TW202033760A - 多因素遺傳疾病的基因檢測法、及檢測套件 - Google Patents

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Abstract

與在疾病中預期存在責任或存在異常的功能有關係的蛋白質的基因的功能多型（功能性SNP）可作為罹患風險或疾病的檢測方法來使用。透過分析功能性SNP，可檢測多因素遺傳疾病的罹患風險，可使用於輔助診斷、預防疾病。提供檢測功能性SNPs的方法、檢測晶片、檢測套件。

Description

多因素遺傳疾病的基因檢測法、及檢測套件
關於使用已知功能的複數個Single Nucleotide Polymorphism（單核苷酸多型，以下記載成SNP）來檢測多因素遺傳疾病的罹患風險的方法、輔助診斷方法、檢測晶片及檢測套件。
某生物集團的基因組的鹽基序列中的一鹽基變異的多樣性稱為SNP。SNP在多數情形下，在基因組DNA中，是存在於基因區域或其調控區域外，不會帶來遺傳性特徵的變化。但，由於存在可成為基因上的標記者，多數會進行分析SNP，比較其頻度的研究。
例如，將與生病的容易性或藥的副作用的有無等有關連的SNP作為標記來使用，進行比較其頻度的研究。公開過在日本，肺癌、乳癌等惡性腫瘤、或心臟衰竭、心肌梗塞等心血管系疾病為首的35種疾病的日本人患者集團中的每個疾病的SNP頻度與日本人的標準SNP頻度情報作比較研究（JSNP資料庫，URL：http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp/index_ja.html）。
提倡過將明顯與這些疾病有關連的SNP，透過連鎖分析或關連分析，作為界定疾病關連基因的標記的應用。在與這些疾病有關連的SNP中，不會帶來基因表現等變化的中性者也很多，但已知存在對於基因表現量、蛋白質的質的變化、non-coding RNA的變化等疾病關連基因的表現或性質產生影響的SNP，稱為功能性SNP（Functional SNP）（非專利文獻1）。
現今，雖然SNP與疾病的關連愈來愈明顯，但作為疾病的診斷、分析罹患風險的標記，實用化的功能性SNP還不存在。此外，在多因素遺傳疾病中，存在複數個認為相關的基因本身，故非常難以透過單一功能性SNP來判斷罹患風險。
多因素遺傳疾病是複數個遺傳性原因，加上環境主因等多種主因重疊而發病的疾病。複數個遺傳性原因加上環境主因與發病相關，故認為難以預測罹患風險。然而，若可預先預測罹患風險，則可透過去除疾病的環境主因等種種方法來抑制發病。其結果，也可減少罹患者數。
作為多因素遺傳疾病，包括糖尿病、高血壓、缺血性心臟病、NASH（非酒精性脂肪肝炎）、關節風濕（Rheumatism）、痛風、惡性腫瘤等種種疾病。又，在精神神經科領域的疾病中，思覺失調症、情感障礙（躁鬱症、重度憂鬱症等）、依賴性疾病、自閉譜系症（Autism Spectrum Disorder）、注意力不足･過動症、阿茲海默症（Alzheimer's Disease）、猝睡症（Narcolepsy）、恐慌症（Panic Disorder）、社交焦慮症、強迫症、廣泛性焦慮症、進食障礙、人格趨勢及障礙等認為是多因素遺傳疾病。針對這些疾病的遺傳性背景，不知道的事項也很多，但認為存在複數個遺傳性原因。若可預先知道這些多因素遺傳疾病的罹患風險，則可透過減少環境主因來減低罹患風險。
此外，若可透過使用SNP的檢測來進行輔助診斷，則認為對於精神神經科領域的疾病非常有用。在精神神經科領域的疾病中，透過問診來進行診斷是基本。精神神經科領域的疾病與消化器官等內臟疾病的情形相異，無法為了檢測而採取患者的腦組織，無法透過組織生檢來進行診斷。單一憂鬱症狀有可能是截然相異的疾病，但多數是透過醫師的問診等來作出疾病的診斷，而期望客觀的檢測方法的確立。
例如，據說，100人有1人罹患思覺失調症，繼焦慮症、憂鬱症，患者數很多，推定在日本有79.5萬人的患者（厚生勞働省，2008年患者調查）。思覺失調症多數是自思春期後半起至青年期發病，在慢性過程中逐漸形成的精神病性障礙。思覺失調症的病象很多樣，呈現相似於情感障礙等症狀的疾病也很多，特別是，在初期症狀中難以鑑別診斷。思覺失調症若自發病起，可在盡早階段，進行正確診斷，加以治療，則是可期待良好的預後的疾病，可望早期的診斷。若除了問診之外，存在客觀地進行輔助診斷的手段，則可早期進行確實的診斷。
又，也報導過，對於容易轉變成思覺失調症的高風險群，透過抗精神病藥或ω-3脂肪酸投藥、認知行為治療法、家族治療法，大幅抑制朝向思覺失調症的轉變（非專利文獻2），而早期界定高風險群在思覺失調症的預防上也有很大的益處。若對於其他多因素遺傳疾病，也可早期界定高風險群，則可進行預防對策的疾病很多，故認為涉及疾病發病的抑制。 [先前技術文獻]
[專利文獻] [專利文獻1] 日本特開2004-135667號公報
[非專利文獻] [非專利文獻1] Albert, P. R., 2011, J. Psychiatry Neurosci. Vol. 36（6）, pp.363-365., doi: 10.1503/jpn.110137 [非專利文獻2] Preti, A. & Cella, M. 2010, Schizophr. Res., Vol.123（1）, pp.30-36. [非專利文獻3] Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium, 2014, Nature, Vol.511, p.421-427. [非專利文獻4] Oishi, K. et al., 2018, PLos One, 13（11）: e0207133. doi: 10.1371/journal.pone.0207133.eCollection 2018. [非專利文獻5] Demjaha, A. et al., 2012, Am. J. Psychiatry, Vol.169（11）, pp.1203-1210. [非專利文獻6] Seeman, P., 2013, Psychiatry Res. Vol.214（3）, pp.175-80. doi: 10.1016/j.pscychresns.2013.09.013. [非專利文獻7] Abi-Dargham, A. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 97, pp.8104-8109. [非專利文獻8] Laruelle, M. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, pp.9235-9240. [非專利文獻9] Demjaha, A. et al., 2012, Am. J. Psychiatry, Vol.169（11）, pp.1203-1210. [非專利文獻10] 美國國立生物工學情報中心 SNP資料庫，「Reference SNP （refSNP） Cluster Report: rs10770141」，（平成30年11月20日檢索）網際網路 >https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=10770141> [非專利文獻11] 美國國立生物工學情報中心 SNP資料庫，「Reference SNP （refSNP） Cluster Report: rs4680」（平成30年11月20日檢索）網際網路 >https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=4680> [非專利文獻12] 美國國立生物工學情報中心 SNP資料庫，｢Reference SNP （refSNP）Cluster Report: rs1799732｣（平成30年11月20日檢索）網際網路>URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1799732> [非專利文獻13] 美國國立生物工學情報中心 SNP資料庫，「Reference SNP （refSNP）Cluster Report: rs1800497｣（平成30年11月20日檢索）網際網路>URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=1800497> [非專利文獻14] 山崎 義光等人，2010年，綜合檢診（Health Evaluation and Promotion），Vol.37, No.2, pp.8-14. [非專利文獻15] 伴 良行，2010年，昭和醫會誌，第70卷，第1號，第52～57頁 [非專利文獻16] 春日 雅人，2007年，日本內科學會雑誌，第96卷，第9號，第36～44頁 [非專利文獻17] 田中 翠等人，2013年，糖尿病，第56卷第3號，第155～164頁 [非專利文獻18] Reilly, M.T. et al., 2017, Neuropharmacology, Vol.122, p.3-21, doi: 10.1016/j.neuropharm.2017.01.017. [非專利文獻19] Kong, X. et al., 2017, Oncotarget, Vol.8 （No.48）, pp.84329-84337.
[發明所欲解決的課題]
以下，關於作為實施例而舉出分析例的思覺失調症，揭示有檢測套件或輔助診斷方法（專利文獻1、非專利文獻3）。專利文獻1是以DNA微陣列來全面調查基因表現層次，與健康者比較，選擇有變化者，作為檢測套件。雖然使用急性患者5名、慢性患者12名、健康者9名的樣本來分析，分析所使用的各群的樣本數很少，基因表現層次因對象者的健康狀態或環境主因等而受到影響的可能性很高，故認為診斷精度很低。非專利文獻3是將透過全基因體關聯分析（Genome-Wide Association Study，GWAS）所獲得的複數個基因多型（Polymorphism）作為多型風險，嘗試使用於思覺失調症或躁鬱症的輔助診斷。然而，任何候選的基因的效果量都非常低，在妥當性上大有問題。任何結果都沒有實用化，而尋求新的檢測方法、檢測套件。關於上述所舉出的多因素遺傳疾病，也提倡過用於檢測罹患風險的種種標記，但任何都沒有達到實用化。
如上所述，不只遺傳性原因，環境因素也對於多因素遺傳疾病的發病構成重要的影響，故在罹患風險很高的情形下，迴避與發病風險的關連很高的環境主因，預防藥的服用等可達成發病的抑止。又，若預先知道疾病的罹患風險很高，則可進行定期的檢測，早期接受適當的治療。然而，尚未開發出預測罹患風險的有效標記。
至今為止，在將SNP作為檢測標記來使用的情形下，針對存在於單一基因的標記，作出考慮。又，只將功能性SNP作為對象，考慮與疾病的關連，分析罹患風險，還沒有這種例子。本發明提供，作為疾病的標記，將對於基因表現，會帶來量的或質的變化的複數個SNP，加以組合並使用的新檢測方法。本發明作為課題的是，提供檢測至今為止難以預測罹患風險的多因素遺傳疾病的罹患風險的方法、檢測晶片、檢測套件。又，作為課題的是，提供在沒有客觀的診斷基準的精神神經科領域的疾病中，輔助診斷的檢測方法、檢測套件。 [為了解決問題的手段]
本發明是關於以下的疾病的檢測方法、檢測套件。 （1）一種檢測方法，是使用已知與多因素遺傳疾病相關的至少2個以上的基因的功能性SNP，來輔助多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷。 （2）如（1）所記載的檢測方法，其中，前述多因素遺傳疾病，作為精神神經科領域的疾病，是思覺失調症、躁鬱症、情感障礙、依賴性疾病、自閉譜系症、注意力不足･過動症、阿茲海默症、猝睡症、恐慌症、社交焦慮症、強迫症、廣泛性焦慮症、進食障礙、人格趨勢及障礙；作為其他領域的疾病，是糖尿病、高血壓、缺血性心臟病、NASH（非酒精性脂肪肝炎）、關節風濕、痛風、惡性腫瘤。 （3）如（1）或（2）所記載的檢測方法，其中，前述多因素遺傳疾病是思覺失調症或躁鬱症。 （4）如（3）所記載的檢測方法，其中，前述SNP是與多巴胺的變動相關的功能多型。 （5）如（4）所記載的檢測方法，其中，與前述多巴胺的變動相關的功能多型是酪氨酸羥化酶（TH）基因、兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）基因、及多巴胺D2受體（DRD2）基因的基因多型。 （6）如（4）或（5）所記載的檢測方法，其中，前述功能性SNP是rs10770141、rs4680、rs1799732、及rs1800497。 （7）一種檢測方法，其中，除了包括（6）所記載的功能性SNP之外，更包括rs2070762、rs6356、rs921451、rs3837091、rs1079597、rs1076560、rs6277、rs1799836、rs1040399、DAT1 Promoter -67A/T、DAT1 40-bp variable number of tandem repeats的至少任何1個。 （8）一種檢測晶片，是用於輔助（1）～（7）任何1個所記載的多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷的檢測，保持成允許檢測出已知與多因素遺傳疾病相關的複數個基因的功能性SNP。 （9）一種檢測套件，用於輔助多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷的檢測，包括用於（1）～（7）任何1個所記載的檢測的引子及檢測所必需的試藥、或（8）的檢測晶片及檢測所必需的試藥。 （10）一種思覺失調症及躁鬱症的檢測方法，是針對功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，分析對象的DNA，具有rs10770141是T（+）、rs4680是Met（-）、rs1800497是A1（+）的至少任何2個的組合的情形，判定成思覺失調症，或罹患風險的可能性很高；具有全部3個的情形，判定成躁鬱症，或罹患風險的可能性很高。 （11）一種檢測方法，是疑似思覺失調症的患者的檢測方法，針對功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，分析對象的DNA，在對象的年齡是30歲以下的情形下，具有rs10770141是T（+）、或rs4680是Met（-）、rs1800497是A1（+）的組合的情形，判定成思覺失調症的可能性很高。 （12）一種輔助方法，是透過分析功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，來決定思覺失調症患者的抗精神病藥的投藥量。 （13）一種輔助方法，是用於決定（12）記載的抗精神病藥的投藥量，是對於rs10770141是T（+）且rs4680是Met（-）的患者，推薦考慮高用量的多巴胺受體阻斷藥的投藥。 （14）一種診斷方法，是診斷精神神經科領域的疾病的方法，檢測已知與多因素基因疾病相關的至少2個以上的基因的功能性SNP，參照功能性SNP的疾病罹患風險來診斷。 （15）如（14）所記載的診斷方法，前述精神神經科領域的疾病是思覺失調症或躁鬱症，前述功能性SNP是與多巴胺的變動相關的功能多型。 （16）一種預防方法，是透過（1）～（7）任何1個所記載的檢測方法，在多因素遺傳疾病判斷出發病風險很高的情形下，透過預防藥的投藥或非藥物療法來抑制發病。 （17）一種治療方法，是透過（1）～（7）的任何1個所記載的檢測方法，鑑別診斷多因素遺傳疾病，投藥治療藥或進行非藥物療法。
過去是採取進行全基因體關聯分析，尋找與疾病有關連的SNP，這樣的方法。相對於此，本發明人等人是假定，在疾病中「預期存在責任（或存在異常）的功能」是因該功能表現所必需的構成蛋白質的基因的功能多型的組合而受到影響，進行功能多型的分析。此方法是透過與疾病有關連的基因的功能多型來分析罹患風險的方法，故產生關連於預期與疾病相關的功能的先天的特徵或異常。因此，可說明其疾病的病理或病狀，可為各個患者選擇適當的預防法或治療法的可能性很高。
在本說明書中，「功能性SNP」是指存在於基因區域或其調控區域的SNP，會帶來基因表現的增減或轉譯出來的蛋白質的質的變化等某些變化者。某疾病中的功能性SNP不只包括與該疾病直接相關的功能性SNP，也包括明顯相關的訊號傳遞系統、酵素級聯（Cascade）等與疾病相關的基因群的功能性SNP。在以下作為例子所示的思覺失調症的情形下，是指存在於與多巴胺合成能力、分解能力、或其受體的多巴胺D2受體（Dopamine D2 Receptor，DRD2）的密度相關的基因區域、其調控區域，對於基因表現量或蛋白質來引起變化的SNP。此外，不只包括多巴胺神經系統，可包括血清素（Serotonin）神經系統、去甲基腎上腺素（Noradrenaline）神經系統等報導過與思覺失調症相關的其他神經傳遞系統有關的蛋白質、或今後發現相關性的蛋白質的功能性SNP。
又，本發明的檢測晶片也可將與欲檢測出的複數個SNP互補的寡核苷酸（Oligonucleotide）直接固定於基板，也可固定於圓珠（Beads）等載體後，保持於基板。自患者的血液等抽出核酸，透過通常方法來進行雜交（Hybridization），檢測出形成2條鏈的核酸即可。或者，也可構造成，透過使用侵入物（Invader）法、即時PCR法等PCR的公知的檢測方法，使作為檢測出對象的複數個SNP可同時檢測出。又，也可構造成，在一個檢測晶片上一併固定可檢測其他疾病的功能性SNP，可同時檢測複數個疾病。凡是可界定功能性SNPs的序列的公知方法，使用什麼方法都沒有關係。又，作為檢測套件，可包括用於檢測出功能性SNPs的引子（Primer）、及用於使用於PCR的試藥、或必需上述檢測晶片的試藥等。
至今為止，本發明人等人針對罹患及作用機制很明確的多巴胺過感受性精神病（Dopamine Supersensitivity Psychosis，DSP），報導過罹患風險（非專利文獻4）。但，認為針對思覺失調症本身的罹患風險，在多巴胺神經傳遞系統之外，也與很多機制相關，而認為不可只進行這些基因的SNP分析。但，本發明人等人的分析結果發現，關於發病機制多元的多因素遺傳疾病，也可透過將認為相關的基因的SNP加以組合並分析來診斷罹患風險。因為隱含著與發病有關的機制也存在於多巴胺神經系統之外的系統，構築可判斷將近半數的集團的罹患風險的系統，認為非常有意義。
以下，本發明是以思覺失調症為中心來說明，但組合「功能性SNP」來使用的分析手法有效於其他疾病，特別是多因素遺傳疾病。特別是，思覺失調症、情感障礙、依賴性疾病、糖尿病、高血壓、高脂血症是在世界上有很多患者的疾病，可望早期診斷或預防。基因的功能多型的組合是先天性的，當然可在發病前預測，也不因病狀･病期而受到影響，可預測疾病的預後、進展。特別是，可在發病前預測罹患風險，以預防的觀點，是非常重要的檢測。又，針對問診是診斷的重要的要素的精神神經疾病，作為為診斷提供客觀的判斷材料的輔助診斷方法，是有用的工具。特別是，對於在發病初期，鑑別診斷有困難的疾病，例如，思覺失調症及躁鬱症等，所謂的功能性SNP的客觀的判斷材料，就診斷來說，非常有益。
據說思覺失調症的異種性很高，但約75%見效於多巴胺D2受體阻斷藥的抗精神病藥。報導過，見效於DRD2阻斷藥的患者的多巴胺合成能力亢進（非專利文獻5）。此外，報導過，思覺失調症患者的DRD2密度可能很低（非專利文獻6）。構成多巴胺神經傳遞系統的蛋白質及其功能性SNP是示意於圖1。
多巴胺是透過酪氨酸羥化酶（Tyrosine Hydroxylase，TH）而放出至合成的突觸（Synapse）間隙。釋放（遊離）至突觸間隙的多巴胺是透過兒茶酚-O-甲基轉移酶（Catecol-O-Methyltransferase，COMT）來分解，或透過多巴胺轉運子（Dopamine Transporter，DAT）來再次攝入細胞內。又，多巴胺是透過多巴胺D2受體（DRD2）來抑制釋放。
思覺失調症隱含著，在中腦邊緣系統多巴胺作動性神經中的神經末梢處，多巴胺放出的亢進及突觸間隙的多巴胺濃度的上昇（非專利文獻7、8）。另一方面，報導稱，透過抗精神病藥來改善陽性症狀的群體的多巴胺合成能力升高，而無法改善的群體的該合成能力等同於健康者（非專利文獻9），而隱含著多巴胺合成能力或突觸間隙的多巴胺濃度與症狀或抗精神病藥的治療反應性有關。
在細胞內，自酪氨酸（Tyrosine）合成的多巴胺是透過這些酵素、受體來調節其作用，而已知與思覺失調症的發病有關連。圖1所示意的蛋白質之中，TH、COMT、DRD2是已知存在功能多型的蛋白質。
不只多巴胺神經傳遞系統，在更多認為與基因相關的思覺失調症中，若多巴胺神經傳達功能也與發病風險相關，則與DSP的發病風險相關的功能性SNP組有可能提高思覺失調症發病風險。思覺失調症是因多巴胺神經功能的反覆過度亢進與消退而形成。這認為是與多巴胺拮抗劑（Antagonist）的反覆投藥所引起的精神病同樣的機制。於是，使用與DSP發病風險相關性很高的基因組，針對思覺失調症發病風險來進行考慮。 [實施例]
使用的SNP是TH基因啟動子區域、COMT基因、DRD2基因的多型（表1）。具體而言，是TH基因啟動子區域的C-824T基因多型、COMT基因的158位的Val置換成Met的多型、DRD2基因的-141C Ins/Del多型、ANKK1基因的Taq1A多型。ANKK1（Ankyrin Repeat and Kinase Domain Containing 1）基因是接近DRD2基因的基因，ANKK1的Taq1A多型是隱含著與DRD2密度的關連性的多型。這些多型在美國國立生物技術情報中心的SNP資料庫中分別是作為rs10770141、rs4680、rs1799732、及rs1800497而登錄的1鹽基多型（非專利文獻10～13）。進行這些3個基因的多型是否與思覺失調症發病風險相關的分析。
[表1]
Figure 02_image001
本實施例是在受到千葉大學醫學部的倫理審查委員會的許可，又，恪遵世界醫師會的赫爾辛基宣言及日本精神神經學會的倫理規約，獲得充分的知情同意，遵守關於隱私的保密義務，對於匿名性的保持作出充分的考量的前提下實施。
思覺失調症患者是選擇符合美國精神醫學會出版的精神障礙的診斷及統計手冊第4版文字修訂版（DSM-4-TR; Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV-Text Revision）的診斷基準者。以思覺失調症患者349人及健康者273人為對象，分析上述功能多型的組合。
將自思覺失調症患者、健康者的血液採取而來的DNA，使用QIAamp DNA Blood Minikit（Qinagen）來抽出，進行分析。分析是透過即時PCR的手法（TaqMan SNP Genotyping Assay（Thermo Fisher Scientific）），針對上述4個SNP，識別各患者及健康者的基因型。亦即，分析TH基因C-824T基因多型（rs10770141，T對偶基因）、及COMT基因Val158Met多型（rs4680，Met對偶基因）、DRD2基因Taq1A多型（rs1800497，A1對偶基因）、及位於其上游附近的ANKK1的-141CIns/Del多型（rs1799732，Del對偶基因）（表2）。
[表2]
Figure 02_image003
在TH基因的C-824T基因多型（rs10770141）中，C置換成T者標示成T（+），在COMT基因Val158Met多型（rs4680）中，置換成Met者標示成Met（+），DRD2基因Taq1A多型（rs1800497）中的A1對偶基因（Allele）具備者標示成A1（+），在-141CIns/Del多型（rs1799732）中認定有欠缺者標示成Del（+）。在各多型中，（-）的標示顯示不具備上述多型。
在TH基因中，具備基因多型T（+）者，酪氨酸羥化酶的活性很高，亦即，多巴胺產能很高。在COMT基因中，具備置換成Val的Met（-）者，多巴胺分解酵素的COMT的活性很高的多巴胺分解很快。具備A1（+）、或Del（+）的基因多型者導致多巴胺D2受體的低度表現。
根據各多型的組合，針對多巴胺的合成、分解、受體表現來作整理（表3）。活動性顯示多巴胺神經傳達性的活動性，自左邊起顯示多巴胺合成的高低、多巴胺分解的高低、受體表現的高低，整理具體的多型的組合、思覺失調症、健康者中的人數、出現頻度、出現頻度比。
[表3]
Figure 02_image005
其結果，在TH是高度表現（T（+））、COMT是高度表現（Met（-））、DRD2是低度表現（A1（+）、或Del（+））的組合的情形下，與其他組合比較，發現思覺失調症的出現頻度非常高。表4顯示，是T（+）、Met（-）、而A1（+）、或Del（+）的情形，與其他組合比較，算出勝算比（Odds Ratio）的結果。在是T（+）、Met（-），而A1（+）、或Del（+）的基因多型的組合的情形下，勝算比是6.5（p>0.029），高比率容易生思覺失調症，獲得這樣的結果。進行Fischer的正確機率檢定的結果，在具有上述基因多型的情形下，在單側檢定中P值是0.00357，在雙側檢定中是0.00296，以Bonferroni的方法來校正後，P值也分別是0.02856、0.02368，顯然容易生思覺失調症，獲得這樣的結果。在上述SNP的組合的情形下，DSP發病風險也很高（非專利文獻4）。然而，DSP發病風險不只在上述SNP的組合下，在其他組合下發病風險也變高，故與思覺失調症發病風險不完全一致。
[表4]
Figure 02_image007
根據功能多型的性質，認為此組合的人具有下述多巴胺神經傳達功能。此組合的功能性SNP的人的TH基因的多巴胺合成能力很高，故透過壓力（Stress）等來大量合成多巴胺。況且，DRD2是低度表現，故難以抑制釋放，大量多巴胺釋放至突觸間隙。但，COMT的多巴胺分解能很高，故有可能具有即刻分解多巴胺的多巴胺傳達功能。此組合的人具有先天多巴胺神經活動急劇增強、消退的多巴胺神經傳達功能，而認為透過壓力的重複性，引起sensitization，表現思覺失調症狀。此也與過去以來的思覺失調症的病狀假說相符，可選擇適當的治療法，同時，涉及預防法的開發的可能性很高。
此組合是分析的思覺失調症患者的4.6%，但如表5所示，認為存在其他也與突觸間隙的多巴胺變動有關係的功能多型，這些也存在顯示同樣的多巴胺變動的功能性SNP的組合。此外，透過將據說與血清素神經傳遞系統、去甲基腎上腺素神經傳遞系統等與思覺失調症有關連的神經傳遞系統有關的功能多型加以組合，可更廣範圍正確預測思覺失調症的罹患風險。
[表5]
Figure 02_image009
思覺失調症患者多數是透過DRD2阻斷藥的抗精神病藥來改善。在對抗精神病藥治療中，認為存在抗精神病藥的最佳DRD2占有率，同時，對於各個抗精神病藥，認為存在最佳用量。但，在實際臨床上，治療用量的個人差異很大。若可透過功能性SNP來變化基因的功能，則認為對於抗精神病藥的效果產生影響。於是，分析功能性SNP與抗精神病藥用量之間的相關性。在思覺失調症的情形下，將處方給予的內服藥的處方量換算成氯丙嗪（Chlorpromazine）的值的氯丙嗪換算量作為基準來使用，而分析氯丙嗪換算量與SNP之間的相關性。
如上述所示，針對千葉大學所收集的思覺失調症患者的樣本，分析單一SNP（Single SNP）或2個SNP的組合（Double SNP）與氯丙嗪換算量（CP等價換算量）之間的關係。詳細分析的結果，發現DRD2的基因多型之中，TaqIA與疾病發病的相關性很高，故多巴胺神經傳遞系統的基因的功能多型之中，針對TaqIA、TH、COMT的3個基因的功能性SNP，進行分析（圖2）。
在各個基因中，在TH的T（+）與COMT的Met（-）中，見到CP等價換算量很高的趨勢。在基因的組合中，TH的T（+）與COMT的Met（-）的組合中，CP等價換算量顯著很高，獲得這樣的結果（p>0.05）。又，在TH的T（+）與TaqIA的A1（-）的組合中，也有CP等價換算量很高的趨勢。
基於這些結果，針對TH、COMT、TaqIA的3個功能性多型，進行各個多型的思覺失調症患者及健康者中的出現頻度的分析（表6）。CP等價換算量有顯著高值的TH的T（+）與COMT的Met（-）的組合顯示勝算比2.59（p>0.05）的明顯高的比例。
[表6]
Figure 02_image011
抗精神病藥的投藥量很少的話，無法發揮抗精神病效果。另一方面，抗精神病藥的過度投藥會引起錐體外症候群或抑鬱、不適感等副作用，服藥持續性（Adherence）減低，而再發，造成不良的長期預後。又，過度投藥會引起DRD2的補償性增加，誘發多巴胺過感受性精神病，發展成治療抗性。用於提供最佳用量給各個人的生物學的指標是必需的，但也可使用功能性SNP的組合，作為用於決定最佳用量的基準。
接著，使用理化學研究所的多數樣本來進行分析。根據日本人集團中的2012名思覺失調症患者（男性1111名，平均年齡47.2±14.1歲，女性901名，平均年齡49.2±14.7歲）、及2170名健康者（男性889名，平均年齡39.2±13.8歲，女性1281名，平均年齡44.6±14.1歲），關於年齡、性別，透過使用「Greedy 5-To-1 Digit-Matching」演算法的趨勢評分匹配（Propensity Score Matching），針對思覺失調症患者、健康者各1272名來進行分析。思覺失調症患者有男性574名，女性698名，平均年齡47.4±13.9歲，平均發病年齡24.9±13.4歲，健康者有男性603名，女性669名，平均年齡46.5±13.9歲。再者，為了檢驗上述先導研究（Pilot Study）的預備的結果，分析所使用的對象排除千葉大學及關連病院所採用的患者。
rs10770141（TH）、rs4680（COMT）、rs1800497（TaqA1）認為與多巴胺的變動的相關性很高，故針對這3個功能性SNPs來進行分析。針對統計分析的方法，準用上述方法。
[表7]
Figure 02_image013
全年齡：思覺失調症（SZ）n=1272，健康者（CNT）n=1272；20-30歲：SZ n=182，CNT n=170，透過Fischer的正確機率檢定（雙側檢定），#p>0.05、*p>0.01、**p>0.001 又，All Double Combination意思是具有2個SNP的組合者，也包括具有全部3個SNP的變異（Met（-）*A1（+）*T（+））者。
首先，全年齡的思覺失調症患者內的遺傳性風險，rs4680（Met（-））是48.1%，rs1800497（A1（+））是61.1%，rs10770141（T（+））是11.5%，具有全部這些風險因素者是2.9%，不具有者是18.1%。相對於此，在健康者中，rs4680（Met（-））是42.7%，rs1800497（A1（+））是47.6%，rs10770141（T（+））是6.8%，具有全部這些風險因素者是2.4%，不具有者是25.3%。將與思覺失調症的相關性搭配年齡、性別而算出的各SNPs的勝算比是如表7所示，rs4680（Met（-））是1.24，rs1800497（A1（+））是1.73，rs10770141（T（+））是1.79，任何皆顯著。
又，rs4680（Met（-））及rs1800497（A1（+））、rs1800497（A1（+））及rs10770141（T（+））的2個遺傳性風險的具備者的勝算比分別是2.01、1.87，認定有顯著差異。又，rs4680（Met（-））及rs10770141（T（+））認定有與思覺失調症相關的趨勢（p=0.068）。具備上述任何2個風險因素者是思覺失調症患者群的35.8%，勝算比2.22，是非常高的值。
此外，思覺失調症發病的好發年齡（30歲以下）分開來分析的話，認定有更顯著的趨勢（表7，20-30歲）。rs4680（Met（-））是53.0%，rs1800497（A1（+））是62.1%，rs10770141（T（+））是13.7%，具有全部這些風險因素者是3.3%。相對於此，在健康者中，rs4680（Met（-））是38.8%，rs1800497（A1（+））是48.8%，rs10770141（T（+））是1.2%，具有全部這些風險因素者是1.2%。算出與思覺失調症的相關性的各SNPs的勝算比是如表7所示，rs4680（Met（-））是1.78，rs1800497（A1（+））是1.72，rs10770141（T（+））是13.38，比起在全年齡中的分析，顯示更高的相關性。
又，在2個風險因素的分析中，在全部組合中也認定有顯著差異，rs4680（Met（-））及rs1800497（A1（+））、rs4680（Met（-））及rs10770141（T（+））、rs1800497（A1（+））及rs10770141（T（+））的勝算比分別是8.97、5.96、6.46。此外，具備上述任何2個風險因素者是思覺失調症患者群的42.9%（健康者群5.9%），勝算比12.00，是非常高的值。
好發年齡的勝算比更高，隱含著遺傳性主因在好發年齡中與思覺失調症發病更相關。在遺傳性風險主因很高的群體中，若可以思覺失調症的好發年齡來進行預防性介入，則可抑制思覺失調症的發病。例如，透過檢測晶片等，預先掌握到遺傳性主因的有無，對於發病風險很高的群體，可進行投藥、認知行為治療法、家族治療法等預防性介入。
已知思覺失調症存在發病的前階段的精神病發病風險狀態（At Risk Mental State，ARMS）、或美國精神醫學會診斷基準DSM-5中在發病前稱為減弱精神病症候群的階段。ARMS不只發展成思覺失調症，也存在發展成躁鬱症的情形，據說發病後，兩疾病的診斷錯誤也很多。也存在ARMS見效於一部分的抗精神病藥或介入家族、ω-3脂肪酸的報導，若可在ARMS的階段，透過檢測SNPs，判斷是發展成思覺失調症風險很高，或是發展成躁鬱症的風險很高，則可進行更適當的對應。
在思覺失調症之外，已知也存在遺傳性主因的躁鬱症、自閉症或ADHD、社交焦慮症、認知症等，若也可透過功能性SNP來檢測，則可早期或在發病前，進行投藥、介入家族等適當的對應。
又，已知精神科領域的疾病自症狀表現至治療開始的期間變長的話，對於抗精神病藥的反應性變少。但，在發病初期，難以診斷，例如，已指出躁鬱症及思覺失調症的鑑別很困難。透過使用功能性SNP的檢測，由於可獲得輔助診斷的情報，可更早選擇適當的治療法。
接著，針對躁鬱症，使用千葉大學的樣本來進行分析的結果，關於躁鬱症，也發現多巴胺神經系統基因多型有關連。對於今後預定的多數例，必須等待檢驗，但在具有rs4680（Met（-））及rs10770141（T（+））的2個風險因素的情形下，勝算比5.86，在具有3個風險因素的情形下，勝算比12.0，與健康者之間，認定有顯著差異（表8）。
[表8]
Figure 02_image015
躁鬱症（BP）n=172，健康者（CNT）n=273，透過Fischer的正確機率檢定（雙側檢定），#p>0.05、*p>0.01、**p>0.001
在思覺失調症中，認定3個風險因素的具備與健康者沒有顯著差異，相對地，在躁鬱症中，發現3個風險因素的具備與疾病相關。基於這些結果，在每個疾病中，多巴胺神經系統的特徵明顯相異。又，在思覺失調症中，COMT的高活性對偶基因與前突觸的DDR2密度的低度表現對偶基因的組合（Met（-）*A1（+））是特徵，在躁鬱症中，COMT的高活性對偶基因與TH的高度表現對偶基因的組合（Met（-）*T（+））是特徵。隱含著執行功能或工作記憶、注意功能因COMT的Met的有無而有所區別，故推估Met（-）是與兩疾病的發病有關的環境因素的應答性相關。此外，也推測可能因TaqIA的A1（+）、TH的T（+）而呈現思覺失調症或躁鬱症。
又，如上所述，存在其他也與多巴胺的變動有關的功能性SNP。此外，存在血清素神經系統、去甲基腎上腺素神經系統等其他也推測與思覺失調症等精神疾病相關的功能性SNPs。若可透過推進這些分析，進行異種性很高的精神科領域的疾病的鑑別，則可更早進行鑑別診斷，選擇適當的治療法。
此處是以思覺失調症、躁鬱症為示例，但例如，作為用於檢定糖尿病的罹患風險的功能性SNP，包括胰島素（Insulin）抗性關連基因脂聯素（Adiponectin）的功能性SNP（G-276T、T94G）、CD14的功能性SNP（T-159C）、香樹脂醇（Amyrin）基因SNP（Ser20Gly）、肝細胞核因子的基因HNF4α（P1-HNF4α、P2-HNF4α）、PPARγ（Pro12Ala）、胰島素受體基因IRS-1（Gly972Arg）、IRS-2（Gly1057Asp）、與肥胖症有關連的基因多型的功能性SNP的β3腎上腺素（Adrenaline）受體的基因多型（Trp64Arg）、β2腎上腺素受體的基因多型（Arg16Gly）、UCP1（Uncoupling Protein 1）的基因多型（A-3826G）、FTO（A/T）等（非專利文獻14～17）。又，對於情感障礙，已知血清素轉運子基因5HTTLTPR（l/s）、血清素5HT1A 受體基因5HTR1（C-1019G,Gly272Asp）、血清素5HT2A 受體基因5HTR2A（T102C,A-1438G）、色胺酸（Tryptophan）合成酵素TPH1、或多巴胺神經傳遞系統的基因多型等，對於依賴性疾病，除了多巴胺神經傳遞系統的基因多型之外，已知鴉片類藥物（Opioid）受體基因OPRM1（A11G）等功能性SNP（非專利文獻18～19），而透過組合這些SNP，同樣可檢測罹患風險。
如以上所示，此處所示的分析方法是，針對多因素遺傳疾病，透過將至今為止報導過的功能性SNP加以組合並分析，可分析疾病的罹患風險的方法，是應用範圍非常廣泛的分析方法。
．多巴胺合成關連酵素 TH:酪氨酸羥化酶 DDC:多巴脫羧酶 ．多巴胺分解酵素 COMT:兒茶酚-O-甲基轉移酶 MAOB:單胺（Monoamine）氧化酶B ．多巴胺釋放抑制 DRD2:多巴胺D2受體 多巴胺再次攝入部位 DAT:多巴胺轉運子 ．多巴胺代謝物 3-MT:3-甲氧酪胺（3-Methoxytyramine） DOPAC:3,4-二羥基苯基乙酸（3,4-Dihydroxyphenylacetic Acid）
[圖1] 多巴胺合成、分解的示意圖。 [圖2] 功能性SNPs與抗精神病藥用量之間的關係圖。
．多巴胺合成關連酵素
TH:酪氨酸羥化酶
DDC:多巴脫羧酶
．多巴胺分解酵素
COMT:兒茶酚-O-甲基轉移酶
MAOB:單胺(Monoamine)氧化酶B
．多巴胺釋放抑制
DRD2:多巴胺D2受體
多巴胺再次攝入部位
DAT:多巴胺轉運子
．多巴胺代謝物
3-MT:3-甲氧酪胺(3-Methoxytyramine)
DOPAC:3,4-二羥基苯基乙酸(3,4-Dihydroxyphenylacetic Acid)

Claims (13)

  1. 一種檢測方法，是使用已知與多因素遺傳疾病相關的至少2個以上的基因的功能性SNP，來輔助多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷。
  2. 如請求項1所記載的檢測方法，其中，前述多因素遺傳疾病，作為精神神經科領域的疾病，是思覺失調症、躁鬱症、情感障礙、依賴性疾病、自閉譜系症、注意力不足･過動症、阿茲海默症、猝睡症、恐慌症、社交焦慮症、強迫症、廣泛性焦慮症、進食障礙、人格趨勢及障礙；作為其他領域的疾病，是糖尿病、高血壓、缺血性心臟病、NASH（非酒精性脂肪肝炎）、關節風濕、痛風、惡性腫瘤。
  3. 如請求項1或2所記載的檢測方法，其中，前述多因素遺傳疾病是思覺失調症或躁鬱症。
  4. 如請求項3所記載的檢測方法，其中，前述SNP是與多巴胺的變動相關的功能多型。
  5. 如請求項4所記載的檢測方法，其中，與多巴胺的變動相關的前述功能多型是酪氨酸羥化酶（TH）基因、兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）基因、及多巴胺D2受體（DRD2）基因的基因多型。
  6. 如請求項4或5所記載的檢測方法，其中，前述功能性SNP是rs10770141、rs4680、rs1799732、及rs1800497。
  7. 一種檢測方法，其中，除了包括請求項6所記載的功能性SNP之外，更包括rs2070762、rs6356、rs921451、rs3837091、rs1079597、rs1076560、rs6277、rs1799836、rs1040399、DAT1 Promoter -67A/T、DAT1 40-bp variable number of tandem repeats的至少任何1個。
  8. 一種檢測晶片，是用於輔助請求項1～7任何1項所記載的多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷的檢測，保持成允許檢測出已知與多因素遺傳疾病相關的複數個基因的功能性SNP。
  9. 一種檢測套件，是用於輔助多因素遺傳疾病的罹患風險或診斷的檢測，包括用於請求項1～7任何1項所記載的檢測的引子及檢測所必需的試藥、或請求項8的檢測晶片及檢測所必需的試藥。
  10. 一種檢測方法，是用於思覺失調症及躁鬱症，是針對功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，分析對象的DNA，具有rs10770141是T（+）、rs4680是Met（-）、rs1800497是A1（+）的至少任何2個的組合的情形，判定成思覺失調症，或罹患風險的可能性很高；具有全部3個的情形，判定成躁鬱症，或罹患風險的可能性很高。
  11. 一種檢測方法，是疑似思覺失調症的患者的檢測方法，是針對功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，分析對象的DNA，在對象的年齡是30歲以下的情形下，具有rs10770141是T（+）、或rs4680是Met（-）、rs1800497是A1（+）的組合的情形，判定成思覺失調症的可能性很高。
  12. 一種輔助方法，是透過分析功能性SNP的rs10770141、rs4680、及rs1800497，來決定思覺失調症患者的抗精神病藥的投藥量。
  13. 一種輔助方法，是用於決定請求項12記載的抗精神病藥的投藥量，是對於rs10770141是T（+）且rs4680是Met（-）的患者，推薦考慮高用量的多巴胺受體阻斷藥的投藥。
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