在量の日内変動もしくは概日変動を補正するために正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上昇させる運動に起因する前記1つもしくは複数のmiRNAの前記存在量の変動を補正するために正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景の差異を補正するために調整される、実施形態2に記載の方法。
(a)1つまたは複数のmiRNAの濃度の決定が、RNAシークエンシング(「RNA−seq」)、qPCR、miRNAアレイ、またはマルチプレックスmiRNAプロファイリングによって実施される、実施形態2または実施形態3に記載の方法。(http://www.abcam.com/kits/review−of−mirna−assay−methods−qpcr−arrays−and−sequencing)。
前記少なくとも1つのmiRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−5p、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193a−5p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183−5p、miR−183、miR−183−3p、miR−665、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、及びmiR−3074−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−149−5p、miR−125a−5p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、及びlet−7e−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−4705、miR−620、miR−1277−5p、miR−125a、及びmiR−193a−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−655、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−374c−5p、miR−29c−3p、もしくはmiR−190a−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−5p、miR−92a、mir−1972、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−374c−5p、miR−29c−3p、及びmiR−190a−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−149−5p、miR−125a−5p、miR−130b−3p、let−7d−3p、miR−598、miR−374b−5p、miR−675−3p、miR−500a−3p、miR−374a−5p、及びlet−7e−5p、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、のうちの少なくとも1つである、実施形態2、実施形態3、または実施形態4に記載の方法。
前記唾液サンプルが、特定の時刻に前記ヒト対象から採取され、前記サンプルのmiRNAの前記濃度レベル(複数可)が、同一の時刻にその他は同一の条件の下で採取された唾液における正常なmiRNA値と比較される、実施形態2〜17のいずれか1つに記載の方法。
前記唾液サンプルが、miRNAの前記正常レベル(複数可)が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、実施形態2〜17のいずれか1つに記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記miRNAレベル(複数可)の前記値を調整または正規化して、miRNAレベル(複数可)の日内変動または概日変動を補正することをさらに含む、前記方法。
前記唾液サンプルが、miRNAの前記正常レベル(複数可)が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、実施形態2〜17のいずれか1つの実施形態に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記miRNAレベル(複数可)の前記値を調整または正規化することで、回帰モデルもしくは他の統計解析で使用されるmiRNAレベル(複数可)の日内変動もしくは概日変動を補正するか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景を補正すること、をさらに含む、前記方法。
前記唾液サンプルが、覚醒から1時間以内、歯磨きもしくは口のすすぎの前、飲食前、及び/または心拍数を上昇させる運動の前に採取される、実施形態2〜20のいずれか1つに記載の方法。
前記選択が、前記miRNAのうちの4つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びASDの少なくとも1つの症状の可能性を有する前記異常miRNAレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、実施形態2〜21のいずれか1つに記載の方法。
前記選択が、前記miRNAのうちの10以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びASDの少なくとも1つの症状の可能性を有する前記異常miRNAレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、実施形態2〜21のいずれか1つに記載の方法。
Prevotella timonensis、Streptococcus vestibularis、Enterococcus faecalis、Acetomicrobium hydrogeniformans、Streptococcus属の1種HMSC073D05、Rothia dentocariosa、Prevotella marshii、Prevotells属の1種HMSC073D09、Propionibacterium acnes、及びCampylobacterからなる群、または上記微生物に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは100%の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物、から選択される1つまたは複数の唾液微生物に由来するRNA(複数可)の存在量レベルを前記対象において決定すること、ならびに前記微生物RNAの前記存在量レベル(複数可)を、同一の1つまたは複数の微生物RNAの正常レベル(複数可)と比較することであって、前記正常(または対照)存在量レベルが、1人の非ASD対象に見られるもの、2人以上の非ASD対象に由来する平均値、または異常な日内リズムもしくは概日リズムと関連する状態、障害、もしくは疾患の1つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル(複数可)である、前記比較すること、ならびに前記1つまたは複数の微生物RNAの異常存在量を有する対象を、ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとしてさらに選択すること、をさらに含む、実施形態2〜23のいずれか1つに記載の方法。こうした微生物についての追加情報は、https://_jgi.doe.gov/またはhttp://_www.uniprot.org/proteomes/(これらは両方共、参照によって組み込まれる)において利用することができる。
唾液のmiRNAレベルの決定または微生物RNA存在量レベル(複数可)の決定が、RNAシークエンシング(RNA−seq)によって実施される、実施形態2〜24のいずれか1つに記載の方法。(https://_en.wikipedia.org/wiki/RNA−Seq)。
前記シークエンシングデータ生リード数が、分位数正規化され、平均によって中心化され、それぞれの変数の標準偏差で除算され、データが正規化されることでサンプル間の数の変動が考慮され、及び/または1つまたは複数の不変miRNAの存在量に対してデータが正規化されることで相対存在量レベル及び/または絶対存在量レベルが示され、任意選択で、前記正規化データが統計的にさらに解析される、実施形態25に記載の方法。
miRNAの少なくとも1つの異常レベルを有する対象を、1つもしくは複数のmiRNAの前記少なくとも1つの異常な唾液中レベルを低減し、及び/または1つもしくは複数の異常な微生物RNA存在量レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含む、実施形態2〜26のいずれか1つに記載の方法。
少なくとも2つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを採取すること、ならびに前記第2の唾液サンプルまたはその後の唾液サンプルが、正常に近づいたmiRNAレベル(複数可)及び/または微生物RNA存在量レベルを有するときに治療レジメンの効力を決定すること、をさらに含む、実施形態27に記載の方法。
ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとして選択された対象を、1つもしくは複数のmiRNAの少なくとも1つの異常な唾液中存在量、または1つもしくは複数の微生物RNA存在量レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含み、前記レジメンが、外科的治療、薬物治療、miRNAもしくはmiRNAアンタゴニストによる治療、抗微生物治療、食事療法もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、心理療法、行動療法、または代替医学療法のうちの1つまたは複数を実施することを含む、実施形態2〜26のいずれか1つに記載の方法。
miRNA及び/または微生物RNAを検出するためのmiRNAアッセイキットであって、前記miRNAアッセイキットが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、hsa−miR−146a−3p、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183、miR−183−3p、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、miR−3074−5p、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、let−7e−5p、miR−620、miR−1277−5p、miR−584−5p、let−7a−5p、mir−944、及びmiR−655からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つのmiRNAに相補的であるか、あるいはその他の様式で前記少なくとも1つのmiRNAの増幅及び/または検出に適した1つ、2つ、または3つ以上のプローブまたはプライマーと、任意選択で、1つまたは複数のサンプル採取ツール、1つまたは複数のサンプル採取容器、前記miRNA及び/または微生物RNAを増幅及び/または検出及び/または定量化するための1つまたは複数の試薬、1つまたは複数の正または負の対照、1つまたは複数の反応基質または反応プラットフォーム、包装材料(複数可)、及び/または使用説明物と、を含む、前記miRNAアッセイキット。
ASDの少なくとも1つの症状と相関する少なくとも1つのmiRNAの濃度を同定するための方法であって、前記方法が、
(a)1人または複数人の対象から唾液サンプルを採取すること、
(b)前記サンプルにおけるmiRNAをシークエンシングすること、
(c)miRNA当たりのシークエンシングリードを数えることによって、存在量の異なるmiRNAを同定し、配列リードデータを正規化し、正規化された配列リード数を、異なる時点で採取された唾液サンプル間で比較すること、
(d)ハウスキーピング遺伝子もしくはハウスキーピングmiRNA(存在量が不変)のRNA発現、または2つ以上のハウスキーピング遺伝子に由来する平均化RNA存在量に対して配列リードデータを正規化すること、
(e)得られたデータのピアソン相関係数を計算し、1つまたは複数のmiRNAの濃度レベル、及び唾液に見られる微生物に由来する1つまたは複数のRNA存在量レベル、及びADSの少なくとも1つの症状、を説明すること、
(f)ASDの少なくとも1つの症状と相関する異常な存在量レベルを有するとして1つまたは複数のmiRNAを選択すること、ならびに
(g)任意選択で、DIANA miRpathまたは他のソフトウェアを使用してmiRNAの標的遺伝子を決定すること、
を含む、前記方法。
自閉症スペクトラム障害(ASD)もしくはASDと関連することが知られていない発達遅延(「DD」)を有すると疑われる対象、またはASDもしくは前記発達遅延の症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び/またはマイクロバイオームデータを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける1つもしくは複数のマイクロRNA(miRNA)のリード数、及び/または1つもしくは複数の微生物トランスクリプトーム配列のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び/または微生物トランスクリプトーム配列データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、1つまたは複数の不変miRNAまたは他の不変RNAを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたmiRNA及び微生物RNAに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のmiRNA及び微生物RNAの存在量レベルを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物RNAの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する1つもしくは複数の対照miRNA及び/または1つもしくは複数の対照微生物RNAの、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、を含み、前記対象のmiRNA及び/または微生物RNAのうちの前記1つまたは複数の前記存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは1人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物RNAと比較したときの、前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象がASDを有し得るか、またはASD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示されるか、あるいは前記対象がDDを有し得るか、またはDD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。補完または代替の実施形態では、miRNAまたは微生物RNAの増加または減少は、1人もしくは複数人の健康な対照対象、明らかに定型の発達を有する1人もしくは複数人の対象、1人もしくは複数人のASD対象、または1人もしくは複数人のDD対象、に由来する値と比較され得る。複数人の対象に由来する値が対照として使用されるとき、平均値が使用され得る。対照対象は、年齢、性別、もしくは遺伝的背景を対象として選択されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景が一致するようにされ得る。
前記対象のmiRNA及び/または微生物RNAのうちの前記1つまたは複数の前記存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象、あるいは1人もしくは複数人の発達遅延対照対象、または一群の発達遅延対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物RNAと比較したときの、前記存在量レベルの正または負の差異によって、前記ASD関連症状の重症度が示される、実施形態32に記載の方法。
前記miRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、hsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態32に記載の方法。
微生物RNAによって同定される前記微生物が、分類識別子1095749 Pasteurella bettyae CCUG2042、分類識別子1236 Gammaproteobacteria、分類識別子1239 Firmicutes、分類識別子1715084 Rothia属の1種HMSC065C03、分類識別子1739299 Streptococcus属の1種HMSC056C01、分類識別子1739336 Streptococcus属の1種HMSC073D05、分類識別子1739408 Streptococcus属の1種HMSC072G04、分類識別子186826 Lactobacillales、分類識別子537011 Prevotella copri DSM18205、分類識別子712 Pasteurellaceae、分類識別子889206 Streptococcus vestibularis ATCC49124からなる群、及び/または上記の微生物が変異した微生物もしくは上記の微生物の機能的ホモログである微生物(上記の微生物に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは100%の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物など)、から選択される、実施形態32に記載の方法。参照ポリヌクレオチドに対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも87.5%、少なくとも90%、少なくとも92.5%、少なくとも95%、少なくとも97.5%、少なくとも98%、少なくとも99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはゲノム配列(上記の微生物に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、または少なくとも99%のゲノム同一性を有するものなど)の同定には、BLASTNが使用され得る。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態32に記載の方法。
1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の前記存在量レベルが、リアルタイムPCRまたは次世代シークエンシングによって決定される、実施形態32に記載の方法。
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で同一の対象から採取された少なくとも2つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも2つの生物学的サンプルのそれぞれにおける1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の、数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記1つまたは複数の特定のmiRNA及び/または微生物の前記対象の、数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な変化を決定すること、
を含み、
前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象におけるASDまたはASD関連症状の進行が示され、及び/または
前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルの前記存在量レベルの経時的な正または負の差異によって、前記対象におけるASDまたはASD関連症状の進行が示される、前記方法。
前記miRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態38に記載の方法。
RNAによって同定される前記微生物が、分類識別子1095749 Pasteurella bettyae CCUG2042、分類識別子1236 Gammaproteobacteria、分類識別子1239 Firmicutes、分類識別子1715084 Rothia属の1種HMSC065C03、分類識別子1739299 Streptococcus属の1種HMSC056C01、分類識別子1739336 Streptococcus属の1種HMSC073D05、分類識別子1739408 Streptococcus属の1種HMSC072G04、分類識別子186826 Lactobacillales、分類識別子537011 Prevotella copri DSM18205、分類識別子712 Pasteurellaceae、分類識別子889206 Streptococcus vestibularis ATCC49124からなる群、及び/または上記の微生物が変異した微生物もしくは上記の微生物の機能的ホモログである微生物、から選択される、実施形態38に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態38に記載の方法。
1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の前記存在量レベルが、リアルタイムPCRまたは次世代シークエンシングによって決定される、実施形態38に記載の方法。
対象の生物学的サンプルにおけるmiRNA配列(複数可)の検出方法であって、前記方法が、
前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される1つまたは複数のmiRNA配列のそれぞれに対する二本鎖相補DNA配列(cDNA)を創出すること、ならびに
cDNAの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、cDNAの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補miRNA配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
対象の生物学的サンプルにおけるmiBIOME配列(複数可)の検出方法であって、前記方法が、
前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
分類識別子1095749 Pasteurella bettyae CCUG2042、分類識別子1236 Gammaproteobacteria、分類識別子1239 Firmicutes、分類識別子1715084 Rothia属の1種HMSC065C03、分類識別子1739299 Streptococcus属の1種HMSC056C01、分類識別子1739336 Streptococcus属の1種HMSC073D05、分類識別子1739408 Streptococcus属の1種HMSC072G04、分類識別子186826 Lactobacillales、分類識別子537011 Prevotella copri DSM18205、分類識別子712 Pasteurellaceae、及び分類識別子889206 Streptococcus vestibularis ATCC49124からなる群に属する微生物から選択される1つまたは複数の微生物RNA配列のそれぞれに対する二本鎖相補DNA配列(cDNA)を創出すること、ならびに
cDNAの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、cDNAの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補miBIOME配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態44に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、第1の時点で採取された第1の生物学的サンプルであり、前記cDNAが、第1のcDNAである、実施形態44に記載の方法であって、前記方法が、
第2の時点で第2の生物学的サンプルを前記対象から採取すること、
hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群から選択される1つまたは複数のmiRNA配列のそれぞれに対する第2のcDNAを創出すること、
分類識別子1095749 Pasteurella bettyae CCUG2042、分類識別子1236 Gammaproteobacteria、分類識別子1239 Firmicutes、分類識別子1715084 Rothia属の1種HMSC065C03、分類識別子1739299 Streptococcus属の1種HMSC056C01、分類識別子1739336 Streptococcus属の1種HMSC073D05、分類識別子1739408 Streptococcus属の1種HMSC072G04、分類識別子186826 Lactobacillales、分類識別子537011 Prevotella copri DSM18205、分類識別子712 Pasteurellaceae、及び分類識別子889206 Streptococcus vestibularis ATCC49124からなる群に属する微生物から選択される1つまたは複数の微生物RNA配列のそれぞれに対する第2のcDNAを創出すること、ならびに
前記第2のcDNAの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、前記第2の時点で得られた前記生物学的サンプルにおける前記第2のcDNAの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記第2の時点の前記相補miRNA配列及び/または相補微生物配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、ならびに
任意選択で、前記第1の時点で得られた結果を前記第2の時点で得られた結果と比較することによってASD及び/またはASD関連症状の進行を追跡すること、
をさらに含む、前記方法。
対象がASD及び/またはASD関連症状を有するかどうかを決定するためのキットであって、前記キットが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択されるmiRNAのリボヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列を有する2つ以上のmiRNAプローブを含むプローブセットを含む、前記キット。
前記プローブセットに結合した固体支持体をさらに含む、実施形態47に記載のキット。
下記のもののうちの少なくとも1つをさらに含む、実施形態47に記載のキット:(a)負の対照として使用される1つの無作為に生成されたリボヌクレオチド配列、(b)全RNA分解に対する標準化対照として使用される、ハウスキーピング遺伝子に由来する少なくとも1つのオリゴヌクレオチド配列、及び(c)正の対照として使用される少なくとも1つの無作為に生成されたリボヌクレオチド配列。
miRNAの配列に対応するヌクレオチド配列を含む、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20のプローブを含む、マイクロアレイ。
前記miRNAのうちの少なくともいくつかが、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−5p、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193a−5p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183−5p、miR−183、miR−183−3p、miR−665、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、及びmiR−3074−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択され、支持体上に存在するものである、実施形態50に記載のマイクロアレイ。
miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−5p、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193a−5p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183−5p、miR−183、miR−183−3p、miR−665、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、及びmiR−3074−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択されるmiRNAの配列に対応するヌクレオチド配列を含む少なくともプローブのセットと、
前記唾液サンプルに存在する少なくとも1つの微生物遺伝子配列を検出及び定量化することが可能なヌクレオチド配列を含む任意選択のプローブのセットであって、前記少なくとも1つの微生物配列が、Prevotella timonensis、Streptococcus vestibularis、Enterococcus faecalis、Acetomicrobium hydrogeniformans、Streptococcus属の1種HMSC073D05、Rothia dentocariosa、Prevotella marshii、Prevotells属の1種HMSC073D09、Propionibacterium acnes、及びCampylobacterからなる群から選択される少なくとも1つの生物に由来するものである、前記任意選択のプローブのセットと、
を含む、実施形態50または実施形態51に記載のマイクロアレイ。
自閉症スペクトラム障害(ASD)について分析される対象におけるmiRNA存在量プロファイルの検出方法であって、前記方法が、
前記対象から採取されたサンプル(好ましくは、前記サンプルは、唾液サンプルである)におけるマイクロRNA(miRNA)のプロファイル変化を、健康な個体または非ASD発達遅延個体のmiRNAプロファイルと比較して検出することを含み、前記miRNAプロファイルが、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20のmiRNAを含む、前記方法。
前記対象の唾液サンプルに存在する微生物遺伝子配列のプロファイルを検出して、健康な個体または非ASD発達遅延個体の唾液に由来する微生物RNAのプロファイルと比較することをさらに含む、実施形態53に記載の方法。
前記miRNAのいくつかが、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−5p、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193a−5p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183−5p、miR−183、miR−183−3p、miR−665、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、及びmiR−3074−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、実施形態53に記載の方法。
RNA配列によって同定される前記微生物が、Prevotella timonensis、Streptococcus vestibularis、Enterococcus faecalis、Acetomicrobium hydrogeniformans、Streptococcus属の1種HMSC073D05、Rothia dentocariosa、Prevotella marshii、Prevotells属の1種HMSC073D09、Propionibacterium acnes、及びCampylobacterからなる微生物の群から選択される少なくとも2つを含む、実施形態54に記載の方法。
対象における自閉症スペクトラム障害の治療方法であって、前記方法が、行動療法、コミュニケーション療法、食事療法、投薬療法、及び代替医学療法のうちの1つまたは複数で前記対象を治療することを含み、前記対象が、請求項53〜56のいずれか1項に記載の方法によって前記自閉症スペクトラム障害の治療が必要であると同定される、前記方法。
前記自閉症スペクトラム障害が、精神障害の診断及び統計マニュアル第5版(DSM−5,2013)において分類される社会的コミュニケーションの欠如、社会的相互作用の欠如、常同的行動パターンのうちの少なくとも1つを含む、実施形態57に記載の方法。
自閉症スペクトラム障害と相関する、唾液サンプルに存在する少なくとも1つの微生物遺伝子配列を検出及び定量化することが可能なヌクレオチド配列を含むプローブのセットを含む、マイクロアレイ。
自閉症スペクトラム障害と相関するmiRNAの配列に対応するヌクレオチド配列を含む、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも20のプローブのセットをさらに含む、実施形態59に記載のマイクロアレイ。
自閉症スペクトラム障害(ASD)について分析される対象におけるmiRNA存在量プロファイルの検出方法であって、前記方法が、前記対象の唾液サンプルに存在する微生物遺伝子配列のプロファイルを検出して、健康な個体または非ASD発達遅延個体の唾液に由来するmBIOMEのプロファイルと比較することを含む、前記方法。
ASDを検出または診断するための方法であって、前記方法が、
対象の唾液における1つまたは複数のASD関連miRNAを検出すること、
非ASD対象のものを有意に下回る量または有意に上回る量で前記miRNAが存在するときにASDを検出または診断すること、及び
任意選択で前記対象のASDを治療すること、
を含む。
検出または診断が、口腔−運動処理及び/または口腔−感覚処理に関する障害と関連する1つまたは複数のマイクロRNAの異常レベルを検出することが含む、実施形態62に記載の方法。
前記口腔−運動処理が、発語失行であり、及び/または前記口腔−感覚処理が、食品テクスチャ感度である、実施形態63に記載の方法。
検出または診断が、軸索ガイダンス、神経栄養シグナル伝達、GABA作動性シナプス、またはニコチン中毒、に関する障害と関連する1つまたは複数のマイクロRNAの異常レベルを検出することを含む、実施形態62に記載の方法。
検出または診断が、社会的情緒に関する障害または限定的/常同的行動と関連する1つまたは複数のマイクロRNAの異常レベルを検出することを含む、実施形態62に記載の方法。
前記1つまたは複数のマイクロRNAが、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−149−5p、miR−125a−5p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、及びlet−7e−5pからなる群から選択される少なくとも1つを含む、実施形態62に記載の方法。
TD対象またはDD対象におけるマイクロRNAレベルと比較したときの、1つまたは複数のマイクロRNAのレベル増加がASDと関連し、TD対象またはDD対象におけるマイクロRNAレベルと比較したときの、1つまたは複数のマイクロRNAのレベル増加がASDと関連し、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択される少なくとも1つのマイクロRNAの前記レベル増加が検出される、実施形態62に記載の方法。
TD対象またはDD対象におけるマイクロRNAレベルと比較したときの、1つまたは複数のマイクロRNAのレベル減少がASDと関連する、実施形態62に記載の方法。
正常な対象におけるマイクロRNAレベルと比較したときの、1つまたは複数のマイクロRNAのレベル減少がASDと関連し、TD対象またはDD対象におけるマイクロRNAレベルと比較したときの、1つまたは複数のマイクロRNAのレベル減少がASDと関連し、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される少なくとも1つのマイクロRNAの前記レベル減少が検出される、実施形態62に記載の方法。
少なくとも1つのmiRNAが、非ASD対象のものを超える量で存在するmiRNAからなる群から選択され、少なくとも1つのmiRNAが、非ASD対象のものを下回る量で存在するmiRNAからなる群から選択されるときにASDを検出または診断することを含む、実施形態62に記載の方法。
非ASD対象のものを下回る量で存在する少なくとも1つのmiRNAの正規化値に対する、非ASD対象におけるものを超える量で存在する少なくとも1つのmiRNAの正規化値の比が、少なくとも0.1、少なくとも0.2、少なくとも0.5、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9から10までの範囲(すべての介在値及び中間値を含む)であるときにASDを検出または診断することを含み、前記比が、非ASD対象におけるmiRNAの量でmiRNAの量を除算することによって決定される正規化値に基づく、実施形態62に記載の方法。
miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の増加、及び/またはmiR−4705、miR−620、miR−1277−5p、miR−125a、及びmiR−193a−5pからなる群から選択される前記マイクロRNAのうちの1つもしくは複数の減少、を検出することによって、ASDをDDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の減少、及び/またはmiR−655、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の増加、を検出することによって、ASDをDDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
mir−374c−5p、miR−29c−3p、またはmiR−190a−5pのうちの少なくとも1つと、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−5p、miR−92a、mir−1972、またはmiR−7706のうちの少なくとも1つと、を検出することによって、ASDをDDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択される前記マイクロRNAのうちの1つもしくは複数の増加、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群から選択される前記マイクロRNAのうちの1つもしくは複数の減少、を検出することによって、ASDをTDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の減少、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の増加、を検出することによって、ASDをTDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の増加、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の減少、を検出することによって、ASDをTDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の減少、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択される前記miRNAのうちの1つもしくは複数の増加、を検出することによって、ASDをTDと区別して検出または診断することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
miR−374c−5p、miR−29c−3p、及びmiR−190a−5pのうちの少なくとも1つと、miR−149−5p、miR−125a−5p、miR−130b−3p、let−7d−3p、miR−598、mir374b−5p、miR−675−3p、mir−500a−3p、miR−374a−5p、及びlet−7e−5pのうちの少なくとも1つと、を検出することによって、ASDを区別して検出または診断し、TDを除外することをさらに含む、実施形態62に記載の方法。
前記唾液が、スワブで採取される、実施形態62に記載の方法。
前記対象が、少なくとも、生後0ヶ月、生後1ヶ月、生後2ヶ月、生後3ヶ月、生後4ヶ月、生後5ヶ月、生後6ヶ月、生後7ヶ月、生後8ヶ月、生後9ヶ月、生後10ヶ月、生後11ヶ月、もしくは生後12ヶ月、または1歳、2歳、3歳、4歳、5歳、6歳、7歳、8歳、9歳、10歳、11歳、12歳、13歳、14歳、15歳、16歳、17歳、18歳、19歳、20歳、21歳、22歳、23歳、24歳、もしくは25歳である、実施形態62に記載の方法。
非ASD対象においてDDをTDと区別して検出または診断するための方法であって、前記方法が、
miR−125a−5p及びmiR584−5pからなる群から選択されるmiRNAのうちの1つもしくは複数の量の減少、及び/またはlet−7a−5p及びmiR−944の量の増加、を検出し、それによってDD対象を検出すること、ならびに任意選択で前記DD対象を治療すること、あるいは
miR−665、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群から選択されるmiRNAのうちの1つもしくは複数の量の減少、及び/またはmiR−125a−5p及びmiR−193a−5pの量の増加、を検出し、それによってTD対象を検出すること、ならびに任意選択で前記対象をDD治療から外すこと、
を含む、前記方法。
ASD、DD、またはTDと関連するマイクロRNAを検出する2つ以上のプローブを含む、組成物。
唾液におけるmiRNAを検出するためのキットであって、前記キットが、miRNAを認識する1つ、2つ、または3つ以上のプローブと、任意選択の賦形剤、緩衝剤、プラットフォーム、容器、指示薬、包装材料、または使用説明物と、を含む、前記キット。
対象における脳発達、脳修復、または脳再生を監視するための方法であって、前記方法が、
前記対象の唾液における、脳発達、脳修復、または脳再生と関連する1つまたは複数のmiRNAを検出すること、ならびに
脳発達、脳修復、または脳再生の状態下にない対照対象のものを有意に下回る量または有意に上回る量で前記miRNAが存在するときに脳発達、脳修復、または脳再生の予後予測を行うこと、及び任意選択で、治療の開始、継続、変更、または中止の選択を行うこと、
を含む、前記方法。
予後予測が、所望の脳発達、脳修復、または脳再生と関連する1つまたは複数のmiRNAの異常レベルを検出することを含む、実施形態86に記載の方法。
マイクロRNA(miRNA)存在量の時間的変動を考慮するためにエピジェネティック配列データを正規化する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける1つまたは複数のmiRNAのリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータを正規化してサンプル間のリード数の変動を考慮することであって、前記リード数正規化において1つまたは複数の不変miRNAが使用される、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、及び
前記リード数正規化miRNAにアルゴリズムを適用することであって、前記アルゴリズムにおいて前記時刻が使用されることで前記対象のmiRNA存在量レベルが時刻に対して正規化される、前記適用すること、
を含む、前記方法。
障害または疾患が疑われる対象のエピジェネティックシークエンシングデータを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ASDを有さないことが判明しており、前記方法が、
前記対象のエピジェネティック配列データを正規化してリード数の変動を考慮すること、
前記エピジェネティック配列データをさらに正規化して存在量の時間的変動を考慮すること、
前記対象のmiRNAのうちの前記1つまたは複数の、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNAのリード数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象のmiRNAのうちの前記1つまたは複数の前記存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNAと比較したときの、前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象が障害状態または疾患状態を有し得ることが示される、前記方法。
前記miRNAが、A群の概日変動マイクロRNA(circaMiR)からなる群、及び/または前記A群のcircaMiRのシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態89に記載の方法。
前記miRNAが、A群のcircaMiRとB群のcircaMiRとの両方からなる群、及び/または前記A群のcircaMiR及びB群のcircaMiRのシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態89に記載の方法。
前記対象が、ASD関連症状を有すると疑われる、実施形態89に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態89に記載の方法。
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で前記対象から採取された少なくとも2つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも2つの生物学的サンプルのそれぞれにおける1つまたは複数の特定のmiRNAの、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記1つまたは複数の特定のmiRNAの前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記1つまたは複数の特定のmiRNAの、前記対象のリード数及び時刻が正規化された存在量レベルが経時的に変化しているかどうかを決定すること、
を含み、
前記1つまたは複数の特定のmiRNAの、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象の障害状態または疾患状態が改善または悪化していることが示される、前記方法。
時刻正規化に供される前記miRNAが、A群のcircaMiRからなる群、及び/または前記A群のcircaMiRのシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態94に記載の方法。
時刻正規化に供される前記miRNAが、A群のcircaMiR及びB群のcircaMiRからなる群、及び/または前記A群のcircaMiR及びB群のcircaMiRのシード配列を共有するmiRNA、から選択される、実施形態94に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態94に記載の方法。
前記対象が、ASD関連症状を有すると疑われる、実施形態94に記載の方法。
マイクロバイオーム遺伝子配列存在量の時間的変動を考慮するためにエピジェネティック配列データを正規化する方法であって、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける1つまたは複数の微生物遺伝子配列存在量のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティック配列データを正規化してサンプル間のリード数の変動を考慮することであって、前記リード数正規化において1つまたは複数の不変miRNAが使用される、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、及び
前記リード数正規化微生物存在量にアルゴリズムを適用することであって、前記アルゴリズムにおいて前記時刻が使用されることで前記対象微生物存在量レベルが時刻に対して正規化される、前記適用すること、
を含む、前記方法。
障害状態または疾患状態を有する対象のエピジェネティック配列を、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、前記障害または疾患を有さないことが判明しており、前記方法が、
対象のエピジェネティック配列データを正規化してリード数の変動を考慮すること、
前記エピジェネティック配列データをさらに正規化して存在量の時間的変動を考慮すること、
前記対象の微生物RNA存在量のうちの前記1つまたは複数の、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の1つまたは複数の微生物の、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルと比較すること、
を含み、
前記対象の微生物RNAのうちの前記1つまたは複数の前記存在量レベルを、1人もしくは複数人の健康な対照対象、または一群の健康な対照対象に由来する同一の1つまたは複数の微生物RNAと比較したときの前記存在量レベルの増加または減少によって、前記対象が前記障害状態または疾患状態を有し得ることが示される、前記方法。
前記微生物RNAが、C群の微生物RNAからなる群から選択される、実施形態100に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態100に記載の方法。
前記対象が、ASD関連症状を有すると疑われる、実施形態100に記載の方法。
対象における障害状態または疾患状態の進行の監視方法であって、前記方法が、
異なる時点で前記対象から採取された少なくとも2つの生物学的サンプルを分析することで、前記少なくとも2つの生物学的サンプルのそれぞれにおける1つまたは複数の特定の微生物RNAの、リード数及び時刻が正規化された存在量レベルを決定すること、ならびに
前記1つまたは複数の特定の微生物RNAの前記決定されたレベルを経時的に比較することで、前記1つまたは複数の特定のmiRNAの、前記対象のリード数及び時刻が正規化された存在量レベルが経時的に変化しているかどうかを決定すること、
を含み、
前記1つまたは複数の特定の微生物RNAの、前記リード数及び時刻が正規化された存在量レベルの経時的な増加または減少によって、前記対象の障害状態または疾患状態が改善または悪化していることが示される、前記方法。
時刻正規化に供される微生物RNAが、C群の微生物RNAからなる群から選択される、実施形態104に記載の方法。
前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態104に記載の方法。
前記対象が、ASD関連症状を有すると疑われる、実施形態104に記載の方法。
第1の生物学的サンプルにおけるmiRNA及び/または微生物RNA配列(複数可)あるいは複数のmiRNA及び/または微生物RNA配列の検出方法であって、前記方法が、
対象から生物学的サンプルを採取すること、
A群のcircaMiR、B群のcircaMiR、及びC群の微生物RNAから選択される1つまたは複数のmiRNA配列または微生物RNA配列のそれぞれに対する二本鎖相補DNA配列(cDNA)を創出すること、ならびに
cDNAの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、cDNAの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記相補miRNA配列または相補微生物RNA配列の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、
を含む、前記方法。
前記第1の生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態108に記載の方法。
第2の生物学的サンプルにおけるmiRNA及び/または微生物RNA配列(複数可)の検出方法であって、前記方法が、
第2の時点で前記対象から生物学的サンプルを採取すること、
A群のcircaMiR、B群のcircaMiR、及びC群のmiBiomeから選択される1つまたは複数のmiRNA配列または微生物RNA配列のそれぞれに対する二本鎖相補DNA配列(cDNA)を創出すること、ならびに
cDNAの存在、絶対量、または相対量を検出することであって、前記第2の時点で得られた前記生物学的サンプルにおけるcDNAの前記存在、絶対量、または相対量によって、前記第2の時点の前記相補miRNA配列または相補miBiome配列(複数可)の存在、絶対量、または相対量が示される、前記検出すること、ならびに
前記第1の時点で得られた前記結果を前記第2の時点で得られた前記結果と比較することによって障害または疾患の進行を追跡すること、
を含む、前記方法。
第2の時点で採取される前記生物学的サンプルが、唾液、脳脊髄液、血液、血清、血漿、尿、糞便、粘膜排出物、涙、または組織である、実施形態110に記載の方法。
前記対象が、ASD関連症状を有すると疑われる、実施形態110に記載の方法。
時間リズムの変化を検出するための方法であって、前記方法が、
唾液におけるmiRNAまたは微生物RNAのレベルの、少なくとも1つの異常パターンまたはパターン変化を、1人または複数人の正常な対象に由来する対照値と比較して検出すること、ならびに
miRNAまたは微生物RNAの量の、少なくとも1つの異常パターンまたはパターン変化を有する対象を選択すること、ならびに任意選択で、
時間リズム変化と関連するASDまたはASD関連症状を有する対象を選択し、任意選択で、前記miRNAまたは微生物RNAの量の、前記少なくとも1つの異常パターンまたはパターン変化を低減または再同期する治療を実施すること、
を含む、前記方法。
1つまたは複数のmiRNAの量の前記異常パターンまたはパターン変化が検出される、実施形態113に記載の方法。
この研究の目的は、数ある中でも特に、唾液miRNAの差異によってASD小児とNS小児とをどのくらい良好に区別できるかを決定すること、口腔マイクロバイオームの差異によってASD小児とNS小児とをどのくらい良好に区別できるかを決定すること、miRNAとマイクロバイオームとの間の関連性の強度を定量化すること、ならびに主要な知見の機能的結果を調べること、とした。
対象
すべての対象について親の同意を得た。ASDの確定診断、発達遅延(DD)の診断、または定型発達(DD)の健康な対照の診断のいずれかを有する2〜6歳の小児から全部で258サンプルを採取した。詳細なアンケート、Vineland適応行動尺度(第2版)、及び自閉症診断観察スケジュール(第2版)を使用して包括的な医学的情報及び人口統計情報を入手した。
発達遅延診断=ICD−10によるコード付け(ASDのDSM−5基準を満たさない)
発達状態は、Vineland適応行動尺度−3で決定した。
参加時点で唾液を1回採取した。
−非絶食状態
−水道水での口腔のすすぎ
−舌下腺及び耳下腺
−採取時刻の制限なし
唾液のmiRNA及びマイクロバイオーム存在量の同定及び定量化は、Upstate Medical UniversityのSUNY Molecular Analysis Core(SUNYMAC)においてNextSeq(登録商標)500機器での次世代シークエンシング(NGS)を使用して実施した。Partek FlowソフトウェアのShrimp(登録商標)2アルゴリズムを使用してmiRbase21データベースに対するNGSリードのアライメントを実施することで成熟miRNAを同定した。K−SLAMを使用してヒトマイクロバイオームデータベースに対するリードの追加アライメントを実施した。
この研究では、ASD小児及び対照小児に焦点を当てた。miRNAデータ及びマイクロバイオームデータを別々に正規化することで全リード数の差異を調整し、分位数正規化を行った。正規化値の球面性をスクリーニングした後、主成分分析(PCA)を使用して統計解析を実施した。データをフィルタリングすることで、欠損が60%を超えるものを除外し、PCA結果に基づいて極度の異常値サンプルを除外した。ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定を最初に使用することで、有意な診断効果を有する最も頑健なmiRNA及びマイクロバイオーム分類識別子をスクリーニングした。次に上位の有意なmiRNA及び分類識別子を診断分類モデルにおいて使用し、相関行列を得た。最も強い予測有用性を示したmiRNAを、Diana ToolsのmiRpath(登録商標)を使用する機能解析に供した。結果は、図1〜17に示される。
ASD対象の唾液では脳関連miRNAの発現差異が検出され、この発現差異は、ASD分類を予測するものであり、適応行動の神経発達尺度と関連し得るという仮説を立てた。こうであれば、迅速、簡単、かつ非侵襲性のASD診断が可能になり得る。この仮説を検証するパイロット研究では、年齢及び性別を一致させた対照と比較して、ASD患者ではmiRNAが異なって発現することが発見された。
バイオマーカースクリーニングにおいて同定された上位のmiRNAに対する背景を得るために、こうしたmiRNAを、DIANA TOOLS(登録商標)miRpathにおける経路エンリッチメント解析に供した。この解析によって、唾液バイオマーカーmiRNAが標的とするいくつかの脳関連KEGG群が明らかとなった。こうしたKEGG経路において最も目立ったものは、神経発達群及び神経伝達の神経伝達群、ならびにオキシトシンシグナル伝達群であった。上位にランク付けされた標的遺伝子KEGG経路:cAMPシグナル伝達(p=0.0009、48遺伝子)、アンフェタミン中毒(p=0.0009、17遺伝子)、MAPKシグナル伝達(p=0.0009、56遺伝子)、軸索ガイダンス(p=0.0017、32遺伝子)、ドーパミン作動性シナプス(p=0.0024、32遺伝子)、オキシトシンシグナル伝達(p=0.017、31遺伝子)。
こうした知見のいくつかは、ASD対象における糞便研究から得られた結果と類似している。
ASD小児、DD小児、及びTD小児からなる、より大きなサンプルサイズを使用し、上記のものと同様の方法を用いた実施例である。サンプルサイズを400とした結果、3群分類検定について約94%の検出力が得られた(図21A〜Bを参照のこと)。
TRI Reagent LSを使用してDNA Genotek RNA精製プロトコールに従って唾液miRNAの盲検サンプルを精製した後、RNeasyミニカラム(Qiagen)を使用して2回目の精製を実施する。Agilent Bioanalyzerを使用してRNAサンプルの収量及びクオリティーを評価してから、Illumina TruSeq(登録商標)低分子RNAサンプル調製プロトコール(Illumina;San Diego,California)を用いてライブラリーを構築する。マルチプレックス化したサンプルを、SUNY Upstateにおいてサンプル当たりのリード数が300〜500万となるようにIllumina NextSeq(登録商標)機器で分析する。バーコードインデックスに基づいてサンプルを脱マルチプレックス化し、フィルタリングしてPCR重複及びクオリティーが不十分なリードを除去し、インデックス配列及びアダプター配列をトリミングした後、得られたFASTQファイル(それぞれのサンプルにおいて見つかったすべての配列を、それぞれの塩基についてのクオリティースコアと共に含む)のクオリティー評価指標を調べる。クオリティーが不十分な配列(クオリティースコア<30)を除去した後、残ったリードを、2つの異なる下流ワークフローにおいて使用することで、下記のように宿主miRNA及び微生物RNAをマッピングする:1)Partek Flowソフトウェア(Partek;St.Louis,Missouri)及びSHRiMP2(登録商標)アライナーを使用してヒトゲノム参照配列のビルドhg38に対するリードの全ゲノムアライメントを実施する。次に、それぞれのサンプル中のmiRNA総数を、mirBASE21データベースにおける成熟配列及び前駆配列に対して定量化する。2)K−SLAMソフトウェアを使用してNCBIマイクロバイオームゲノムデータベースに対する微生物RNAアライメントを実施する。
ロジスティック回帰モデルおいて、実施例4のサンプルに由来する患者データ、miRNA、及びマイクロバイオームデータの比を使用する実施例である。
マイクロバイオームデータ及びmiRNAデータを使用して非線形統計学習法(例えば、ランダムフォレスト)を利用した実施例である。
ロジスティック回帰分類器において、患者データ、miRNA、及び微生物データの補正(z−スコア)比を使用した実施例である。
miRNAの比及びマイクロバイオームデータの比を統計学習モデルに入力した実施例である。
ASDにおけるMiRNA:12の研究によって、発現差異を有する219のmiRNAが同定されており、34のmiRNA(16%)は、複数の研究にまたがってオーバーラップしており、27のmiRNAは、変化の方向が同一であった。
20の自閉症と20の対照との対比、
糞便16S rDNA、
Prevotellaは、自閉症症状と相関したが、食事とは相関しなかった。図26A〜B。
方法
この横断的な観察症例対照研究は、Penn State College of Medicine及びState University of New York Upstate Medical Universityの独立した審査委員会によって承認されたものである。この試験に参加するすべての小児の親からインフォームドコンセントを書面で得た。
この研究には、年齢2〜6歳の小児(n=346)が参加した。発達状態に基づいて参加者を3つの群(ASD(n=180)、TD(n=106)、DD(n=60))に分けた。ASDは、アメリカ精神医学会の診断及び統計マニュアル第5版(DSM−5)に規定される基準を使用して臨床医のコンセンサス診断によって定義した。幼児における自閉症のための修正チェックリスト(改定版)(MCHAT−R)でのASDスクリーニングの結果が陰性であり、医師による標準化された評価での定型発達マイルストーン(例えば、幼児の健康状態調査、親による発達状態の評価)を満たす小児をTD参加者に含めた。定型発達のICD−10診断(例えば、表出性発語遅延、知的能力障害、行動懸念)を有し、臨床医による評価でASDのDSM−5基準を満たさない小児をDD群に含めた。栄養管依存、活性な齲蝕、発熱、上気道感染症、または現在服薬中の経口抗生物質がある小児は、すべての群から除外した。第一度近親者がASDを有する家族歴がある小児、または日常的な小児専門医ケアを必要とする慢性の医学的状態を有する小児は、TD群から除外した。表現型の亜群解析では、注意欠陥多動性障害を有するASD小児(ADHD、n=43)、またはGI障害を有するASD小児(n=39)を、所与の状態を有さないASD小児と比較した。ADHDは、親による調査によって同定し、可能なときはICD−10診断によって確認した。GI障害は、親による調査によって報告される便秘、逆流、慢性腹痛、食物感受性、または再発性の下痢として定義し、カルテ審査によって確認した。
すべての参加者の親に対して小児の医学的調査/人口統計調査及びVineland適応行動尺度(VABS)(第2版)を参加時点で実施した。ASD参加者(n=138)及びDD参加者(n=21)のほとんどに対して自閉症診断観察スケジュール(ADOS)(第2版)を実施するか、または利用可能なときはカルテ審査によって以前の評価スコアを文書化した。ADOSの実施は、訓練された有資格の医療専門家によって実施した。収集した参加者特徴には、以下のものが含まれる:1)人口統計情報(年齢、性別、民族性、体型指数)、2)口腔因子/GI因子(採取時刻、最後の食事の時刻、最後の歯磨きの時刻、プロバイオティクスの使用、GI障害歴、医薬/食物アレルギー、食事制限)、及び3)医療歴(妊娠期間、出産経路、出生時体重、喘息状態、ワクチン接種状況)。こうした因子は、口腔マイクロバイオームのプロファイルと関連する可能性に基づいて選択した。
参加時点でそれぞれの参加者から唾液を採取した。口腔を水ですすいだ後、最後の飲食から少なくとも15分経過した後に、非絶食状態の口の舌下領域及び耳下腺領域から、ORAcollect(登録商標)スワブ(DNA Genotek,Ottawa Canada)を使用して唾液を採取した。スワブを−20Cで保管してから、State University of New York Upstate Molecular Analysis Core Facilityにおいて処理した。標準化されたTrizol手法及びRNeasyミニカラム(Qiagen,Valencia California)を使用して唾液RNAを抽出した。RNAの収量及びクオリティーをAgilent Bioanalyzerで調べてから、ライブラリーを構築し、次世代シークエンシングを用いて定量化した。マルチプレックス化したサンプルを、サンプル当たりの単一末端50塩基リードの数を1000万とする標的深度でNextSeq(登録商標)500機器(Illumina,San Diego,California)で処理した。アダプターのトリミング及びQC解析の後、k−SLAMソフトウェアを使用してRNAリードをヒトマイクロバイオームデータベースにアライメントした。以前に記載したように、微生物遺伝子を網羅的かつ分類学的に分類及び同定するためにkマー法での配列アライメントを使用した。サンプルの少なくとも20%において生リード数が10以上である分類群のみの存在量差異を調べた。個々のRNA転写物を解析に供すことはしなかった。代わりに、本発明者らは、Microbiomanalystソフトウェアを使用して、京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG)微生物データベースを相互参照することによって微生物転写物のコミュニティーによって示される経路及びオントロジーを調べた。このデータベースは、82のKEGGオントロジー(KO)経路セット、11のKEGG代謝セット、及び20のオルソロガス群クラスター(COG)機能セットからなるものである。サンプルの少なくとも10%における存在生リード数が5以上の転写物に限定してマッピングを実施した。分位数正規化を実施した後、Metaboanalystソフトウェアを使用して分類学的データと経路レベルデータとの両方の群間差異を解析することで、観測された存在数のノンパラメトリック群間比較を実施した。こうしたデータセットは、刊行物の受理後にNCBI配列リードアーカイブにて公的に利用可能となる。
ASD群とTD群またはDD群との間の医学的特徴、人口統計特徴、及び神経心理学的特徴の差異をスチューデント両側t検定で評価し、未調整のpが<0.05であることによって有意差を定義した。最大の存在量(存在濃度が最も高い)及び普及率(存在サンプル数が最も多い)を有する分類群を種レベル及び門レベルで報告した。こうした分類学的プロファイルからシャノンアルファ多様性指数及びブレイ・カーティスベータ多様性指数(群等分散性法)を計算し、3つの群の間で比較した。すべての参加者の間の分類群発現差異を多変量部分的最小二乗判別分析(PLS−DA)で視覚化し、射影における変数重要度を、それぞれの分類群について決定した。3つの群の間の個々の分類群差異をノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定で調べた後、マン・ホイットニーU検定での群間事後比較(ASD:TDまたはASD:DD)を実施した。q<0.05とする、多重検定セットのためのFDR調整を行って一元配置分散分析(ANOVA)を使用することで診断群間のKEGG経路転写物の差異を評価した。チューキーの正直有意差(Honestly Significantly Difference)(HSD)検定を使用して、3つすべての群の間での事後検定を実施した。
参加者特徴
ASD群(n=180)は、平均年齢が生後53(±16)ヶ月であり、85%が男子であり、59%がコーカサス人種であった(表1)。TD参加者(n=106)は、平均で10ヶ月若く(43±16ヶ月)、60%が男子であり、63%がコーカサス人種であった。DD群(n=60)は、平均年齢が生後50(±13)ヶ月であり、70%が男子、67%がコーカサス人種であった。ASD対象(午後12:29±2:48)、TD対象(午後12:21±2:43)、及びDD対象(午後12:43±2:43)の間で平均採取時刻に差異は存在しなかった。最後の食事からの経過時間または最後の歯磨きからの経過時間においても群間差異は存在しなかった。TD小児のプロバイオティクス摂取率は0%であったのに対して、ASD小児及びDD小児のプロバイオティクス摂取は3%にすぎなかった。GI障害を有する比率は、TD群(3%)と比較してASD参加者(22%)で高かったが、DD群(20%)との比較では高くなかった。食物または薬剤のアレルギーを有する比率は、TD参加者(9%)及びDD参加者(8%)と比較してASD参加者(21%)で高かったが、これらの参加者が食事制限をしている比率は同様であった。出生時体重に群間差異は存在しなかったが、ASD群の小児の帝王切開率(19%)は、TD参加者(9%)及びDD参加者(8%)と比較して高かった。喘息またはワクチン接種の比率に群間差異は存在しなかった。ASD群の日常生活の社会化ドメインに対する平均VABSスコア(73±13)及び日常生活の活動ドメインに対する平均VABSスコア(75±14)は、TD群及びDD群と比較して低かった。ASD群の平均VABSコミュニケーションスコア(72±18)は、TD参加者(103±15)とは異なっていたが、DD参加者(76±17)とは異なっていなかった。ASD対象の社会的情緒ドメインに対するADOSの総スコア(13±5)ならびに限定的かつ常同的な行動ドメインに対するADOSの総スコア(3±1)は、DD参加者(それぞれ6±4及び2±1)と比較して高かった。
すべてのサンプルの中で、サンプル当たり平均で790,031の分類学的リードが存在した。ASD群(785,766)、TD群(823,480)、及びDD群(738,335)の間で平均リード数に差はなかった。サンプルの≧20%において数が≧10の分類群のみを含むように分類学的リードをフィルタリングした。こうした基準を満たす753の分類群の中で、すべてのサンプルに存在した分類群の数は41であった。
ASD群、TD群、及びDD群の間の差異を、ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定を用いて門レベル及び種レベルで探索した。ASD群、TD群、及びDD群の間に有意差(FDR<0.05)がある分類群は、12存在した(表21)。
門レベル及び分類群レベルでのマイクロバイオーム要素中の変動を一般的なASD 表現型の中で探索した(表23)。
スピアマン順位解析(二値変数)またはピアソン相関解析(連続変数)で、臨床的特徴と個々の門レベルとの間に有意な(R≧0.20、FDR<0.05)関連性は存在しなかった。個々の分類群は、年齢、体型指数、採取時刻、最後の食事からの経過時間、及び最後の歯磨きからの経過時間との関連性を示した(表25)。
ASD状態及びGI表現型を同定する上での個々の分類群の有用性を多変量ロジスティック回帰分析で探索し、受信者動作特性(ROC)曲線解析によって分類精度を視覚化した。それぞれの比較について、それぞれの群の参加者の50%を使用して、予測精度を有する分類群間の比を同定した後、こうした比を、残りの50%のナイーブな「ホールドアウト」サンプルにおいて検証した。8つの分類群を含む5つの比(Mucilaginibacter/Ramlibacter tataouinensis、Sphingomonadales/Planctomycetales、Alphaproteobacteria/Cyanobacteria、Alphaproteobacteria/Limnohabitans、Ramlibacter tataouinensis/Thiobacillus dentrificans)が、訓練セットにおいてASD参加者(66/90)及びTD参加者(38/53)を正しく同定し、0.795のAUC(95%CI:0.711〜0.872)を示した。この分類群パネルは、ホールドアウトセットにおいてもほぼ同一の能力を発揮し(図33A)、ASD小児(73/90)及びTD小児(33/53)を同定した(AUC=0.796)。5つの分類群を含む3つの比(Chamaesiphon minutus/ Lactococcus lactis、Pseudomonadaceae/Lactococcus lactis、Flavobacterium属の1種PK15/Burkholderiales)は、訓練セットにおいてASD小児(64/90)及びDD小児(20/30)を正しく同定し、0.770のAUC(95%CI:0.643〜0.867)を示した。これら3つの比は、ナイーブサンプルのホールドアウトセットにおいても同様の能力を発揮し、ASD小児(82/90)及びDD小児(21/30)を同定した(AUC=0.765)(図33B)。分類群レベルもまた、GI障害を有するASD小児を、GI障害を有さないASD小児と区別する上での有用性を示した。5つの分類群を含む3つの比(Meisseria meningitides M04−240196/Sideroxydans lithotrophicus ES−1、Neurospora crassa OR 74A/Acidipropionibacterium acidiproprionici、Enterobacterales/Neurospora crassa OR 74A)によって、GI障害を有するASD小児(17/19)及びGI障害を有さないASD小児(51/70)が訓練セットにおいて正しく同定された(AUC=0.839、95%CI:0.759〜0.958)。ホールドアウトセットでは、この分類群パネルによって、GI障害を有するASD小児(7/20)及びGI障害を有さない小児(67/71)が同定された(AUC=0.857)(図33C)。
中咽頭において測定した微生物RNA転写物の機能特性をKEGG微生物データベースへのアライメントによって調べた。サンプルの少なくとも10%に5つ以上のアライメントを有するものを含むようにKEGG経路をフィルタリングし、分位数正規化を行った。これによって全部で113のKEGG経路のセットが得られた。113の経路の中で、7つの経路は、ASD群、TD群、及びDD群の間で、見られる頻度が異なっていた(FDR<0.05)(表26)。
本発明者らが知る限り、この研究は、ASD小児におけるマイクロバイオームを最も大きな規模で調査したものであり、中咽頭サンプルを利用したのは、この研究が初めてである。この研究によって、定型発達同等小児と比較しても、発達遅延を有する非自閉症同等小児と比較しても、ASD小児の口腔マイクロトランスクリプトームプロファイルは異なるものであるということが確立された。こうした分類学的パターンは、腸マイクロバイオームの以前の報告といくらかオーバーラップしただけでなく、こうした分類学的パターンによって、中咽頭に特有の新規の変化も同定された。
ASD小児の中咽頭において見られる特有のマイクロトランスクリプトームプロファイルからは、患者のスクリーニング、診断、または分類のための客観的ツールが得られる。本発明者らは、8つの口腔分類群のレベルによってASD小児が定型発達同等小児と区別される可能性があり、5つの分類群の特有のパネルによってほぼ80%の精度でASD対象及びDD対象が分類されることを本明細書に示した。本発明者らは、唾液におけるマイクロRNAのレベルによってASD小児が健康な対照と区別され得ることを実証した。唾液マイクロRNAのいくつかの乱れが、マイクロバイオームとの宿主相互作用によって誘導され得ると考えることは興味深いことである。細胞間シグナル伝達分子としてのマイクロRNAの役割、及び正常な脳発達におけるその重要度を考慮すると、微生物とマイクロRNAとのクロストークは、腸−脳軸が機能する1つの機構であり得る。
ASD群、TD群、及びDD群にわたって口腔マイクロバイオームに影響を与え得る可能性のあるあらゆる変数を制御することは不可能である。この研究では、関連因子が厳密に収集されており(表20)、その結果、完全な透明性を伴って結果を解釈することができる。注目すべき点は、ASD群、TD群、及びDD群の間で異なった唯一の口腔因子/GI因子はGI障害率及び食物/薬剤アレルギー率であり、後者は、いずれの口腔分類群の発現パターンとも関連性しなかったということである。GI障害と関連する1つの口腔分類群(Riemerella anatipestifer Yb2)(表24)は、年齢とも弱い関連性を有し(表25)、ASD対象の中でGI障害を検出する上での有用性を有する第2の口腔分類群(Sideroxydans lithotrophicucus ES1)は、年齢及び採取時刻とも関連していた。したがって、この研究において同定された微生物因子のいくつかは、経時的なGI管の変化によって交絡している可能性がある。発達中の小児の中で口腔マイクロバイオームを時系列的に解析することが、こうした関連性の解明に有用である。
ASD小児ではGIマイクロバイオームが乱れているという証拠が次々と出ている。今回の研究では、この乱れが中咽頭に及ぶことで、微生物コミュニティーの転写活性が影響を受け得ることが示された。そのような変化は、ASD併存疾患(GI障害など)ならびに社会的行動及び常同的行動と関連するものと思われる。この関連性の機構は、微生物代謝の変化に起因するか、または病原性微生物と宿主との関連性を介して生じ得るものである。一方で、口腔の分類学的及び機能的なプロファイリングからは、ASD表現型の客観的マーカーとしての有用性が得られる可能性がある。
参加者.
この多施設横断的前向き症例対照研究には、Penn State College of MedicineまたはSUNY Upstate Medical Universityにおいて小児科健診または発達専門家のケアを受けている年齢2〜6歳の396人の小児が参加した。この2〜6歳の年齢群は、スクリーニング及び診断のバイオマーカーが最も臨床的に有益であると想定される時期である、ASD診断の最少年齢の小児が含まれるという理由で選択した。募集は、学術機関、外来患者、一次ケアクリニック、及び三次ケアクリニックにおいて2015年10月〜2017年8月に実施した。197人のASD小児、128人のTD小児、及び71人のDD小児が唾液RNAシークエンシング及び臨床評価に参加した。それぞれの場所から募集によって集まったASD参加者、TD参加者、及びDD参加者の数はほぼ等しかった。TD対照群及びDD対照群とASD参加者とを比較することで、それぞれスクリーニング及び診断miRNAバイオマーカー候補を同定することが可能であった。ASD状態は、診断及び統計マニュアル(DSM)−5診断によって定義し、直近12ヶ月以内に医師の評価によって確認したものであり、自閉症診断観察スケジュール(ADOS)−II(または他の標準化評価ツール(自閉症スペクトラム障害のためのチェックリスト、自閉症診断面接−改訂版、または小児自閉症評定尺度など))での評価によって裏付けを取った。TD状態は、MCHAT−Rでの自閉症スクリーニングで陰性歴を有することに加えて、直近12ヶ月以内の小児科健診において定型発達が文書化されていることによって定義した。DD状態は、定期訪問時点での標準化スクリーニング(幼児の健康状態調査、MCHAT−R、または親による発達状態評価)によって粗大運動、微細運動、表出的コミュニケーション、受容コミュニケーション、または社会化の臨床的欠如が認められるが、こうした欠如がASDのDSM−5基準は満たさないことによって定義した。標的を絞って募集をかけることによって参加者の年齢及び性別がASD群、DD群、及びTD群にわたって一致するようにした。すべての群の除外基準としたものには、栄養管依存、活性な歯周病、上気道感染症、発熱、交絡性の神経機能障害(すなわち、脳性麻痺、てんかん)または感覚機能障害(すなわち、盲目、聾)、及び行政管理下にある者が含まれる。第一度近親者がASDを有する家族歴があるTD参加者、または日常の投薬または小児専門医ケアを必要とする慢性の医学的状態を有するTD参加者も除外した。
すべての参加者について、年齢、性別、民族性、妊娠期間、出生時体重、周産期合併症、現在の体重、体型指数、中咽頭状態(例えば、アレルギー性鼻炎)、食事制限、投薬、慢性医学的問題、免疫状態、医学的アレルギー、早期介入サービス、手術歴、及び家族の精神疾患歴を含めて、詳細な医学的及び人口統計的な特徴付けを実施した。ASD小児の中での注意欠陥多動性障害(ADHD)(Gargaro et al.,2011)及び胃腸(GI)障害(Molloy et al.,2003)の有病率を考慮し、これら2つのよく見られる医学的併存疾患を同定するための調査質問を含めた。GI障害は、親による報告での便秘、下痢、腹痛、もしくは逆流の存在、ICD−10カルテ審査、または小児の投薬リストにある便柔軟剤/緩下剤の使用によって定義した。ADHDは、親による報告、またはICD−10カルテ審査によって定義した。コミュニケーション、社会化、及び日常生活活動における適応能力を、Vineland適応行動尺度(VABS)−IIを使用してすべての参加者において測定し、標準化スコアを報告した。ASD参加者及びDD参加者(n=164)について可能なときは、自閉症症候学(ADOS−II)の評価を完了させた。社会的情緒(SA)、限定的常同的行動(RRB)、及びADOS−IIの総スコアを記録した。
P−157核酸安定化スワブ(DNA Genotek;Ottawa,ON,Canada)を使用して非絶食状態のすべての小児から唾液を採取した。可能なときは歯を避けるように注意しながら、口腔の舌下領域及び耳下腺領域から5〜10秒間にわたって唾液を採取した(Hypertext Transfer Protocol Secure(https)://www.youtube.com/watch?v=AzCpHWqhRQs&feature=youtu.be)。
この研究の主目的は、以下の2つの臨床有用性を提供し得るmiRNAを同定することとした:1)ASD参加者とDD参加者とを区別(ロジスティック回帰分析)するための診断パネルとしての有用性、ならびに2)ASD参加者とTD参加者とを区別(ロジスティック回帰分析)するためのスクリーニングパネルとしての有用性。ASD/TD群間またはASD/DD群間の医学的特徴及び人口統計特徴の差異をスチューデントの両側t検定を使用して比較した。ノンパラメトリッククラスカル・ワリス検定及び部分的最小二乗判別分析(PLS−DA)を使用することで、ASD/TD群及びASD/DD群を区別するための個々のmiRNA候補を同定した。群間有意差(誤検出率(FDR)<0.05)があり、及び/または絶対回帰係数の、PLS−DAでの重み付けされた総和が≧2.0であるmiRNAをバイオマーカー検証のために選択した。バイオマーカーの探索は、バイオマーカーワークフロー(Xia et al.,2009)を使用してMetaboAnalyst Rパッケージ(McGill University,Montreal,Canada,Hypertext Transfer Protocol(http)://www.metaboanalyst.ca/faces/ModuleView.xhtml)で実施した。
スチューデントの両側t検定を使用することで、ASD群、TD群、及びDD群の間で人口統計特徴、医学的特徴、及び中咽頭特徴を比較した(表26)。ASD参加者の平均年齢(54±15ヶ月)は、TD参加者(47±18ヶ月)と比較して高かったが(p=0.006)、DD参加者(50±13ヶ月、p=0.076)との比較では高くはなかった。ASD群の男子率(161/187、86%)は、TD群(76/126、60%、p=1.0E−6)及びDD群(48/69、70%、p=0.015)と比較して高かった。ASD小児のGI障害率(35/187、19%)は、TD小児(2/125、2%、p=5.4E−7)と比較して高かったが、DD小児(13/69、19%、p=0.92)との比較では高くなかった。ASD群のADHD率(43/187、25%)もまた、TD群(10/125、8%、p=0.0003)と比較すると高かったが、DD群(21/69、30%、p=0.26)との比較では高くなかった。コーカサス人種小児率(274/381、72%)、平均体型指数(18.9±11kg/m2)、喘息率(43/381、11%)もしくはアレルギー性鼻炎率(81/381、21%)、唾液採取時刻(13:00±3時間)、または食事制限率(50/381、13%)は、3群間で有意差(p<0.05)はなかった。
527の成熟miRNAの濃度を、ASD参加者、TD参加者、及びDD参加者の唾液において探索した。これら527のmiRNAの中で、80のmiRNAは、あらゆる参加者の唾液に存在した。すべての参加者にわたって唾液中濃度が最も高いmiRNAは、miR−203a−3pであり、この実験における生リード総数8.44x107のうちの1.14x106(1.4%)を占めた。クラスカル・ワリスノンパラメトリック検定によって、ASD群、TD群、及びDD群の間で有意(FDR<0.05)差を有する14のmiRNAを同定した(図35)。変化が最も大きいmiRNAは、miR−28−3p(χ2=34.2、FDR=1.62E−5)であり、miR−28−3pは、TD小児及びDD小児と比較してASD小児において下方制御されていた。他の4つのmiRNAもまた、TD群と比較してもDD群と比較してもASD群において相対的に下方制御されていた(miR148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706)。TD群と比較してもDD群と比較してもASD群において相対的に上方制御されているmiRNAは4つ存在した(miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5p)。これら14のmiRNAのうちの1つ(miR−151a−3p)のみが、ASD患者のmiRNAに関する以前の研究において「変化」しているとして同定されたものであった(Mundalil et al.,2014)。
100分割交差検証手順を用いてロジスティック回帰分析を行うことで、ASDスクリーニング(ASD小児とTD小児との対比)及び診断(ASD小児とDD小児との対比)において潜在的な有用性を有するバイオマーカーツールセットを構築及び検証した。
唾液miRNAの発現パターンをASD表現型の中で探索した。ASD参加者におけるGI障害の存在は、2つのmiRNA(miR−4700−3p、R=0.37、FDR=6.3E−5;miR−4485−3p、R=−0.27、FDR=0.043)の唾液中レベルと有意に(R>[0.25]、FDR<0.05)相関しており、これらのmiRNAのうちの1つ(miR−4700−3p)は、以前のASD研究において同定されたものであった。ADHDの存在は、唾液miRNA発現と相関しなかった。VABS−II試験の社会化要素での標準化スコアと相関するmiRNAは5つ存在し(miR−152−3p、R=0.30、FDR=0.023;miR−379−5p、R=−0.30、FDR=0.023;miR−4781−3p、R=−0.28、FDR=0.038;miR−26a−5p、R=−0.28、FDR=0.039;miR−221−3p、R=0.28、FDR=0.039)、これらのmiRNAのうちの2つ(miR−379−5p(Mor et al.,2015)及びmiR−221−3p(Wu et al.,2016、Nguyen et al.,2016)は、ASD研究において以前に同定されたものであった。VABS−II試験での日常生活のコミュニケーションスコアまたは日常生活の活動スコアと相関するmiRNAは存在しなかった。ADOS−IIでの社会的情緒とは8つのmiRNAが相関し(miR−223−3p、R=0.34、FDR=0.0082;miR−142−3p、R=0.33、FDR=0.0082;miR−182−5p、R=−0.31、FDR=0.016;miR−142−5p、R=0.31、FDR=0.016;miR−125b−2−3p、R=−0.29、FDR=0.035;miR−181c−5p、R=0.29、FDR=0.036;miR−148b−3p、R=−0.29、FDR=0.036;miR−143−3p、R=0.28、FDR=0.044)、これらのmiRNAのうちの6つは、ASD研究において以前に同定されたものであり(miR−223−3p、miR−142−3p、miR−182−5p、miR−142−5p、miR−148b−3p(17))、上記の8つのmiRNAのうちの1つは、この研究におけるASD/DD分類パネルにおいて利用したものであった(miR−125b−2−3p)。ADOS−IIでの限定的/常同的行動とは10のmiRNAが相関し(miR−136−3p、R=0.52、FDR=1.7E−8;miR−8485、R=0.42、FDR=3.21E−5;miR−106a−5p、R=0.38、FDR=0.0005;miR−3679、R=0.36、FDR=0.0011;miR−573、R=0.33、FDR=0.0049;miR−6733−5p、R=0.30、FDR=0.022;miR−8061、R=0.29、FDR=0.026;miR−130a−3p、R=0.28、FDR=0.040;miR−766−5p、R=0.28、FDR=0.045;miR−431−5p、R=0.028、FDR=0.45)、これらのmiRNAのうちの4つは、以前のASD研究において同定されたものであった(miR−136−3p、miR−106a−5p、miR−130a−3p、及びmiR−431−5p(Hicks et al.,2016))。注目すべきことに、10のmiRNAのすべてが限定的/常同的行動スコアと正の相関を有していた。最終的に、6つのmiRNAが、ADOS−IIでの総スコアと相関し(miR−223−3p、R=0.35、FDR=0.0043;miR−142−3p、R=0.34、FDR=0.0043;miR−142−5p、R=0.31、FDR=0.015、miR−182−5p、R=−0.31、FDR=0.021;miR−151a−3p、R=−0.28、FDR=0.049)、6つのmiRNAのすべてが、以前のASDmiRNA研究において同定されたものであった(Hicks et al.,2016))。これらのmiRNAのうちの1つ(miR−151a−3p)は、TD参加者及びDD参加者と比較してASD小児において下方制御されており、PLS−DAによる群射影において有意な変数重要度を示した。
唾液miRNA発現と臨床的特徴/人口統計特徴との関連性を、ピアソンの相関検定(連続)またはスピアマンの順位相関検定(二値)で評価した。527のmiRNAの発現と、参加者の性別、民族性、体型指数、食事制限、喘息状態、またはアレルギー性鼻炎状態と、の間には有意な関連性(R<[0.25]、FDR<0.05)は存在しなかった。検定した医学的変数/人口統計変数のすべての中で、唾液採取時刻が、関連するmiRNAの数が最も大きかった(n=21)。miR−210−3pレベルと唾液採取時刻との間の関連性が最も強かった(R=−0.35、検定統計量=−6.6、FDR=4.2E−8)。最後の食事からの経過時間と関連するmiRNAは1つ(miR−23b−3p)存在した(R=0.25、検定統計量=4.2、FDR=0.012)。採取時刻または最後の食事からの経過時間と関連するこれら22のmiRNAの中で、12のmiRNAは、以前のmiRNA研究において潜在的なバイオマーカーとして同定されたものであった。これらのmiRNAはいずれも、今回の研究では、ASD小児の唾液では「変化」していなかった。バイオマーカーツールセットの開発における年齢の重要度を考慮すると、参加者年齢が、34のmiRNAと弱く(R<[0.25])、しかし有意に(FDR<0.05)関連したことは注目すべきことである。これらのmiRNAはいずれも、今回のバイオマーカーパネルでは利用してなかったが、これらのmiRNAのうちの15のmiRNAは、以前のASDmiRNA研究において潜在的な標的として同定されたものである(Hicks et al.,2016)。
この実施例では、強い概日リズムを示すmiRNAの一部が既知の概日遺伝子を標的とし、特定の微生物と関連して周期変動するという仮説を立てた。
この研究には11人のヒト対象ボランティアが参加し、3回の異なるサンプル採取において連日のさまざまな時刻に当該ボランティアから唾液サンプルの提供を受けた。スワブを介して唾液を採取し、唾液調製キットを使用して調製した。
採取1:1日目、3日目、及び7日目に採取した午前8時及び午後8時のサンプル。
採取2:1日目、5日目、10日目、及び15日目の午前8時、午後12時、午後4時、及び午後8時のサンプル。
採取3:1日目及び2日目の1日を通じて12回採取(非反復)。
採取1及び採取2のサンプルセットにおいて二元配置分散分析(ANOVA)を実施することで、採取時刻に応じて有意に変動するが、採取日による変動はないmiRNA及び微生物(日変動による影響を日常的に強く受けている可能性がある)を同定した。次に、こうしたmiRNA及び微生物のサブセットを第3のサンプルセットにおいて使用することで、多変量線形回帰を使用する採取時刻の予測精度を評価した。最も強い概日周期変動を示したmiRNAをcircaMiRと命名し、アノテーションされた全部で139の概日遺伝子の予測制御因子であるかについてIngenuity経路解析(IPA)ソフトウェアを使用して調べた。次に、概日遺伝子を標的とするcircaMiRが、最も強い概日変動微生物と関連するという証拠についてピアソン相関解析を使用して調べた。circaMiRが標的とする遺伝子の機能を、その特定の生物学的機能についてIPAソフトウェア及びmiRpathソフトウェアを使用して調べた。
エピジェネティックデータ(例えば、miRNA及び/またはマイクロバイオーム)に関連する統計量(例えば、分散、全分散、または平均分散)の差異、及び/またはエピジェネティックデータの発現レベル(例えば、リード数、蛍光など)の差異を使用することで、健康な対象(小児及び/または成人)と特定の疾患、障害、または状態を患う対象とを区別し得ることが暫定的な結果によって示された。本明細書に記載のシステム及び方法に基づいて区別することが可能な特定の疾患または障害は、限定はされないが、自閉症スペクトラム障害(ASD)、睡眠障害、及び/または外傷性脳損傷であり得る。いくつかの実施形態では、ある特定の対象(例えば、ASD患者)は、正常な健康対象と比較して小さな平均分散を有し得る。他の実施形態では、ある特定の対象は、正常な健康対象と比較して大きな平均分散を有し得る。
48サンプルのデータセット:全部で41のmiRNAは、高度に有意な採取時刻効果(FDR<0.001)を示したが、採取日の効果は示さなかった。
図39に示されるように、19のmiRNAは、両方において共通して変化しており、これら19のmiRNAが第3のデータセットにおいて採取時刻を予測する能力を調べた。
唾液のmiRNAレベル及びマイクロバイオームレベルの一部は、強い概日パターンを示す。この知見は、非常に新規のものであり、これまでに説明されたことがない。唾液のmiRNA及び微生物のいくつかの間には、非常に有意な相関が存在する。ほとんどの唾液circaMiRは、脳、代謝、及びがんの機能に関与する遺伝子に加えて、少なくとも1つまたは複数の概日遺伝子を標的とする。
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Claims (30)
- 自閉症スペクトラム障害(ASD)を有すると疑われる対象、またはASD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有する対象、のエピジェネティックデータ及び/またはマイクロバイオームデータを、1人または複数人の定型発達(TD)対照対象または発達遅延(DD)対照対象、あるいは一群のTD対照対象及び/またはDD対照対象と比較する方法であって、それぞれの健康な対照対象が、ASDを有さないか、またはASDの症状を有さないことが判明しており、前記方法が、
対象から採取された生物学的サンプルにおける1つもしくは複数のマイクロRNA(miRNA)のリード数、及び/またはRNA配列(微生物)によって同定される1つもしくは複数の微生物のリード数を決定すること、
前記対象のエピジェネティックデータ及び/またはマイクロバイオーム遺伝子配列データを正規化してサンプル間の数の変動を考慮することであって、1つまたは複数の不変miRNAを使用して数を正規化することで、データを、その相対存在量に比例させて示す、前記考慮すること、
前記生物学的サンプルが採取された時刻を決定すること、
前記時刻を使用することによって、前記数が正規化されたmiRNAデータ及びマイクロバイオームデータに対して時刻正規化を適用することで、前記対象のmiRNAデータ及びマイクロバイオームデータを時刻に対してさらに正規化すること、ならびに
前記1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物の、前記数及び時刻が正規化された存在量レベルを、1人もしくは複数人のTD対照対象もしくはDD対照対象、または一群のTD対照対象もしくはDD対照対象に由来する1つもしくは複数の対照miRNA及び/または1つもしくは複数の対照微生物の前記数及び時刻が正規化されたレベルと比較すること、
を含み、
前記対象のmiRNA及び/または微生物の前記1つまたは複数の前記レベルを、1人もしくは複数人のTD対照対象もしくはDD対照対象、または一群のTD対照対象もしくはDD対照対象に由来する同一の1つまたは複数のmiRNA及び/または微生物と比較したときの、前記レベルの増加または減少によって、前記対象がASDを有し得るか、またはASD関連症状を示すか、もしくは示す可能性を有することが示される、前記方法。 - 自閉症スペクトラム障害(「ASD」)を検出または診断するための方法であって、前記方法が、
(a)ヒト対象から採取された唾液サンプルにおける1つまたは複数のマイクロRNA(miRNA)の存在量レベルまたは濃度レベル(複数可)を決定すること、及び
(b)前記1つまたは複数のmiRNAの前記決定された存在量レベルまたは濃度レベル(複数可)を、同一の1つまたは複数のmiRNAの正常レベル(複数可)と比較することであって、前記正常(または対照)レベルが、1人の非ASD対象に見られるもの、2人以上の非ASD対象に由来する平均値、またはASDの1つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル(複数可)である、前記比較すること、及び
(c)前記1つまたは複数のmiRNAの異常レベルを有する対象を、ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとして選択すること、
を含み、
前記1つまたは複数のmiRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、hsa−miR−146a−3p、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183、miR−183−3p、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、miR−3074−5p、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、let−7e−5p、miR−620、miR−1277−5p、miR−584−5p、let−7a−5p、mir−944、及びmiR−655からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、前記方法。 - 前記miRNA発現レベルが、RNA発現レベルが実質的に不変の1つもしくは複数のハウスキーピング遺伝子の存在量レベルもしくは平均存在量レベルに正規化され、及び/または前記miRNAレベルが、前記1つもしくは複数のmiRNAレベルの前記存在量の日内変動もしくは概日変動を補正するために正規化されるか、食物摂取もしくは心拍数を上昇させる運動に起因する前記1つもしくは複数のmiRNAレベルの前記存在量の変動を補正するために正規化されるか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景の差異を補正するために調整される、請求項2に記載の方法。
- (a)1つまたは複数のmiRNAの存在量または濃度の決定が、RNAシークエンシング(「RNA−seq」)、qPCR、miRNAアレイ、またはマルチプレックスmiRNAプロファイリングによって決定される、請求項2に記載の方法。(http://www.abcam.com/kits/review−of−mirna−assay−methods−qpcr−arrays−and−sequencing)。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、及びhsa−miR−146a−3pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−5p、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193a−5p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183−5p、miR−183、miR−183−3p、miR−665、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、及びmiR−3074−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−149−5p、miR−125a−5p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、及びlet−7e−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−4705、miR−620、miR−1277−5p、miR−125a、及びmiR−193a−5pからなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−655、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−374c−5p、miR−29c−3p、もしくはmiR−190a−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−5p、miR−92a、mir−1972、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−665、miR−4705、miR−620、及びmiR−1277−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−665、miR−4705、miR−620、miR−1277−5p、let−7a−5p、及びmiR−944からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、let−7a−5p、miR−944、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群から選択され、及び/またはmiR−125a、miR−193a−5p、miR−28−3p、miR−584−5p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、miR−125b−2−3p、及びmiR−7706からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのmiRNAが、miR−374c−5p、miR−29c−3p、及びmiR−190a−5pからなる群から選択され、及び/またはmiR−149−5p、miR−125a−5p、miR−130b−3p、let−7d−3p、miR−598、mir374b−5p、miR−675−3p、mir−500a−3p、miR−374a−5p、及びlet−7e−5p、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、のうちの少なくとも1つである、請求項2に記載の方法。
- 前記唾液サンプルが、特定の時刻に前記ヒト対象から採取され、前記サンプルのmiRNAの前記濃度レベル(複数可)が、同一の時刻にその他は同一の条件の下で採取された唾液における正常なmiRNA値と比較される、請求項2に記載の方法。
- 前記唾液サンプルが、miRNAの前記正常レベル(複数可)が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、請求項2に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記miRNAレベル(複数可)の前記値を調整または正規化して、miRNAレベル(複数可)の日内変動または概日変動を補正することをさらに含む、前記方法。
- 前記唾液サンプルが、miRNAの前記正常レベル(複数可)が決定された時刻とは異なる時刻に前記ヒト対象から採取される、請求項2に記載の方法であって、前記方法が、前記唾液サンプルにおいて決定された前記miRNAレベル(複数可)の前記値を調整または正規化することで、回帰モデルもしくは他の統計解析で使用されるmiRNAレベル(複数可)の日内変動もしくは概日変動を補正するか、または年齢、性別、もしくは遺伝的背景を補正すること、をさらに含む、前記方法。
- 前記唾液サンプルが、覚醒から1時間以内、歯磨きもしくは口の洗浄の前、飲食前、及び/または心拍数を上昇させる運動の前に採取される、請求項2に記載の方法。
- 前記選択が、前記miRNAのうちの4つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びASDの少なくとも1つの症状の可能性を有する前記異常miRNAレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記選択が、前記miRNAのうちの2つ以上の異常レベルを有する対象を選択すること、及びASDの少なくとも1つの症状の可能性を有する前記異常miRNAレベルのピアソン相関係数を任意選択で計算すること、を含む、請求項2に記載の方法。
- Prevotella timonensis、Streptococcus vestibularis、Enterococcus faecalis、Acetomicrobium hydrogeniformans、Streptococcus属の1種HMSC073D05、Rothia dentocariosa、Prevotella marshii、Prevotells属の1種HMSC073D09、Propionibacterium acnes、及びCampylobacterからなる群、または上記微生物に対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、もしくは100%の類似性もしくは同一性を有するゲノムを有する微生物、から選択される1つまたは複数の唾液微生物に由来するRNA(複数可)の存在量レベル(複数可)を前記対象において決定すること、ならびに前記微生物RNAの前記発現レベル(複数可)を、同一の1つまたは複数の微生物RNAの正常レベル(複数可)と比較することであって、前記正常(または対照)発現レベルが、1人の非ASD対象に見られるもの、2人以上の非ASD対象に由来する平均値、または異常な日内リズムもしくは概日リズムと関連する状態、障害、もしくは疾患の1つもしくは複数の症状が現れる前に前記対象において決定された濃度レベル(複数可)である、前記比較すること、ならびに前記1つまたは複数の微生物RNAの異常発現レベルを有する対象を、ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとしてさらに選択すること、をさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 唾液のmiRNAレベルの決定または微生物RNA発現レベル(複数可)の決定が、RNAシークエンシング(RNA−seq)によって実施される、請求項2または請求項24に記載の方法。
- 前記シークエンシングデータ生リード数が、分位数正規化され、平均によって中心化され、それぞれの変数の標準偏差で除算され、データが正規化されることでサンプル間の数の変動が考慮され、及び/または1つまたは複数の不変miRNAの発現に対してデータが正規化されることで相対発現レベル及び/または絶対発現レベルが示され、任意選択で、前記正規化データが統計的にさらに解析される、請求項25に記載の方法。
- miRNAの少なくとも1つの異常レベルを有する対象を、1つもしくは複数のmiRNAの前記少なくとも1つの異常な唾液中レベルを低減し、及び/または1つもしくは複数の異常な微生物RNA発現レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも2つの異なる時点で前記対象から唾液サンプルを採取すること、ならびに前記第2の唾液サンプルまたはその後の唾液サンプルが、正常に近づいたmiRNAレベル(複数可)及び/または微生物RNA発現レベルを有するときに治療レジメンの効力を決定すること、をさらに含む、請求項27に記載の方法。
- ASDを有するか、またはASDを有するリスクがより高いとして選択された対象を、1つもしくは複数のmiRNAまたは1つもしくは複数の微生物RNA発現レベルの少なくとも1つの異常な唾液中レベルを低減するレジメンで治療することをさらに含み、前記レジメンが、外科的治療、薬物治療、miRNAもしくはmiRNAアンタゴニストによる治療、抗微生物治療、食事療法もしくは栄養療法、理学療法、光線療法、心理療法、行動療法、または代替医学療法のうちの1つまたは複数を実施することを含む、請求項2に記載の方法。
- miRNA及び/または微生物RNAを検出するためのmiRNAアッセイキットであって、前記miRNAアッセイキットが、hsa−miR−151a−5p、hsa−miR−183−5p、hsa−miR−4705、hsa−miR−193a−5p、hsa−miR−149−5p、hsa−miR−21−5p、hsa−miR−665、hsa−miR−125a−5p、hsa−miR−502−3p、hsa−miR−25−3p、hsa−miR−221−3p、hsa−miR−30e−5p、hsa−miR−125b−2−3p、hsa−miR−146a−3p、miR−502、miR−502−3p、miR−502−5p、miR−125a、miR−125a−3p、miR−149−5p、miR−149、miR−149−3p、miR−193、miR−193−3p、miR−4705−3p、miR−4705−5p、miR−99b、miR−99b−3p、miR−99b−5p、miR−340−5p、miR−340、miR−340−3p、miR−183、miR−183−3p、miR−665−3p、miR−665−5p、miR3074、miR−3074−3p、miR−3074−5p、miR−28−3p、miR−148a−5p、miR−151a−3p、mIR−125b−5p、miR−130b−3p、miR−92a、let−7d−3p、mir−598、miR−374c−5p、miR−374b−5p、miR−29c−3p、miR−1972、miR−675−3p、miR−7706、miR−500a−3p、miR−374a−5p、miR−190a−5p、let−7e−5p、miR−620、miR−1277−5p、miR−584−5p、let−7a−5p、mir−944、及びmiR−655からなる群、及び/または上記のmiRNAとシード配列を共有するmiRNA、から選択される少なくとも1つのmiRNAに相補的であるか、あるいはその他の様式で前記少なくとも1つのmiRNAの増幅及び/または検出に適した1つ、2つ、または3つ以上のプローブまたはプライマーと、任意選択で、1つまたは複数のサンプル採取ツール、1つまたは複数のサンプル採取容器、前記miRNA及び/または微生物RNAを増幅及び/または検出及び/または定量化するための1つまたは複数の試薬、1つまたは複数の正または負の対照、1つまたは複数の反応基質または反応プラットフォーム、包装材料(複数可)、及び/または使用説明物と、を含む、前記miRNAアッセイキット。
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