JP2020511450A - ミトコンドリアの活性酸素種（ｒｏｓ）産生に関連する疾患の治療のためのデスメチルアネトールトリチオン誘導体 - Google Patents

ミトコンドリアの活性酸素種（ｒｏｓ）産生に関連する疾患の治療のためのデスメチルアネトールトリチオン誘導体 Download PDF

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Abstract

本発明は、疾患の開始および／または変化が、ミトコンドリア起源の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生と作用に関連するその疾患の予防および治療のための、デスメチルアネトールトリチオン（ＡＯＸ）およびその誘導体、特に式（Ｉ）の誘導体、に関する。【化１】【選択図】なし

Description

本発明は、ミトコンドリア起源の活性酸素種（ＲＯＳ）の産生と作用が、その開始および／または変化に関連する疾患の予防および治療のための、デスメチルアネトールトリチオン（ＡＯＸ）およびその誘導体、特に、特許請求の範囲中の式（Ｉ）の誘導体に関する。
ミトコンドリアは現在広く認識されている「老化のフリーラジカル説」の中心にあり、従って、心臓血管疾患、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など）、癌および糖尿病ならびに虚血性起源の組織機能障害を含む、ほぼ全ての老化関連疾患の病因に関わっている。この説では、活性酸素種（ＲＯＳ）によって引き起こされる損傷の蓄積がエネルギー供給および最適な細胞の機能にとって不可欠な数多くの細胞の機能、特にミトコンドリアの機能に影響を与えことが示されている。従って、最適な細胞の機能は細胞が自己修復するためのエネルギーを供給するのに非常に重要であるため、ミトコンドリアはＲＯＳの主要な標的であるように思われる。
興味深いことに、ミトコンドリアは活性酸素種（ＲＯＳ）の主要源であり、そのため、特にミトコンドリアは、酸化的損傷を与える標的にされる。その結果、ミトコンドリアの自己産生ＲＯＳは、ミトコンドリアの機能障害や細胞死をもたらす酸化的損傷を引き起こす。
ＲＯＳの生理学的および病理学的役割に関して種々の抗酸化剤が試験されてきた。抗酸化剤研究により、生理学的（細胞のシグナル伝達）または病理学的に異なる起源のＲＯＳに対して様々な選択性でＲＯＳを調節する数多くの天然および設計された分子が提供されてきた。しかし、ＲＯＳは数多くの疾患に関連し、抗酸化剤が多くの前臨床的実験において有望であることを示しているが、抗酸化剤系治療薬によるほぼ全ての臨床試験は有効性の限界を示している（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−５９）。
さらに、いくつかの最近の研究から細胞におけるＲＯＳの過剰な減少は有害であることも実証されており、細胞の機能のためにはＲＯＳ産生の適切なバランスが必要であるように思われる（Ｇｏｏｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００４．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９６（２３）：１７４３−５０；Ｂｊｅｌａｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２００７．ＪＡＭＡ．２９７（８）：８４２−５７）。そのため、細胞質ゾルのＲＯＳ産生による細胞のシグナル伝達に影響を与えないミトコンドリアによるＲＯＳ産生の選択的阻害に対する関心が高まっている。
ミトコンドリアの酸化的損傷は広範囲のヒトの疾患の一因となるため、インビボでミトコンドリアによって蓄積されるように設計された抗酸化剤が開発されてきた。これらのミトコンドリア標的化抗酸化剤のうち最も広範囲に研究されてきたものはＭｉｔｏＱであり、これは親油性トリフェニルホスホニウムカチオンに共有結合した抗酸化キノン部分を含んでいる。ＭｉｔｏＱは現在、ラットおよびマウスならびに２つの第２相ヒト臨床試験における一連のインビボ研究で使用されている。高ＲＯＳ産生の条件は現在ではさらによく特性が明らかにされている。ＲＯＳはミトコンドリアにおける呼吸鎖の複数の部位において産生され得るように思われる（Ｑｕｉｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．１：３０４−１２）。最大のスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生は電子輸送体（主にキノン）の大きな減少および高値のミトコンドリアの膜電位という条件下で生じる。逆説的には、これらの条件はミトコンドリアの酸化的リン酸化が低い場合（低い筋肉収縮）または低酸素条件（低酸素状態）で満たされる。
出願人は、ＡＯＸ（デスメチルアネトールトリチオン）が古典的な非特異的抗酸化剤分子として機能するのではなく、より興味深いことに、大部分がミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの部位ＩＱ、すなわち主要なミトコンドリアＲＯＳ産生部位およびミトコンドリア機能障害に主に関与する部位において、酸素ラジカル（ＲＯＳ）産生の直接的な選択的阻害剤として機能することを本明細書において実証する。
したがって、本発明は、遊離酸素ラジカル関連疾患を治療および／または予防するためのＡＯＸおよびそのバイオアイソスター誘導体に関する。
本発明は、遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防における活性酸素種（ＲＯＳ）産生阻害剤として使用するための、式（Ｉ）：
Figure 2020511450
 の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物に関し、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義される通りである。
一実施形態では、本発明の使用のための化合物は、５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オン；５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オンオキシム；５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン；４−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；５−（ベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；およびメチル５−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２−ジチオール−５−イル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート、から選択される。
一実施形態では、本発明の使用のための化合物は、５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（ＡＯＸ）である。
一実施形態では、本発明の使用のための化合物は、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＡおよびＢは、下記で定義される通りである。
一実施形態では、本発明の化合物は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を阻害する。一実施形態では、本発明の化合物は、ミトコンドリアの複合体Ｉの部位ＩＱで、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を阻害する。
一実施形態では、遊離酸素ラジカル関連疾患は、心臓血管疾患、老化疾患、自己免疫疾患、早老症候群、パーキンソン症候群、神経疾患、虚血再灌流障害、感染性疾患、筋肉疾患、肺、腎臓および肝臓の疾患を含む群から選択される。
一実施形態では、心臓血管疾患は、心筋梗塞、心毒性（アントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および抗ウイルス薬の心毒性、好ましくは、アントラサイクリンの心毒性を含む）、肺動脈高血圧症、心不全、心肺疾患、虚血、心臓発作、脳卒中、血栓症および塞栓症を含む群から選択される。
一実施形態では、本発明の化合物は、転移を予防するためのものである。
本発明は、式（Ｉ’）：
Figure 2020511450
 の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物に関し、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ２’、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義される通りである。
一実施形態では、本発明の化合物は、下記で定義の式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物である。
一実施形態では、本発明の化合物は、下記で定義の式（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩＩａ−１）または（ＩＩＩａ−２）、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩または溶媒和物である。
一実施形態では、本発明の化合物は、下記で定義の式（ＩＩａ−１ａ）、（ＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩａ−２ａ）、（ＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩａ−２ｄ）、（ＩＩａ−２ｅ）、（ＩＩＩａ−１ａ）、（ＩＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩＩａ−２ａ）、（ＩＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩＩａ−２ｄ）または（ＩＩＩａ−２ｅ）、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物である。
一実施形態では、本発明の化合物は、下記で定義の式（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｂ−３）、（ＩＩｂ−４）、（ＩＩｂ−５）、（ＩＩＩｂ−１）、（ＩＩＩｂ−２）、（ＩＩＩｂ−３）、（ＩＩＩｂ−４）または（ＩＩＩｂ−５）、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物である。
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物、および少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を含む薬物に関する。
本発明はまた、下記で定義の式（ＩＩａ−１）の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物の製造方法に関し、該方法は、
ａ）シロキサンの存在下で硫黄系試薬を用いて式（Ｃ）
Figure 2020511450
 の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義の通り）を環化し、
式（ＩＩａ−１’）
Figure 2020511450
 の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義の通り）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得るステップを含むこと、
および必要に応じて：
ｂ１）式（ＩＩａ−１’）の化合物を酸化剤（好ましくは、酸化剤は、酢酸水銀Ｈｇ（ＯＡｃ）２である）と反応させて、式（ＩＩａ−１’’）
Figure 2020511450
 の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義の通り）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得ることができること、
または
ｂ２）式（ＩＩａ−１’）の化合物を、塩基（好ましくは、塩基は酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）である）の存在下、ヒドロキシルアミンＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌと反応させて、式（ＩＩａ−１’’’）
Figure 2020511450
 の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、下記で定義の通り）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得ることができること、
を特徴とする。
図１は、ミトコンドリア呼吸に対するＡＯＬ（５−（４−メトキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン）の効果がないことを示す。パネルＡ：ＡＯＬ（この実施例では２０μＭ）の存在下でのインキュベーションの後に、ラットの心臓から単離したミトコンドリアは基質としてのグルタミン酸＋リンゴ酸（ＧＭ）を酸化させていた。リン酸化はアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）によって引き起こされ、アデニントランスロケーターの特異的阻害剤であるアトラクチロシド（ＡＴＲ）によって停止された。パネルＢ〜Ｄ：各種呼吸基質の存在下でのミトコンドリアの酸化的リン酸化の古典的な試験を漸増濃度のＡＯＬ（５〜８０μＭ）の存在下で行った。ＡＯＬの添加後の異なるエネルギー状態でのミトコンドリアの呼吸において統計学的差異は認められなかった。ＡＤＰ添加後の酸化率は、単離したミトコンドリアのアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の合成活性を反映している。 図２は、最大のミトコンドリアＲＯＳ産生を得るためにＡＴＲの存在下（状態４）および複合体ＩおよびＩＩＩの両基質の存在下での単離したミトコンドリアによる酸素ラジカル産生の主要部位を示す。既に述べたように、ミトコンドリアＲＯＳ産生はミトコンドリアの活性および条件に大きく依存している。ＡＯＬを数多くの条件下で試験したが、明確性のために、我々は、最も例証的な結果のみを本明細書で提示することを選択した。鎖全体に電子を付与する全ての基質（すなわち、グルタミン酸＋リンゴ酸＋コハク酸）の存在は細胞におけるインサイツ条件に最も近い。これらの基質条件下で、我々は、ＡＴＲ（リン酸化の阻害：最大の産生）下で完全な鎖によるＲＯＳ産生、および複合体Ｉ（ロテノンによる阻害）および複合体ＩＩ（アンチマイシンＡによる阻害）によるＲＯＳ産生に対するＡＯＬの存在の効果を評価した。色は図３を基準にする。 同上。 図３は、ＡＴＲの存在下（状態４）および複合体ＩおよびＩＩの基質の存在下での単離したミトコンドリアによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＬ（５〜８０μＭ）の効果、ロテノン、アンチマイシンＡおよびミキソチアゾールの効果を示す。これらの複合体の特異的阻害剤の非存在下ではＲＯＳ産生は最大であり、主に部位ＩＱにおける逆電子伝達により生じる（図４を参照）。ＩＱを阻害して電子伝達を特異的に逆にするロテノンの添加後に産生は減少し、部位ＩＩＩＱＯにおいてほぼ全部の産生が起こる。その後に酸素への電子の伝達を遮断するアンチマイシンＡを添加することにより部位ＩＩＩＱＯにおけるＲＯＳ産生が増加し、最後にミキソチアゾールが部位ＩＩＩＱＯにおけるＲＯＳ産生を遮断する（詳細については図２を参照）。 図４は、ミトコンドリアＲＯＳ産生に対するＡＯＬの作用部位およびＡＯＬが作用しないか僅かにしか作用しない部位を示すスキームである。 図５は、雄のＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスから単離した膵島におけるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）に対する１０μＭおよび２０μＭのＡＯＬの効果を示すヒストグラムである。３種類の実験の組み合わせが示されている。各実験のために２匹のマウスからの膵島、ウェルごとに５つの膵島、条件ごとに４〜６つのウェル。インスリン分泌のデータを１１ｍＭのＧｌｃ−Ｖｅｈ群（これを１００％とみなした）に対して正規化した。３ｍＭのＧｌｃ−Ｖｅｈに対して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１、１１ｍＭのＧｌｃ−Ｖｅｈに対して＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１および＃＃＃ｐ＜０．００１、一元配置分散分析およびボンフェローニ事後検定。 図６は、治療から３週間後に測定した体脂肪量を示すヒストグラムである。体脂肪量はグラム（ｇ）で表されている。データは平均±ＳＥＭとして表されている。 図７は、治療から３週間後に測定した除脂肪量を示すヒストグラムである。除脂肪量はグラム（ｇ）で表されている。データは平均±ＳＥＭとして表されている。 図８は、インスリン負荷試験（ＩＴＴ）中のグルコース反応に対するＡＯＬ（５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）による長期治療の効果を示すグラフである。このグラフはＩＴＴ中の血糖値の変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして表されている。 図９は、血糖値に対するＡＯＬの効果を示すヒストグラムである。５週間の治療後に、２時間絶食させたマウスにおいて血糖を測定した。データは平均±ＳＥＭとして表されている。 図１０は、ＭＰＴＰで治療したマウスのＳＮにおけるＴＨ陽性細胞数に対するＡＯＬ（１１日間にわたって５ｍｇ／ｋｇを１日２回）の神経保護効果を示すヒストグラムである。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝１０〜１１）として表されており、反復測定一元配置分散分析、次いでダネットの多重比較検定を用いて分析した。ＭＰＴＰ＋ビークルに対して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。 図１１は、虚血後の再灌流段階中の心収縮性の回復に対するＡＯＬの効果を示すグラフである。データは６回の独立した実験について対照群（黒色）およびＡＯＬ治療群（灰色）の平均±ＳＥＭとして表されている。 図１２は、虚血性心臓の切片の梗塞サイズに対するＡＯＬの効果を示すグラフである。再灌流期間の終わりに心臓を塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。生きている組織は赤色に見えるが、損傷した組織は白色に見える。 図１３は、肺動脈圧および心臓リモデリングに対するＡＯＬ治療の効果を示す２つのグラフのセットである。パネルＡ：正常酸素圧ラット（Ｎ、白色のバー）、慢性低酸素ラット（ＣＨ、薄い灰色のバー）およびモノクロタリンで治療したラット（ＭＣＴ、濃い灰色のバー）において測定した平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）に対するＡＯＬの効果（斜線のバー）。パネルＢ：フルトン指数（すなわち、右心室重量（ＲＶ）：左心室＋隔壁重量（ＬＶ＋Ｓ）の比）として表される右心室肥大。ｎはラット数である。＊、＊＊および＊＊＊はそれぞれＮに対してＰ＜０．０５、０．０１および０．０００１の有意差を示す。＃＃＃はＣＨに対してＰ＜０．０５の有意差を示す。†お よび††はそれぞれＮ＋ＡＯＬに対してＰ＜０．０５および０．０１の有意差を示す。‡はＭＣＴに対してＰ＜０．０５の有意差を示す。 図１４は、肺動脈（ＰＡ）リモデリングに対するＡＯＬの効果を示すグラフのセットである。正常酸素圧ラット（Ｎ、白色のバー）、慢性低酸素ラット（ＣＨ、薄い灰色のバー）およびモノクロタリンで治療したラット（ＭＣＴ、濃い灰色のバー）におけるＰＡ中膜厚の割合を測定してＰＡリモデリングに対するＡＯＬの効果（斜線のバー）を評価した。ＰＡリモデリングを推定するために観察した腺房内動脈を異なる断面直径を有する３つの群に分けた（パネルＡ：５０μｍ未満、パネルＢ：５０〜１００μｍ、パネルＣ：１００〜１５０μｍ）。ｎは血管数である。＊、＊＊および＊＊＊はそれぞれＮに対してＰ＜０．０５、０．０１および０．０００１の有意差を示す。＃＃および＃＃＃はＣＨに対してＰ＜０．０１および０．０００１の有意差を示す。Ｎ＋ＡＯＬに対してＰ＜０．０５および０．０１の有意差。‡はＭＣＴに対してＰ＜０．０５の有意差を示す。 図１５は、進行性の光誘発性網膜変性における網膜の外顆粒層（ＯＮＬ）厚に対するＡＯＬの効果を示すグラフのセットである。パネルＡ：「移動させない」動物に対するビークルおよびＡＯＬの効果。動物を周期的な低強度照明下で飼育し、ビークルまたはＡＯＬの注射を７日間にわたって１日３回行った。治療の終了から１５日後に網膜の組織学的分析を行った。データは未治療の動物（薄い灰色、四角形のドット）、ビークルで治療した動物（濃い灰色、三角形のドット）およびＡＯＬで治療した動物（黒色、丸いドット）の、視神経乳頭の上極および下極における視神経から０．３９ｍｍごとのＯＮＬ厚の平均±ＳＥＭ（単位：μｍ）として表されている。パネルＢ：「移動させた」動物に対するビークルおよびＡＯＬの効果。動物を周期的な低強度照明下で飼育し、周期的な高強度照明下に７日間移動させ、その間に動物にビークルまたはＡＯＬの注射を１日３回実施した。治療の終了時に、動物を周期的な低強度照明条件下に戻し、１５日後に網膜の組織学的分析を行った。データは未治療の動物（薄い灰色、四角形のドット）、ビークルで治療した動物（濃い灰色、三角形のドット）およびＡＯＬで治療した動物（黒色、丸いドット）の、視神経乳頭の上極および下極における視神経から０．３９ｍｍごとのＯＮＬ厚の平均±ＳＥＭ（単位：μｍ）として表されている。 図１６は、４つのマウス群（ＷＴ−ＫＯＬ：ビークルで治療した野生型マウス、ＷＴ−ＡＯＬ：ＡＯＬで治療した野生型マウス、ＫＯ−ＫＯＬ：ビークルで治療したＳＯＤ２−ＫＯマウス、ＫＯ−ＡＯＬ：ＡＯＬで治療したＳＯＤ２−ＫＯマウス）に対するＳＯＤ２−ＫＯ寿命実験を示すグラフのセットである。データは平均値として表されている。パネルＡ：日数による経時的なマウスの体重の変化（単位：グラム）。パネルＢ：日数による経時的な体重増加の割合としてのベースライン補正したマウスの体重。パネルＣ：日数による経時的な割合でのＫＯ−ＫＯＬおよびＫＯ−ＡＯＬ群間の生存割合。 図１７は、５つの群のマウス（ＷＴ−ＫＯＬ：ビークルで治療した野生型マウス、ＷＴ−ＡＯＬ：ＡＯＬで治療した野生型マウス、ＫＯ−ＫＯＬ：ビークルで治療したＳＯＤ２−ＫＯマウス、ＫＯ−ＡＯＬ：ＡＯＬで治療したＳＯＤ２−ＫＯマウス、ＷＴ：未治療の野生型マウス）間での心臓におけるコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性を示すグラフである。心臓部から試料採取したＳＤＨ反応物の光学濃度を画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｔ ＭＫＩＩ（Ａｋｏｓ）を用いて測定した。この密度を平均灰色レベルの形態で表した（ここでは、平均灰色レベル＝灰色の合計／測定画素数である）。データは測定した光学濃度の平均値として表されている。 図１８は、ＡＯＬで治療したか、または未治療のＷＴおよびＳＯＤ２−ＫＯマウスからの肝臓切片のオイルレッドＯ染色を示すグラフのセットである。ヒストグラムは、脂質滴の平均サイズ（パネルＡ）、滴密度（滴数／肝臓面積）（パネルＢ）および総脂質面積（平均サイズｘ滴数）（パネルＣ）を表す。 図１９は、ミトコンドリアの酸化に対するＡＯＸの効果を示す。ＡＯＸの存在中で、種々の酸化的リン酸化条件下において、ミトコンドリア呼吸を示す典型的な実験を図１９Ａに示す。酸化的リン酸化アッセイの前に、５分間のインキュベーションのためにＡＯＸがミトコンドリアに添加された。酸素消費（濃い灰色の線）は、基質添加後に開始され（ＧＭ：グルタミン酸−リンゴ酸）、およびＡＤＰ（リン酸化状態）により活性化される。リン酸化は、ＡＴＲ（アトラクチロシド）により停止され、低残留呼吸は、ミトコンドリアの内膜の完全性を反映している。図１９Ｂは、ＤＭＳＯ中の漸増濃度のＡＯＸの存在下で、上記の異なる呼吸段階（Ｓｕｃｃ／ＲＯＴ：ＧＭ基質、コハク酸およびロテノン）中のミトコンドリアの酸化速度の変化を示す。 図２０は、ミトコンドリアのＡＴＰリン酸化に対するＡＯＸの効果を示す。リン酸化速度は、Ｇｏｕｓｐｉｌｌｏｕらの（２０１４．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．１３（１）：３９−４８）により以前に記載のように、酸化速度と同時に測定され、漸増濃度のＡＯＸの効果が報告された。結果は、対照に対する、ｐＨ単位／秒の変化の相対パーセンテージとして表される。 図２１は、ＡＴＲの存在下における、複合体ＩおよびＩＩＩ（グルタミン酸、リンゴ酸およびコハク酸）両方の基質の存在下、従って、大部分が複合体Ｉにより産生される条件下で、単離されたミトコンドリアによる酸素ラジカル産生に対する漸増ＡＯＸ濃度の効果を示す。ミトコンドリアにより産生されたＲＯＳの測定は、蛍光レゾルフィンを生ずるアンプレックスレッドの酸化によりＨ２Ｏ２の出現を測定する、古典的なペルオキシダーゼ−アンプレックスレッド系を用いることにより実施した（図２２Ｂ参照）。 図２２は、インビトロアッセイにおいて、ＡＯＬおよびオルチプラズに比べて、非ミトコンドリアＲＯＳに対し、ＡＯＸの効果がないことを示す。非ミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２は、還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下、商業的に入手できるＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを使用して得て、再度、古典的なペルオキシダーゼ−アンプレックスレッド系を用いて測定した（図２２Ｂ）。増大した濃度の種々の試験分子の効果は、図２２Ａに示す。水平の直線は、試験した全濃度にわたるＡＯＬ（９９．２％）およびＡＯＸ（１０９．９％）のＲＯＳ産生の平均パーセンテージを表す。 図２３は、癌腫細胞株Ａ５４９およびＨ４６０の生存率に対するＡＯＸの効果を示し、対照（０μＭ ＡＯＸ）に対する％で表した。細胞を漸増投与量、０〜５００μＭ ＡＯＸと共にインキュベートし、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイにより細胞傷害性を評価した（図２３Ａ）。結果はまた、ＡＯＸ濃度のｌｏｇとして表した（図２３Ｂ）。 図２４は、オキシグラフによる手法により評価して、Ｈ４６０細胞の呼吸に対するＡＯＸおよびＡＯＬの効果がないことを示す。 図２５は、トランスウェル試験を用いて、癌腫細胞の転移活性に対し、ＡＯＸの効果のないことを示す。手短に説明すると、Ｈ４６０癌腫細胞を細胞透過性膜の上層上に置き、一定のインキュベーション期間の後、膜を通って移動した細胞を染色し、計数した。図２５Ａは、種々の条件（対照、５μＭ ＡＯＸ、１０μＭ ＡＯＸおよび１０μＭ ＮＡＣ［Ｎ−アセチルシステイン］）に対する下部コンパートメント中の染色した細胞の写真を示す。図２５Ｂは、図２５Ａの結果を示すヒストグラムである。 図２６は、種々の濃度のＡＯＬ（図２６Ａ）またはＡＯＸ（図２６Ｂ）の存在下、セロトニン（５ＨＴ）またはエンドセリン（ＥＴ−１）により誘導された肺内動脈の収縮を示す。二元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。 同上。 図２７は、ＡＯＬの存在下または非存在下、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、０．２％ＦＣＳおよび０．２％ＦＣＳ＋１００μＭセロトニン（５ＨＴ）中でインキュベーション後の肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）の増殖を示す。 図２８は、コハク酸（呼吸複合体２のエネルギー基質）および呼吸鎖の既知の阻害剤、すなわち、部位ＩＱに対しては１０ｍＭのコハク酸単独、部位ＩＩＩＱｏｕｔｅｒに対しては、１０ｍＭコハク酸、４μＭロテノンおよび２．５μＭアンチマイシンＡの組み合わせを用いて個別に標的化した場合に、単離ミトコンドリアの部位ＩＱおよびＩＩＩＱＯによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＬ、ＡＯＸおよびオルチプラズ（０〜８０μＭ）の効果を示す。図２８Ａは、部位ＩＱに対する３つの分子の効果、および図２８Ｂは、部位ＩＩＩＱＯに対する分子の効果を示す。 図２９は、コハク酸（呼吸複合体２のエネルギー基質）および呼吸鎖の既知の阻害剤、すなわち、部位ＩＱに対しては１０ｍＭのコハク酸単独、部位ＩＩＩＱｏｕｔｅｒに対しては、１０ｍＭコハク酸、４μＭロテノンおよび２．５μＭアンチマイシンＡの組み合わせを用いて個別に標的化した場合に、単離ミトコンドリアの部位ＩＱおよびＩＩＩＱＯによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＸ類似体（Ｃｐ１；Ｃｐ２；Ｃｐ３；Ｃｐ４；Ｃｐ５；Ｃｐ６ａ；Ｃｐ８；Ｃｐ９ａ）（０〜２５μＭ）の効果を示す。図２９Ａは、部位ＩＱに対する（上段パネル）Ｃｐ１、Ｃｐ２、Ｃｐ３、Ｃｐ４、（下段パネル）Ｃｐ５、Ｃｐ６ａ、Ｃｐ８およびＣｐ９ａの効果、および図２９Ｂは、部位ＩＩＩＱＯに対するＣｐ５、Ｃｐ６ａおよびＣｐ９ａの効果を示す。 同上。
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
数値の前の用語の「約」は前記数値の値の±１０％を意味する。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アルコキシ」は、基−Ｏ−アルキルを意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アルキル」は、式ＣｎＨ２ｎ＋１のヒドロカルビルラジカルを意味し、ｎは、１以上の数である。通常、本発明のアルキル基は、１〜８個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子、より好ましくは１〜３個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖または分岐鎖アルキル基であってよい。好適なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびオクチルが挙げられる。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アルキルアミノ」は、基−ＮＨ−アルキルを意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アルキルオキシカルボニル」は、基−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−アルキルを意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。好ましいアルキルオキシカルボニル基は、メチルオキシカルボニルである。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アルキルスルホニル」は、基−ＳＯ２−アルキルを意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
本明細書で使用される場合、用語の「アミノ」は、基−ＮＨ２を意味する。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アミノアルキル」は、基−アルキル−ＮＨ２を意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アミノスルホニル」は、基−ＳＯ２−ＮＨ２を意味する。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「アリール」は、単一環（すなわち、フェニル）または一緒に縮合した複数の芳香環（例えば、ナフチル）を有し、通常、５〜１２個の原子、好ましくは６〜１０個の原子を含む、多価不飽和芳香族ヒドロカルビル基を意味する。アリールの非限定的例には、フェニル、ナフタレニルが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語の「バイオアイソスター」は、ほぼ等しい分子形状および体積、ほぼ同じ電子分布を有し、類似の物理学的性質および類似の生物活性を示す、化合物または基を意味する。
本明細書で使用される場合、用語の「カルボキシ」は、基−ＣＯＯＨを意味する。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「カルボキシアルキル」は、基−アルキル−ＣＯＯＨを意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
用語の「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを意味する。
単独で、または別の置換基の一部としての用語の「ハロアルキル」は、１つまたは複数の水素が本明細書で定義されるハロゲンで置換されている、本明細書で定義されるアルキルラジカルを意味する。ハロアルキルの非限定的例には、フルオロメチル、ジフルオロメチルおよびトリフルオロメチルが挙げられる。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置換されている、本明細書で定義されるアリール基を意味する。換言すれば、それは、５〜１２個の炭素原子芳香族単一環または一緒に縮合した、通常５〜６個の原子を含む２個の環を含む環系を意味し、その中の１個または複数の炭素原子が酸素、窒素および／または硫黄原子で置換され、窒素および硫黄へテロ原子は任意に酸化されてもよく、窒素へテロ原子は任意に四級化されてもよい。このようなヘテロアリールの非限定的例には、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、フラニルおよびピロリルが挙げられる。
用語の「ＩＣ５０」または「５０％阻害濃度」は、インビトロで５０％阻害に必要な阻害剤の濃度を表す。これは、アゴニスト薬物に対する「ＥＣ５０」または「５０％効果濃度」と同等である。「ＥＣ５０」はまた、５０％の最大作用をインビボで得るために必要な血漿中濃度も表す。
単独で、または別の置換基の一部として、本明細書で使用される場合、用語の「ニトロオキシアルキル」は、基−アルキル−ＯＮＯ２を意味し、アルキルは本明細書で定義される通りである。
表現の「薬学的に許容可能な賦形剤」は、動物、好ましくはヒトに投与した場合に、有害、アレルギー性またはほかの不都合な反応をもたらさない賦形剤を意味する。これは、ありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含む。ヒトへの投与のために、製剤は、例えばＦＤＡまたはＥＭＡなどの規制当局によって要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度基準を満たすものでなければならない。
本明細書で使用される場合、用語の「ＲＯＳ」は、活性酸素種を意味する。ＲＯＳは、化学的に反応性の酸素含有化学種である。例としては、ペルオキシド（［Ｏ−Ｏ］２−およびＲ−Ｏ−Ｏ−Ｒ、例えば、Ｈ２Ｏ２）、超酸化物（Ｏ２・−）、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）および一重項酸素（１Ｏ２）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞中では、ＲＯＳは、酸素の代謝の副産物として産生されるが、環境ストレスは、「酸化ストレス」と呼ばれる細胞によるＲＯＳ産生の増大をもたらす場合があり、細胞構造に対する大きな損傷に繋がる。現在までに、いくつかの別々のＲＯＳ産生部位が特定され、これらの中には、ミトコンドリア（特に、ミトコンドリアの呼吸鎖の部位ＩＱ、ＩＦ、ＩＩＩＱＯ、ＳＤＨおよびｍＧＰＤＨ）、ミクロソーム（例えば、チトクロムＰ４５０およびジアミンオキシダーゼ）、ペルオキシソームおよび細胞膜中のいくつかの酵素（例えば、ＮＡＤＰＨオキシダーゼおよびリポキシゲナーゼ）がある。ＲＯＳが放出および貯蔵される細胞内の部位に応じて、「細胞質ゾルのＲＯＳ」および「ミトコンドリアのＲＯＳ」にさらに区別してもよい。例えば、ミトコンドリアの呼吸鎖の複合体Ｉ（部位ＩＱおよびＩＦ）およびミトコンドリア複合体ＩＩの部位ＳＤＨは、ＲＯＳを産生し、ミトコンドリアの内腔に向けてＲＯＳを放出するので、これらは「ミトコンドリアのＲＯＳ」と見なされ、一方、ミトコンドリアの呼吸鎖の複合体ＩＩＩ（部位ＩＩＩＱＯ）および部位ｍＧＰＤＨは、ＲＯＳを産生し、細胞質に向けてＲＯＳを放出するので、これらは、「細胞質ゾルのＲＯＳ」と見なされる。
本発明の化合物の用語の「塩」は、本明細書では、酸付加塩およびその塩基塩を表すために使用される。好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。非限定的例には、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、テトラフルオロホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、蟻酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／二水素リン酸塩、ピログルタミン酸塩、サッカリン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩およびキシノホ酸塩が挙げられる。好適な塩基塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。非限定的例には、アルミニウム塩、アルギニン塩、ベンザチン塩、カルシウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、ジオラミン塩、グリシン塩、リシン塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、オラミン塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トロメタミン塩、２−（ジエチルアミノ）エタノール塩、エタノールアミン塩、モルホリン塩、４−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン塩および亜鉛塩が挙げられる。例えば、ヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩などの酸および塩基のヘミ塩を形成してもよい。好ましい薬学的に許容可能な塩には、塩酸塩／塩化物、臭化水素酸塩／臭化物、重硫酸塩／硫酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、および酢酸塩が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語の「部位ＩＱ」は、ＮＡＤＨ：ユビキノン酸化還元酵素（ミトコンドリア複合体Ｉとしても知られる）のユビキノン結合部位を意味する。部位ＩＱは、ミトコンドリア内腔内に放出されるＲＯＳを産生する。
本明細書で使用される場合、用語の「部位ＩＦ」は、ミトコンドリア複合体Ｉのフラビン結合部位を意味する。部位ＩＦは、ミトコンドリア内腔内に放出されるＲＯＳを産生する。
本明細書で使用される場合、用語の「部位ＩＩＩＱＯ」は、チトクロムｂｃ１複合体（ミトコンドリア複合体ＩＩＩとしても知られる）のユビキノン結合部位を意味する。部位ＩＩＩＱＯは、細胞質に向けて放出されるＲＯＳを産生する。
本明細書で使用される場合、用語の「部位ＳＤＨ」は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ミトコンドリア複合体ＩＩとしても知られる）を意味する。部位ＳＤＨは、ミトコンドリア内腔内に放出されるＲＯＳを産生する。
本明細書で使用される場合、用語の「部位ｍＧＰＤＨ」は、グリセロール ３−リン酸デヒドロゲナーゼを意味する。部位ｍＧＰＤＨは、細胞質に向けて放出されるＲＯＳを産生する。
本明細書では、用語の「溶媒和物」は、化学量論的または準化学量論的量の１個または複数の薬学的に許容可能な溶媒分子、例えば、エタノールまたは水を含む本発明の化合物を表すために使用される。用語の「水和物」は、前記溶媒が水の場合を意味する。
用語の「対象」はヒトを含む動物を意味する。本発明の意味において、対象は患者、すなわち、治療を受けている人、医学的治療を受けている人、または治療を受けたことがある人、または疾患の発症について監視されている人であってもよい。一実施形態では、対象は雄（男性）である。別の実施形態では、対象は雌（女性）である。
用語の「互変異性体」は、互変異性化と呼ばれる化学反応により相互変換可能な有機化合物を意味する。前記化学反応は、単結合と隣接二重結合の切り替えに付随して起こる水素原子またはプロトンの移動を含む。
表現の「治療的有効量」は、標的に対して有意なマイナスまたは有害な副作用を引き起こすことなく、（１）遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の発症を遅らせるか予防する、（２）遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状の進行、増悪または悪化を減速または停止する、（３）遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の症状の寛解をもたらす、（４）遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の重症度または発生率を低下させる、または（５）遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態を治癒させることを目的とした薬剤のレベルまたは量を意味する。予防的または防止的な処置のために、遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の発症前に治療的有効量を投与してもよい。代わりにまたは追加して、治療処置のために遊離酸素ラジカルに関連する疾患、障害または状態の開始後に治療的有効量を投与してもよい。
「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ）」という用語は、治療処置および予防処置の両方を指し、その目的は、標的とされる病的状態または疾患を予防するか減速させることである。治療を必要とするものとしては、既に疾患に罹患しているものならびに疾患に罹患しやすいものまたは疾患を予防すべきものが挙げられる。対象または哺乳動物は、本発明に係る治療を受けた後に当該対象または哺乳動物が、ＲＯＳ産生の減少および／または特定の疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状のある程度の緩和、罹患率および死亡率の低下ならびに生活の質の問題の改善のうちの１つまたは複数の観察可能および／または測定可能な減少または非存在を示す場合に、疾患または障害または状態に対する「治療が成功」となる。治療の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通している通常の手順によって容易に測定可能である。
発明の詳細な説明
本発明の目的の１つは、有効量のミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）産生阻害剤の投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防方法；または遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防方法のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）産生阻害剤であり、前記阻害剤が、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を阻害する。
一実施形態では、本発明の阻害剤は生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生に影響を与えない。一実施形態では、生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生は、本発明の阻害剤の存在下で５％を超えて調節（増減）されない。一実施形態では、生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生は、本発明の阻害剤の存在下で、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％超えて調節（増減）されない。
本明細書で使用される場合、「影響を与えない」という用語は、ＲＯＳ産生レベルを決定するための当業者に公知の技術により測定される本発明の阻害剤の効果がないことを意味する。
別の実施形態では、本発明の阻害剤は、細胞質ゾルのＲＯＳ産生の阻害剤ではない。
一実施形態では、本発明の阻害剤は、ＩＩＩＱＯおよびｍＧＰＤＨから選択される少なくとも１つの部位で、生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生に影響を与えない。
一実施形態では、本発明の阻害剤は、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％超えて、ＩＩＩＱＯおよびｍＧＰＤＨから選択される少なくとも１つの部位からの生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生を減少させない。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、ミトコンドリアの呼吸鎖の複合体ＩＩＩの部位ＩＩＩＱＯからの生理学的（細胞質ゾルの）ＲＯＳ産生を減少させない。
細胞質ゾルのＲＯＳ産生は、細胞全体のＲＯＳ産生と内部ミトコンドリアのＲＯＳ産生との差によって決定される。あるいは、細胞質ゾルのＲＯＳ産生は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼＲＯＳ産生のインビトロアッセイで決定できる。
別の実施形態では、本発明の阻害剤はＲＯＳ産生の上流で作用する。
細胞質ゾルのＲＯＳ産生を検出するための試験は最先端技術であり、当業者に周知である。
このような試験の例には、下記が挙げられるが、これらに限定されない。
（１）細胞全体のＲＯＳ産生の測定：
５−（および−６）−クロロメチル−２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート、アセチルエステル（ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ）および／またはＨ２ＤＣＦＤＡは、細胞における細胞質ゾルの活性酸素種（ＲＯＳ）の指示薬である。ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡは受動的に細胞の中に拡散し、そこではその酢酸基が細胞内エステラーゼによって切断され、そのチオール反応性クロロメチル基が細胞内のグルタチオンおよび他のチオールと反応する。その後の酸化により細胞内部に捕捉された蛍光付加物が生じ、これにより長期の試験を容易にする（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（５）：４４３−９；Ｓａｒｖａｚｙａｎ，１９９６．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７１（５ Ｐｔ ２）：Ｈ２０７９−２０８５）。
（２）細胞中のミトコンドリアのＲＯＳ産生の測定：
無傷の細胞中の細胞内ＲＯＳを測定してその起源をミトコンドリアであると帰属するのはかなり難しい。近年、ミトコンドリアの機能にとって非常に重要なプロトン駆動力が、親油性トリフェニルホスホニウムカチオンＴＰＰ＋を「送達」複合体として用いて、様々な化合物を、高度に陰性のミトコンドリアマトリックスに向けるために利用されている。これらのうち、ミトヒドロエチジンまたはミトジヒドロエチジウムとも呼ばれているミトソックスレッド（ＭｉｔｏＳＯＸ Ｒｅｄ）は一般にミトコンドリアのＲＯＳの推定のために使用されている。ミトソックス（ＭｉｔｏＳＯＸ）のＴＰＰ＋部分により、ミトコンドリアマトリックス中でのＲＯＳ感受性ヒドロエチジンの多様な蓄積が可能となり、スーパーオキシドによるヒドロエチジンの酸化により特異的な蛍光酸化生成物、２−ヒドロキシエチジウムを生じる（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（１６）：５７２７−５７３２；Ｐｏｌｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．５４７：２２５−２５０）。
一実施形態では、本発明の阻害剤は、ミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）産生の選択的阻害剤である。
一実施形態では、本発明の阻害剤は、ＩＱ、ＩＦおよびＳＤＨから選択される少なくとも１つの部位でのミトコンドリアのＲＯＳ産生の選択的阻害剤である。
一実施形態では、本発明によるミトコンドリアの産生の選択的阻害剤は、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％を超えて、ＩＱ、ＩＦおよびＳＤＨから選択される少なくとも１つの部位からのミトコンドリアのＲＯＳ産生を減少させ、一方で、残りのＲＯＳ産生部位からのミトコンドリアのＲＯＳ産生に対し与える影響は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％未満である。
一実施形態では、単一のミトコンドリアのＲＯＳ産生部位からのミトコンドリアのＲＯＳ産生の選択的阻害剤である阻害剤は、ＲＯＳ産生部位ＩＱ、ＩＦ、またはＳＤＨの内の１つからのＲＯＳ産生を１８％を超えて減少させるが、残りのＲＯＳ産生部位からのＲＯＳ産生に対する影響は１０％未満である。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの部位ＩＱおよび／またはＩＦでのミトコンドリアのＲＯＳ産生の選択的阻害剤である。
ミトコンドリアの呼吸鎖の複合体Ｉは、２つの別々の部位：ユビキノン結合部位およびフラビンモノヌクレオチド部位、からＲＯＳを産生できる。
複合体Ｉのユビキノン結合部位（ＩＱ）：
ＩＱからのＲＯＳ産生を特異的に分析するために、呼吸鎖に電子を供給するための基質として５ｍＭのコハク酸を使用し得る。ＩＱ ＲＯＳ産生は、ミトコンドリアの内膜を横切るプロトン駆動力（ＰＭＦ）の変化に対して非常に感受性が高い（ＰＭＦ＝ΔΨｍ＋ΔｐＨ）。従って、ＩＱ ＲＯＳアッセイでのヒット化合物の選択性を評価する場合に、ΔΨｍアッセイの保守的な閾値を利用してもよい。
部位ＩＱからの電子漏出は、強力なＰＭＦの存在下において減少したＱプールからＣＩによるマトリックスＮＡＤ＋への逆輸送中に十分に明らかにされている。実験的には、ＩＱ ＲＯＳ産生に有利に働く条件は生理機能からあまりにもかけ離れており、そのため、高いその能力にもかかわらず多くの者がその関連性を軽視している。但し、低濃度のグルタミン酸（ＣＩにより電子を順方向に供給する）およびコハク酸（電子を逆方向に供給する）の両方を供給した場合であっても、呼吸しているミトコンドリアは有意なレベルのロテノン感受性ＲＯＳ（すなわちＩＱ ＲＯＳ）を産生する。さらに、比較分析から、部位ＩＱからの最大のＲＯＳ産生（但し、部位ＩＦからの産生は異なる）と多様な脊椎動物種全体における最大寿命との反比例関係が示されている（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．６（５）：６０７−１８；Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．９（１）：７８−９１）。従っ て、ＩＱ ＲＯＳの選択的調節剤により、正常および病理学的プロセスにおけるミトコンドリアＲＯＳ産生の推定上の役割を探るための特有の機会が得られる。
複合体Ｉのフラビン結合部位（ＩＦ）：
ＩＦからのＲＯＳ産生を特異的に分析するために、呼吸鎖に電子を与えるための基質溶液は５ｍＭのグルタミン酸、５ｍＭのリンゴ酸および４μＭのロテノンを含み得る。部位ＩＦは、ミトコンドリアマトリックス内のＮＡＤＨプールの減少状態に比例する速度でＲＯＳを産生する（Ｔｒｅｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６（３６）：３１３６１−７２）。殺虫剤ロテノンによる部位ＩＱの遮断は、フラビンの酸化を防止することによって部位ＩＦからのＲＯＳ産生を増加させることができる。複合体Ｉのフラビン結合部位（部位ＩＦ）からの最大のＲＯＳ産生は、部位ＩＱおよびＩＩＩＱＯと比較して比較的低く、これは、このアッセイにおけるより高いバラツキおよびその後の最初のスクリーニングにおけるヒットコーリングのより高い偽陽性率に繋がり得る。
ロテノンおよび神経毒ＭＰＰ＋による複合体Ｉ活性の阻害は、げっ歯類およびヒトの両方におけるパーキンソニズムに関連づけられており、これは複合体ＩのＲＯＳ産生の機能障害と神経変性との間の関連を示唆している。従って、複合体ＩからのＲＯＳ産生を阻害できる化合物は、療法において有用であり得る。
別の実施形態では、本発明の阻害剤または選択的阻害剤は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの部位ＩＱでのミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）産生の選択的阻害剤である。
本明細書で使用される場合、用語の「選択的阻害剤」は、複合体Ｉの部位ＩＱでのＲＯＳ産生を阻害できる化合物を意味するが、同時に、残りの部位からのＲＯＳ産生およびミトコンドリアの膜電位（ΔΨｍ）および酸化的リン酸化に対する影響は最小であり得る。例えば、ロテノンの存在下（すなわち、部位ＩＱにおけるＲＯＳ産生が阻害される場合）およびアンチマイシンＡの存在下（すなわち、ＲＯＳが主に複合体ＩＩＩによって産生される場合）での単離ミトコンドリアの場合、ＲＯＳ産生の阻害に対する化合物のＩＣ５０は、ロテノンの非存在下よりも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０倍高い。
一実施形態では、本明細書で使用される場合、「選択的阻害剤」という用語はまた、本明細書で与えられるいずれか１つの定義と排他的にまたは包括的に、複合体Ｉの部位ＩＱでのミトコンドリアのＲＯＳ産生を、約０．１μＭ〜約２０μＭの範囲、好ましくは約１０μＭのＩＣ５０で阻害できる化合物を意味する。一実施形態では、本明細書で使用される場合、「選択的阻害剤」という用語はまた、本明細書で与えられるいずれか１つの定義と排他的にまたは包括的に、複合体Ｉの部位ＩＱでのミトコンドリアのＲＯＳ産生を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０μＭのＩＣ５０で阻害できる化合物を意味する。別の実施形態では、前記化合物は、ＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼＲＯＳ産生のインビトロアッセイにおいて細胞質ゾルのＲＯＳ産生を大きくは阻害しない。
本明細書で使用される場合、用語の「選択的阻害剤」はまた、本明細書で与えられるいずれか１つの定義と排他的にまたは包括的に、複合体Ｉの部位ＩＱでのＲＯＳ産生を阻害できる化合物を意味し、同時に、残りの部位からのＲＯＳ産生およびミトコンドリアの膜電位（ΔΨｍ）および酸化的リン酸化に対する影響は最小であり得る。例えば、ロテノンの存在下での（すなわち、部位ＩＱでのＲＯＳ産生が阻害される場合の）単離したミトコンドリアにおけるＲＯＳ産生の阻害に対する化合物のＩＣ５０は、アンチマイシンＡの存在下（すなわち、ロテノンの後で添加され、従って、ＲＯＳが主に複合体ＩＩＩによって産生される場合）よりも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０倍高いまたは大きい。
種々の組織から単離したミトコンドリアにおけるミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの部位ＩＱで産生されるＲＯＳを特異的に検出するための試験は当業者に周知である。
エネルギー産生を変えることなく、単離ミトコンドリアの所定の部位におけるＲＯＳ産生阻害剤を特定するための高スループットアッセイについても説明する。これらのアッセイはＲＯＳ産生の部位特異的調節物質を特定すると共に、ミトコンドリアの生体エネルギー産生の広範囲作用型抗酸化剤および各種阻害剤などの特異性の低いエフェクターも明らかにする。従って、内部ミトコンドリア膜を横切る正常なエネルギー共役電子およびプロトン流束を変えることなく、電子伝達鎖内の特定の部位における酸素への望ましくない電子漏出（ＲＯＳ産生）を区別する阻害剤を特定し得る。アッセイは、色素アンプレックス ＵｌｔｒａＲｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるミトコンドリアＲＯＳ産生の標準的な蛍光ベースアッセイおよび電位差測定色素ＴＭＲＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるΔΨｍを高スループットマイクロプレートフォーマットに適合させる。新しく単離した骨格筋ミトコンドリアにおける機能的調節のロバスト検出のために５種類のＲＯＳおよび１種類のΔΨｍアッセイのコアセットが提供される。一般的なアッセイ混合物に添加される基質および阻害剤を変えることにより、５つの主要なＲＯＳ産生部位（部位ＩＱ、ＩＦ、ＩＩＩＱＯ、ＳＤＨおよびｍＧＰＤＨ）を別々に標的化し得る。ΔΨｍを監視するためのカウンタースクリーニングを並行して実行し、正常なミトコンドリアエネルギー産生の一般的な阻害剤または脱共役剤であると思われる化合物を除去してもよい。
別の実施形態では、全てのアッセイに対して阻害剤を２．５μＭで、二通りに試験する。エンドポイント蛍光をＤＭＳＯに対して正規化し、公知のミトコンドリアの阻害剤対照ウェルを各プレートに含めた。各ＲＯＳアッセイにおける陽性ヒット化合物を、好ましくは１５％以上、より好ましくは１８％以上、さらにより好ましくは２０％以上の低減閾値をそのアッセイに適用することにより最初に濾過してもよい。ＴＭＲＭベースのカウンタースクリーニングにおいてΔΨｍを変えた化合物の除去も行いながら、各ＲＯＳアッセイをそれ以外に対するカウンタースクリーニングとして用い得る。従って、濾過したヒット化合物をその後に評価して、他のＲＯＳアッセイを、例えば、２０％または１８％または１５％を超えて変えるか、ΔΨｍを好ましくは１０％またはより好ましくは５％またはさらにより好ましくは４％を超えて変えたものを除去してもよい。
別の実施形態では、本発明の阻害剤は直接にはミトコンドリアでの酸化的リン酸化に大きくは影響を与えず、酸化的リン酸化は１０、９、８、７、６、５％未満で調節されることが好ましい。
遊離酸素ラジカル関連疾患は、酸化ストレス不均衡およびミトコンドリア機能障害に関連している。特に、ミトコンドリア機能障害に関連する疾患は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生によって誘導される。
遊離酸素ラジカル関連疾患としては、限定されないが、心臓血管疾患、老化疾患、自己免疫疾患、早老症候群、パーキンソン症候群、神経疾患、虚血再灌流障害、感染性疾患、筋肉疾患、肺、腎臓および肝臓の疾患が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患としては、限定されないが、高血圧症、心毒性（アントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および抗ウイルス薬の心毒性を含む）、原因を問わない心不全、虚血、心筋梗塞、心臓発作、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、心細動、高血圧症、血栓症および塞栓症、気管支喘息などのアレルギー／炎症状態、関節リウマチ、炎症性腸疾患、２型糖尿病、糖尿病と難聴（ＤＡＤ、Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ−Ｗａｌｌａｃｅ症候群としても知られる）、炎症性疾患、リウマチ熱、肺動脈高血圧症、症候性心筋症（バース症候群、コステロ症候群、フリードライヒ失調症、レオパード症候群、ヌーナン症候群、心臓・顔・皮膚症候群、心臓脳筋症およびアルストレーム症候群、など）、自然免疫応答および心肺疾患、例えば、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓症、心膜炎、大動脈縮窄症、ファロー四徴症、大動脈弁狭窄症、僧帽弁狭窄症、大動脈弁逆流症、僧帽弁逆流症、塵肺症、気管支拡張症、心筋症、および／または内皮ニトログリセリン耐性が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連老化疾患としては、限定されないが、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、皮膚の老化、皮膚のＵＶ損傷、薄毛（ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、たるみ、しわ、年齢によるしみの出現、血管損傷／乾燥部位、脂漏性角化症、日光性角化症、キンドラー症候群、ボーエン病、皮膚癌、関節炎、強直性脊椎炎、炎症性多発性関節症、膝関節炎、流行性多発性関節炎、乾癬性関節炎、白内障、難聴、癌、転移、転移プロセス阻止、肝疾患、移植、腫瘍および抗腫瘍薬または免疫抑制薬および化学物質の毒性、骨粗鬆症、多形皮膚萎縮症、肢端早老症、遺伝性硬化性ポイキロデルマ、先天性角化異常症、色素性乾皮症、ブルーム症候群、ファンコニー貧血、コケイン症候群および公害病が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連自己免疫疾患としては、限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、クローン病、重症筋無力症、グレーヴス病、強皮症、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、乾癬が挙げられる。
自己免疫疾患は、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血および自己免疫性血小板減少症などの血液疾患に関連する自己免疫疾患であり得る。
自己免疫疾患はまた、側頭動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、ウェゲナー肉芽腫症などの脈管炎およびベーチェット病であり得る。
他の自己免疫疾患としては、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎などの脊椎関節症、抗リン脂質抗体症候群および多発性筋炎が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連早老症候群としては、限定されないが、早老症、ブルーム症候群、コケイン症候群、ド・ブラシー症候群（Ｄｅ Ｂａｒｓｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、先天性角化異常症、拘束性皮膚障害、ロスムンド・トムソン症候群、硫黄欠乏性毛髪発育異常症、ウェルナー症候群、Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ−Ｒａｕｔｅｎｓｔｒａｕｃｈ症候群、および色素性乾皮症が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連パーキンソン症候群としては、限定されないが、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺、多系統萎縮症、大脳皮質基底核変性症またはレヴィー小体認知症、毒素誘発性パーキンソニズム、および常染色体性劣性ＰＡＲＫ６関連パーキンソニズムまたは常染色体性劣性ＰＩＮＫ１関連パーキンソニズムなどのＰＤの早期発症型バリアントが挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連神経疾患としては、限定されないが、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病および老化、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、ウィルソン病、リー症候群、キーンズ・セイアー症候群、レーベル遺伝性視神経症、認知障害、気分障害、運動障害、遅発性ジスキネジー、脳損傷、アポトーシス、認知症、てんかん、てんかん性認知症、初老期認知症、外傷後認知症、老人性認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、脳卒中後認知症、統合失調症、ダウン症候群、運動ニューロン疾患、アミロイドーシス、２型糖尿病関連アミロイド、クロイツフェルト・ヤコブ病、壊死性細胞死、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、クールー病・動物スクレイピー、長期血液透析関連アミロイド、老人性心臓アミロイドおよび家族性アミロイドポリニューロパチー、脳疾患、内臓神経障害、記憶喪失、アルミニウム中毒、生体細胞中の鉄レベルの減少、哺乳類における遊離遷移金属イオンレベルの減少、体または特定の体区画に毒性量の金属を有する患者、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、視覚性運動盲、アルコール関連認知症、主要な加齢性タウオパチー、健忘失語症、疾病失認、失行症、発語失行、聴覚型言語失認（ａｕｄｉｔｏｒｙ ｖｅｒｂａｌ ａｇｎｏｓｉａ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、ロゴペニック型進行性失語、神経原線維変化、声失認）、ピック病、主要な進行性失語症、進行性非流暢性失語症、意味性認知症、ステロイド認知症症候群、視空間失認（ｖｉｓｕｏｓｐａｔｉａｌ ｄｙｓｇｎｏｓｉａ）、アミノグリコシドの耳毒性副作用およびコカイン毒性が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連虚血再灌流障害としては、限定されないが、脳卒中、脳虚血、脳幹脳卒中症候群（ｂｒａｉｎｓｔｅｍ ｓｔｒｏｋｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、頸動脈内膜剥離、小脳卒中症候群、皮質性色覚異常、脳出血、脳梗塞、脳静脈洞血栓症、実質内出血、頭蓋内出血、ラクナ梗塞、延髄外側症候群、橋脳外側症候群（ｌａｔｅｒａｌ ｐｏｎｔｉｎｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、部分的前方循環梗塞（ｐａｒｔｉａｌ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｆａｒｃｔ）、後方循環梗塞（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｆａｒｃｔ）、無症候性脳卒中（ｓｉｌｅｎｔ ｓｔｒｏｋｅ）、脳卒中の組み合わせ（ｓｔｒｏｋｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）、脳卒中地帯（ｓｔｒｏｋｅ ｂｅｌｔ）、脳卒中回復、一過性脳虚血発作、流域梗塞（Ｗａｔｅｒｓｈｅｄ ｓｔｒｏｋｅ）、ウェーバー症候群、肥満症、移植のための臓器保存、虚血および再灌流障害が挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連感染性疾患としては、限定されないが、Ｃ型肝炎、敗血症、感染性ミオパチー、敗血症性ショックが挙げられる。
遊離酸素ラジカル関連筋肉疾患としては、限定されないが、ミオパチー、ミトコンドリアのミオパチー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー１型、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー２型、リアノジン受容体１（ＲＹＲ１）関連ミオパチー、セレンタンパク質１（ＳＥＰＮ１）関連ミオパチー、キーンズ・セイアー症候群、心筋症、運動障害、不活動による筋萎縮、骨格筋火傷およびデュピュイトラン拘縮が挙げられる。
遊離酸素ラジカルに関連する肺、腎臓および肝臓の疾患としては、限定されないが、嚢胞性線維症、喘息、公害病、心肺疾患、肺動脈高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓症、塵肺症、気管支拡張症、気管支喘息、人工呼吸器誘発性横隔膜機能不全、肺癌、アルコール性脂肪肝疾患、脂肪肝疾患、糖尿病、生体外腎臓保存、Ｃ型肝炎における肝炎、１型糖尿病における腎臓損傷および肝硬変が挙げられる。
一実施形態では、特に本発明において治療されるべき疾患は、加齢黄斑変性症、パーキンソン病、アルツハイマー病、虚血再灌流障害、肺動脈高血圧症、強皮症、アテローム性動脈硬化症、心不全、心筋梗塞、関節炎、肺毒性、心肺疾患、炎症性疾患、癌、転移、心毒性（アントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および抗ウイルス薬の心毒性を含む）、原因を問わない心不全、虚血、心臓発作、脳卒中、血栓症／塞栓症、喘息、アレルギー／炎症状態、気管支喘息、関節リウマチ、炎症性腸疾患、ハンチントン病、認知障害、早老症、早老症候群、てんかん性認知症、初老期認知症、外傷後認知症、老人性認知症、血管性認知症、ＨＩＶ−１関連認知症、脳卒中後認知症、ダウン症候群、運動ニューロン疾患、アミロイドーシス、２型糖尿病関連アミロイド、クロイツフェルト・ヤコブ病、壊死性細胞死、ゲルストマン・ストロイスラー症候群、クールー病・動物スクレイピー、長期血液透析関連アミロイド、老人性心臓アミロイドおよび家族性アミロイドポリニューロパチー、脳疾患、内臓神経障害（ｎｅｕｒｏｓｐａｎｃｈｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、記憶喪失、アルミニウム中毒、生体細胞中の鉄レベルの減少、哺乳類における遊離遷移金属イオンレベルの減少、体または特定の体区画に毒性量の金属を有する患者、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、白内障、糖尿病、癌、肝疾患、皮膚の老化、移植、アミノグリコシドの耳毒性副作用、腫瘍および抗腫瘍薬または免疫抑制薬および化学物質の毒性、先天性免疫応答およびフリードライヒ運動失調症である。
一実施形態では、特に本発明において治療されるべき疾患は、心筋梗塞、心毒性（アントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および抗ウイルス薬の心毒性、好ましくは、アントラサイクリンの心毒性を含む）、肺動脈高血圧症、心不全、心肺疾患、虚血、心臓発作、脳卒中、血栓症および塞栓症を含む群から選択される遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患である。
一実施形態では、本発明において特に治療されるべき疾患は、老化疾患、ＡＭＤ、皮膚の老化、心臓血管疾患（例えば、アントラサイクリンの心毒性など）、早老症／早老症候群、パーキンソン病、アルツハイマー病、フリードライヒ運動失調症、虚血再灌流、心肺疾患、喘息、癌、転移および／または公害病である。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は心毒性、好ましくは、アントラサイクリンの心毒性である。アントラサイクリン毒性に関与する機序は、ＲＯＳ産生および部位特異的ＤＮＡ損傷に関係する。酸化ストレス誘導は、実際に、アントラサイクリンの心毒性において、ＤＮＡ損傷、筋節損傷、ミトコンドリア機能障害および生存促進性シグナル伝達の減少を誘導することにより役割を果たし、心筋細胞の死亡と生存の両方を媒介する（Ｖａｌｃｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ａｒｃｈ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１２（２）：４２８−４３５）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、肺高血圧症である。実際に、肺血管系に対し、ＲＯＳ生成を促進する薬剤の有害作用が示され、また逆に、肺高血圧症の動物モデルにおいて、抗酸化剤の有益な効果が示されている。このように、ＲＯＳ産生は、肺血管リモデリング、内皮機能障害、血管収縮反応の変化、細胞外マトリックスの炎症および改変、肺高血圧症病態生理学の全ての重要な特徴に直接的に関連している（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｍｉｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．７（３）：１７５−２００）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、虚血性および再潅流傷害である。実際に、ＲＯＳの過剰産生は、再潅流傷害の起源における重要な因子である（Ｇｒａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．６：５２４−５１）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、糖尿病である。実際に、慢性高血糖およびその後の活性酸素種（ＲＯＳ）の増大は、細胞機能を劣化させ、インスリン抵抗性を高めて、２型糖尿病の増悪に繋がる（Ｋａｎｅｔｏ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ Ｉｎｆｌａｍｍ．，２０１０：４５３８９２）が、しかし、他のタイプの糖尿病、例えば、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）の増悪にも繋がる。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、パーキンソン病である。実際に、ＲＯＳの産生の増大をもたらす、ミトコンドリアの機能障害および酸化的損傷は、パーキンソン病の損傷した脳領域中で見つかることが多い状態である（Ｍｕｎｏｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎｓ Ｄｉｓ．２０１６：７０４９１０８）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、黄斑変性症である。実際に、特に、網膜色素上皮細胞中の、過剰のＲＯＳ産生および酸化ストレスと一緒になったＲＯＳの蓄積は、黄斑変性症の病因として一定の役割を果たす。ＲＯＳレベルは、加齢網膜中で増加し、酸化ストレスに繋がり、光受容体、網膜色素上皮細胞、およびアポトーシスプロセスにおける脈絡毛細管の損傷を生ずる（Ｎｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１６．Ｏｘｉｄ．Ｍｅｄ．Ｃｅｌｌ．Ｌｏｎｇｅｖ．２０１６：３１６４７３４）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、強皮症である。実際に、重要なＲＯＳ源であるＮＡＤＰＨオキシダーゼは、強皮症線維芽細胞中で発現上昇し、ＲＯＳの大きな蓄積を生じ、次にこれが細胞活性化およびＤＮＡ損傷において重要な役割を果たしていることが示された（Ｓｐａｄｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．６７（６）：１６１１−２２）。
一実施形態では、本発明において特に予防および／または治療されるべき疾患は、転移である。実際には、ＲＯＳ産生は腫瘍増殖および転移の機序、すなわち腫瘍細胞の遊走、浸潤、コロニー形成能、転移生着に関与しており、自然発生転移は、ＲＯＳ産生およびＴＣＡサイクル活性異常に関連するミトコンドリア表現型の自然選択、すなわち「転移性ミトコンドリアスイッチ（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｓｗｉｔｃｈ）」と命名されている機序によって促進される（Ｐｏｒｐｏｒａｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ．８（３）：７５４−７６６）。ＲＯＳ過剰産生も血管新生を促進し、ＲＯＳ産生阻害剤は互恵的な抗血管新生剤でもある。
一実施形態では、本発明の阻害剤または選択的阻害剤は、ＡＯＸまたはその誘導体である。ＡＯＸは、デスメチルアネトールトリチオンであり、５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン：
Figure 2020511450
 としても表される。
一実施形態では、ＡＯＸの誘導体は、そのバイオアイソスター、好ましくは、そのフェノールバイオアイソスターである。
一実施形態では、フェノールバイオアイソスターは、例えば、次の群、その互変異性体および任意に置換されてもよいその誘導体である。
Figure 2020511450
特定の実施形態では、好ましい本発明のフェノールバイオアイソスターは、以下のもの、その互変異性体および任意に置換されてもよいその誘導体である：
Figure 2020511450
従って、好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（Ｉ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり；
式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳまたはＯであり；より好ましくはＸはＳであり；
ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨまたはＮであり；より好ましくはＹはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；
Ｒ３はヒドロキシであり；またはＲ３およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と一緒に、５員ヘテロアリール部分を形成し、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−または−Ｂ＝ＣＲ６−Ａ−であり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；
ＢはＣＨまたはＮであり；および
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである。
好ましい実施形態では、式（Ｉ）において：
ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳであり；
ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；好ましくはＲ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、水素であり；
Ｒ３はヒドロキシであり；またはＲ３およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と一緒に、５員ヘテロアリール部分を形成し、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−であり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素またはＣ１−Ｃ８アルキルであり；
ＢはＣＨまたはＮであり；および
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである。
好ましい実施形態では、ＸはＳである。別の好ましい実施形態では、ＸはＯである。好ましい実施形態では、ＹはＣＨである。別の好ましい実施形態では、ＹはＮである。
好ましい実施形態では、Ｒ３およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と一緒に、５員ヘテロアリール部分を形成し、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−であり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；好ましくはＲ７は水素またはアルキルオキシカルボニルであり；
ＢはＣＨまたはＮであり；および
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；好ましくはＲ６は水素またはヒドロキシルである。
より好ましくは、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ｏ−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−または−Ｎ（ＣＯＯＭｅ）−ＣＨ＝ＣＨ−であり、より好ましくは、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ｏ−Ｃ（ＯＨ）＝Ｎ−である。
別の好ましい実施形態では、Ｒ３およびＲ２は、これらが結合している炭素原子と一緒に、５員ヘテロアリール部分を形成し、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ｂ＝ＣＲ６−Ａ−であり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；好ましくはＲ７は水素またはアルキルオキシカルボニルであり；
ＢはＣＨまたはＮであり；および
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；好ましくはＲ６は水素またはヒドロキシルである。
より好ましくは、−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ｎ＝Ｃ（ＯＨ）−Ｓ−である。
従って、好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（Ｉ’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり；
式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳまたはＯであり；より好ましくはＸはＳであり；
ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨまたはＮであり；より好ましくはＹはＣＨであり；
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；
Ｒ２’およびＲ３’は、これらが結合している炭素原子と一緒に、５員ヘテロアリール部分を形成し、−Ｒ３’−Ｒ２’−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−または−Ｂ＝ＣＲ６−Ａ−であり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；
ＢはＣＨまたはＮであり；および
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＡおよびＢは、式（Ｉ）で定義される通りである。
一実施形態では、式（ＩＩ）において：
ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳであり；
ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨであり；
ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素またはＣ１−Ｃ８アルキル基であり；
ＢはＣＨまたはＮであり；
Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである。
好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の化合物は、式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩａ）の化合物は、式（ＩＩａ−１）または（ＩＩａ−２）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ−１）の化合物である。別の好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ−２）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩａ−１）の化合物は、式（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−１’’）または（ＩＩａ−１’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ−１’）または（ＩＩａ−１’’）の化合物、より好ましくは式（ＩＩａ−１’）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩａ−２）の化合物は、式（ＩＩａ−２’）、（ＩＩａ−２’’）または（ＩＩａ−２’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ−２’）または（ＩＩａ−２’’）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩａ−１）および（ＩＩａ−２）の化合物は、式（ＩＩａ−１ａ）、（ＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩａ−２ａ）、（ＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩａ−２ｄ）または（ＩＩａ−２ｅ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩａ−１ａ）、（ＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩａ−２ａ）、（ＩＩａ−２ｂ）または（ＩＩａ−２ｅ）の化合物、より好ましくは式（ＩＩａ−１ａ）または（ＩＩａ−１ｅ）の化合物、より好ましくは式（ＩＩａ−１ａ）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩｂ）の化合物は、式（ＩＩｂ’）、（ＩＩｂ’’）および（ＩＩｂ’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、式（ＩＩｂ）の化合物は、式（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｂ−３）、（ＩＩｂ−４）または（ＩＩｂ−５）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＡおよびＢは、式（Ｉ）で定義される通りである。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩａ）の化合物は、式（ＩＩＩａ−１）または（ＩＩＩａ−２）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ−１）の化合物である。別の好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ−２）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩａ−１）の化合物は、式（ＩＩＩａ−１’）、（ＩＩＩａ−１’’）または（ＩＩＩａ−１’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくはは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ−１’）または（ＩＩＩａ−１’’）の化合物、より好ましくは式（ＩＩＩａ−１’）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩａ−２）の化合物は、式（ＩＩＩａ−２’）、（ＩＩＩａ−２’’）または（ＩＩＩａ−２’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくはは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ−２’）または（ＩＩＩａ−２’’）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩａ−１）および（ＩＩＩａ−２）の化合物は、式（ＩＩＩａ−１ａ）、（ＩＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩＩａ−２ａ）、（ＩＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩＩａ−２ｄ）または（ＩＩＩａ−２ｅ）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、式（ＩＩＩａ−１ａ）、（ＩＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩＩａ−２ａ）、（ＩＩＩａ−２ｂ）または（ＩＩＩａ−２ｅ）の化合物、より好ましくは式（ＩＩＩａ−１ｂ）の化合物である。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩｂ）の化合物は、式（ＩＩＩｂ’）、（ＩＩＩｂ’’）および（ＩＩＩｂ’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りである。
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩｂ）の化合物は、式（ＩＩＩｂ−１）、（ＩＩＩｂ−２）、（ＩＩＩｂ−３）、（ＩＩＩｂ−４）または（ＩＩＩｂ−５）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であり、式中Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、上記で定義の通りである。
特定の実施形態では、本発明の阻害剤は、下記から選択される：
５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（ＡＯＸ）；
５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オン（Ｃｐ１）；
５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オンオキシム（Ｃｐ２）；
５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（Ｃｐ３）；
４−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（Ｃｐ４）；
５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（Ｃｐ５）；
５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（Ｃｐ６ａ）；
５−（ベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン（Ｃｐ８）；および
メチル５−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２−ジチオール−５−イル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート（Ｃｐ９ａ）。
好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、ＡＯＸ、Ｃｐ１、Ｃｐ３、Ｃｐ４、Ｃｐ５、Ｃｐ６ａおよびＣｐ９ａから選択される。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、ＡＯＸ、Ｃｐ１、Ｃｐ３、Ｃｐ５およびＣｐ６ａから選択される。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、ＡＯＸである。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、Ｃｐ１である。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、Ｃｐ３である。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、Ｃｐ５である。好ましい実施形態では、本発明の阻害剤は、Ｃｐ６ａである。
本発明はまた、上記で定義の式（ＩＩａ−１）の化合物、より具体的には、式（ＩＩａ−１’）、（ＩＩａ−１’’）および（ＩＩａ−１’’’）
Figure 2020511450
 の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物の製造方法に関し、式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通りであり；
前記方法は、
ａ）硫黄系試薬（好ましくは硫黄系試薬はＰ４Ｓ１０である）を用いて、シロキサン（好ましくはシロキサンはヘキサメチルジシロキサン（Ｍｅ３ＳｉＯＳｉＭｅ３、ＨＭＤＯである）の存在下、式（Ｃ）
Figure 2020511450
 の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）を環化し、
上記で定義の式（ＩＩａ−１’）の化合物を得ることを含み、また、必要に応じ、
ｂ１）式（ＩＩａ−１’）の化合物を酸化剤（好ましくは、酸化剤は、酢酸水銀Ｈｇ（ＯＡｃ）２である）と反応させて、上記で定義の式（ＩＩａ−１’’）の化合物を得ることができ、または
ｂ２）式（ＩＩａ−１’）の化合物を、塩基（好ましくは、塩基は酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）である）の存在下、ヒドロキシルアミンＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌと反応させて、上記で定義の式（ＩＩａ−１’’’）の化合物を得ることができる。
一実施形態では、式（ＩＩａ−１）の化合物の製造方法は、中間体（Ｃ）を製造する予備ステップを含んでよく、該ステップは、式（Ａ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の酸誘導体を、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）の存在下で、３−メトキシ−３−オキソプロパン酸（Ｂ）
Figure 2020511450
 、その後ジイミダゾリルケトン、さらにその後、ＨＣｌと反応させて、式（Ｃ）の化合物を得ることを含む。
一実施形態では、式（ＩＩａ−１）の化合物の製造方法は、中間体（Ｃ）を製造する予備ステップを含んでよく、該ステップは、式（Ａ’）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の酸誘導体を、水素化ナトリウムの存在下で、ジメチルカーボネートと反応させて、式（Ｃ）の化合物を得ることを含む。
本発明はまた、式（ＩＩａ−２）の化合物、より具体的には、式（ＩＩａ−２’）および（ＩＩａ−２’’’）
Figure 2020511450
 （式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物の製造方法に関し、
前記方法は、式（Ｅ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物を、塩基（好ましくは、塩基は水素化ナトリウム（ＮａＨ）である）の存在下で、二硫化炭素（ＣＳ２）を用いて環化し、上記で定義の式（ＩＩａ−２’）の化合物を得ることを含み；
および、必要に応じ、式（ＩＩａ−２’）の化合物を、塩基（好ましくは、塩基は酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）である）の存在下、ヒドロキシルアミンＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌと反応させて、上記で定義の式（ＩＩａ−２’’’）の化合物を得ることができる。
本発明はまた、式（ＩＩａ−２’’）
Figure 2020511450
 （式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物の製造方法に関し、
前記方法は、式（Ｅ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物を、クロロカルボニルスルフェニルクロリドと反応させて、式（ＩＩａ−２’’）の化合物を得ることを含む。
一実施形態では、中間体（Ｅ）は、アミド誘導体（Ｄ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）を、ローソン試薬と反応させて、上記で定義の式（Ｅ）の化合物を得ることにより、得てもよい。
一実施形態では、アミド中間体（Ｄ）は、式（Ａ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の酸誘導体を、塩基（好ましくは、塩基はピリジン（Ｃ５Ｈ５Ｎ）である）の存在下で、尿素（ＣＯ（ＮＨ２）２と反応させて、式（Ｄ）の化合物を得ることにより、得てもよい。
本発明はまた、式（ＩＩｂ）の化合物、より具体的には、式（ＩＩｂ’）、（ＩＩｂ’’）および（ＩＩｂ’’’）
Figure 2020511450
 （式中Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物の製造方法に関し、
前記方法は、
ａ）ローソン試薬の存在下、硫黄系試薬（好ましくは硫黄系試薬は八硫黄Ｓ８である）を用いて、式（Ｇ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）の化合物を環化し、上記で定義の式（ＩＩｂ’）の化合物を得ることを含み；
および必要に応じて：
ｂ１）式（ＩＩｂ’）の化合物を酸化剤（好ましくは、酸化剤は、酢酸水銀Ｈｇ（ＯＡｃ）２である）と反応させて、上記で定義の式（ＩＩｂ’’）の化合物を得ることができ；または
ｂ２）式（ＩＩｂ’）の化合物を、塩基（好ましくは、塩基は酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）である）の存在下、ヒドロキシルアミンＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌと反応させて、上記で定義の式（ＩＩｂ’’’）の化合物を得ることができる。
一実施形態では、式（ＩＩｂ）の化合物の製造方法は、中間体（Ｇ）を製造する予備ステップを含んでよく、該ステップは、式（Ｆ）
Figure 2020511450
 （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、上記で定義の通り）のエステル誘導体を、塩基（好ましくは、塩基はトリエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）である）の存在下、ルイス酸（好ましくは、ルイス酸はＴｉＣｌ４である）と反応させて、上記で定義の式（Ｇ）の化合物を得ることを含む。
本発明はまた、本発明の阻害剤または選択的阻害剤を含むかそれからなるかまたは本質的にそれからなる組成物にも関する。
本発明はまた、本明細書の前に記載されている阻害剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる組成物であって、それを必要としている対象の遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための組成物またはその治療に使用するための組成物に関する。
本発明は、遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための、またはその治療で使用するための、組成物に関し、前記組成物は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる。
本発明はまた、本発明の阻害剤または選択的阻害剤を、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を組み合わせて、含むかそれからなるかまたは本質的にそれからなる医薬組成物に関する。
本発明はまた、本明細書の前に記載されている阻害剤を、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせて、含むかそれからなるか本質的にそれからなる医薬組成物であって、それを必要としている対象の遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための、またはその治療に使用するための医薬組成物に関する。
本発明はまた、遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための、またはその治療で使用するための、医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤および少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる。
好適な賦形剤としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩および酢酸塩の溶液、ゼラチン、コラーゲン、カーボポール（登録商標）、植物油などが挙げられる。また、好適な防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどをさらに含んでもよい。
本発明の組成物中に使用し得る薬学的に許容可能な賦形剤の他の例としては、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒトの血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
さらに、いくつかの賦形剤は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、好適な担体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する例えば溶媒および分散媒、好適なそれらの混合物および例えば落花生油および胡麻油などの植物油など）、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウムなど）、被覆剤（例えば、レシチンなど）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなど）、抗酸化剤および安定化剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素など）、非イオン性浸潤剤または清澄剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールなど）、粘度調整剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ペトロラタム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど）を含んでもよい。
薬学的に許容可能な賦形剤の他の例は、シクロデキストリン（ＣＤ）およびその誘導体である。シクロデキストリンは、有効成分の可溶化および／または安定化を改善し得る。好ましくは、シクロデキストリンはベータシクロデキストリンである。ある実施形態では、シクロデキストリンは、ＳＢＥシクロデキストリン（ＳＢＥ：スルホブチルエーテル）およびＨＰシクロデキストリン（ＨＰ：ヒドロキシプロピル）またはこれらの誘導体から選択される。ある実施形態では、シクロデキストリンはＳＢＥシクロデキストリン、好ましくは、ＳＢＥベータシクロデキストリンである。ある実施形態では、シクロデキストリンはＨＰシクロデキストリン、好ましくは、ＨＰベータシクロデキストリンである。
本発明はまた、本発明の阻害剤または選択的阻害剤を含むかそれからなるかまたは本質的にそれからなる薬物に関する。
本発明はまた、本明細書の前に記載されている阻害剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる薬物であって、それを必要としている対象の遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための、またはその治療に使用するための薬物に関する。
本発明はまた、遊離酸素ラジカル関連疾患を治療するための、またはその治療で使用するための薬物に関し、前記薬物は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる。
本発明はまた、本発明の阻害剤を含む化粧品組成物に関する。
本発明はまた、本発明の阻害剤を含む機能性化粧品組成物に関する。
本発明の別の目的は、本発明の阻害剤を含むかそれからなるか本質的にそれからなる保全液または保護液である。
一実施形態では、保全液は、臓器、生体組織および／または生細胞の保全のためのものである。一実施形態では、前記臓器としては、限定されないが、心臓、肝臓、腎臓、肺、膵臓、腸、皮膚および角膜が挙げられる。一実施形態では、前記臓器は移植、すなわち、任意の臓器または体組織のそれの元の部位からレシピエント部位への移動のためのものである。特に、同種移植片移植手順では、元の移植片の部位は、ドナー個体中にあり、レシピエント部位は、別のレシピエント個体中である。
一実施形態では、保全液は、０．１μＭ〜１２０μＭの範囲の濃度の、すなわち、約０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭまたは１２０μＭの濃度の本発明の阻害剤を含む。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、全身投与または局所投与される。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、経口で、注射によって、局所的に、経鼻で、頬側に、直腸内に、膣内に、気管内に、内視鏡で、経粘膜で、および経皮投与で、投与される。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、注射、好ましくは全身注射される。全身注射に適した製剤の例としては、限定されないが、液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態が挙げられる。全身注射の例としては、限定されないが、静脈内、皮下、筋肉内、皮内および腹腔内注射ならびに灌流が挙げられる。別の実施形態では、注射の場合、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は無菌である。無菌医薬組成物を得るための方法としては、限定されないが、ＧＭＰ合成（ＧＭＰは「優良医薬品製造基準」を表す）が挙げられる。
別の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は経口投与される。経口投与に適した製剤の例としては、限定されないが、固体形態、液体形態およびゲルが挙げられる。経口投与に適した固体形態の例としては、限定されないが、丸薬、錠剤、カプセル、軟ゼラチンカプセル、硬ゼラチンカプセル、カプレット、圧縮錠剤、カシェ剤、ウェーハ、糖衣丸剤、糖衣錠剤、または分散錠／または崩壊錠、粉末、経口投与前の液体中への溶解または懸濁に適した固体形態および発泡錠が挙げられる。経口投与に適した液体形態の例としては、限定されないが、溶液、懸濁液、飲用に適した溶液、エリキシル剤、密閉薬びん、頓服水剤、飲薬、シロップおよび水薬が挙げられる。
別の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は局所投与される。局所投与に適した製剤の例としては、限定されないが、スティック、リップスティック、ワックス、クリーム、ローション、軟膏、香膏、ゲル、グロス、日焼け止め製剤、化粧品、マスク、洗い流さない洗浄剤またはクレンザー、脱毛製剤などが挙げられる。
局所投与は、例えば、手、指または多種多様な塗布装置（ロールアップ、ロールオンもしくは他のスティック容器、チューブ容器、綿ボール、化粧用パフ、綿棒、ポンプ、ブラシ、マット、布など）を用いて、局所的効果のために本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物を目的の部位（一般に、露出された目視で観察可能な表皮の最も外側の層などのその１つまたは複数の露出面または外面）に直接に送達、投与または塗布することを特徴とする。塗布は、例えば、皮膚に塗る、置く、擦り付ける、撫で付ける、注ぐ、延ばす、および／またはマッサージすることによって、あるいはあらゆる他の好都合または好適な方法によって行ってもよい。局所投与は、本組成物の成分の対象の血流内へのあらゆる顕著な吸収を生じさせることなく（全身作用を回避するように）達成することが好ましい。
本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物を、例えば、防腐剤としての１％または２％（ｗ／ｗ）ベンジルアルコール、乳化蝋、グリセリン、パルミチン酸イソプロピル、乳酸、精製水およびソルビトール溶液と混合して、白色の滑らかで均質かつ不透明なクリームまたはローションを形成することができる。さらに、本組成物はポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００）を含有し得る。それらを例えば、防腐剤としての２％（ｗ／ｗ）ベンジルアルコール、白色ペトロラタム、乳化蝋およびテノックスＩＩ（ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、クエン酸、プロピレングリコール）と混合して軟膏を形成することができる。包帯材料の織布パッドまたはロール、例えばガーゼを本組成物の溶液、ローション、クリーム、軟膏に含浸させることができ、あるいは他のそのような形態も局所塗布のために使用することができる。
別の実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、組成物を含浸させて不透過性裏地に積層した、樹脂架橋剤を含むアクリル系ポリマー接着剤の１種などの経皮システムを用いて局所塗布することもできる。
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、経皮パッチ、より具体的には徐放経皮パッチとして投与することができる。この経皮パッチは、例えば、接着性マトリックス、ポリマーマトリックス、リザーバーパッチ、マトリックスまたは一体型積層構造などのあらゆる従来の形態を含むことができ、一般に１つまたは複数の裏打ち層、接着剤、浸透促進剤、任意の律速膜および塗布前に接着剤を露出させるために除去される剥離ライナーを含む。ポリマーマトリックスパッチはポリマーマトリックス形成材料も含む。好適な経皮パッチは、例えば、米国特許第５，２６２，１６５号、同第５，９４８，４３３号、同第６，０１０，７１５号および同第６，０７１，５３１号にさらに詳細に記載されており、その各開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
経皮投与に適した製剤の例としては、限定されないが、軟膏、ペースト、クリーム、フィルム、香膏、例えば、経皮パッチなどのパッチ、ゲル、リポソーム形態などが挙げられる。
一実施形態では、経皮組成物は、軟膏、ペースト、クリーム、フィルム、香膏、例えば、経皮パッチなどのパッチ、ゲル、リポソーム形態などである。
本発明の一実施形態では、軟膏は油性軟膏、例えば水中油型または油中水型軟膏などの乳化軟膏または水溶性軟膏であり、好ましくは油性軟膏である。
本発明の一実施形態では、油性軟膏は、例えば、植物および動物油、植物および動物脂肪、ワックス、ワセリン（例えば白色ワセリンまたはワセリン油など）、ならびにパラフィン（例えば液体パラフィンまたはパラフィン油など）などの基剤を使用する。
本発明の一実施形態では、経皮組成物は１種または複数の賦形剤をさらに含む。好適な薬学的に許容可能な賦形剤は当業者に周知である。好適な賦形剤の例としては、限定されないが、担体、乳化剤、硬化剤、レオロジー調整剤または増粘剤、界面活性剤、皮膚軟化剤、防腐剤、湿潤剤、緩衝剤、溶媒、保湿剤および安定化剤が挙げられる。
別の実施形態では、特定の投与経路は眼内であってもよい。別の実施形態では、投与経路は、例えば、点眼薬の投与または眼を本発明の阻害剤を含む点眼液に浸す、などの局所眼投与であってもよい。
点眼液は、眼球および／または結膜への投与、結膜嚢への挿入あるいは後眼部内への投与を目的とした無菌の液体、半固体または固体製剤を意味する。本明細書で使用される場合、「後眼部」という用語は、前部硝子体膜およびその後ろの構造体（硝子体液、網膜、脈絡膜、視神経）を含む眼の後部３分の２を意味する。特に、眼科用組成物は、例えば硝子体内注射によって硝子体内に投与してもよい。眼科用組成物の例としては、限定されないが、点眼薬、洗眼液、点眼薬のための粉末および洗眼液のための粉末ならびに結膜嚢または硝子体内に注射される組成物が挙げられる。
担体の例としては、限定されないが、水、緩衝生理食塩水、石油ゼリー（ワセリン、白色軟パラフィンとしても知られている）、ペトロラタム、油（例えば、鉱油、植物油、動物油、パラフィン油、ヒマシ油またはワセリン油など）、有機および無機ワックス（例えば、微結晶性ワックス、パラフィンワックス、蜜蝋およびオゾケライトワックスなど）、天然ポリマー（例えば、キサンタンガム、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、澱粉またはアラビアゴムなど）、合成ポリマー、アルコール、ポリオールなどが挙げられる。本発明の一実施形態では、担体は乳化剤、油相成分および水相成分を含むクリーム基剤である。
周知の軟膏またはローション基剤賦形剤の例としては、限定されないが、ワセリン、プラスチベース（商標）（ポリエチレン（平均分子量：約２１０００Ｄａ）および液体パラフィンを用いて調製された基剤）およびＥＳＭＡ−Ｐ（商標）（微結晶性ワックスから作製されている）が挙げられる。
乳化剤の例としては、限定されないが、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、カルボキシポリメチレン、ポリカルボフィル、ポリエチレングリコールおよびそれらの誘導体、単独または脂肪アルコール（例えば、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセトステアリルアルコールなど）と組み合わせた、例えば、ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリオキシエチレンおよびその誘導体、ならびにソルビタンエステル（例えば、ソルビタン脂肪酸エステルなど）が挙げられる。
油相成分の例としては、限定されないが、ワセリン（例えば、白色ワセリン、黄色ワセリンまたはワセリン油など）、パラフィン（例えば、液体パラフィンまたはパラフィン油など）、ジメチコンおよびそれらの混合物が挙げられる。
水相成分の例としては、限定されないが、水、グリセロールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
硬化剤の例としては、限定されないが、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコールおよびセチルアルコールが挙げられる。
レオロジー調整剤または増粘剤の例としては、限定されないが、カルボマー（例えば、カーボポール（登録商標）など）およびポリオキシエチレン獣脂アミン（例えば、エトミーン（登録商標）など）が挙げられる。
界面活性剤の例としては、限定されないが、アニオン性、カチオン性、両性および非イオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、セトステアリルアルコール、セチルアルコール、ラウリル硫酸マグネシウム、ワックスまたはそれらの組み合わせなどが挙げられる。
皮膚軟化剤の例としては、限定されないが、白色または黄色ペトロラタム（白色または黄色ワセリン）、液体ペトロラタム（液体ワセリン）、パラフィンまたはアクアフォーが挙げられる。
防腐剤の例としては、限定されないが、例えば、ニパギン（ヒドロキシ安息香酸メチル）、ニパソール（ヒドロキシ安息香酸エステル）、ブチルパラベン、エチルパラベン、メチルパラベン、プロピルパラベンカリウム、プロピルパラベンナトリウム、パラヒドロキシ安息香酸エステル、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸、パラベン、クロロブタノール、フェノール、チメロサール、安息香酸ナトリウムおよびベンジルアルコールなどの抗菌性防腐剤が挙げられる。
湿潤剤の例としては、限定されないが、プロピレングリコールおよびアルギン酸プロピレングリコールが挙げられる。
緩衝剤の例としては、限定されないが、水酸化ナトリウム、クエン酸および水酸化カリウムが挙げられる。
溶媒の例としては、限定されないが、水、イソプロパノール、ベンジルアルコールおよびプロピレングリコールが挙げられる。
保湿剤の例としては、限定されないが、グリセリン、鉱油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油およびワセリン、プロピレングリコール、パラフィン、ワックス（例えば、蜜蝋など）、ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物（例えば、マクロゴール（マクロゴールは異なる分子量のポリエチレングリコールからなる混合物である）など）、ステアリルアルコール、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸エステル（パラベン）、ゲル化炭化水素、クエン酸、スクアレン、ラノリン、グリセリン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、動物および植物脂肪、油、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛およびそれらの混合物が挙げられる。
安定化剤の例としては、限定されないが、炭水化物（例えば、スクロース、ラクトースおよびトレハロースなど）、糖アルコール（例えば、マンニトールおよびソルビトールなど）、アミノ酸（例えば、ヒスチジン、グリシン、フェニルアラニンおよびアルギニンなど）が挙げられる。
本発明の一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物を、薬剤の中枢神経系への送達を容易にする送達システムと共に使用してもよい。例えば、各種血液脳関門（ＢＢＢ）透過性促進剤を使用して、治療薬に対する血液脳関門の透過性を一時的かつ可逆的に高めてもよい。そのようなＢＢＢ透過性促進剤としては、限定されないが、ロイコトリエン、ブラジキニン作動薬、ヒスタミン、タイトジャンクションディスラプター（例えば、ゾヌリン、ゾット）、高浸透圧溶液（例えば、マンニトール）、細胞骨格収縮剤（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、および短鎖アルキルグリセロール（例えば、１−Ｏ−ペンチルグリセロール）が挙げられる。経口、舌下、非経口、埋込、経鼻および吸入経路により活性薬剤の中枢神経系への送達を行うことができる。いくつかの実施形態では、本発明の化合物を末梢神経系に対する影響を最小にして中枢神経系に投与し得る。
血液脳関門（ＢＢＢ）は物理的障壁であり、中枢神経系（ＣＮＳ）の血管とＣＮＳそれ自体の大部分の領域との間の細胞輸送機序システムである。ＢＢＢは血液からの有害である可能性のある化学物質の進入を制限し、かつ必須栄養素の進入を可能にすることによって恒常性を維持する。しかし、ＢＢＢは障害の治療または認知、学習および記憶などの正常で、望ましい脳機能を維持または促進するための、薬剤のＣＮＳへの送達に対する手ごわい障壁になり得る。
一実施形態では、本阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、徐放形態で投与される。別の実施形態では、本組成物、医薬組成物または薬物は、調節剤の放出を制御する送達システムを含む。
一実施形態では、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、当業者によって決定され、各対象に個人的に適合させた用量で投与される。
本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の総１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることは理解されよう。どの特定の患者のための具体的な治療的有効量も、治療されている疾患および疾患の重症度、用いられる特定の組成物、対象の年齢、体重、総体的な健康、性別および食事、投与時間、投与経路、治療の持続期間、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物と組み合わされるか同時に使用される薬物、および医術で周知の同様の因子などを含む種々の要因に依存するであろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低いレベルで治療用化合物の投与を開始して所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることは十分に当業者の範囲内であるが、反対に、負荷用量（より迅速に定常状態血漿中濃度に到達するための方法）で開始し、その後に排出過程の効果を正確に補償するように計算した維持用量を投与することも同様に有用であり得る。
一実施形態では、治療的有効量の本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、少なくとも１日１回、１日２回、少なくとも１日３回投与される。
別の実施形態では、治療的有効量の本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、２日ごとに、３日ごとに、４日ごとに、５日ごとに、６日ごとに投与される。
別の実施形態では、治療的有効量の本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、１週間に２回、毎週、２週間ごとに、１ヶ月に１回投与される。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約１μｇ／日〜約１００ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約５０ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約１０ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約９ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約８ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約７ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約６ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約５ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約４ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約３ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約２ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約１ｍｇ／日、約１μｇ／日〜約１００μｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約１μｇ／日〜約１０ｍｇ／日、約５μｇ／日〜約１０ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約７．５ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約５ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約２．５ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約２ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約１ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約０．７５ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約０．５ｍｇ／日、約１０μｇ／日〜約０．２５ｍｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．１ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、約０．１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、約０．５ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日、約０．５ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日、約０．５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、約０．５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、約０．５ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日、約１ｍｇ／日〜約２０００ｍｇ／日、約１ｍｇ／日〜約１５００ｍｇ／日、約１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日、約１ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日、約１ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約１μｇ／日、約２μｇ／日、約４μｇ／日、約６μｇ／日、約８μｇ／日、約１０μｇ／日、約１５μｇ／日、約２０μｇ／日、約２５μｇ／日、約３０μｇ／日、約３５μｇ／日、約４０μｇ／日、約４５μｇ／日、約５０μｇ／日、約５５μｇ／日、約６０μｇ／日、約６５μｇ／日、約７０μｇ／日、約７５μｇ／日、約８０μｇ／日、約８５μｇ／日、約９０μｇ／日、約９５μｇ／日、約１００μｇ／日、約１５０μｇ／日、約２００μｇ／日、約２５０μｇ／日、約３００μｇ／日、約３５０μｇ／日、約４００μｇ／日、約４５０μｇ／日、約５００μｇ／日である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．１ｍｇ／日、０．２ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．４ｍｇ／日、０．５ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、０．７ｍｇ／日、０．８ｍｇ／日、０．９ｍｇ／日、１ｍｇ／日、２ｍｇ／日、４ｍｇ／日、６ｍｇ／日、８ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、１５ｍｇ／日、２０ｍｇ／日、２５ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、３５ｍｇ／日、４０ｍｇ／日、４５ｍｇ／日、５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１２５ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、１７５ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、４００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、７００ｍｇ／日、８００ｍｇ／日、９００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、１２００ｍｇ／日、１４００ｍｇ／日、１６００ｍｇ／日、１８００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．９ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約１０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．１μｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５μｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．２ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．０７５ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日〜約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約９ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．１μｇ／ｋｇ／日、約０．２μｇ／ｋｇ／日、約０．４μｇ／ｋｇ／日、約０．６μｇ／ｋｇ／日、約０．８μｇ／ｋｇ／日、約１μｇ／ｋｇ／日、約１．５μｇ／ｋｇ／日、約２．０μｇ／ｋｇ／日、約２．５μｇ／ｋｇ／日、約３．０μｇ／ｋｇ／日、約３．５μｇ／ｋｇ／日、約４．０μｇ／ｋｇ／日、約４．５μｇ／ｋｇ／日、約５．０μｇ／ｋｇ／日、約５．５μｇ／ｋｇ／日、約６．０μｇ／ｋｇ／日、約６．５μｇ／ｋｇ／日、約７．０μｇ／ｋｇ／日、約７．５μｇ／ｋｇ／日、約８．０μｇ／ｋｇ／日、約８．５μｇ／ｋｇ／日、約９．０μｇ／ｋｇ／日、約９．５μｇ／ｋｇ／日、約１０．０μｇ／ｋｇ／日、約１５．０μｇ／ｋｇ／日、約２０．０μｇ／ｋｇ／日、約２５．０μｇ／ｋｇ／日、約３０．０μｇ／ｋｇ／日、約３５．０μｇ／ｋｇ／日、約４０．０μｇ／ｋｇ／日、約４５．０μｇ／ｋｇ／日、約５０．０μｇ／ｋｇ／日である。
本発明の一実施形態では、対象に投与される阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物の１日量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０９ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約２ｍｇ／ｋｇ／日、約２．５ｍｇ／ｋｇ／日、約３ｍｇ／ｋｇ／日、約３．５ｍｇ／ｋｇ／日、約４ｍｇ／ｋｇ／日、約４．５ｍｇ／ｋｇ／日、約５ｍｇ／ｋｇ／日、約６ｍｇ／ｋｇ／日、約７ｍｇ／ｋｇ／日、約８ｍｇ／ｋｇ／日、約９ｍｇ／ｋｇ／日、約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約１２ｍｇ／ｋｇ／日、約１４ｍｇ／ｋｇ／日、約１６ｍｇ／ｋｇ／日、約１８ｍｇ／ｋｇ／日、約２０ｍｇ／ｋｇ／日である。
本発明の一実施形態では、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、約１μｇ〜約１００ｍｇ、約１μｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約１０ｍｇ、約１μｇ〜約９ｍｇ、約１μｇ〜約８ｍｇ、約１μｇ〜約７ｍｇ、約１μｇ〜約６ｍｇ、約１μｇ〜約５ｍｇ、約１μｇ〜約４ｍｇ、約１μｇ〜約３ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約１μｇ〜約１ｍｇ、約１μｇ〜約１００μｇの量で投与される。
本発明の一実施形態では、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、約１μｇ〜約１０ｍｇ、約５μｇ〜約１０ｍｇ、約１０μｇ〜約７．５ｍｇ、約１０μｇ〜約５ｍｇ、約１０μｇ〜約２．５ｍｇ、約１０μｇ〜約２ｍｇ、約１０μｇ〜約１ｍｇ、約１０μｇ〜約０．７５ｍｇ、約１０μｇ〜約０．５ｍｇ、約１０μｇ〜約０．２５ｍｇの量で投与される。
別の実施形態では、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、約０．０２ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約１５００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約５００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約２００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約１００ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約５０ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約２５ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．０２ｍｇ〜約５ｍｇの量で投与される。
別の実施形態では、本発明の阻害剤、組成物、医薬組成物、薬物、化粧品組成物または機能性化粧品組成物は、約０．０２ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、０．６ｍｇ、０．７ｍｇ、０．８ｍｇ、０．９ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇ、３ｍｇ、３．５ｍｇ、４ｍｇ、４．５ｍｇ、５ｍｇ、５．５ｍｇ、６ｍｇ、６．５ｍｇ、７ｍｇ、７．５ｍｇ、８ｍｇ、８．５ｍｇ、９ｍｇ、９．５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１０００ｍｇ、１２００ｍｇ、１４００ｍｇ、１６００ｍｇ、１８００ｍｇ、２０００ｍｇの量で投与される。
一実施形態では、本発明の方法は長期治療のためのものである。別の実施形態では、本発明の方法は急性治療のためのものである。
本発明の一実施形態では、対象は、遊離酸素ラジカル関連疾患であると診断されている。本発明の別の実施形態では、対象は、遊離酸素ラジカル関連疾患を発症するリスクがある。
一実施形態では、前記対象は成人、十代の若者、小児、幼児または新生児である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を対象に投与することを含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を対象に投与することを含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の心筋梗塞の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の心筋梗塞の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の心筋梗塞の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の心不全の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の心不全の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の心不全の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の肺高血圧症の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の肺高血圧症の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の肺高血圧症の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の虚血再灌流障害の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の虚血再灌流障害の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の虚血再灌流障害の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、治療および／または予防を必要とする対象の老化疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、治療および／または予防を必要とする対象の老化疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、治療および／または予防を必要とする対象の老化疾患の治療および／または予防方法；またはその治療および／または予防のための方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、インスリン分泌を増大させることを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を投与することを含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、インスリン分泌を増大させることを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を投与することを含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、インスリン分泌を増大させることを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤の対象への投与を含む、ニューロンを保護することを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を投与することを含む、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、ニューロンを保護することを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、有効量のミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤を投与することを含む、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、ニューロンを保護することを必要とする対象において、それを実施する方法である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存する方法であって、該方法は、前記臓器、生体組織および／または生細胞を、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤と接触させることを含む。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、臓器、生体組織および／または生細胞を保存する方法であって、該方法は、前記臓器、生体組織および／または生細胞を、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤と接触させることを含む。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、臓器、生体組織および／または生細胞を保存する方法であって、該方法は、前記臓器、生体組織および／または生細胞を、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤と接触させることを含む。
本発明の別の目的は、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、または治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、または治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、または治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、またはその治療および／または予防に使用するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤である。
本発明の別の目的は、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することにより、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することなく、遊離酸素ラジカルの産生を阻害することを必要とする対象においてそれを実施するための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、少なくとも１種の遊離酸素ラジカル関連心臓血管疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心筋梗塞の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心不全の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、心毒性、好ましくはアントラサイクリンの心毒性、抗癌剤の心毒性、キノロンの心毒性および／または抗ウイルス薬の心毒性、より好ましくはアントラサイクリンの心毒性を治療および／または予防するための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、肺高血圧症の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、虚血再灌流障害の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、老化疾患の治療および／または予防のための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌の増大のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、インスリン分泌を増大させるための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンの保護のための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、ニューロンを保護するための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための薬物の製造における、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための薬物の製造における、複合体Ｉの部位ＩＱでミトコンドリアに作用することによる、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
本発明の別の目的は、好ましくは移植手順の前に、臓器、生体組織および／または生細胞を保存するための薬物の製造における、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害することのない、ミトコンドリアのＲＯＳ産生阻害剤または選択的阻害剤の使用である。
以下の実施例により本発明をさらに例示する。
化学的実施例
一般実験手順
試薬および溶媒
全ての合成グレードの試薬および溶媒は、供給されたままで使用した。反応に使用した溶媒は乾燥し、必要に応じ最先端技術により蒸留した。いくつかの溶媒は、乾燥品として市販されており、そのままで使用した。
反応条件
乾燥条件が必要な場合には、ガラス器具をオーブン乾燥し、反応を窒素雰囲気下で実施した。室温（ｒ．ｔ．）は、２０〜２５℃を意味する。−７８℃の反応温度は、固体ＣＯ２とアセトンを用いて得た。０℃の反応温度は、氷浴を用い、加熱が必要な場合は、接触温度計を備えた油浴を使用した。
反応は、ＴＬＣでモニターした。ＴＬＣは、シリカゲルおよび蛍光指示薬を塗布した、Ｍｅｒｃｋ，ＤＣ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４プレートＵＶ２５４プレコートアルミニウムシートを用いて実施した。使用した指示薬には、リンモリブデン酸エタノール溶液を含めた。
フラッシュクロマトグラフィー
フラッシュカラムクロマトグラフィーによる粗生成物の精製には、シリカゲルであるＭＮ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０、１５〜４０ミクロングレード（マッハライ・ナーゲル社製）を用いた。試料をシリカ／溶媒カラムの上端に直接アプライするかドライシリカゲルスラリーとしてアプライした。
自動化フラッシュクロマトグラフィー
Ｔｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（登録商標）精製システムで、粗製試料を少量の適切な溶媒中に溶解し、ＲｅｄｉＳｅｐ（登録商標）プレパックカラムにアプライした。カラムをＴｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（登録商標）精製システム内に置き、溶媒勾配液プログラムを用いて自動精製を実施した。システムは、化合物がＵＶにより検出される自動画分収集設備と共に使用したか、または全画分を収集した。
核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）
ＮＭＲは、４００ＭＨｚ（１Ｈ）および１００ＭＨｚ（１３Ｃ）で稼働するＢｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａＳｈｉｅｌｄ測定器で記録した。重水素化溶媒からの残留溶媒のシフトを用いて、較正を実施した。ＣＤＣｌ３を溶媒として用いた場合、この溶媒の７．２６（１Ｈ）および７７．１６（１３Ｃ）のシグナルに対し、較正を実施した。分析する試料中に芳香族化合物が存在する場合、ＣＤＣｌ３にＭｅ４Ｓｉを加え、０．０（１Ｈ）でスペクトルを較正した。Ｄ２Ｏを使った場合、４．７９ｐｐｍ（１Ｈ）の水のシグナルを内部標準として選定した。ＣＤ３ＯＤの場合には、内部標準として、３．３１ｐｐｍ（１Ｈ）および４９．０ｐｐｍ（１３Ｃ ＮＭＲ）を選定した。（ＣＤ３）２ＳＯの場合には、内部標準として、２．５０ｐｐｍ（１Ｈ）および３９．５ｐｐｍ（１３Ｃ）を選定した。１９Ｆの場合には、ＣＦＣｌ３を外部基準として使用した。化学シフトは１００万分の１（ｐｐｍ）の単位で報告し、結合定数をヘルツ（Ｈｚ）で示す。プロトンおよび炭素シグナルの多重度の略語は、次の通りである：ｓ シングレット、ｄ ダブレット、 ｄｄ ダブレットのダブレット、ｄｔ トリプレットのダブレット、ｄｄｔ トリプレットのダブレットのダブレット、ｔ トリプレット、ｔｔ トリプレットのトリプレット、ｑ クインテット、ｍ マルチプレット。
質量分析（ＭＳ）および液体クロマトグラフィー・タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ）
質量分析は次記を備えた、Ｗａｔｅｒｓ ３１００ Ｍａｓｓ ｄｅｔｅｃｔｏｒ，Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５で実施した：ＥＳＩまたはＡＰＣＩによる１ｐｇ感度；数秒幅の高速ＬＣピークと完全適合するための、２，０００ダルトンまで１０，０００Ｄａ／秒のスキャン速度；ＺＳｐｒａｙ（商標）源による双直交サンプリングイオン化；支持型可変ＵＶ（ＴＵＶ）、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）、および蒸発光散乱（ＥＬＳ）光学検出器。または、質量分析は、ＵＰＬＣ／ＭＳ：Ｘｅｖｏ Ｇ２ Ｑｔｏｆ Ｔｈｅ Ｘｅｖｏ Ｇ２ ＱＴｏｆ質量分析計に、ＵＰＬＣ（登録商標）／ＭＳＥおよびＱｕａｎＴｏｆ技術を付加した装置で実施した。
融点分析
融点をＳＴＵＡＲＴ ＳＭＰ３測定器で測定した。
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
ＨＰＬＣ−ＤＡＤ分析を、適切な分析カラム、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア、Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ ６００ Ｍｕｌｔｉｓｏｌｖｅｎｔ送達システムおよびフォトダイオードアレイ検出器（Ｗａｔｅｒｓ ２９９６）および／または屈折計、システム制御装置（Ｗａｔｅｒｓ ６００）を備えたＷａｔｅｒｓ分析ＨＰＬＣシステムで実施し、また、２０μＬの試料ループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅ ｉｎｊｅｃｔｏｒ ７７２５ｉを使用した。
中間化合物（Ｃ）の合成
基本手順Ａ。磁気攪拌機を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、適切な市販のアリールエタノンおよびジメチルカーボネートを加える。水素化ナトリウム（鉱物油中６０％）を撹拌しながらゆっくり加えた後、全体を一晩還流する。混合物を水中に注ぎ込み、ＨＣｌ（２Ｍ）で酸性化し、酢酸エチルで抽出する。有機層を水（５０ｍＬ）および飽和ブライン溶液（５０ｍＬ）で洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去する。粗製材料を、適切な溶媒を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、対応するメチル ３−オキソ−３−アリールプロパノエートを得る。
中間体７、１１および１３を基本アルキル化手順Ａを用いて合成した。
中間体７：メチル ５−（３−メトキシ−３−オキソプロパノイル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート
Figure 2020511450
 アリールエタノンとしての６（１．０３ｇ、６．４７ｍｍｏｌ）、ジメチルカーボネート（１２ｍＬ）および水素化ナトリウム（２．５ｇ、６４．７ｍｍｏｌ）を用いて、基本アルキル化手順Ａにより反応を行った。後処理および精製後、化合物７を得た（ｍ＝１．４ｇ、７８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．３０（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７８（ｄｄ，Ｊ＝８．７，１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄｄ，Ｊ＝３．１，０．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｓ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ）．
中間体１１：メチル ３−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−３−オキソプロパノエート
Figure 2020511450
 アリールエタノンとしての１０（１．９ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）、ジメチルカーボネート（２４ｍＬ）および水素化ナトリウム（４．７５ｇ、１１８ｍｍｏｌ）を用いて、基本アルキル化手順Ａにより反応を行った。後処理および精製後、化合物１１を得た（ｍ＝５８０ｍｇ、２３％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１１．９４（ｓ，２Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．８Ｈｚ，２Ｈ），７．５８（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｓ，３Ｈ），３．６４（ｓ，６Ｈ）．
中間体１３：メチル ３−（ベンゾフラン−５−イル）−３−オキソプロパノエート
Figure 2020511450
 アリールエタノンとしての１２（１．４５ｇ、９．０６ｍｍｏｌ）、ジメチルカーボネート（２５ｍＬ）および水素化ナトリウム（２．１７ｇ、９０．６ｍｍｏｌ）を用いて、基本アルキル化手順Ａにより反応を行った。後処理および精製後、化合物１３を得た（ｍ＝１．５８ｇ、８０％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ（ｐｐｍ）８．３５（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．９８−８．０１（ｍ，１Ｈ），７．８９（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．００−７．０１（ｍ，１Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ）．
中間体９：メチル ３−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３−オキソプロパノエート
Figure 2020511450
 磁気攪拌機を備えた１００ｍＬの丸底フラスコに、水素化ナトリウム（鉱物油中６０％）（１ｇ、４８ｍｍｏｌ）、ジメチルカーボネート（４．２ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（３０ｍＬ）を加えた。テトラヒドロフラン（３０ｍＬ）中の市販アリールエタノン８（１．９４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を撹拌しながらゆっくり加え、全体を７２時間還流した。混合物を水中に溶注ぎ込み、飽和塩化アンモニウム（５０ｍＬ）で酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。減圧下で蒸発させた後、粗製材料を酢酸エチル中の結晶化により精製し、対応するメチル ３−オキソ−３−アリールプロパノエート ９を得た（ｍ＝１．８９ｇ、７５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１２．３３（ｓ，１Ｈ），８．２４（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｓ，２Ｈ），３．６５（ｓ，３Ｈ）．
化合物Ｃｐ１の合成
Figure 2020511450
 ステップ１．Ｃｐ１−メトキシ：５−（４−メトキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オン。酢酸水銀（ＩＩ）（４ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を、市販のジチオン１（１ｇ、４．１６ｍｍｏｌ）の、酢酸（ｖ＝２５ｍＬ）およびクロロホルム（ｖ＝８０ｍＬ）の混合物中の溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。全体を濾過し、留去した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル：アセトン＝９０：１０）に供し、黄色固体として、Ｃｐ１−メトキシ（８００ｍｇ、８５％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．５９（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．９８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），６．７７（ｓ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）１９４．２９，１７０．１３，１６２．５２，１２８．０８，１２５．０８，１１６．３０，１１４．７５，５５．６０．
ステップ２．Ｃｐ１：５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オン。メチルアリールエーテルのＣｐ１−メトキシ（４１０ｍｇ、１．８３ｍｍｏｌ）およびピリジン塩酸塩（６３０ｍｇ、５．５ｍｍｏｌ）の混合物を丸底フラスコに入れ、２５０Ｗで５分間のマイクロ波照射を実施した。変換が完了後、反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝９７：３）に供し、ジチオンＣｐ１（ｍ＝７０ｍｇ、１０％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）９．３１（ｓ，１Ｈ），７．８０−７．６６（ｍ，２Ｈ），７．０５−７．００（ｍ，２Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，アセトン−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１９２．９５，１７０．４８，１６１．０８，１６０．９６，１２８．３４，１２３．９４，１１６．２５，１１６．１６，１１５．１７．
化合物Ｃｐ２の合成
Figure 2020511450
 Ｃｐ２：５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オンオキシム。ヒドロキシルアミン塩酸塩（１４０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を、市販のジチオン２（２２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ）および酢酸ナトリウム（１６５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）のエタノール（ｖ＝５ｍＬ）中溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した後、減圧下で濃縮した。得られた固体をシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン）に供し、赤色固体として、ジチオンＣｐ２（ｍ＝５１ｍｇ、３２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１１．５５（ｓ，１Ｈ），１０．０８（ｓ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），７．０７（ｓ，１Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１６１．９９，１５９．８３，１５３．４６，１２８．３６，１２３．７１，１１６．３０，１１２．７７．
化合物Ｃｐ３の合成
Figure 2020511450
 参考文献：ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＆ ＭｃＫｉｎｎｏｎ，１９６７．Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．４５（１１）：１２２５−１２２９
ステップ１．Ｃｐ３−メトキシ：５−（４−メトキシフェニル）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン。二硫化炭素（１８ｍＬ）中の市販イソチオシアネート３（３ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）および五硫化リン（６ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）を、丸底フラスコに入れ、６５Ｗで１５分間のマイクロ波照射に供した。変換の完了後、溶液を濾過し、減圧下で留去した。オイル状の残留物をエタノール（約３０ｍＬ）で処理し、０℃に冷却した。粗製ジチオンを濾別し、（ジクロロメタン：エタノール＝１：１）から再結晶化して黄色固体Ｃｐ３−メトキシ（ｍ＝２２０ｍｇ、７％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．１２（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２６（ｓ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，３Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１８５．３５，１６０．７１，１２６．６５，１１９．０４，１１０．２３，５１．１０．
ステップ２．Ｃｐ３：５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン。メチルアリールエーテルのＣｐ３−メトキシ（３００ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（ｖ＝６ｍＬ）の混合物を丸底フラスコに入れ、０℃に冷却した。ジクロロメタン中の１Ｍの三臭化ホウ素（ｖ＝６ｍＬ、６ｍｍｏｌ）をゆっくり加え、全体を一晩撹拌した。変換の完了後、反応混合物を水中に注ぎ込み、懸濁液を得た。固形物を濾別し、水で洗浄した。ジクロロメタン中での沈殿により、所望のフェノールＣｐ３（ｍ＝２７０ｍｇ、９５％）を得る。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１１．０９（ｓ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）２１４．９３，１９１．６６，１６５．１２，１３２．１５，１２２．２２，１１７．２０．
化合物Ｃｐ４の合成
Figure 2020511450
 参考文献： Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２４（２４）：５８２９−５８３１
ステップ１．Ｃｐ４−メトキシ：４−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン。 メチル ２−（４−メトキシフェニル）−３−オキソプロパノエート４（３．７９ｇ、１９．５２ｍｍｏｌ）、ローソン試薬（７．８９ｇ、１９．５２ｍｍｏｌ）、および硫黄（３１３ｍｇ、９．５９ｍｍｏｌ）の２５０ｍＬのトルエン中混合物を、２７０分間加熱還流した。反応が完了すると、混合物を濾過し、濾液を濃縮した。カラムクロマトグラフィー（石油エーテル：アセトン＝１０：１）による精製により、赤色固体を得た。得られた固体をエーテルで洗浄し、アセトン中で結晶化し、Ｃｐ４−メトキシ（１．５６ｇ、３３％収率）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３７（ｓ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）２１４．１２，１６０．１０，１５３．０４，１４９．０８，１３０．２８，１２５．４３，１１３．８８，５５．３５．
ステップ２．Ｃｐ４：４−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン。メチルアリールエーテルのＣｐ４−メトキシ（１７１ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）およびピリジン塩酸塩（２６４ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）の混合物を丸底フラスコに入れ、２５０Ｗで５分間のマイクロ波照射を実施した。変換が完了後、反応混合物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝９７：３）に供し、ジチオンＣｐ４（ｍ＝５１ｍｇ、３２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，アセトン−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．９４（ｓ，１Ｈ），８．６７（ｓ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ）．
化合物Ｃｐ５の合成
Figure 2020511450
 基本手順Ｂ．五硫化リン（０．７ｍｍｏｌ）、硫黄（１ｍｍｏｌ）、ヘキサメチルジシロキサン ＨＭＤＯ（３ｍｍｏｌ）をキシレン（２．５ｍＬ）中、１４５℃で５分間加熱する。適切な メチル ３−オキソ−３−アリールプロパノエートを少しずつ加え、反応混合物を１時間還流し、反応を終了させる。その後、粗製チオンを濾別し、濾液を濃縮する。カラムクロマトグラフィーによる精製および結晶化により、対応するアリールジチオンを得る。
Ｃｐ５：５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン。化合物Ｃｐ５の合成は、中間体１１（５８０ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、Ｐ４Ｓ１０（６５８ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、硫黄（７９ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、ＨＭＤＯ（０．７６ｍＬ、７．６５ｍｍｏｌ）、およびキシレン（５ｍＬ）を用いて、基本加硫手順Ｂにより実施した。後処理、シリカゲル（ＴＨＦ）上での急速精製およびエタノールとアセトン中での結晶化後、Ｃｐ５（ｍ＝７０ｍｇ）を暗赤色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１２．０７（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｓ，１Ｈ），７．６６（ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）２１５．７３，１７３．９２，１５４．６１，１４６．６５，１３６．０６，１３２．０７，１２７．４８，１２２．３１，１１０．９４，１０８．６９．
化合物Ｃｐ６ａの合成
Figure 2020511450
 ＣＰ６ａ：５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン。中間体９（７００ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、Ｐ４Ｓ１０（６８０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、硫黄（８１．５ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、ＨＭＤＯ（１．６３ｍＬ、７．６５ｍｍｏｌ）、およびキシレン（６ｍＬ）を用いて、基本加硫手順Ｂにより反応を行った。後処理、シリカゲル（ＴＨＦ）上での急速精製およびＣ１８（アセトニトリル：水勾配液）上での逆相によるさらなる精製後、Ｃｐ６ａ（ｍ＝６．７ｍｇ）を赤色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．２６（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．８４（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｓ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７３．８５，１７０．５９，１４４．１３，１４０．３９，１３５．２４，１２６．３７，１２５．４８，１２２．２０，１１２．６２．
化合物Ｃｐ８の合成
Figure 2020511450
 Ｃｐ８：５−（ベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン。中間体１２（１．５８ｇ、７．２５ｍｍｏｌ）、Ｐ４Ｓ１０（１．９３ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）、硫黄（２３２ｍｇ、７．２５ｍｍｏｌ）、ＨＭＤＯ（０．７６ｍＬ、２１．７ｍｍｏｌ）、およびキシレン（１５ｍＬ）を用いて、基本加硫手順Ｂにより反応を行った。後処理、シリカゲル（ジクロロメタン）上での急速精製およびエタノールとアセトン中での結晶化後、Ｃｐ８（ｍ＝８９０ｍｇ）を黄色固体として得た。Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．２６（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８６−７．８１（ｍ，３Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（ｄｄ，Ｊ＝２．２，０．９Ｈｚ，１Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）２１５．６４，１７４．８４，１５６．７３，１４８．５１，１３５．８２，１２８．８２，１２６．８７，１２４．２５，１２１．２６，１１３．０４，１０７．６８．
化合物Ｃｐ９ａの合成
Figure 2020511450
 Ｃｐ９ａ：メチル ５−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２−ジチオール−５−イル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート。中間体７（７００ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、Ｐ４Ｓ１０（６８０ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）、硫黄（８１．５ｍｇ、２．５５ｍｍｏｌ）、ＨＭＤＯ（１．６３ｍＬ、７．６５ｍｍｏｌ）、およびキシレン（６ｍＬ）を用いて、基本加硫手順Ｂにより反応を行った。後処理、シリカゲル（ＴＨＦ）上での急速精製およびエタノールとアセトン中での結晶化後、我々は、Ｃｐ９ａ（ｍ＝５５ｍｇ）を暗赤色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）８．２０（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｄｄ，Ｊ＝８．７，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５９（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ）．１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ６）δ（ｐｐｍ）１７６．７８，１３８．９０，１３４．２７，１３２．５９，１２８．８５，１２２．８４，１２０．７２，１１１．５２，１０２．５７，３４．１２，３３．２４，３１．０９．
生物学的実施例
実施例１：ＡＯＬはミトコンドリアの酸化的リン酸化に影響を与えない
材料および方法
動物処置方法および倫理声明
記載されている全ての実験は、国家および欧州研究会議の実験動物の管理と使用に関する指針に準じて行った。Ｐ．Ｄｉｏｌｅｚは、フランス農林省の動物の健康および保護局（Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｆｏｒｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）による動物実験を行うための有効なライセンス（０３／１７／１９９９、ライセンス番号３３０８０１０）を有している。
材料
全ての化学薬品は、スクロースおよびＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手）以外は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した試薬グレードとした。トリチオアネトール化合物（ＡＯＬ、５−（４−メトキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオンに該当）は民間企業ＧＭＰＯ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から譲り受けた。１５ｍＭのストック溶液をＤＭＳＯ中で調製し、数日間だけ０℃で暗所に保管した。
ミトコンドリアの単離
雄のウィスターラット（２５０〜３２５ｇ；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ，Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから入手）をスタニングおよび頸椎脱臼によって屠殺し、心臓を迅速に取り出し、１００ｍＭのスクロース、１８０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）の脱脂ＢＳＡ（ｐＨ７．２）を含有する低温の単離培地で洗浄した。
心臓ミトコンドリアの単離を冷室で行った。ホモジナイゼーションの前に心臓（約１．５ｇ）をハサミで細かく刻み、プロテアーゼ（１ｍＬの単離緩衝液当たり２ｍｇの細菌プロテイナーゼＸＸＩＶ型）を補充した５ｍＬの同じ培地中で撹拌しながら５分間処理した。その組織懸濁液を５０ｍｌのガラス製ポッター型ホモジナイザーの中に注ぎ込み、２０ｍＬの単離緩衝液で希釈し、次いで電動テフロン乳棒を用いて３分間ホモジナイズした。ホモジネートを篩絹（Ｓｅｆａｒ Ｎｉｔｅｘ）で濾過してデブリを除去し、８，０００ｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを５ｍＬの単離緩衝液で濯ぎ、２５ｍＬの同じ緩衝液に再懸濁した後、８分間、低速遠心分離（４００ｇ）を行った。得られた上澄みを７，０００ｇで１５分間の遠心分離を２回行い、洗浄したミトコンドリアのペレットを得、これを１５０μＬの単離緩衝液に静かに再懸濁した。ＢＳＡを標準液として用いて、ブラッドフォード法（Ｓｉｇｍａ、キット番号Ｂ６９１６）によってタンパク質濃度を測定した。ミトコンドリアを４０〜５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、５時間未満にわたり氷上で保持した。
ミトコンドリア呼吸
漸増用量（０〜８０μＭの最終濃度）のＡＯＬの非存在または存在下でインキュベートした心臓ミトコンドリア（０．１ｍｇ／ｍＬ）の酸素消費率を、高分解能酸素濃度計（Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２Ｋ、Ｏｒｏｂｏｒｏｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて２５℃で一定速度で撹拌しながらポーラログラフィーで記録した。呼吸培地は、１４０ｍＭのスクロース、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および本質的に脂肪酸を含まない１ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ｐＨ７．２）で構成された。
ミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生
心臓ミトコンドリアからのＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生速度を外来性西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＥＣ１．１１．１．７、Ｓｉｇｍａ）の存在下で無色の非蛍光指示薬アンプレックスレッドの酸化によって評価した。Ｈ２Ｏ２をアンプレックスレッドと１：１の化学量論比で反応させて、蛍光化合物レゾルフィン（励起：５６０ｎｍ、発光：５８５ｎｍ）を得る。このレゾルフィンは、一旦形成されると安定である。温度制御および撹拌機能を備えた分光蛍光光度計（ＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ，Ｍｏｎａｃｏ）を用いて蛍光を連続的に測定した。単離したミトコンドリア（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１５μＭのアンプレックスレッドおよび１０μｇ／ｍＬのＨＲＰを補充した以前のものと同じ実験用緩衝液中でインキュベートした。グルタミン酸（５ｍＭ）／リンゴ酸（２．５ｍＭ）をコハク酸（５ｍＭ）と共に、それぞれ、複合体Ｉおよび複合体ＩＩ基質として使用した。１５μＭのアトラクチロシドの存在下での非リン酸化条件、すなわちミトコンドリア膜が最大となる状態ＩＶ条件下で実験を行った。その後、ロテノン（１．５μＭ）、アンチマイシンＡ（２μＭ）およびミキソチアゾール（０．２μＭ）を順次添加して電子伝達鎖内の酸化還元中心（図２を参照）、すなわち部位ＩＱ、ＩＦ（ロテノンにより阻害）、ＩＩＩＱｉ（アンチマイシンＡにより阻害）およびＩＩＩＱＯ（ミキソチアゾールにより阻害）を阻害した。最後にアッセイを、ＡＯＬを含む全ての関連化合物の存在下で既知の量のＨ２Ｏ２（３００ｎＭのステップ）で較正した。アンプレックスレッドアッセイそれ自体およびＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＬの効果がない対照試験を、心臓ミトコンドリアの非存在下およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ＥＣ１．６．３．３、５ｍＵ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社）およびＮＡＤＨ（１００μＭ）溶液の存在下で行った。
結果
我々は最初に、ＡＯＬ化合物がラットの心臓から単離したミトコンドリアに対する酸化的リン酸化に直接には影響を与えないことを確認した（図１）。これを今では古典的であるオキシグラフ法を用いて行った。ミトコンドリアを最初に各種ＡＯＬ濃度（５〜８０μＭ）でインキュベートし、次いで呼吸基質を添加し（基質状態、黒色の曲線）、その後、ＡＤＰ濃度を飽和させて最大の酸化的リン酸化率（灰色の曲線）を得、最後にＡＤＰ／ＡＴＰトランスロケーターを阻害し、非リン酸化条件下でミトコンドリアの漏出率を生じさせるアトラクチロシド（ＡＴＲ）を添加した（図１Ａ）。図１Ｂ〜図１Ｄの他のパネルは異なる呼吸基質の組み合わせ、すなわち複合体Ｉに電子を与えるグルタミン酸＋リンゴ酸、複合体ＩＩに電子を与えるコハク酸（＋ロテノン）、および両複合体に電子を与えるグルタミン酸＋リンゴ酸＋コハク酸で得られた結果を示す。クレブス回路が機能し、かつコハク酸およびＮＡＤＨの両方が呼吸鎖によって酸化されるインビボ条件に最も酷似しているために、この最後の基質組み合わせを選択した。その結果は、試験した広範囲の濃度についてＡＯＬの存在下において統計学的差異が観察されなかったことを示しており（図１）、これはミトコンドリアの酸化的リン酸化、すなわち呼吸鎖活性およびＡＴＰ合成の両方ならびにミトコンドリアの内膜完全性（ＡＴＲ添加後の漏出率）に対するこれらの条件下でのＡＯＬの効果がないことを実証している。この最後の結果は、ＡＯＬが酸化的リン酸化収率に影響を与えないことを示している。まとめると、全てのこれらの結果から、ヒトの健康のためのこの薬物の長期間の使用により報告されている、ＡＯＬのどのような有害な効果も存在しないことが確認される。
実施例２：ＡＯＬはミトコンドリアによるスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生を阻害する
既に述べたように、ミトコンドリアＲＯＳ産生はミトコンドリアの活性および条件に大きく依存している。我々は数多くの条件下でミトコンドリアによるＲＯＳ産生に対するＡＯＬの効果を試験したが、明確性のためにＡＯＬの非常に特異的な効果の最も立証的な結果のみを本明細書に示すことを選択した。既に考察したように、呼吸鎖全体に電子を与える基質の組み合わせ（すなわち、グルタミン酸、リンゴ酸およびコハク酸）（図２Ａ）の存在は、代謝が活性である細胞における最も特有のインサイツ条件である。さらに、最大のミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生はミトコンドリアの高リン酸化条件下では生じないが電子輸送体が大きく減少する条件下、すなわち低リン酸化条件またはリン酸化が存在しない条件下で生じる。これらの条件は、ＡＴＲの存在下（ＡＴＲによるＡＴＰ／ＡＤＰトランスロケーターの阻害）（図１）で満たされ、我々は飽和ＡＤＰ条件下でＡＴＲを添加することによりＲＯＳ産生が引き起こされることを完全に確認することができ、これは最大のリン酸化条件下での検出限界であった（結果は示さず）。これらの条件下では、ＲＯＳは呼吸鎖の異なる部位において産生される（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９；Ｑｕｉｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．１：３０４−３１２）（図２）。主要な産生部位は複合体ＩおよびＩＩＩに位置しており、ここでは電子の位置エネルギーの大きな変化が生じ（Ｂａｌａｂａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｃｅｌｌ．１２０（４）：４８３−４９５；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（１）：２０９−２７）、これにより、これらの部位におけるプロトンポンピングも可能になる。
我々は、最大のＲＯＳ産生条件下で呼吸鎖全体によるＲＯＳ産生に対するＡＯＬの作用を解明するために、一連の阻害剤滴定を設計した（図２Ｅ）。複合体の特異的阻害剤の非存在下ではＲＯＳ産生は最大となり、これは主に部位ＩＱにおける逆電子伝達により生じる（図２Ａ）。複合体Ｉの部位ＩＱ（キノン部位）または部位Ｉｆ（フラビン部位）のいずれかにより産生されるＲＯＳはミトコンドリア内膜の内側（すなわちマトリックス側）に送達されることに留意することが非常に重要である。ロテノン（ＩＱに特異的に結合する古典的な複合体Ｉ阻害剤）の添加後、ＲＯＳ産生は大きく減少し、部位ＩＩＩＱＯにおいてほぼ全体が生じ、残りの産生は複合体Ｉ基質の存在およびロテノンによって阻害されないＮＡＤＨ産生により部位Ｉｆで生じる（図２Ｂ）。その後のアンチマイシンＡ（チトクロームｃへの電子伝達阻害剤）の添加により、酸化されたキノンに対する還元されたキノンの比の増加が生じ、これは複合体ＩＩ活性によってさらに減少し、従って部位ＩＩＩＱＯにおけるＲＯＳ産生は付随的に増加する（図１Ｃ）。最後に、ミキソチアゾール（複合体ＩＩＩの部位ＩＩＩＱＯの阻害剤）の添加により複合体ＩＩＩのＲＯＳ産生が消失し、残りの非常に低い産生は複合体Ｉのフラビン部位によるものとみなすことができるが、我々はこのための既知の阻害剤を有していない（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（１）：２０９−２７）。
図３は、図２に規定されている異なる条件下で測定したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対する漸増濃度のＡＯＬ（５〜８０μＭ）の存在の効果を示す。この図に示されている結果から、ＡＯＬは阻害剤の非存在下で測定したＲＯＳ産生に対してのみ約８０％の影響を与えるが、他の条件下で測定したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２に対するこの範囲のＡＯＬ濃度について統計学的差異は観察されなかったことが明らかである。図２から分かるように、この特定の条件（ＡＴＲのみが存在）は、我々のアッセイにおいてＲＯＳが複合体Ｉ（部位ＩＱ）によって産生される唯一の条件である。ロテノンをこのアッセイに添加した場合、ＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生は、どの部位が関与したにせよ、また高濃度の場合であってもＡＯＬに対して感受性がないように思われる。ミトコンドリアＲＯＳ産生のいくつかの部位に対する効果の明らかな欠如は驚くべきものであるだけでなく、ミトコンドリアに対するＡＯＬの真の作用機序に関する興味深い疑問を呈するものでもある。実際には、これらの結果は過去の論文に記載されて、その治療的使用のための特許の基盤となるＡＯＬの作用モードの基本的な仮説を否定するものである。これらの結果はＡＯＬがラジカル捕捉剤ではないことを実質的に実証しており、もしＡＯＬがラジカル捕捉剤であれば、その作用はＲＯＳの由来とは無関係になるであろう。しかし、ＡＯＬは明らかに複合体Ｉの部位ＩＱでのＲＯＳ産生、さらには、その部位のみでＲＯＳ産生を大きく減少させることから、我々はＡＯＬがこの部位におけるＲＯＳの形成を特異的に阻害するという証拠を有する。
その機序はまだ調査中であるが、ＡＯＬ化合物が特異的にミトコンドリアの複合体Ｉを妨害し、他の部位からのスーパーオキシド産生または酸化的リン酸化に対して影響を与えることなく複合体Ｉのユビキノン結合部位（部位ＩＱ）からのスーパーオキシド産生を選択的に阻害するという証拠が本明細書に示されている。我々の知る限りでは、最近になって文献に記載されたばかりの匹敵する特性を有する唯一の１種の化合物、すなわちＮ−シクロヘキシル−４−（４−ニトロフェノキシ）ベンゼンスルホンアミドが存在する（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９）。ＡＯＬ同様に、この化合物は呼吸鎖の成分としての複合体Ｉの活性および酸化的リン酸化を変化させない。
実際にアンプレックスレッドを蛍光レゾルフィンに酸化することによりＨ２Ｏ２の出現を測定する、ミトコンドリアによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２の測定のために利用されるペルオキシダーゼ−アンプレックスレッドシステムを用いて、ＡＯＬの特異性をさらにインビトロで試験した（図４を参照）。ミトコンドリアの非存在下で、代わりにＨ２Ｏ２産生系を測定システムに追加して、この系に対するＡＯＬの効果を試験することができた。添加されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でＨ２Ｏ２を産生する市販のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用い、アンプレックスレッドのレゾルフィンへの還元を測定することにより、これを行った（図４）。我々は、これらの条件下では蛍光のどのような阻害も観察しなかったが、これはＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ活性に対するＡＯＬのいかなる効果をも否定するものである（結果は示さず）。これらの結果から、ＡＯＬは測定システムを妨害することもＨ２Ｏ２と直接相互作用することもないことが確認される。興味深いことに、これらの結果は、ＡＯＬがＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を阻害せず、また、ＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼが、細胞における（唯一ではないにしても）１つの主要な非ミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生物質であることも実証している。図４のスキームは、ミトコンドリアによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対するＡＯＬの作用モードに関する異なる情報を要約しており、本明細書に実証されている非常に高い特異性を強調している。これらの結果はラジカル捕捉剤としてのＡＯＬの推定上の効果に関する過去の断定と顕著に対照をなすものである。
ラットの心臓から単離したミトコンドリアについて試験した場合には、ＡＯＬはミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を有効に減少させる（単離したミトコンドリアにおいては、Ｈ２Ｏ２はミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼによるＲＯＳの還元により産生される）。しかし、本明細書に示されている結果により、ＡＯＬが単純な抗酸化剤またはラジカル捕捉剤として機能しないことが明確に実証されている。抗酸化剤は一般的なＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２捕捉剤であるが、ＡＯＬは複合体Ｉの部位ＩＱによるＲＯＳの形成に対して完全な選択性を示し、これはＡＯＬがスーパーオキシドラジカルと単純に相互作用しないが、複合体Ｉにおけるそれらの形成を特異的に防止することを実証している。従って、その点でＡＯＬは最新クラスの酸化ストレス保護剤のメンバーであるように見え、そのたった１つのメンバーはごく最近になって報告されたばかりである（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９）。抗酸化剤は一般に電子伝達を直接妨害せず、産生の下流でＲＯＳおよび／またはＨ２Ｏ２を捕捉し、従ってＲＯＳの効果を完全に抑制することはできない（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９）が、ＡＯＬはＲＯＳ形成を防止することにより異なって作用し、従って、ミトコンドリアをそれ自体のＲＯＳから保護するために、より活性であり得る。
本明細書に示されているデータはさらに踏み込んでＡＯＬがミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの部位ＩＱにおけるＲＯＳ形成の特異的阻害剤であることを実証している。しかし、さらなる実験はＡＯＬが他のミトコンドリア部位に対して完全に影響を与えないことを 確認することを求められるが、これは上記結論を妨げるものではない。我々は、ＡＯＬが細胞質ゾルにおける酸素ラジカル形成に影響を与えることなくミトコンドリアとのみ相互作用することができ、従って細胞内シグナル伝達に影響を与えないといういくつかの証拠も本明細書に示す。
ロテノンまたは神経毒ＭＰＰ＋による複合体Ｉ活性の阻害はげっ歯類およびヒトの両方におけるパーキンソニズムに関連づけられおり、これは複合体Ｉの機能障害、ＲＯＳ産生および神経変性間の関連性を示唆している（Ｌａｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１９（４５８７）：９７９−９８０；Ｂｅｔａｒｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（１２）：１３０１−１３０６）。対照的に、比較分析から、部位ＩＱからの最大のスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生と多様な脊椎動物種全体における最大寿命との反比例関係が分かっている（但し、部位ＩＦについては、この限りではない）（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．６（５）：６０７−６１８；Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．９（１）：７８−９１）。従って、部位ＩＱまたは部位ＩＦからのスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生の選択的調節剤により、正常および病理学的プロセスにおけるミトコンドリアＲＯＳ産生の推定上の役割を探るための特有の機会が得られる（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９）。議論の余地があるにしても、ＡＯＬによって影響を受けない部位ＩＩＩＱが低酸素状態中に細胞のシグナル伝達において重要な役割を担うといういくつかの推測もある。
結論として、ＡＯＬ特性は細胞におけるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生の特異的調節剤の探索における大きなブレークスルーであり得るように見える。これは研究における現在の重要な問題であり、ＡＯＬはヒトの使用のために既に認可されているため、新しく発見される分子に対して非常に大きな利点を有している。
−ＡＯＬはＲＯＳ産生の上流で作用するため古典的な抗酸化剤よりも高い保護を保証する；
−ＡＯＬはミトコンドリアＲＯＳ産生に対して特異的に作用する；
−ＡＯＬは数多くの疾患、特に心疾患にとって非常に重要なミトコンドリアの保護を保証する；
−ＡＯＬは細胞シグナル伝達を妨げない；
−ＡＯＬは、主要なミトコンドリア部位で、パーキンソン病および心細動などの重要な疾患に関与し得る複合体Ｉの部位ＩＱに特異的に作用する。
故に、ＡＯＬはミトコンドリア内部でのＲＯＳ産生を特異的に防止する新しいクラスの「保護剤」の最初のメンバーの代表となり得、従って各種酸化ストレス中にミトコンドリアの保護のために使用し得、従って非常に重要な細胞のＲＯＳシグナル伝達に対して非常に少ない副作用で疾患を防止し得る。
実施例３：心臓血管疾患：糖尿病におけるＡＯＬの効果
マウス膵島におけるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）に対する化合物ＡＯＬの効果
この研究の目的は、マウスから単離した膵島におけるグルコース刺激性インスリン分泌（ＧＳＩＳ）を調節する化合物ＡＯＬの能力を調査することであった。
材料および方法
実験は欧州連合勧告（２０１０／６３／ＥＵ）に厳密に遵守して行い、フランス農業水産省（認可番号３３０９００４）およびボルドー大学の倫理委員会によって認可された。使用する動物の苦痛および数を少なくするために最大の努力を行った。
３種類の独立した実験を行い、各実験のために２匹のマウスを屠殺し、以下にさらに記載する手順に従って膵島を単離した。
コラゲナーゼ消化法を用いて膵島を単離した。手短に説明すると、膵臓を０．３３ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５．６ｍＭのグルコースおよび１％のウシ血清アルブミン（ｐＨ７．３５）を含有するハンクス液で膨張させ、取り出して、３７℃で６〜９分間維持した。組織の消化および３回の連続洗浄による外分泌物の除去後に、双眼拡大鏡下で膵島を手で回収した。膵島は１１ｍＭのグルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含有し、２ｍＭのグルタミン、２００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、２００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、およびチャコールデキストラン処理した８％のウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地で２０〜２４時間培養することにより消化から回復させた。
各静的ＧＳＩＳ実験のために、２匹のマウスからの膵島を最初に９５％のＯ２：５％のＣＯ２の混合物（ｐＨ７．４）で平衡化した３ｍＬのクレブス−重炭酸塩緩衝液（１４ｍＭのＮａＣｌ、０．４５ｍＭのＫＣｌ、０．２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＨＥＰＥＳおよび３ｍＭのグルコース）中、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、５種のサイズを一致させた膵島からなる群を、３ｍＭのグルコース（Ｇｌｃ）および１１ｍＭのグルコース＋ビークル（クレブス−重炭酸塩緩衝液中の０．４％のＤＭＳＯ）または１１ｍＭのグルコース＋希釈試験薬物（ビークル中の１０μＭまたは２０μＭのＡＯＬ）刺激のうちのいずれか１つを含む０．５ｍＬの新しい緩衝液を含む２４ウェルプレートウェルに移し、さらに１時間インキュベートした。各実験条件のために６つの異なるウェルを使用した。インキュベーションの終わりに、ウシのアルブミンを１％の最終濃度になるまで各ウェルに添加し、プレートを４℃で１５分間放置してインスリン分泌を止めた。次に、培地を回収し、製造業者の説明書に従って、ＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎのキット）によるインスリン含有量のその後の測定のために−２０℃で貯蔵した。各ウェルにおけるインスリン分泌を１時間のインキュベーションごとに１つの膵島当たりのインスリン（ｎｇ）として計算し、次いで１１ｍＭのグルコースビークル群中のインスリン分泌（これを１００％とみなした）のパーセンテージとして表した。
実験群の説明を表１に示す。
Figure 2020511450
結果
３種類の実験のそれぞれで得られた個々のインスリン分泌値を合わせて平均した。これらを１１ｍＭのグルコースビークル群に対して正規化したインスリン分泌の相対的割合として表す（図５）。
合わせたデータ分析からＡＯＬが１０μＭおよび２０μＭの両方においてＧＳＩＳを増加させたことが分かり、これは１１ｍＭのグルコースビークル群と比較した場合に同様の効力を示し（一元配置分散分析、ボンフェローニの事後検定）、そのＧＳＩＳ増加は約６５〜７５％の範囲であった。統計分析については表２を参照されたい。
Figure 2020511450
結論
この調査は、試験した用量（１０μＭおよび２０μＭ）のＡＯＬがＧＳＩＳを増加させ、マウスから単離した膵島におけるインビトロでのインスリン分泌を有意に刺激することを実証している。
従って、これらの調査結果は、ＡＯＬが、１型糖尿病、２型糖尿病およびＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）などの他のタイプの糖尿病を含む、糖尿病などの、インスリン分泌が不十分な病的状態において特に有用であり得ることを示唆している。
食餌誘発性肥満マウスにおける食餌摂取量、体重およびグルコース代謝に対するＡＯＬによる長期治療の効果
材料および方法
この研究の目的は、高脂肪食（ＨＦＤ）を与えられた食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおいて毎日の腹腔内（ｉｐ）投与によって最長５週間にわたって５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量で毎日投与した化合物ＡＯＬが食餌摂取量、体重、脂肪症およびグルコース代謝を変化させるか否かを判定することであった。
薬理学的研究を開始する前の１２週間にわたり、マウスにＨＦＤ（脂肪、主としてラードからカロリーの６０％）を自由に摂取させた。動物に腹腔内（ｉｐ）投与によってＡＯＬまたはそのビークルを与え、この研究期間にわたってＨＦＤで維持した。食餌摂取量および体重を毎日測定し、最長で連続３週間記録した。
異なる実験群におけるマウスの適切な振り分けのために、薬理学的研究の開始前に、我々は、それらの体組成をＥｃｈｏ ＭＲＩ ９００（ＥｃｈｏＭｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）を用いてインビボで評価した（Ｃａｒｄｉｎａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ｍｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３（７）：７０５−１６；Ｃａｒｄｉｎａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１５６（２）：４１１−８も参照）。毎日の食餌摂取量および体重測定値を天秤（モデルＴＰ１５０２、Ｄｅｎｖｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて得た。
３０匹の７週齢の雄のＣ５７／Ｂｌ６Ｊマウスが２０１６年２月２５日に実験室に到着し、マウスを実験飼育室に１週間順応させた後、１回目のインビボ体組成分析（Ｅｃｈｏ ＭＲＩ ９００，ＥｃｈｏＭＲＩ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に供した。この１回目のＭＲＩ分析後に、動物に１２週間の期間にわたって高脂肪食（ＨＦＤ）を自由に与えた。その後、それらのマウスを２回目のＭＲＩ分析に供し、同等の体重および体組成の３つの実験群に振り分けた。
薬理学的治療を開始すると（１日目）、自身のホームケージに収容されている動物の食餌摂取量（ＦＩ）および体重（ＢＷ）を暗期前に毎日測定した。こぼれた餌を毎日確認した。最初の事前に測定した量からホッパーに残っている餌を差し引いて餌の消費量を計算した。連続３週間にわたってＦＩおよびＢＷを測定した。その後に、体組成（脂肪量および除脂肪量の変化）に対する治療の潜在的効果を観察するために動物を３回目のＭＲＩ分析に供し、続いて、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）およびインスリン負荷試験（ＩＴＴ）に供した。屠殺するまで全部で５週間の期間にわたり、マウスにＡＯＬまたはそのビークルの毎日のｉｐ投与を行った。
核磁気共鳴画像全身組成分析装置（Ｅｃｈｏ ＭＲＩ ９００；ＥｃｈｏＭｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して覚醒下マウスの体脂肪および除脂肪量を繰り返し評価した。
ＧＴＴおよびＩＴＴを定常的に使用してそれぞれグルコース負荷およびインスリン負荷中にグルコース代謝の動的調節を評価した。それらによりグルコース不耐性の存在およびホルモンインスリンの作用に対する起こり得る抵抗性に関する情報が得られる。
動物にＧＴＴのために１．５ｇ／ｋｇのＤ−グルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＩＴＴのために０．５Ｕ／ｋｇのインスリン（Ｈｕｍｕｌｉｎ，Ｌｉｌｌｙ，Ｆｒａｎｃｅ）をｉｐ注射した。ＧＴＴおよびＩＴＴのために動物を一晩絶食させた。これらの試験を翌朝行った。血液試料を尾静脈から異なる時点で（グルコースまたはインスリンのｉｐ投与から０、１５、３０、６０、９０および１２０分後に）採取し、グルコーススティック（ＯｎｅＴｏｕｃｈ Ｖｉｔａ，Ｌｉｆｅｓｃａｎ Ｆｒａｎｃｅ，Ｉｓｓｙ ｌｅｓ Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いてグルコース濃度を測定した。
屠殺時に血液試料を採取し、グルコーススティックを用いて血糖を迅速に評価し、次いで血液試料を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。得られた血漿をその後のインスリン測定のために−８０℃で貯蔵し、製造業者の説明書に従ってＥＬＩＳＡを実施し（Ｍｅｒｃｏｄｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎのキット）、インスリン測定を行った。
インスリン抵抗性の存在に関する情報を与えるＨＯＭＡ−ＩＲ指数を、式［（グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）ｘインスリン（ｍＵ／Ｌ）］／２２．５を用いて計算した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて統計分析を行った。二元配置分散分析の反復測定を行って、食餌摂取量、体重、ＧＴＴおよびＩＴＴに対する治療因子、時間因子およびそれらの相互作用の効果を分析した。一元配置分散分析を行って、累積食餌摂取量、体組成、ＧＴＴおよびＩＴＴのＡＵＣならびに屠殺時の循環グルコース、インスリンおよびＨＯＭＡ−ＩＲに対する治療因子の効果を比較した。分散分析の結果が有意である場合（ｐ＜０．０５）、チューキー事後検定を行って群間での適切な多重比較が可能となった。データは平均±ＳＥＭとして表されている。グラフはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて作成した。
結果
この治療は、体重またはＡＯＬの１回目の投与前に体重を測定した１日目から計算した体重の変化率（％）に対して有意な効果を有していなかった。
ＡＯＬの長期投与は、３週間後に脂肪量を減少させる傾向があった（ｐ＝０．１３、図６）が除脂肪量に対しては全く効果を有していなかった（図７）。平均±ＳＥＭ値は図６および図７に示されており、統計分析はそれぞれ表３および表４に示されている。
Figure 2020511450
Figure 2020511450
１０ｍｇ／ｋｇの用量のＡＯＬはＩＴＴ中に循環グルコースレベルに対するインスリンの作用を有意に鈍らせ（図８）、これはインスリン抵抗性の存在を示唆している。従って、治療効果はＡＵＣを分析する際にも認められ（ＡＵＣ ｖｅｈ：１２８１２．５０±７５０．３５、ＡＵＣ（５ｍｇ／ｋｇのＡＯＬ）：１５００６．５６±１１３９．６９、ＡＵＣ（１０ｍｇ／ｋｇのＡＯＬ）：１８１６８．３３±１５６２．９０、一元配置分散分析Ｆ（２，２３）＝５．１８６、ｐ＝０．０１３８）、１０ｍｇ／ｋｇのＡＯＬ群はビークル群よりも有意に高いＡＵＣを有していた（チューキー事後検定、ｐ＝０．０１０７）。平均±ＳＥＭ値は図８に示されており、統計分析は表５に示されている。
Figure 2020511450
治療の５週間後の屠殺時に２時間絶食させたマウスで血糖値を測定した。
ＡＯＬは血糖値を減少させる傾向があり（図９）、統計分析は表６に示されている。
Figure 2020511450
結論
食餌誘発性肥満動物において、ＡＯＬの長期毎日投与はＤＩＯマウスの体重および食餌摂取量を減少させる傾向があった（データは示さず）。従って、これは脂肪量および基礎血糖値を減少させる傾向と関連していた。
全体として、これらのデータはＡＯＬが食餌性肥満症モデルにおいていくつかの有益な効果を有し得ることを示唆している。
実施例４：神経疾患：パーキンソン病におけるＡＯＬの効果
この研究では、パーキンソン病の亜慢性１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）マウスモデルにおける黒質（ＳＮ）中のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性ニューロンの数を数えることにより、ＡＯＬの神経保護効果の可能性を評価した。マウスをＡＯＬ（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）またはビークルで連続１１日間治療した。ＭＰＴＰ（２０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）または生理食塩水を４〜８日目の治療日に投与した。治療薬の最終投与から１２日目に全てのマウスを屠殺した。
Ｃ５７／ｂｌ６マウスにおける亜慢性ＭＰＴＰ投与により黒質線条体のドーパミン作動性ニューロンの変性が生じ、これによりＳＮ中のＴＨ陽性ニューロン数の減少（今回は３９％の減少）が生じる。
材料および方法
ビークル条件では、供試品を生理食塩水中の０．５％のＤＭＳＯ／０．９５％のＴｗｅｅｎ２０に溶解し、ＡＯＬを５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に（ｉ．ｐ．）投与した。投与体積は１０ｍＬ／ｋｇであった。
体重２２〜２８ｇの雄のＣ５７ｂｌ／６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ）を１２時間の明暗サイクル下で餌および水を自由に与えながら温度制御された部屋に収容した。暫定的に、１群当たりｎ＝１０匹の最終数を達成するために、１群当たりｎ＝１２匹を使用して実験中に生じ得る減少を考慮した。黒質においてドーパミン作動性ニューロンの神経変性を生じさせるために、マウスをＭＰＴＰ塩酸塩で処理した（２０ｍｇ／ｋｇを連続５日間にわたって１日１回のｉ．ｐ．投与）。
マウスを最後の投与後に頸椎脱臼によって人道的に安楽死させた。
脳の尾側半分（黒質を含む）をパラホルムアルデヒド（０．１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中の４％）中に５日間置き、その後、凍結保護のために２０％のスクロース（０．１ＭのＰＢＳ中の２０％）に移した。その後、その組織を低温イソペンタン（−５０℃±２℃）中で凍結させた。
線条体を切開して別々にし、秤量して、ドライアイス（−７０℃±１０℃）中で別々に急速凍結させた。組織試料をドーパミンおよびその代謝産物の任意のＨＰＬＣ分析のために−７０℃（±１０℃）で貯蔵した。この選択肢を採用しない場合、線条体は破壊される。
中脳全体の冠状連続切片を５０μｍの間隔でクリオスタットを用いて切断した。切片を凍結保護溶液を含むウェルプレートの中に浮動状態で採取し、次いでこれをＴＨ免疫組織化学処理の日まで−２０℃で貯蔵した。
ＴＨ免疫組織化学を４番目の切片ごとに以下のように行った。組織切片を−２０℃の冷凍庫から取り出し、放置して室温に調節し、次いでＰＢＳ溶液で洗い流した。内因性ペルオキシダーゼを０．３％のＨ２Ｏ２を含むＰＢＳ中で１０分間インキュベートすることによって抑制した。その後、切片をＰＢＳで洗浄し、非特異的抗原部位の遮断のために、４％の正常なウマ血清（ＮＨＳ）および０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。次いで、切片を１／１０，０００希釈の抗体希釈物＋チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）のための一次抗体（抗ＴＨ親和性単離抗体、Ｓｉｇｍａ Ｔ８７００）中、室温で一晩インキュベートした。その後、切片をＰＢＳで完全に洗い流し、ＩｍｍＰＲＥＳＳ Ｉｇペルオキシダーゼポリマー検出試薬（Ｖｅｃｔｏｒ ＭＰ７４０１）中で３０分間インキュベートした。この後に、切片をＰＢＳで完全に洗浄した。その後、免疫学的染色を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／Ｔｒｉｓ／Ｈ２Ｏ２キット（Ｖｅｃｔｏｒ ＳＫ４１００）で顕色させた。１分後、何回かのＰＢＳ洗浄により顕色を停止した。切片をマウントして０．１％クレシルバイオレットで対比染色した。
不偏立体解析を使用してＴＨ免疫陽性（ＴＨ＋）ニューロンの数を推定した（Ｍｅｒｃａｔｏｒ，Ｅｘｐｌｏｒａ Ｎｏｖａ，Ｌａ Ｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。異なるＴＨ＋ニューロンの群のサイズおよび形状を調べてＳＮの境界を決定した。体積を式：Ｖ＝ΣＳ ｔｄ（式中、ΣＳは表面積の合計であり、ｔは平均切片厚であり、ｄは測定する２つの連続する切片間の切片数である）を用いて計算した。４切片ごとに１つを使用して、系統抽出法を用いて光学的解剖器具を配置した。解剖器具（５０μｍの長さ、４０μｍの幅）を１５０μｍ（ｘ）および１２０μｍ（ｙ）だけ互いに離した。式：Ｎ＝Ｖ（ＳＮ）（ΣＱ−／ΣＶ（ｄｉｓ））（式中、Ｎは細胞数の推定値であり、ＶはＳＮの体積であり、ΣＱ−は解剖器具で数えた細胞数であり、ΣＶ（ｄｉｓ）は全ての解剖器具の総体積である）を使用してＴＨ＋ニューロンの数を推定した。次いで、各群についてニューロンの平均推定数およびＳＥＭを計算した。
全ての統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７を用いて行った。全てのデータは平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示されている。ＡＯＬの効果は一元配置分散分析、次いでダネットの多重比較事後分析を用いて分析した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
結果
ＳＮ中のＴＨ＋細胞数に対する治療の有意な効果が認められた（Ｆ２，２９＝１０．９４、ｐ＜０．００１、図１０）。ＳＮ中のＴＨ＋細胞数はビークルで処理動物と比較してＭＰＴＰ処理動物において３９％減少した（ｐ＜０．００１）。ＡＯＬの投与後に、ＳＮ中のＴＨ＋細胞数はビークルと比較してＭＰＴＰ処理マウスにおいて４４％増加した（ｐ＜０．０１）。
結論
５ｍｇ／ｋｇの用量における連続１１日間のＡＯＬ治療は、ＳＮ中のＴＨ＋細胞のＭＰＴＰに誘発される減少を防止するためにビークルと比較して有意な神経保護効果があり、ＡＯＬの投与によりＳＮ中の４４％超の細胞生存が得られる。
これらのデータは、ＡＯＬ治療がＭＰＴＰ中毒から黒質中のドーパミン作動性ニューロンを保護できることを示唆している。
実施例５：心臓血管疾患：虚血再灌流障害におけるＡＯＬの効果
本研究は、全虚血および再灌流後に生じる損傷からラットの灌流心臓を保護するＡＯＬの能力を評価することを目的とする。
収縮性および組織生存能に対する３０分間の全虚血およびその後の１２０分間の再灌流の結果（図１１）を、１０μＭのＡＯＬで予め治療したか未治療（対照ビークル）の単離ラットの灌流心臓で調べた。
材料および方法
全ての手順は、英国動物（科学的処置）法１９８６および米国国立衛生研究所によって発行された実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＩＨ刊行物番号８５−２３、１９９６年改訂）に準拠した。雄のウィスターラット（２５０〜３００ｇ）を３％イソフルランで麻酔し、ヘパリン処理してペントバルビタール（１３０ｍｇ／ｋｇ）の致死的なＩＰ注射によって安楽死させた。心臓（約０．９５ｇの生体重）を迅速に採取して、３７℃で９５％Ｏ２／５％ＣＯ２を通気した１１８ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２５ｍｍｏｌ／ＬのＮａＨＣＯ３、４．８ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．２ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＳＯ４、１１ｍｍｏｌ／Ｌのグルコースおよび１．８ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を含有する氷冷クレブス−ヘンゼライト緩衝液（ｐＨ７．４）中に入れた。ランゲンドルフ心臓灌流を行い（Ｇａｒｌｉｄ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９１（１）：Ｈ１５２−６０）、左心室に配置し、圧力変換器に接続したバルーンを用いて、心筋仕事量二重積（心拍数ｘ収縮期血圧）（ＲＰＰ）を連続測定して収縮性を評価した。心臓を一定流量モード（１２ｍＬ／分）で灌流した。１０分間の安定化およびその後のビークル（対照）または１０μＭのＡＯＬ溶液による１０分間の治療後に、心臓を３７℃の灌流緩衝液に浸漬しながら灌流の流れを３０分間停止することで全正常温虚血（ｇｌｏｂａｌ ｎｏｒｍｏｔｈｅｒｍｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉａ）を誘発させた。再灌流期間の終了時に心臓を染色して梗塞サイズを評価するか、液体窒素で冷却したトングを用いて凍結クランプした。後者の場合、心臓を液体窒素下で粉砕してさらなる分析のために−８０℃で貯蔵した。
再灌流期間の終了時に、心臓を塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色した。すなわち、心臓において１％の最終濃度を得るために、心臓を１２％（ｗ／ｖ）のＴＴＣ溶液を用いて、１３ｍＬ／分で７分間灌流した。その後、心臓をカニューレから外し、３７℃でさらに４分間インキュベートした後、長手方向軸に直角に６枚の切片を切り出した。次いで、これらの切片を４℃の４％（ｗ／ｖ）のホルマリン溶液で一晩処理し、秤量した後、各切片の両側を写真撮影した。各側の壊死およびリスク部分の面積を面積測定（ＡｌｐｈａＥａｓｅ ｖ５．５）により各写真上で決定し、心臓全体を虚血に供したため、梗塞面積は心臓の総断面積のパーセンテージとして表した。
６種類の独立した製剤からのデータは平均±ＳＥＭとして表されている。各群の数ｎは２０匹未満であり、当該分布を非正規とみなしたため、ノンパラメトリックマンホイットニー検定（ＳＰＳＳ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ １７．０）を行って２つの群を比較した。結果はＰ値が０．０５未満であれば統計的に有意であるとみなした。
結果
図１１は、虚血後の再灌流の重要な段階中のＲＰＰ（本明細書では心収縮性の代わりとみなした）の変化を示す。明らかにＡＯＬは収縮性を改善し、ＡＯＬで治療した対照心臓と比較して同一の変化の後で、再灌流の２時間後、対照心臓よりも約３倍高い収縮性の改善を示した。この時点で、組織生存能を評価するために、心臓をＴＴＣ染色するように準備した。ＡＯＬ心臓のより高い収縮活動をＴＴＣ染色で確認し、治療した心臓および未治療の心臓の切片の写真（データは示さず）はＡＯＬが心臓組織の重要な保護を誘発したことを明確に示す。この保護をより徹底的に分析し、その結果は図１２に示されている。梗塞面積（損傷した組織）は、ＡＯＬで治療した、および未治療の心臓の平均値と共に各独立した実験の総表面のパーセンテージとして表されている。結果から、ＡＯＬが心臓組織を虚血／再灌流損傷から極めて有意に保護することが明らかである。実際には、約５０％の梗塞組織がＡＯＬによる前治療により救済された（図１２）。
結論
これらの結果は、エクスビボ（生体器官）条件下では、高確率で複合体ＩのレベルにおけるミトコンドリアＲＯＳ産生阻害剤としてのＡＯＬの役割を拡張する。
それらは心臓だけでなく虚血にさらされるあらゆる組織における虚血／再灌流損傷に対する組織保護のためのＡＯＬの治療的利益も証明している。
実施例６：心臓血管疾患：肺高血圧症におけるＡＯＬの効果
本研究は、肺血管系の生理機能におけるミトコンドリアの役割を調査し、肺高血圧症の新しい代替治療を提供することを目的とする。この疾患は、肺血管抵抗の上昇、右心室肥大、右心不全および最終的に死に繋がる肺の動脈圧の上昇および肺動脈（ＰＡ）のリモデリングを特徴とする。
肺高血圧症は５つの群に分けることができ、そのうち群１は肺動脈高血圧症に相当する。群３には、肺疾患（慢性閉塞性肺疾患など）および／または肺胞の低酸素血症（ａｌｖｅｏｌａｒ ｈｙｐｏｘｅｍｉａ）に起因する肺高血圧症を含む。
ＡＯＬの効果に関する問題を扱うために、群３および群１の肺高血圧症をそれぞれ有する、病態生理学的特性を共有する２種類の異なるラットモデル、すなわち低酸素症モデルおよびモノクロタリン誘発モデルを使用した。
材料および方法
雄のウィスターラット（３００〜４００ｇ）を３つの群に分けて４週間後に使用した。
・第１の群（対照または正常酸素圧ラット−Ｎラット）を周囲空気室に収容した。
・第２の群（慢性低酸素症ラット−ＣＨラット）を低圧室（５０ｋＰａ）において慢性低酸素に３週間曝露した。
・第３の群（ＭＣＴラット）に６０ｍｇ／ｋｇの単一用量のモノクロタリンを腹腔内注射した。ＭＣＴ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を等体積のＨＣｌ（１Ｍ）およびＮａＯＨ（１Ｍ）に溶解した。
各群において、何匹かの動物をＡＯＬ（Ｓｕｌｆａｒｌｅｍ，ＥＧ Ｌａｂｏ Ｅｕｒｏｇｅｎｅｒｉｃｓ、餌と混合した粉砕錠剤、自由に摂取）で治療し、何匹かの他の動物は未治療とした。食べた餌の重量を毎日測定して投与したＡＯＬ用量を推定した。このようにして、第２および第３の群では、３週間の実験中に１０ｍｇ／ｋｇ／日を投与した。
各条件で、７〜１０匹のラットを使用した。全ての動物の世話および実験手順は、欧州実験動物学会連合（ＦＥＬＡＳＡ：Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）の勧告に準拠しており、地域倫理委員会（アキテーヌ地域倫理委員会（Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’Ａｑｕｉｔａｉｎｅ−参照番号５０１１００１６−Ａ）によって認可された。
平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）および右心室肥大の両方を測定して肺高血圧症を評価した。ＰＡＰを測定するために、Ｎ、ＣＨおよびＭＣＴラットをペントバルビタールナトリウム（Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ）の腹腔内注射（６０ｍｇ／ｋｇ）により麻酔し、閉胸ラットにおいて、右の頸静脈、次いで右心房および右心室を通して肺動脈の中に挿入し、かつＢａｘｔｅｒ社製Ｕｎｉｆｌｏｗゲージ圧力変換器に取り付けられたカテーテルを介してｍＰＡＰを測定した。右心室（ＲＶ）の、左心室＋隔壁（ＬＶ＋Ｓ）に対する重量比（フルトン指数）によって右心室肥大を推定した。
パラフィン包埋した肺の切片からの肺動脈（ＰＡ）中膜厚の割合を測定してＰＡリモデリングを評価した。最初に肺切片を一般的な組織学的手順に従ってヘマトキシリンおよびエオシン（ＶＷＲ）で染色した。各切片において、異なる断面直径を有する１０個の腺房内動脈からなる３群（すなわち、５０μｍ未満、５０〜１００μｍおよび１００〜１５０μｍの断面直径）を観察して内側壁厚を評価した。
結果
結果をｎ回の独立した観察の平均±ＳＥＭとして表す。対応のない標本のためのノンパラメトリック検定（マンホイットニー検定）を用いて全てのデータを分析した。図１３は肺動脈圧（図１３Ａ）および心臓リモデリング（図１３Ｂ）に対するＡＯＬの効果を示す。ｎはｍＰＡＰおよびフルトン指数測定のためのラット数を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ６、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて全ての棒グラフの作成および統計を行った。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。図から分かるように、ＡＯＬは対照群（Ｎラット）に対して有意な効果はなかった。しかし、平均肺動脈圧はＡＯＬで治療したＭＣＴラットにおいて減少し、ＡＯＬで治療したＣＨラットにおいてさらにより有意であった。しかし、ＡＯＬ治療はフルトン指数に対しては効果がなかった。
図１４は肺動脈リモデリングに対するＡＯＬの効果を示す。ｎは中膜厚％の測定のために分析した血管数を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ６、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて全ての棒グラフの作成および統計を行った。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。ＡＯＬはＣＨラットにおいて有意な効果を示し、肺動脈直径は約３０％減少した。
結論
１０ｍｇ／ｋｇ／日の経口用量でのＡＯＬ治療は、インビボでの肺高血圧症、特に群３の肺高血圧症における予防および／または治療において有意な効果を有する。結果は実際に、臨床的総体症状の有意な改善を示している。
これらのデータは、ミトコンドリアが肺血管系の生理機能において主要な役割を担い、ＡＯＬの使用を肺高血圧症の治療まで広げることを示唆している。
実施例７：老化疾患および早老症候群：黄斑変性症におけるＡＯＬの効果
本研究は進行性変性に対して網膜を保護するＡＯＬの能力を評価することを目的とする。
材料および方法
周期的な低強度照明下で飼育したラットを周期的な高強度照明下に１週間移動させ、３つの群（未治療動物、ビークル治療動物およびＡＯＬ治療動物）に分けた。治療される動物は、６ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のビークルまたはＡＯＬ注射を１日３回、移動した７日間にわたって受けた（照明点灯の３０分前、０１：００ｐｍ、０９：００ｐｍ）。１週間後に動物を暗所に移動させた（Ｄ０）。
対照群（「移動させない群」）は周期的な高強度照明下に移動させなかったが、上記と同じ治療、すなわち７日間に３回のビークルまたはＡＯＬ注射を受け、その後に暗所に移動させた（Ｄ０）。
暗所への移動の翌日（Ｄ１）に１回目の網膜電図検査を行う。その検査では光刺激に応答して、網膜により生成される電気生理学的シグナルを測定する。そのシグナルは通常、２種類の波、すなわちａ波およびｂ波を特徴とする。ａ波は外側の光受容体層の錐体および杆体に由来する初期の角膜の陰性波を表す。それは外節膜におけるナトリウムイオンチャネルの閉鎖による光受容体の過分極を反映している。ｂ波は内網膜（主にミューラーおよびＯＮ型双極細胞）に由来する角膜の陽性波を表す。網膜電図の分析は、光刺激の強度の関数としての振幅および／またはこれらの波の潜時を測定することからなる。所与の光刺激強度でのａ波の振幅は光受容体の数に依存し、一方、所与の光刺激強度および所与の光受容体数でのｂ波の振幅はシグナル伝達効率を示す。
Ｄ１の網膜電図検査後に動物を周期的な低強度照明条件下に戻し、Ｄ１５に２回目の網膜電図検査を行う。
その後、組織学的分析のために動物を屠殺した。網膜の各種層の厚さ、特に外顆粒層（ＯＮＬ）厚および内顆粒層（ＩＮＬ）厚を測定した（単位：μｍ、視神経から、視神経乳頭の上極および下極中の０．３９ｍｍ毎）。
結果
組織学的分析は図１５に報告されている。それは、対照群（「移動させない群」）においてＡＯＬでの治療がＯＮＬ厚に対して効果を有していなかったことを示している（図１５Ａ）。これはＡＯＬが網膜の光受容体に対して毒性作用がないことを示唆している。
一方、周期的な高強度照明条件への移動（「移動させた場合」）は未治療の動物においてＯＮＬの有意な減少（いくつかの領域では半分に）を誘発する。しかし、ＡＯＬはＯＮＬを光誘発性損傷に対して保護する傾向がある。組織学的分析は実際にＡＯＬで治療し、さらに周期的な高強度照明に曝露した動物においてＯＮＬ厚の有意な増加を示した（図１５Ｂ）。
結論
ＡＯＬ治療は網膜への光誘発性損傷に対する有意な保護効果を有する。特に網膜の厚さは、未治療の動物と比較した場合に長期の周期的な高強度照明曝露後に保護されていることが分かった。
実施例８：ミトコンドリア機能障害に関連する疾患におけるＡＯＬの効果
本研究は酸化的リン酸化機能障害モデルにおけるインビボでのＡＯＬの効果を試験することを目的とする。
材料および方法
ＣＤ１バックグラウンドのミトコンドリアのＭｎ−スーパーオキシドジスムターゼが欠乏しているマウス（ＳＯＤ２−ＫＯ）を使用した。この遺伝子変化は有害な表現型をもたらし、平均８日齢での動物の死亡を引き起こす。ミトコンドリアのスーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシド（高反応性）を過酸化水素（低反応性）に変換し、次いでミトコンドリア膜を通過してマトリックスおよび細胞質ゾルの抗酸化系により解毒することができるフリーラジカル除去酵素である。この研究の目的は、ＡＯＬがＩＱスーパーオキシド産生に対するその活性によりＳＯＤ２−ＫＯ表現型を救うことができるか否かを試験することであった。
出生後、動物の子の遺伝子型を特定し（３日齢）、産子数は１ケージ当たり動物の子が６匹まで減少した。次いで、動物を治療した（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）中のＡＯＬ−５ｍｇ／ｋｇ）か、または治療しなかった（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）のみ、以下ではＫＯＬと記載されている）。投与量の選択は主に、化合物の溶解限度（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）中の２．８ｍＭ）および動物の子における最大注射可能体積（１グラムの体重当たり６〜７μＬ）によって決定された。同じ親からの２種類の異なる世代に対して２種類の研究（寿命と心臓におけるコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）活性および肝臓におけるオイルレッドＯ染色）を行った。毎日動物の体重を測定して（腹腔内）注射した。
コハク酸デヒドロゲナーゼ活性はミトコンドリアマトリックス中のスーパーオキシドのマーカーである。従って、ＳＯＤ２の不足は心臓におけるＳＤＨ活性の減少に関連している。この実験の目的はＡＯＬがＫＯマウスにおけるＳＤＨ活性を回復することができるか否かを試験することであった。
オイルレッドＯ染色はＳｏｄ２−ＫＯの肝臓に蓄積することが分かっている脂質のマーカーである。しかし、スーパーオキシド／過酸化水素産生と肝臓の脂質蓄積との直接的な関連性は確立されていない。この研究の目的は、Ｓｏｄ２−ＫＯマウスにおける肝臓の脂質蓄積を防止するＡＯＬの効力を試験することであった。
結果
寿命
４つの群を以下のように構成した。
１．ＷＴ−ＫＯＬ（ｎ＝７）、ビークルのみで治療した野生型マウス群；
２．ＷＴ−ＡＯＬ（ｎ＝１７）、ＡＯＬで治療した野生型マウス群；
３．ＫＯ−ＫＯＬ（ｎ＝２）、ビークルのみで治療したＳｏｄ２−ＫＯマウス群
４．ＫＯ−ＡＯＬ（ｎ＝４）、ＡＯＬで治療したＳｏｄ２−ＫＯマウス群
３日齢から死亡するまで動物に１日１回注射した。
図１６Ａおよび図１６Ｂは体重の変化（Ａ）および初期体重の割合を示す。これらの結果から、体重および体重増加がＷＴマウスよりもＫＯマウスで低いことが分かる。しかし、ＡＯＬでの治療は８日目〜１２日目から分かるようにこの効果を軽減する傾向があり、当該化合物の潜在的な有益な効果を示唆している。
図１６Ｃは、ＡＯＬで治療したか否かに関わらずＳｏｄ２−ＫＯマウスの生存割合を示す。上記結果を考慮して期待されるように、ＫＯマウスにおいてＡＯＬ治療によって中間寿命および最大寿命の両方が僅かに向上し、ＡＯＬで治療したマウスは未治療のマウスと比較して最長２日間長く生き延び、これはＡＯＬの有益な効果を裏付けている。
心臓におけるＳＤＨ活性およびオイルレッドＯ染色
５つの群を以下のように構成した：
１．ＷＴ−注射なし（ｎ＝６）、未治療の野生型マウス群；
２．ＷＴ−ＫＯＬ（ｎ＝６）、ビークルのみで治療した野生型マウス群；
３．ＷＴ−ＡＯＬ（ｎ＝６）、ＡＯＬで治療した野生型マウス群；
４．ＫＯ−ＫＯＬ（ｎ＝４）、ビークルのみで治療したＳｏｄ２−ＫＯマウス群；
５．ＫＯ−ＡＯＬ（ｎ＝６）、ＡＯＬで治療したＳｏｄ２−ＫＯマウス群。
この研究では、動物を３日目から５日目まで毎日治療した（５ｍｇ／ｋｇ）。心臓および肝臓を６日目に採取した。
予想どおりに、ＳＤＨ活性はＷＴ動物と比較してＫＯにおいて減少する傾向があった（有意でない）。但し、ＡＯＬはＫＯマウスにおいてＳＤＨ活性の非常に僅かな増加のみを示したが、ＳＤＨ活性をＷＴマウスのレベルまで回復させることはできなかった（図１７）。
図１８は、脂肪滴の平均サイズ（パネルＡ）、密度（パネルＢ）および面積（パネルＣ）を示す。未治療のＫＯマウスはＷＴ動物と比較して高脂質含有表現型を示した。しかし、ＡＯＬで治療したＫＯマウスでは未治療の動物と比較して脂肪滴密度は減少した。さらに重要なことには、これらの結果はＡＯＬ治療がＫＯマウスにおける総脂質面積を回復させることができることも示し、これはＳｏｄ２−ＫＯマウスにおけるインビボでのミトコンドリアのスーパーオキシド産生の狙い通りの抑制に一致していた。
結論
インビボ調査は有望な結果を示している。ＡＯＬ治療はマウスにおけるＳＯＤ２枯渇の効果を完全に打ち消すことはできないが、結果は体重増加の低下の軽減と共に未治療のＫＯ動物と比較して寿命をなお数日引き延ばし得ることを示している。これはＡＯＬの潜在的効果を示唆している。
ＡＯＬの生物学的利用能は非常に乏しいことが知られている。従って、より高い用量での治療はこれらの実験におけるＡＯＬの効果の向上に繋がる可能性がある。しかし、構成的ＫＯは、１種のみの真に特異的な治療により救うには、あまりにも有害性の強い表現型が保持されているので、他の薬物との相乗作用を求めることが必要かもしれない。
インビボで、結果から、ＡＯＬが脂質含有量を回復させることができ、および／またはＳｏｄ２−ＫＯマウスの肝臓における脂質蓄積を防止することができることも明らかになった。
実施例９：ＡＯＸは、高濃度（２０μＭ超）でミトコンドリアの酸化的リン酸化に影響を及ぼす。
材料および方法
動物処置方法および倫理声明
記載されている全ての実験は、国家および欧州研究会議の実験動物の管理と使用に関する指針に準じて行った。Ｐ．Ｄｉｏｌｅｚは、フランス農林省の動物の健康および保護局（Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｉｍａｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｆｏｒｅｔ，Ｆｒａｎｃｅ）による動物実験を行うための有効なライセンス（０３／１７／１９９９、ライセンス番号３３０８０１０）を有している。
材料
全ての化学薬品は、スクロースおよびＮＡＤＨオキシダーゼ（Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手）以外は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した試薬グレードとした。ＡＯＬおよびＡＯＸは、ＯＰ２（Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）から譲り受けた。１５ｍＭのストック溶液をＤＭＳＯ中で調製し、数日間だけ０℃で暗所に保管した。
心臓ミトコンドリアの単離
雄のウィスターラット（２５０〜３２５ｇ；Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ，Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ，Ｆｒａｎｃｅから入手）をスタニングおよび頸椎脱臼によって屠殺し、心臓を迅速に取り出し、１００ｍＭのスクロース、１８０ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％（ｗ／ｖ）の脱脂ＢＳＡ（ｐＨ７．２）を含有する低温の単離培地で洗浄した。
心臓ミトコンドリアの単離を冷室で行った。ホモジナイゼーションの前に心臓（約１．５ｇ）をハサミで細かく刻み、プロテアーゼ（１ｍＬの単離緩衝液当たり２ｍｇの細菌プロテイナーゼＸＸＩＶ型）を補充した５ｍＬの同じ培地中で撹拌しながら５分間処理した。その組織懸濁液を５０ｍｌのガラス製ポッター型ホモジナイザーの中に注ぎ込み、２０ｍＬの単離緩衝液で希釈し、次いで電動テフロン乳棒を用いて３分間ホモジナイズした。ホモジネートを篩絹（Ｓｅｆａｒ Ｎｉｔｅｘ）で濾過してデブリを除去し、８，０００ｇで１０分間遠心分離した。得られたペレットを５ｍＬの単離緩衝液で洗い流し、２５ｍＬの同じ緩衝液に再懸濁し、次いで低速遠心分離（４００ｇ）に８分間供した。得られた上澄みを７，０００ｇで１５分間の遠心分離を２回行い、洗浄したミトコンドリアのペレットを得、これを１５０μＬの単離緩衝液に静かに再懸濁した。ＢＳＡを標準液として用いて、ブラッドフォード法（Ｓｉｇｍａ、キット番号Ｂ６９１６）によってタンパク質濃度を測定した。ミトコンドリアを４０〜５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度で、５時間未満にわたり氷上で保持した。
ミトコンドリアの酸素消費およびＡＴＰ合成
漸増用量（０〜１００μＭの最終濃度）のＡＯＸの非存在または存在下でインキュベートした心臓ミトコンドリア（０．１ｍｇ／ｍＬ）の酸素消費率を、高分解能酸素濃度計（Ｏｘｙｇｒａｐｈ−２Ｋ、Ｏｒｏｂｏｒｏｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて２５℃で一定速度で撹拌しながらポーラログラフィーで記録した。呼吸培地は、１４０ｍＭのスクロース、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および本質的に脂肪酸を含まない１ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ｐＨ７．２）で構成された。
ＡＴＰ合成は、以前に記載（Ｇｏｕｓｐｉｌｌｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．１３（１）：３９−４８）のように、高感度ｐＨ電極（Ｍｅｔｒｏｈｍ）を用いて同じ条件下で測定した。
ミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生
心臓ミトコンドリアからのＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生速度を外来性西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＥＣ１．１１．１．７、Ｓｉｇｍａ）の存在下で無色の非蛍光指示薬アンプレックスレッドの酸化によって評価した。Ｈ２Ｏ２をアンプレックスレッドと１：１の化学量論比で反応させて、蛍光化合物レゾルフィン（励起：５６０ｎｍ、発光：５８５ｎｍ）を得る。このレゾルフィンは、一旦形成されると安定である。温度制御および撹拌機能を備えた分光蛍光光度計（ＳＡＦＡＳ Ｘｅｎｉｕｓ，Ｍｏｎａｃｏ）を用いて蛍光を連続的に測定した。
単離したミトコンドリア（０．１ｍｇ／ｍＬ）を１５μＭのアンプレックスレッドおよび１０μｇ／ｍＬのＨＲＰを補充した以前のものと同じ実験用緩衝液中でインキュベートした。グルタミン酸（５ｍＭ）／リンゴ酸（２．５ｍＭ）をコハク酸（５ｍＭ）と共に、それぞれ、複合体Ｉおよび複合体ＩＩ基質として使用した。１５μＭのアトラクチロシドの存在下、非リン酸化条件で実験を行った。その後、ロテノン（１．５μＭ）、アンチマイシンＡ（２μＭ）およびミキソチアゾール（０．２μＭ）を順次添加して電子伝達鎖内の酸化還元中心（図２を参照）、すなわち部位ＩＱ、ＩＦ（ロテノンにより阻害）、ＩＩＩＱｉ（アンチマイシンＡにより阻害）およびＩＩＩＱＯ（ミキソチアゾールにより阻害）を阻害した。最後にアッセイを、ＡＯＸを含む全ての関連化合物の存在下で既知の量のＨ２Ｏ２（３００ｎＭのステップ）で較正した。アンプレックスレッドアッセイそれ自体およびＮＡＤ（Ｐ）ＨオキシダーゼＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＬ、ＡＯＸおよびオルチプラズの効果がない対照試験を、心臓ミトコンドリアの非存在下およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ（ＥＣ１．６．３．３、５ｍＵ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社）およびＮＡＤＨ（１００μＭ）溶液の存在下で行った。
結果
我々は最初に、ＡＯＸ化合物がラットの心臓から単離したミトコンドリアに対する酸化的リン酸化に直接に影響を与えるかどうかを試験した。これを今では古典的であるオキシグラフ法を用いて行った（図１９Ａ）。ミトコンドリアを最初に各種ＡＯＸ濃度（２０〜１００μＭ）でインキュベートし、次いで呼吸基質を添加し（基質状態、黒色の曲線）、その後、ＡＤＰ濃度を飽和させて最大の酸化的リン酸化率（酸素消費の傾斜、灰色の曲線）を得、最後にＡＤＰ／ＡＴＰトランスロケーターを阻害し、非リン酸化条件下でミトコンドリアの漏出率を生じさせるアトラクチロシド（ＡＴＲ）を添加した（図１９Ａ）。図１９Ｂは、呼吸鎖に電子を供給するために、コハク酸（＋ロテノン）を用いて得た結果を示す。この基質は、これが呼吸鎖調節を最も厳密に反映しているので、選択した。この結果は、「基質」状態およびＡＴＲ状態（内膜プロトン漏出率）下で、ＡＯＸは、最大５０μＭの濃度の増加に続いて、５０μＭを超える濃度の減少を誘導した。これらのデータは、２０μＭを超える濃度でのＡＯＸの酸化的リン酸化に対する脱共役および付随する酸化速度の抑制を示唆する。データは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化、すなわち呼吸鎖活性およびＡＴＰ合成の両方ならびにミトコンドリアの内膜完全性（ＡＴＲ添加後測定される漏出率）に対するこれらの条件下での高濃度のＡＯＸ（２０μＭ超）の効果がないことを示している。
図２０は、単離ラット心臓ミトコンドリアのリン酸化速度（ＡＴＰ合成速度）に対するＡＯＸの効果を示す。結果は、２０μＭ未満の濃度は、単離ミトコンドリアによるＡＴＰ合成を変えないことを確証している。しかし、より高い濃度は、速度を効果的に低下させ、６０μＭで完全にリン酸化を消滅させる。
実施例１０：ＡＯＸはミトコンドリアによるスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生を阻害する
既に述べたように、ミトコンドリアＲＯＳ産生はミトコンドリアの活性および条件に大きく依存している。我々は数多くの条件下でミトコンドリアによるＲＯＳ産生に対するＡＯＸの効果を試験したが、明確性のためにＡＯＸの非常に特異的な効果の最も立証的な結果のみを本明細書に示すことを選択した。呼吸鎖全体に電子を与える完全な基質の組み合わせ（すなわち、グルタミン酸、リンゴ酸およびコハク酸）（図２Ａ）の存在は、代謝が活性である細胞における最も特有のインサイツ条件である。さらに、最大のミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生はミトコンドリアの高リン酸化条件下では生じないが電子輸送体が大きく減少する条件下、すなわち低リン酸化条件またはリン酸化が存在しない条件下で生じる。これらの条件は、ＡＴＲの存在下で満たされ、我々は飽和ＡＤＰ条件下でＡＴＲを添加することによりＲＯＳ産生が引き起こされることを完全に確認することができ、これは最大のリン酸化条件下での検出限界であった（結果は示さず）。これらの条件下では、ＲＯＳは呼吸鎖の異なる部位において産生される（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９；Ｑｕｉｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．１：３０４−３１２）（図２）。
我々は、最大のＲＯＳ産生条件下で呼吸鎖全体によるＲＯＳ産生に対するＡＯＸの作用を解明するために、一連の阻害剤滴定を設計した（図２Ｅ）。基質の組み合わせの存在下および複合体の特異的阻害剤の非存在下ではＲＯＳ産生は最大となり、これは主に部位ＩＱにおける逆電子伝達により生じる（図２Ａ）。ＩＱ触媒的部位に特異的に結合する古典的な複合体Ｉ阻害剤であるロテノンの添加後、ＲＯＳ産生は大きく減少し、部位ＩＩＩＱＯにおいてほぼ全てが生じる（図２Ｂ）。したがって、ロテノン添加後のＲＯＳ産生の減少（アンプレックスレッド法で測定、図２２）は、複合体ＩによるＲＯＳ産生活性を表す。
図２１は、これらの条件下で測定したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対する漸増濃度のＡＯＸ（２．５〜２０μＭ）の効果を示す。この図に示される結果から、ＡＯＸは、ＡＯＬで必要な濃度より低い濃度で、複合体ＩによるＲＯＳ産生を強く阻害することが明らかに認められる（比較のために、図３参照）。実際に、２．５μＭもの低いＡＯＸ濃度で、部位ＩＱによるＲＯＳ産生に対する阻害効果が示され、推定ＩＣ５０は約９．５μＭであった（最小：−７２．５２７２±６８．６４；最大：５５４．０４５±１９．７３；ＩＣ５０：９．４６７６８±１．０１８；ヒル係数：２．６１５７９±０．５７０６）。
実施例１１：ＡＯＸはＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼによる非ミトコンドリアスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産物を除去しない
実際にアンプレックスレッドを蛍光レゾルフィンに酸化することによりＨ２Ｏ２の出現を測定する、ミトコンドリアによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２の測定のために利用されるペルオキシダーゼ−アンプレックスレッドシステムを用いて、ＡＯＸの作用機序をさらにインビトロで試験した（図２２）。ミトコンドリアの非存在下で、代わりにＨ２Ｏ２産生系をアッセイに追加して、この非ミトコンドリアスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生に対するＡＯＸの効果を試験することができた。この試験は、添加されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でＨ２Ｏ２を産生する市販のＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを用い、アンプレックスレッドのレゾルフィンへの還元を測定することにより行った。我々は、ＡＯＸの漸増濃度（１０〜１００μＭ）の効果を、ＡＯＬおよびオルチプラズの効果と比較した（図２２Ａ）。示された結果は、ＡＯＬおよびＡＯＸの両方は、これらの条件下でＲＯＳ測定に対する全体的な影響は認められなかったが、オルチプラズは、アッセイにより測定されるＲＯＳの量が常に低下した。従って、これらの結果は、オルチプラズは、ＮａＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼを阻害するかまたは中等度の（不十分な）ラジカル捕捉剤として作用してスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２に結合し、ペルオキシダーゼアッセイには利用できないが、どのような環境下でも、非ミトコンドリア（細胞質ゾルを模倣する）スーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生を阻害することを示している。これはＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ活性に対するＡＯＸおよびＡＯＬのどの効果とも相容れないものである。これらの結果から、ＡＯＸおよびＡＯＬは測定システムを妨害することもＨ２Ｏ２と直接相互作用することもないことが確認される。興味深いことに、これらの結果は、ＡＯＸおよびＡＯＬがＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を阻害せず、また、ＮＡＤＰ（Ｈ）オキシダーゼが、細胞における（唯一ではないにしても）１つの主要な非ミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生物質であることも実証している。図２２Ｂのスキームは、ミトコンドリアによるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼに対するＡＯＸおよびＡＯＬの作用モードに関する種々の情報を要約している。
ラットの心臓から単離したミトコンドリアについて試験した場合には、ＡＯＸはミトコンドリアＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を有効に減少させる（単離したミトコンドリアにおいては、Ｈ２Ｏ２はミトコンドリアスーパーオキシドジスムターゼによるＲＯＳの還元により産生される）。しかし、本明細書に示されている結果により、ＡＯＸが抗酸化剤またはラジカル捕捉剤として機能しないことが明確に実証されている。抗酸化剤は一般的なＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２捕捉剤であるが、ＡＯＸは複合体Ｉの部位ＩＱによるＲＯＳの形成に対して選択性を示し、これはＡＯＸがスーパーオキシドラジカルと単純に相互作用しないが、複合体Ｉにおけるそれらの形成を特異的に防止することを実証している。その点に関して、したがって、ＡＯＸは、ＲＯＳ形成を防止し、そのため、自身のＲＯＳからミトコンドリアを保護するのにより活性であることによる、新しい種類の酸化ストレス保護剤のメンバーに見える。我々は、ＡＯＸが細胞質ゾルにおける酸素ラジカル形成に影響を与えることなくミトコンドリアとのみ相互作用することができ、従って細胞内シグナル伝達に影響を与えないといういくつかの証拠も本明細書に示す。
ロテノンまたは神経毒ＭＰＰ＋による複合体Ｉ活性の阻害はげっ歯類およびヒトの両方におけるパーキンソニズムに関連づけられおり、これは複合体Ｉの機能障害、ＲＯＳ産生および神経変性間の関連性を示唆している（Ｌａｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２１９（４５８７）：９７９−９８０；Ｂｅｔａｒｂｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０００．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３（１２）：１３０１−１３０６）。対照的に、比較分析から、部位ＩＱからの最大のスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生と多様な脊椎動物種全体における最大寿命との反比例関係が分かっている（但し、部位ＩＦについては、この限りではない）（Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．６（５）：６０７−６１８；Ｌａｍｂｅｒｔ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，２０１０．Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ．９（１）：７８−９１）。従って、部位ＩＱまたは部位ＩＦからのスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生の選択的調節剤により、正常および病理学的プロセスにおけるミトコンドリアＲＯＳ産生の推定上の役割を探るための特有の機会が得られる（Ｏｒｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．６５：１０４７−１０５９）。
これらの結果はＡＯＸがラジカル捕捉剤ではないことを実質的に実証しており、もしＡＯＬがラジカル捕捉剤であれば、ＲＯＳ測定値に対する効果は、スーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２の起源、ミトコンドリアまたは非ミトコンドリアの起源とは無関係になるはずである。その機序はまだ調査中であるが、ＡＯＸ化合物が特異的にミトコンドリアの複合体Ｉを妨害し、複合体Ｉのユビキノン結合部位（部位ＩＱ）からのスーパーオキシド産生を選択的に阻害するという証拠が本明細書に示されている。
結論として、ＡＯＸ特性は細胞におけるＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生の特異的ミトコンドリア標的化調節剤の探索における大きなブレークスルーであり得るように見える。ＡＯＸはＲＯＳ産生の上流で作用するため古典的な抗酸化剤よりも高い保護を保証する。
実施例１２：ＡＯＸはミトコンドリアのＲＯＳ産生を特異的に阻害するが、細胞質ゾルのＲＯＳ産生を阻害しない
材料および方法
ヒト非小細胞癌腫細胞株Ｈ４６０およびＡ５４９をＡＴＣＣから入手した。ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）および１００ユニットのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）からなる増殖培地中で細胞を培養した。３７℃、９５％湿度、および５％ＣＯ２で制御したインキュベーター（モデル３１００シリーズ、Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ）中、７５ｃｍ２ Ｔフラスコまたは１７５ｃｍ２ Ｔフラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れて細胞を維持した。細胞培地を１日おきに新しくした。２〜３日おきに、０．２５％トリプシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）を用いてＨ４６０およびＡ５４９培養物をフラスコから剥離させ、継代培養した。継代培養時に、全ての培養物を８０〜９０％コンフルエンスで維持した。
スルホローダミンＢ比色分析法により細胞傷害性スクリーニングを実施した。Ａ５４９およびＨ４６０細胞（２ｘ１０３）を９６ウェルプレートに播種し、付着後、５〜５００μＭのＡＯＬまたはＡＯＸ、または対照のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と共に、細胞をインキュベートした。処理の４８時間後、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイで、Ｖｉｃｈａｉ（Ｖｉｃｈａｉ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（３）：１１１２−６）に従って、細胞傷害性を評価した。
トランスウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，８．０μｍ細孔径）中で細胞遊走アッセイを実施した。遊走アッセイのために、無血清媒体中の２ｘ１０４細胞を上室中に加えた。１０％ＦＢＳ含有培地を下室に加えた。１６時間後、フィルターを通過して移動した細胞を０．２％クリスタルバイオレットで染色し、ソフトウェアＩｍａｇｅ Ｊを用いて計数した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使って統計分析を行った。結果は、ｎ個の独立した実験に対し、平均値±ＳＥＭ値で表される。群間の比較は、一元配置分散分析と事後ダネット検定により実施した。適切な場合には、独立スチューデントｔ−検定またはマン・ホイットニーの検定を用いた。ｐ＜０．０５の差異を有意と見なした。
結果
培養細胞に対するＡＯＸの細胞傷害性の非存在
ＡＯＸの細胞傷害性の試験を、広い範囲の濃度（０〜５００μＭ）の、２種の癌腫細胞株（Ｈ４６０およびＡ４５９）に対して実施した。結果を図２３に示す。
１００μＭ未満の濃度に対して、明確に有意な毒性は観察されず、また、細胞生存率は、より高い濃度のＡＯＸに対してのみ急速な低下が観察された（図２３Ａ）。これらの結果を片対数プロットとしてプロットすることにより（図２３Ｂ）、我々は、高用量ＡＯＸ毒性のＩＣ５０を１３４．８±０．３μＭとして計算可能であった。これらの結果は、ＡＯＸが、たとえ高濃度（１００μＭ）でも、培養細胞に対し有害な影響を示さないことを示している。
癌腫細胞呼吸に対するＡＯＸの効果の非存在
癌腫細胞に対するＡＯＸ（０〜４０μＭ）の効果を、古典的なオキシグラフ手法を用いて評価し、姉妹分子であるＡＯＬの効果と比較した。
Ｈ４６０休止細胞の酸素消費を連続的に測定し、漸増濃度のＡＯＬおよびＡＯＸ（０〜４０μＭ）を調製物に注入した（図２４）。ＡＯＸまたはＡＯＬを加えたＨ４６０細胞による酸素消費速度の変化がないことが認められ、ミトコンドリア活性および細胞エネルギー代謝の細胞内の乱れが存在しないことを示している。これらの結果は、ＡＯＬおよびＡＯＸの細胞機能に対する有害な影響が存在しないことを確証している。
癌腫細胞転移活性に対するＡＯＸの効果
細胞遊走のトランスウェル試験をこのアッセイに利用し、２種の異なる濃度のＡＯＸ（５および１０μＭ）の存在下でＨ４６０癌腫細胞の移動を測定し、細胞質ゾルのＲＯＳ産生の陽性対照としての１００μＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の効果と比較した（図２５）。
図２５Ａは、種々のアッセイ条件に対する下部コンパートメント中の染色細胞の写真を示す。結果をヒストグラム（図２５Ｂ）に示し、膜を通過した細胞の数が対照とＡＯＸ条件で同等なので、ＡＯＸによる転移活性の誘導が存在しないことを示している。対照的に、細胞質ゾルのＲＯＳを標的とする典型的な細胞浸透性ラジカル捕捉剤であるＮＡＣの存在下では、我々は、転移活性の大きな増加を観察した。
これらの結果は、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の阻害剤としてのＡＯＸの作用は、細胞質ゾルのＲＯＳ産生と干渉しないことを明確に示している。
結論
単離ミトコンドリアに直接適用する場合、ＡＯＸは、おそらく、この分子の、弱酸として作用し、ミトコンドリア膜電位を混乱させるプロトン化能力のために、高濃度（２０μＭ超）でミトコンドリアの機能に対しある程度の有害作用を有する。しかし、我々は、これらの条件は、高濃度であってもミトコンドリアの機能障害を誘発しない無傷の細胞中では達成されないことを観察できるであろう。
これらの結果は、１００μＭを超える濃度、すなわち、治療処置下の可能な循環濃度を十分超える濃度でも、ＡＯＸは培養細胞に対し毒作用を有さないことを示す。これは、これらの条件下で、細胞呼吸およびエネルギー代謝に対するＡＯＸの効果が存在しないことで確証された。
癌腫細胞の転移活性に対するＡＯＸの効果が、この転移活性に対する効果を高めるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）と対比して、存在しないことにより、ミトコンドリアのＲＯＳ阻害に対するＡＯＸの特異性および細胞質ゾルのＲＯＳ産生に対するＡＯＸの効果の存在しないことが確証される。
実施例１３：心臓血管疾患：肺高血圧症におけるＡＯＸの効果
本研究は、肺高血圧症の新しい代替治療を提供することを目的とする。この疾患は、肺血管抵抗の上昇、右心室肥大、右心不全および最終的に死に繋がる肺の動脈圧の上昇および肺動脈（ＰＡ）のリモデリングを特徴とする。
肺内動脈収縮性に対するＡＯＸとＡＯＬの効果比較
ＡＯＸの効果の問題を扱うために、ＡＯＬまたはＡＯＸの非存在下および存在下で、セロトニンまたはエンドセリンを用いてアゴニスト誘発収縮時の、肺内動脈に対する等尺性張力測定を実施した。
材料および方法
一次肺内動脈（ＩＰＡ１）を、外径１．５〜２ｍｍの短い管状セグメントに分割し、等尺性収縮測定に使用した。クレブス溶液（１１８．４ｍＭのＮａＣｌ、４．７ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、２５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭのＣａＣｌ２および１１．１ｍＭのＤ−グルコース含有、ＮａＯＨで調節してｐＨ７．４）を含む、３７℃の単離臓器浴システムに動脈輪を取り付け、１５％Ｏ２／５％ＣＯ２で連続的にバブリングした。初期荷重０．８ｇ〜１ｇを動脈輪に印加した。組織をクレブス溶液中で１時間平衡化させ、１５分毎に洗い流した。その後の収縮応答の正規化に使用する基準収縮を得るために、高ＫＣｌ溶液（８０ｍＭ）を加えた。
その後、セロトニン（５ＨＴ、１０−４〜１０−８Ｍ）またはエンドセリン（ＥＴ−１、１０−７〜１０−１０Ｍ）に対する累積濃度反応曲線（ＣＣＲＣ）を作成することにより、異なるアゴニストに対する収縮応答を試験した。表示がある場合、ＡＯＬまたはＡＯＸは３０分間プレインキュベーションし、その後、薬物の存在下でアゴニストに対するＣＣＲＣを実施した。クレブス溶液からのＮａＣｌに対し等モル量のＫＣｌで置換することにより、高カリウム溶液を得た。０．３μＭのＰｈｅ−誘発予備収縮肺動脈輪上の１０μＭのカルバミルコリンにより誘発された緩和を試験することにより、各輪に対する内皮機能を試験した。データ取得および分析を容易にするために、トランスデューサ系を用いて、ＩＯＸソフトウェア（ＥＭＫＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）と接続して、受動的および能動的機械的性質を評価した。
結果
収縮は、セロトニン（５ＨＴ）またはエンドセリン（ＥＴ−１）の濃度依存性であり、測定された最大収縮は、１００μＭの５ＨＴおよび０．１μＭのＥＴ−１であった。
ＡＯＬは、最大５ｘ１０−５Ｍのセロトニンで誘発された収縮を緩和できたが、エンドセリン誘発収縮に対しては効果がなかった（図２６Ａ）。
１０μＭのＡＯＸ含有浴中でインキュベートした輪に対しても同一パターンの応答が観察された（図２６Ｂ）。しかし、より高い濃度のＡＯＸの使用により、１０−４Ｍのセロトニンで誘発された収縮が緩和され得る。
結論
これらのデータは、ミトコンドリアが肺血管系の生理機能において主要な役割を果たしていることをさらに確証し、また、肺動脈収縮性を小さくするための、従って、肺高血圧症の予防および／または治療のための、ＡＯＬよりも高いＡＯＸの効力を示唆している。
肺動脈平滑筋細胞増殖に対するＡＯＬの効果
材料および方法
肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）増殖の検出を、ＤＮＡ合成中の、５−ブロモ−２’−デオキシ−ウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みの測定に基づいて、比色分析イムノアッセイキット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．，ＵＳＡ）を使用することによりアッセイした。
単離ＰＡＳＭＣを、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した培地中、５ｘ１０３細胞／ウェル／１００μＬの密度で９６ウェル培養プレートに播種した。培養プレートを、空気中５％のＣＯ２下、３７℃の加湿インキュベーター中に置いた。４８時間後、細胞を、１％インスリン−トランスフェリン−セレンを補充した無血清培地中で４８時間の増殖停止に供した。この期間の終わりに、ＰＡＳＭＣを下記のいずれかを含む培地中で２４時間インキュベートした：
−０．２％のＦＣＳ（対照条件）；
−０．２％のＦＣＳ＋１０、２０、６０、または１００μＭのＡＯＬ；
−０．２％のＦＣＳ＋１００μＭの５ＨＴ（セロトニン）；
−０．２％のＦＣＳ＋１００μＭの５ＨＴ＋１０、２０、６０、または１００μＭのＡＯＬ；
−１０％のＦＣＳ；
−１０％のＦＣＳ＋１０、２０、６０、または１００μＭのＡＯＬ。
各条件を、３回繰り返して試験した。次に、１０μＬのＢｒｄＵ（１００μＭ）を培地に加え、細胞をさらに３７℃で２時間インキュベートした。その後、比色分析方法を用いて、製造業者の説明書に従ってＤＮＡ合成をアッセイした。新しく合成したＢｒｄＵ ＤＮＡを、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｐｅｃｔｒｏｓｔａｒ／ｎａｎｏ；ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ−ｓｕｒ−Ｍａｒｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で、４９０ｎｍの基準波長を用いて３８０ｎｍの波長で試料の吸光度を測定することにより特定した。
結果
図２７に報告したように、ＡＯＬは、高濃度のＦＣＳ（１０％）により、またはより多くの生理的条件、すなわち、０．２％のＦＣＳおよび１００μＭの５ＨＴの存在下で、誘発された増殖をうまく抑制した。
結論
これらのデータは、ＡＯＬが、肺高血圧症の予防および／または治療において、潜在的効果を有することを示唆している。
実施例１４：心臓血管疾患：アントラサイクリンの心毒性におけるＡＯＸの効果
本研究は、アントラサイクリンの心毒性モデルにおけるＡＯＸの効果を評価することを目的とする。１０週齢のラットにアントラサイクリン由来の抗癌剤をＡＯＸと共に１４〜１７日間投与して、これを評価した。
材料および方法
この研究を１０週齢のスプラーグドーリーラットで実施し、異なる治療薬を腹腔内に１４〜１７日間投与した後、分析のために心臓を回収した。動物実験における「３Ｒ原則」を尊重するために、特に１種のアントラサイクリン分子のみ、すなわちドキソルビシンに対する実験に焦点を当て、ＡＯＸの効果を１種類の他の保護分子のみ、すなわちデクスラゾキサンのみと比較することによって試験する群の数を可能な限り制限した。
実験の終了時に、治療したラットの心臓を取り出し、心臓機能をＬａｎｇｅｎｄｈｏｒｆシステムにおいてこれらの心臓の灌流後に徹底的に調べて、ドキソルビシンによって影響を受ける心臓機能およびＡＯＸ治療が効率的であるか否かを決定した。
この研究は、それぞれ８匹のラットからなる下記の５つの異なる群を含む：
１．対照群。ラットは５％のＤＭＳＯ＋９５％のＮａＣｌ（０．９％）からなるビークルのみを１７日間にわたって１日２回（朝と晩）の投与を受けた；
２．Ｄｏｘｏ群。ラットは３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の用量のドキソルビシンを３日目から１４日間にわたって２日に１回（朝）に投与を受けた。ラットは全ての他の注射ではビークルのみの投与を受けた；
３．Ｄｅｘｒａ群。ラットを３ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の用量のドキソルビシンと同時に３０ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の用量のデクスラゾキサン（基準保護剤）で３日目から１４日間にわたって２日に１回治療した（２０１１年にフランスの地域保険機関「ＡＲＳ」によって推奨された投与量比に従う）。ラットは全ての他の注射ではビークルのみの投与を受けた；
４．ＡＯＸ群。ラットをＡＯＸおよびドキソルビシンで治療した：
・４ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＡＯＸ、朝と晩、ドキソルビシンの１回目の注射の７２時間前；
・ドキソルビシン注射の日に（Ｄｏｘｏ群を基準に）：ドキソルビシン注射と共に４ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＡＯＸ、次いで９０分後に４ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）の用量のＡＯＸの２回目の注射；
・ドキソルビシン注射のない日：４ｍｇ／ｋｇ（ｉ．ｐ．）のＡＯＸ、朝と晩。
５．ＡＯＸ／Ｃａｒｖ／Ｅｎａｌ群。ラットを本明細書の上に記載したＡＯＸ群からのラットと同様に治療した。ＡＯＸ注射に、心不全のための古典的な治療薬（１ｍｇ／ｋｇの用量のカルベジロール（β遮断薬）および０．５ｍｇ／ｋｇの用量のエナラプリル（血管拡張薬））を補充した。
実施例１５：自己免疫疾患：強皮症におけるＡＯＸの効果
本研究は強皮症を有する患者からの線維芽細胞に対するＡＯＸの効果を試験することを目的とする。強皮症は、コラーゲン合成の増加、微小血管の損傷、Ｔリンパ球の活性化および結合組織産生の変化を特徴とする慢性の全身性自己免疫疾患である。
材料および方法
健康なドナーおよび強皮症を有する患者の両方からの線維芽細胞を完全ＤＭＥＭ培地（１０％ＦＣＳ、１％抗生物質）中で、フラスコを用いて培養する。６時間の付着後に、細胞から血清を一晩除去した。
ＡＯＸを即時調製する。ＡＯＸを秤量し、５ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯに溶解した。このストック溶液を最終的に１０ｍＭおよび５ｍＭになるまでＤＭＳＯでさらに希釈した。ＡＯＸを４０、２０および１０μＭの最終濃度に達するまで完全ＤＭＥＭ培地でさらに希釈した。
培養細胞を４０、２０および１０μＭのＡＯＸに接触させた。対照細胞をＤＭＳＯ（０．２％）およびＮ−アセチルシステイン（３ｍＭ）を補充した完全ＤＭＥＭ培地に接触させた。細胞を正常酸素圧条件（３７℃、２０％Ｏ２）および低酸素条件（３７℃、１％Ｏ２）で６時間または２４時間インキュベートする。
ＭＭＰ−１、ＭＩＰおよびＭＣＰ分泌分析のために培養物上澄みを採取し、等分して、投与のために−２０℃で貯蔵する。製造業者の説明書に従ってＭＭＰ−１をＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）により定量化する。ＭＣＰ−１およびＭＩＰ−１αの濃度をＣＢＡ（細胞数測定ビーズアレイ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で定量化する。
ＭＭＰ１、コラーゲンおよびＣＣｌ２の発現の分析のために、細胞をトリプシンで剥がし、ＰＢＳで洗浄する。次いで、細胞ペレットを溶解緩衝液に再懸濁し、製造業者の説 明書に従ってＲＮＡ抽出を行う（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡ Ｐｌｕｓ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）。１μｇのＲＮＡをレトロ転写し（ＧｏＳｃｒｉｐｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）、次いで、ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ３８４ ＰＣＲ装置でのＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲ（ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ）の前に１０倍に希釈する。ＭＭＰ−１、Ｃｏｌ１Ａ２およびＣＣｌ２のためのプライマーを使用して目的の遺伝子を測定し、Ｐｐｉａ、ＲＰＬＰ０およびＥＥＦ１Ａ１のためのプライマーを使用してリファレンス遺伝子を測定する。
実施例１６：オルチプラズとは逆に、ＡＯＸは部位ＩＱでのＲＯＳ産生を選択的に阻害する
材料および方法
ラットの心臓からミトコンドリアを新しく単離し、ミトコンドリア懸濁液のタンパク質量を測定した後、漸増濃度のＡＯＬ、ＡＯＸおよびオルチプラズの外部からの添加に応答したＨ２Ｏ２産生を、アンプレックスレッドおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて蛍光定量法により測定した
ミトコンドリアのＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生の２つの主要部位を、コハク酸（呼吸複合体２のエネルギー基質）および呼吸鎖の既知の阻害剤、すなわち、部位ＩＱに対しては１０ｍＭのコハク酸単独（陽性対照としてのＣＣＣＰ）および部位ＩＩＩＱｏｕｔｅｒに対しては、１０ｍＭコハク酸、４μＭロテノンおよび２．５μＭアンチマイシンＡ（陽性対照としてのミキソチアゾール）の組み合わせを用いて個別に標的化した。これらの「反応」溶液を、鎖内の主に単一部位から最大速度のＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を生成するように設計した（Ｑｕｉｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３．Ｒｅｄｏｘ Ｂｉｏｌ．１：３０４−１２）。
測定では、５０μＭのアンプレックスレッド試薬および２０μｇ／ｍｌのＨＲＰからなる作業溶液を反応緩衝液に混合して、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ Ｆ−ｂｏｔｔｏｍ）の対応する、漸増濃度（０〜８０μＭ）のＡＯＬ、ＡＯＸまたはオルチプラズ非含有または含有ウェル中に入れた。１ウェル当たり０．１２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度までミトコンドリアを加え、アッセイを開始した。１マイクロプレートウェル当たりの適切な全容積は２００μＬであった。
室温下、プレートを暗所で、２０〜２５分間インキュベートした。二重軌道振とう（１００ｒｐｍ−３秒）を適用した後、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でエンドポイント蛍光値を読み取った。実際に、Ｈ２Ｏ２を、アンプレックスレッドと１：１の化学量論比で反応させて、蛍光化合物レゾルフィンを得て、これを次の光学設定で用いて分析した（励起波長：５４６−２０ｎｍ；発光：６００−４０ｎｍ；ゲイン：７５０）。
また、１４０ｍＭのスクロース、１００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、および実質的に脂肪酸不含の１ｇ／Ｌ（ｗ／ｖ）のＢＳＡ（ｐＨ７．２）からなる実験緩衝液中で、０〜５μＭの範囲の濃度のＨ２Ｏ２検量線を作成した。
結果
図２８は、これらの条件下で測定したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対する漸増濃度のＡＯＬ、ＡＯＸおよびオルチプラズ（０〜８０μＭ）の効果を示す。
図２８Ａに示される結果から、ＡＯＬおよびＡＯＸは、２．５μＭの低い濃度で、複合体ＩによるＲＯＳ産生を強く阻害することが明らかに認められる。これに対して、オルチプラズは、同一濃度および８０μＭまでの濃度で、部位ＩＱでのＲＯＳ産生に対し、不十分な阻害効果のみを示した。
図２８Ｂは３種の化合物のいずれも、複合体ＩＩＩによるＲＯＳ産生の阻害に対し、効果がないことをさらに示す。
まとめると、これらの結果は、オルチプラズとは逆に、ＡＯＬおよびＡＯＸが、ミトコンドリアのＲＯＳ産生の部位ＩＱ選択的阻害剤であることを明確に示す。
実施例１７：ＡＯＸ類似体はミトコンドリアによるスーパーオキシド／Ｈ２Ｏ２産生を阻害する
材料および方法
実施例１６で上記したのと同じプロトコルを用いて、種々のＡＯＸ類似体の外部からの添加に応答したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生を測定した。すなわち、５０μＭのアンプレックスレッド試薬および２０μｇ／ｍＬのＨＲＰからなる作業溶液を反応緩衝液に混合して、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ９６ Ｆ−ｂｏｔｔｏｍ）の対応する、漸増濃度（１〜２５μＭ）の８種の化合物（Ｃｐ１；Ｃｐ２；Ｃｐ３；Ｃｐ４；Ｃｐ５；Ｃｐ６ａ；Ｃｐ８；Ｃｐ９ａ）非含有または含有ウェル中に入れた。１ウェル当たり０．１２５ｍｇ／ｍＬの最終濃度までミトコンドリアを加え、アッセイを開始した。１マイクロプレートウェル当たりの適切な全容積は２００μＬであった。
結果
図２９Ａおよび２９Ｂは、これらの条件下で測定したＲＯＳ／Ｈ２Ｏ２産生に対する漸増濃度のＡＯＸ類似体（２．５〜２５μＭ）の効果を示す。
これらの図に示される結果から、ＡＯＸ類似体は、複合体ＩＩＩと比較して選択的に、複合体ＩによるＲＯＳ産生を阻害することが明らかに認められる。

Claims (15)

  1. 遊離酸素ラジカル関連疾患の治療および／または予防における活性酸素種（ＲＯＳ）の産生の阻害剤としての使用のための式（Ｉ）：
    Figure 2020511450
     の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であって、
    式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳまたはＯであり；より好ましくはＸはＳであり；
    ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨまたはＮであり；より好ましくはＹはＣＨであり；
    Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；
    Ｒ３はヒドロキシであるか；またはＲ３およびＲ２が、それらが結合している炭素原子と一緒に５員ヘテロアリール部分を形成し、ここで−Ｒ３−Ｒ２−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−または−Ｂ＝ＣＲ６−Ａ−であり；
    ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；
    ＢはＣＨまたはＮであり；および
    Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである、
    化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  2. 前記化合物が下記から選択される、請求項１に記載の使用のための化合物：
    ５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；
    ５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オン；
    ５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−オンオキシム；
    ５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン；
    ４−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；
    ５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；
    ５−（２−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−６−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；
    ５−（ベンゾフラン−５−イル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオン；および
    メチル ５−（３−チオキソ−３Ｈ−１，２−ジチオール−５−イル）−１Ｈ−インドール−１−カルボキシレート。
  3. 前記化合物が５−（４−ヒドロキシフェニル）−３Ｈ−１，２−ジチオール−３−チオンである、請求項１または請求項２に記載の使用のための化合物。
  4. 式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
    Figure 2020511450
     のものである請求項１に記載の使用のための化合物であって、式中、Ｘ、Ｙ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、ＡおよびＢは、請求項１で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  5. 前記化合物が、ミトコンドリアのＲＯＳ産生を阻害し、好ましくは前記化合物が、ミトコンドリアの複合体Ｉの部位ＩＱにおけるミトコンドリアのＲＯＳ産生を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
  6. 前記遊離酸素ラジカル関連疾患が、心臓血管疾患、老化疾患、自己免疫疾患、早老症候群、パーキンソン症候群、神経疾患、虚血再灌流障害、感染性疾患、筋肉疾患、肺、腎臓および肝臓の疾患を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
  7. 前記心臓血管疾患が、心筋梗塞、心毒性、肺動脈高血圧症、心不全、心肺疾患、虚血、心臓発作、脳卒中、血栓症および塞栓症を含む群から選択される、請求項６に記載の使用のための化合物。
  8. 式（Ｉ’）：
    Figure 2020511450
     の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物であって、
    式中、ＸはＳ、ＯまたはＮＨＯＨであり；好ましくはＸはＳまたはＯであり；より好ましくはＸはＳであり；
    ＹはＣＨ、ＣまたはＮであり；好ましくはＹはＣＨまたはＮであり；より好ましくはＹはＣＨであり；
    Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立に、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルであり；
    Ｒ２’およびＲ３’は、それらが結合している炭素原子と一緒に５員ヘテロアリール部分を形成し、ここで−Ｒ３’−Ｒ２’−は、−Ａ−ＣＲ６＝Ｂ−または−Ｂ＝ＣＲ６−Ａ−であり；
    ＡはＯ、ＳまたはＮＲ７であり；Ｒ７は水素、Ｃ１−Ｃ８アルキルまたはアルキルオキシカルボニルであり；
    ＢはＣＨまたはＮであり；および
    Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ハロ、アミノ、アルキルスルホニル、アミノスルホニル、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アリール、アルコキシ、ハロアルキル、アルキルアミノ、アミノアルキル、ニトロオキシアルキルまたはカルボキシアルキルである、
    化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  9. 式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩＩａ）または（ＩＩＩｂ）：
    Figure 2020511450
     のものである請求項８に記載の化合物であって、式中、Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項８で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  10. 式（ＩＩａ−１）、（ＩＩａ−２）、（ＩＩＩａ−１）または（ＩＩＩａ−２）：
    Figure 2020511450
     のものである請求項８または請求項９に記載の化合物であって、式中、Ｘ、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項８で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  11. 式（ＩＩａ−１ａ）、（ＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩａ−２ａ）、（ＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩａ−２ｄ）、（ＩＩａ−２ｅ）、（ＩＩＩａ−１ａ）、（ＩＩＩａ−１ｂ）、（ＩＩＩａ−１ｃ）、（ＩＩＩａ−１ｄ）、（ＩＩＩａ−１ｅ）、（ＩＩＩａ−２ａ）、（ＩＩＩａ−２ｂ）、（ＩＩＩａ−２ｃ）、（ＩＩＩａ−２ｄ）または（ＩＩＩａ−２ｅ）：
    Figure 2020511450
    Figure 2020511450
    のものである請求項８〜１０のいずれか１項に記載の化合物であって、式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項８で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  12. 式（ＩＩｂ−１）、（ＩＩｂ−２）、（ＩＩｂ−３）、（ＩＩｂ−４）、（ＩＩｂ−５）、（ＩＩＩｂ−１）、（ＩＩＩｂ−２）、（ＩＩＩｂ−３）、（ＩＩＩｂ−４）または（ＩＩＩｂ−５）：
    Figure 2020511450
     のものである請求項８または請求項１０に記載の化合物であって、式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、請求項８で定義される通りである、化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物。
  13. 請求項８〜１２のいずれか１項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物と、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤と、を含む医薬組成物。
  14. 請求項８〜１２のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物、を含む医薬。
  15. 請求項１０または請求項１１に記載の式（ＩＩａ−１）の化合物またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を製造するための方法であって、
    ａ）シロキサンの存在下で硫黄系試薬を用いて式（Ｃ）
    Figure 2020511450
     （式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１０で定義される通りである）を環化して、式（ＩＩａ−１’）
    Figure 2020511450
     の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１０で定義される通りである）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得るステップを含むこと、および必要に応じて：
    ｂ１）式（ＩＩａ−１’）の化合物を酸化剤（好ましくは、前記酸化剤は、酢酸水銀Ｈｇ（ＯＡｃ）２である）と反応させて、式（ＩＩａ−１’’）
    Figure 2020511450
     の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１０で定義される通りである）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得ることができること、
    または
    ｂ２）式（ＩＩａ−１’）の化合物を、塩基（好ましくは、前記塩基は酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ）である）の存在下でヒドロキシルアミンＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌと反応させて、式（ＩＩａ−１’’’）
    Figure 2020511450
     の化合物（式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、請求項１０で定義される通りである）またはその薬学的に許容可能な互変異性体、塩もしくは溶媒和物を得ることができること、
    を特徴とする、方法。

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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020049166A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 OP2 Drugs Pharmaceutical composition comprising cyclodextrin compexes of anethole trithione or derivatives thereof
CN112546216B (zh) * 2020-11-20 2022-10-28 西湖大学 小分子化合物奥替普拉在制备增强体液免疫应答的药物中的应用
CN114414332B (zh) * 2022-01-05 2024-04-16 北京科技大学 一种基于Al-CQDs和Al-CNSs的抗氧化剂的制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998027970A2 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 National Research Council Of Canada Treatment of diseases or prevention of cellular damage caused by oxygen-containing free radicals
WO2001091118A1 (fr) * 2000-05-22 2001-11-29 Clarion Co., Ltd. Lecteur de disque
CN1355156A (zh) * 2000-11-27 2002-06-26 朱国和 含有造纸废料污泥的微生物菌肥及其制备方法
CN102961376A (zh) * 2012-11-06 2013-03-13 暨南大学 HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀在制备抗淋巴瘤药物中的应用
EP2889294A1 (en) * 2012-08-21 2015-07-01 Soochow University 3h-1,2-dithiocyclopentene-3-thioketone compounds and application thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001009118A2 (en) 1999-07-29 2001-02-08 Patrick T Prendergast Dithiolthione compounds for the treatment of neurological disorders and for memory enhancement
KR20030067935A (ko) 2002-02-09 2003-08-19 김상건 올티프라즈를 포함하는 간경화(간경변증) 치료를 위한 간 조직 재생용 제약 조성물
CN1244325C (zh) 2001-05-11 2006-03-08 成都国嘉联合制药有限公司 胆维他在制药中的应用
US7199122B2 (en) 2001-10-02 2007-04-03 Fox Chase Cancer Center Methods for inhibiting angiogenesis
DE60309834D1 (de) 2002-02-13 2007-01-04 Solvay Pharma Verwendung von anethol-dithiolethion zur vorbeugung von lungenkrebs
TW200640898A (en) 2005-02-24 2006-12-01 Solvay Pharm Bv Anethole dithiolethione and other dithiolethiones for the treatment of conditions associated with dysfunction of monoamine neurotransmission
JP2010520333A (ja) 2007-03-01 2010-06-10 セダーズ−シナイ メディカル センター 〔１，２〕−ジチオラン部分を含有する抗酸化剤重合体およびその使用
CN102961375B (zh) 2012-12-05 2015-01-14 苏州大学 一种ampk激活剂及其在制备治疗糖尿病和/或糖尿病并发症的药物中的应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998027970A2 (en) * 1996-12-24 1998-07-02 National Research Council Of Canada Treatment of diseases or prevention of cellular damage caused by oxygen-containing free radicals
WO2001091118A1 (fr) * 2000-05-22 2001-11-29 Clarion Co., Ltd. Lecteur de disque
CN1355156A (zh) * 2000-11-27 2002-06-26 朱国和 含有造纸废料污泥的微生物菌肥及其制备方法
EP2889294A1 (en) * 2012-08-21 2015-07-01 Soochow University 3h-1,2-dithiocyclopentene-3-thioketone compounds and application thereof
CN102961376A (zh) * 2012-11-06 2013-03-13 暨南大学 HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀在制备抗淋巴瘤药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROWN, DENNIS A.; ET AL: "Synthesis and structure-activity relationships study of dithiolethiones as inducers of glutathione i", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 24(24),, JPN7022000503, 2014, pages 5829 - 5831, ISSN: 0004701579 *
MARIA N. VIANA; ET AL: "Recherche de proprietes antibilharziennesede dithiole-thiones, d'intermediaires", EUROPEAN JOURANAL MEDICINAL CHEMISTRY-CHIMI THERAPEUTIQUE, vol. 21(2),, JPN7022000504, 1986, pages 123 - 130, ISSN: 0004701580 *

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