JP2020508694A5 - - Google Patents
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Description
本発明は概して、ErbB2抗体、および例えばヒト癌治療における、単独でのまたは他のErbB2抗体(例えば、トラスツズマブ)と組み合わせたその使用に関する。
《関連出願の相互参照》
本出願は、全ての目的のためにその開示全体が参照により本明細書により組み込まれる、2017年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/443078号に対する優先権を主張する。
本出願は、全ての目的のためにその開示全体が参照により本明細書により組み込まれる、2017年1月6日に出願された米国仮特許出願第62/443078号に対する優先権を主張する。
受容体チロシンプロテインキナーゼErbB−2(ErbB2)は、上皮成長因子受容体(EGFR)ファミリーのメンバーであり、該ファミリーにはEGFR、ErbB3およびErbB4も含まれる(Akiyamaら、Arch Biochem Biophys 245、531−6(1986)(非特許文献1);RubinおよびYarden、Ann Oncol.12 Suppl 1:S3−82001(2001)(非特許文献2))。ErbB2はまた、しばしばヒト上皮成長因子受容体2(HER2)とも呼ばれ、科学文献で互換的に使用される。これらの4つの受容体の各々が細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン含み、細胞内ドメインはチロシンキナーゼドメインを含み、そのC末端は多数のシグナル伝達分子と相互作用し、リガンド依存性生理活性とリガンド非依存性生理活性の両方を示す(Marmorら、Int J Radiat Oncol Biol Phys 58、903−13(2004)(非特許文献3))。HER2は、EGFRメンバー、すなわちEGFR、ErbB3およびErbB4のいずれかとヘテロ二量体化し、他のErbB受容体の好ましい二量体化パートナーと考えられる。トランス活性化されると、ErbB2は、Ras−マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)およびPI3K−mTORカスケードを含むいくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化して、細胞増殖を促進し、アポトーシスを回避する(Citriら、Nat Rev Mol Cell Biol 7:505−16(2006)(非特許文献4)に概説されている)。ErbB2は正常な成人組織では適度に発現されており、ここでは細胞増殖および分化を調節する。ErbB2タンパク質の遺伝子増幅および過剰発現は、乳癌、胃癌および卵巣癌の20〜30%で報告されている(Kingら、Cancer Res 49:4185−91(1989)(非特許文献5);Slamonら、Science 235:177−82(1987)(非特許文献6);Koeppenら、Histopathology 38、96〜104(2001)(非特許文献7))。一般に、erbB2遺伝子増幅は比較的大きな転移能および予後不良と相関する。その発現は正常組織では比較的低レベルであるので、ErbB2は標的療法の魅力的な標的である(Drebinら、Proc Natl Acad Sci USA 83:9129−33(1986)(非特許文献8))。
トラスツズマブ(CAS180288−69−1、HERCEPTIN(登録商標)Genentech)は、細胞ベースアッセイにおいて高い親和性で(Kd=5nM)、ヒトErbB2細胞外ドメインに選択的に結合するマウスHER2抗体の組換えヒト化モノクローナル抗体バージョンである(Carterら、Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9(1992)(非特許文献9))。トラスツズマブは、in vitroアッセイとマウス異種移植片腫瘍モデルの両方で、ErbB2を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている(Hudziakら、Mol Cell Biol 9、1165〜1172(1989)(非特許文献10);Lewisら、Immunol Immunother 37、255〜263(1993)(非特許文献11))。腫瘍細胞に対する直接効果に加えて、抗体依存性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)などの免疫機構を含むいくつかの作用機序が提案されている(Ben−Kasusら、Mol Cell Biol 9、1165〜1172(2007)(非特許文献12)に概説されている)。トラスツズマブは、広範な前の抗癌療法後に進行したHER2陽性またはHER2陽性転移性乳癌(MBC(s))としても知られるErbB2過剰発現を有する患者の治療のために1998年に承認された(Baselgaら、J Clin Oncol 14、737〜744(1996)(非特許文献13);Slamonら、N Engl J Med 344、783〜792(2001)(非特許文献14))。しかしながら、トラスツズマブ単剤療法に対する患者の反応は比較的低く(およそ15%)、短命である(中央持続時間9か月)(Cobleighら、Clin Oncol 17:2639−48(1999)(非特許文献15))。一方、トラスツズマブは、おそらくはErbB2駆動生存経路の妨害のために、化学療法と組み合わせると、相乗効果を示すように思われる(Arteagaら、Cancer Res 54:3758−65(1994)(非特許文献16))。トラスツズマブは、HER2陽性腫瘍を有する患者に化学療法単独よりも著しく優れた結果を提供するが、事実上全ての治療患者が、最終的に利用可能な療法に進行する。HER2を過剰発現している癌を有する患者の結果を改善する機会が残っている。
抗体標的化療法への1つのアプローチは、抗原発現癌細胞に細胞傷害性薬物を特異的に送達するための抗体を利用することである。トラスツズマブに連結されたマイタンシノイドDM1で構成される「免疫毒素」と呼ばれ得る抗体薬物コンジュゲート(ADC(s))は、HER2過剰発現およびトラスツズマブ感受性またはトラスツズマブ耐性腫瘍細胞株、ならびにヒト乳癌の異種移植片モデルで強力な抗腫瘍活性を示す。トラスツズマブ−MCC−DM1(T−DM1)は、その疾患がHER2標的療法に難治性の患者に承認されている(Beeramら、Cancer 118、5733〜5740(2007)(非特許文献17))。しかしながら、T−DM1は、HER2+転移性乳癌(MBC)の患者に第一選択療法として使用した場合、トラスツズマブを超える利点を示さない。
代替アプローチは併用療法であり、これは、(i)耐性発達の頻度を減少させる、(ii)非重複毒性および同様の治療プロファイルを有する薬物の用量を減少させ、結果として治療指数を増加させる、(iii)別の薬物の使用を通して、細胞をある薬物に対して感作させる、および(iv)2つの薬物による生物活性に対する相加または相乗効果を利用することによって効力増強を達成するという利点を有する(Pegramら、Oncogene 18:2241〜2251(1999)(非特許文献18);Konecnyら、Breast Cancer Res.and Treatment 67:223〜233(2001)(非特許文献19);Pegramら、J.of the Nat.Cancer Inst.96(10):739〜749(2004)(非特許文献20))。
HER2二量体化阻害剤抗体およびEGFR阻害剤は、癌に対する併用療法について報告されている(米国特許出願公開第2007/0020261号(特許文献1))。ペルツズマブ(PERJETA(登録商標))は単独で、MBC患者で治療活性を有することが実証されている。さらに、ペルツズマブは、転移性疾患に対する前の抗ErbB2療法または化学療法も受けていないHER2陽性転移性乳癌(MBC)の患者の治療で、トラスツズマブおよびドセタキセルと組み合わせた使用について示されている(Baselgaら、J Clin Oncol 28、1138〜1144、(2010)(非特許文献21))。
単独でまたはトラスツズマブなどの他の治療薬と組み合わせて使用した場合に、好ましくは相乗的に、HER2陽性腫瘍細胞に対する治療効果を有する新規なErbB2抗体が依然として必要とされている。
Akiyamaら、Arch Biochem Biophys 245、531−6(1986)
RubinおよびYarden、Ann Oncol.12 Suppl 1:S3−82001(2001)
Marmorら、Int J Radiat Oncol Biol Phys 58、903−13(2004)
Citriら、Nat Rev Mol Cell Biol 7:505−16(2006)
Kingら、Cancer Res 49:4185−91(1989)
Slamonら、Science 235:177−82(1987)
Koeppenら、Histopathology 38、96〜104(2001)
Drebinら、Proc Natl Acad Sci USA 83:9129−33(1986)
Carterら、Proc Natl Acad Sci USA 89:4285−9(1992)
Hudziakら、Mol Cell Biol 9、1165〜1172(1989)
Lewisら、Immunol Immunother 37、255〜263(1993)
Ben−Kasusら、Mol Cell Biol 9、1165〜1172(2007)
Baselgaら、J Clin Oncol 14、737〜744(1996);Slamonら、N Engl J Med 344、783〜792(2001)
Slamonら、N Engl J Med 344、783〜792(2001)
Cobleighら、Clin Oncol 17:2639−48(1999)
Arteagaら、Cancer Res 54:3758−65(1994)
Beeramら、Cancer 118、5733〜5740(2007)
Pegramら、Oncogene 18:2241〜2251(1999)
Konecnyら、Breast Cancer Res.and Treatment 67:223〜233(2001)
Pegramら、J.of the Nat.Cancer Inst.96(10):739〜749(2004)
Baselgaら、J Clin Oncol 28、1138〜1144、(2010)
本発明は、5つの抗HER2抗体4C9、4H2、4G6、5H12および5G9ならびに関連する結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび医薬組成物、ならびにその使用に関する。「ErbB2抗体」、「HER2抗体」、「抗ErbB2抗体」および「抗HER2抗体」という用語は、本明細書で互いに置換可能に使用され、ErbB2またはHER2に特異的に結合する抗体を指す。
結合タンパク質が提供される。結合タンパク質は、受容体チロシンプロテインキナーゼErbB−2(ErbB2)に特異的に結合する抗原結合フラグメントを含む。抗原結合フラグメントは、配列番号17〜51および56〜160からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む。
抗原結合フラグメントは、配列番号17〜51からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも1つの可変領域を含み得る。
抗原結合フラグメントは、配列番号17および18;配列番号19および20;配列番号21および22;配列番号23および24;配列番号25および26;配列番号27および32;配列番号27および33;配列番号27および34;配列番号27および35;配列番号27および36;配列番号27および37;配列番号27および38;配列番号28および32;配列番号28および33;配列番号28および34;配列番号28および35;配列番号28および36;配列番号28および37;配列番号28および38;配列番号29および32;配列番号29および33;配列番号29および34;配列番号29および35;配列番号29および36;配列番号29および37;配列番号29および38;配列番号30および32;配列番号30および33;配列番号30および34;配列番号30および35;配列番号30および36;配列番号30および37;配列番号30および38;配列番号31および32;配列番号31および33;配列番号31および34;配列番号31および35;配列番号31および36;配列番号31および37;配列番号31および38;配列番号39および45;配列番号39および46;配列番号39および47;配列番号39および48;配列番号39および49;配列番号39および50;配列番号39および51;配列番号40および45;配列番号40および46;配列番号40および47;配列番号40および48;配列番号40および49;配列番号40および50;配列番号40および51;配列番号41および45;配列番号41および46;配列番号41および47;配列番号41および48;配列番号41および49;配列番号41および50;配列番号41および51;配列番号42および45;配列番号42および46;配列番号42および47;配列番号42および48;配列番号42および49;配列番号42および50;配列番号42および51;配列番号43および45;配列番号43および46;配列番号43および47;配列番号43および48;配列番号43および49;配列番号43および50;配列番号43および51;配列番号44および45;配列番号44および46;配列番号44および47;配列番号44および48;配列番号44および49;配列番号44および50;および配列番号44および51からなる群から選択される2つの可変領域を含み得る。
抗原結合フラグメントは、配列番号56〜160からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含み得る。
抗原結合フラグメントは3つのCDRのうちの少なくとも1つのセットを含み得、少なくとも1つのCDRセットは、4C9 VHセット、4C9 VLセット、4H2 VHセット、4H2 VLセット、4G6 VHセット、4G6 VLセット、5F12 VHセット、5F12 VLセット、5G9 VHセット、5G9 VLセット、5F12.VH.V1セット、5F12.VH.1セット、5F12.VH.2セット、5F12.VH.3セット、5F12.VH.4セット、5F12.VL.V1セット、5F12.VL.1セット、5F12.VL.2セット、5F12.VL.3セット、5F12.VL.4セット、5F12.VL.5セット、5F12.VL.6セット、5G9.VH.V1セット、5G9.VH.1セット、5G9.VH.2セット、5G9.VH.3セット、5G9.VH.4セット、5G9.VH.5セット、5G9.VL.V1セット、5G9.VL.1セット、5G9.VL.2セット、5G9.VL.3セット、5G9.VL.4セット、5G9.VL.5セットおよび5G9.VL.6セットからなる群から選択される。
抗原結合フラグメントは3つのCDRのうちの2つのCDRセットを含み得、2つのCDRセットは、4C9 VHセットおよび4C9 VLセット;4H2 VHセットおよび4H2 VLセット;4G6 VHセットおよび4G6 VLセット;5F12 VHセットおよび5F12 VLセット;5G9 VHセットおよび5G9 VLセット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.V1セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.V1セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.V1セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.V1セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.V1セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.1セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.1セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.1セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.1セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.1セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.2セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.2セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.2セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.2セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.2セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.3セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.3セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.3セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.3セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.3セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.4セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.4セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.4セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.4セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.4セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.5セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.5セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.5セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.5セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.5セット;5F12.VH.V1セットおよび5F12.VL.6セット;5F12.VH.1セットおよび5F12.VL.6セット;5F12.VH.2セットおよび5F12.VL.6セット;5F12.VH.3セットおよび5F12.VL.6セット;5F12.VH.4セットおよび5F12.VL.6セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.V1セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.1セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.2セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.3セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.4セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.5セット;5G9.VH.V1セットおよび5G9.VL.6セット;5G9.VH.1セットおよび5G9.VL.6セット;5G9.VH.2セットおよび5G9.VL.6セット;5G9.VH.3セットおよび5G9.VL.6セット;5G9.VH.4セットおよび5G9.VL.6セット;および5G9.VH.5セットおよび5G9.VL.6セットからなる群から選択される。
抗原結合フラグメントはCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含み得、CDR−H1は配列番号56、62、68、74、80、86、89、92、95、98、122、125、128、131、134および137からなる群から選択され;CDR−H2は配列番号57、63、69、75、81、87、90、93、96、99、123、126、129、132、135および138からなる群から選択され;CDR−H3は配列番号58、64、70、76、82、88、91、94、97、100、124、127、130、133、136および139からなる群から選択され;CDR−L1は配列番号59、65、71、77、83、101、104、107、110、113、116、119、140、143、146、149、152、155および158からなる群から選択され;CDR−L2は配列番号60、66、72、78、84、102、105、108、111、114、117、120、141、144、147、150、153、156および159からなる群から選択され;CDR−L3は配列番号61、67、73、79、85、103、106、109、112、115、118、121、142、145、148、151、154、157および160からなる群から選択される。
結合タンパク質はヒトアクセプターフレームワーク配列をさらに含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、配列番号3〜10からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、配列番号3〜10および161〜166からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、主要残基における少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み得、主要残基は、CDRに隣接する残基;グリコシル化部位残基;レア残基;ヒトErbB2と相互作用することができる残基;CDRと相互作用することができる残基;カノニカル残基(canonical residue);重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基;Vernierゾーン内の残基;およびChothiaによって定義された可変重鎖CDR1とKabatによって定義された第1の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の残基からなる群から選択される。
結合タンパク質が、主要残基における少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワーク配列を含む場合、結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変領域配列をさらに含み得る。
ヒトアクセプターフレームワークが少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む場合、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークの配列と少なくとも約65%同一のアミノ酸配列からなり、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークと同一の少なくとも70個のアミノ酸残基を含み得る。結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィドで連結されたFv、scFv、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体および二重特異性抗体(dual specific antibody、bispecific antibody)からなる群から選択され得る。
結合タンパク質は抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体、完全長四量体免疫グロブリン、IgG分子、IgG1分子、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体および親和性成熟抗体からなる群から選択され得る。一実施形態では、結合タンパク質がヒト化抗体である。別の実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。
「ErbB2媒介生理活性」および「ErbB2活性」という用語は、本明細書で互いに置換可能に使用され、細胞、組織、器官もしくは対象などの生物系、または試料においてErbB2によって引き起こされるまたは妨害される生物活性を指す。ErbB2媒介生理活性またはErbB2活性は、ErbB2を過剰発現している細胞で上方制御され得る。ErbB2媒介生理活性の例としては、自身とのホモ二量体化、EGFR、またはErbB3またはErbB4とのヘテロ二量体化、ErbB2によって制御されるシグナル伝達経路、およびErbB2依存性細胞増殖が挙げられる。試料は対象から得ることができる。細胞は対象内にあり得る。
対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。対象は、ErbB2活性が有害である疾患または障害を患い得る。本明細書で使用される「有害」という用語は、疾患も障害も有さない対照である対象のErbB2活性と比較した、疾患または障害を有する対象のErbB2活性の変化を指す。ErbB2活性が疾患または障害を有する対象で有害である場合、ErbB2活性が、疾患も障害も有さない対照である対象のErbB2活性よりも、例えば少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%高くなり得る。
結合タンパク質はErbB2媒介生理活性を調節し得る。本明細書で使用される「調節する」という用語は、ErbB2媒介生理活性を増加または減少させることを指す。ErbB2媒介生理活性が変化している場合、結合タンパク質は変化したErbB2媒介生理活性を中和することができる。ErbB2媒介生理活性が上方制御されている場合、結合タンパク質は上方制御されたErbB2媒介生理活性を減少、阻害、遮断または拮抗することができる。結合タンパク質は、例えば試料または細胞のErbB2媒介生理活性の少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%を調節することができる。このような結合タンパク質について、試料または細胞のErbB2媒介生理活性を調節する方法が提供される。本方法は、有効量の結合タンパク質を、ErbB2媒介生理活性を有する試料または細胞に投与する工程を含み、それによってErbB2媒介生理活性が、例えば少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%調節される。例えば試料、細胞または対象のErbB2媒介生理活性を調節するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
結合タンパク質は、ErbB2陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行され得る。本明細書で使用される「ErbB2陽性細胞」という用語は、ErbB2を発現する細胞を指す。一実施形態では、ErbB2陽性細胞がErbB2を過剰発現する。このような結合タンパク質が、抗体薬物コンジュゲート(ADC)用途に使用され得る。結合タンパク質は、少なくとも約5%、約10%、約15%、約20%、約30%または約50%の内部移行率を有し得る。結合タンパク質は、エンドサイトーシスによって内部移行され得る。結合タンパク質は、ErbB2との複合体で内部移行され得る。このような結合タンパク質について、結合タンパク質をErbB2陽性細胞に内部移行する方法が提供される。本方法は、細胞を有効量の結合タンパク質と接触させる工程を含み、それによって結合タンパク質が細胞に内部移行される。細胞は対象内にあり得る。結合タンパク質をErbB2陽性細胞に内部移行するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
結合タンパク質は、同時または逐次のいずれかで一緒にErbB2陽性細胞と接触させると、追加の薬剤の前記細胞への内部移行を増強し得る。増強は、接触後所定の期間以内、例えば、約0.5時間、約1時間、約2時間、約4時間、約6時間、約8時間、約10時間、約12時間、約16時間または約24時間以内に少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%であり得る。追加の薬剤は、ErbB2に結合することができるが、結合タンパク質とは異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ErbB2はヒトErbB2であり得る。追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。結合タンパク質は、接触後2時間以内に、トラスツズマブのErbB2細胞への内部移行を少なくとも約20%増強し得る。
結合タンパク質は、ErbB2陽性細胞の増殖を阻害し得る。ErbB2細胞の増殖が、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%阻害され得る。ErbB2陽性細胞はBT474細胞であり得る。結合タンパク質は、BT474細胞の増殖を少なくとも約70%阻害し得る。
結合タンパク質は、ErbB2陽性腫瘍の増殖を、場合により追加のErbB2抗体と相乗的に阻害し得る。ErbB2陽性腫瘍の増殖は、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%阻害され得る。腫瘍は追加のErbB2抗体に耐性であり得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質および追加のErbB2抗体による腫瘍増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質および追加のErbB2抗体による相加阻害よりも少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%大きくなり得る。追加のErbB2抗体はトラスツズマブであり得る。結合タンパク質は、トラスツズマブと使用すると、ErbB2陽性およびトラスツズマブ耐性である腫瘍の増殖を、少なくとも約70%阻害し得る。
結合タンパク質構築物も提供される。結合タンパク質構築物は、本発明の結合タンパク質と、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域とを含む。免疫グロブリン定常領域は、ヒトIgM定常領域、ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域、ヒトIgG4定常領域、ヒトIgE定常領域およびヒトIgA定常領域からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域であり得る。免疫グロブリン定常領域は、配列番号1、配列番号2およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。結合タンパク質構築物では、結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有し得る。
結合タンパク質コンジュゲートがさらに提供される。結合タンパク質コンジュゲートは、本発明の結合タンパク質構築物と、イメージング剤、治療薬、細胞傷害剤および免疫付着分子(immunoadhesion molecule)からなる群から選択される薬剤とを含む。イメージング剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択され得る。薬剤は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生薬、有糸分裂阻害薬、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス剤からなる群から選択され得る。結合タンパク質コンジュゲートでは、結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有し得る。結合タンパク質コンジュゲートは抗体コンジュゲートであり得る。
結合タンパク質コンジュゲートは、ErbB2陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行され得る。結合タンパク質コンジュゲートは、エンドサイトーシスによって内部移行され得る。結合タンパク質コンジュゲートは、ErbB2との複合体で内部移行され得る。このような結合タンパク質コンジュゲートについて、結合タンパク質コンジュゲートをErbB2陽性細胞に内部移行する方法が提供される。本方法は、細胞を有効量の結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含み、それによって結合タンパク質コンジュゲートが細胞に内部移行される。細胞は対象内にあり得る。結合タンパク質コンジュゲートをErbB2陽性細胞に内部移行するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
結合タンパク質は結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質結晶は、結合タンパク質の可溶性カウンターパートよりも長いin vivo半減期を有し得る。結合タンパク質結晶は、結合タンパク質の非結晶形態の生物活性を保持し得る。
結合タンパク質構築物は結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質構築物結晶は、結合タンパク質構築物の可溶性カウンターパートよりも長いin vivo半減期を有し得る。結合タンパク質構築物結晶は、結合タンパク質構築物の非結晶形態の生物活性を保持し得る。
結合タンパク質コンジュゲートは結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質コンジュゲート結晶は、結合タンパク質コンジュゲートの可溶性カウンターパートよりも長いin vivo半減期を有し得る。結合タンパク質コンジュゲート結晶は、結合タンパク質コンジュゲートの非結晶形態の生物活性を保持し得る。
本発明の各結合タンパク質について、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、NVおよびpBJからなる群から選択され得る。
本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は原核細胞であり得る。宿主細胞は大腸菌(Escherichia coli)であり得る。宿主細胞は真核細胞であり得る。真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択され得る。動物細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞および昆虫細胞からなる群から選択され得る。哺乳動物細胞はCHO細胞またはCOS細胞であり得る。真菌細胞は出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)であり得る。昆虫細胞はSf9細胞であり得る。
本発明の結合タンパク質を作製する方法が提供される。本方法は、宿主細胞を、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下、培養培地で培養する工程を含む。宿主細胞は、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本発明により作製される結合タンパク質が提供される。
本発明の結合タンパク質を放出するための放出組成物が提供される。本組成物は、製剤と、少なくとも1つのポリマー担体とを含む。製剤は、結晶化結合タンパク質と、成分とを含む。ポリマー担体は、ポリ(アクリル酸)、ポリ(シアノアクリレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−グリコール酸共重合体)すなわちPLGA、ポリ(b−ヒドロキシ酪酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、ポリ[(オルガノ)ホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニック(登録商標)ポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、これらのブレンドおよび共重合体からなる群から選択されるポリマーであり得る。成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択され得る。放出組成物から哺乳動物に結合タンパク質を放出する方法が提供される。本方法は、有効量の放出組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、それによって結合タンパク質が哺乳動物に放出される。放出組成物を製造する方法が提供される。製造方法は、製剤を少なくとも1つのポリマー担体と混合する工程を含む。
医薬組成物は、本発明の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、ErbB2活性が有害である障害を治療するための少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含み得る。追加の薬剤は、治療薬;イメージング剤;抗新生物薬;化学療法薬;血管新生阻害剤;抗VEGF抗体;抗EGFR抗体;抗c−Met抗体;抗ErbB3抗体;抗ErbB2抗体;抗CD20抗体;アフリベルセプト;キナーゼ阻害剤;同時刺激分子遮断薬;抗B7.2抗体;CTLA4−Ig;接着分子遮断薬;抗Eセレクチン抗体;抗Lセレクチン抗体;抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント;抗IL−18抗体;抗TNF抗体;抗IL−6抗体;メトトレキサート;コルチコステロイド;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;DNAアルキル化剤;シスプラチン;カルボプラチン;抗チューブリン剤;パクリタキセル;ドセタキセル;ドキソルビシン;ゲムシタビン;ジェムザール;アントラサイクリン;アドリアマイシン;トポイソメラーゼI阻害剤;トポイソメラーゼII阻害剤;5−フルオロウラシル(5−FU);ロイコボリン;イリノテカン;受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アポトーシス阻害剤;Bcl2/Bclx阻害剤;エルロチニブ、ゲフィチニブ、COX−2阻害剤、セレコキシブ、シクロスポリン;ラパマイシン;検出可能な標識またはレポーター分子;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋遮断薬;抗微生物薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;アナボリックステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制剤;成長ホルモン;ホルモン補充薬;放射性医薬品;抗うつ薬;統合失調症治療薬;刺激剤;喘息薬;βアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン;そのエピネフリン類似体;サイトカイン;およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択され得る。
対象の疾患または障害を治療する方法が提供される。疾患または障害ではErbB2活性が有害である。治療方法は、有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを対象に投与する工程を含み、それによって対象のErbB2活性が調節される。疾患または障害は、乳癌、胃癌(gastric cancer、stomach cancer)、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿道癌、女性生殖系癌、男性生殖系癌、内分泌線癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血器腫瘍からの固形腫瘍、腫瘍転移、眼血管新生、浮腫、関節リウマチ、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、膵炎、多嚢胞性卵巣(POD)、子宮内膜症、子宮類線維症、前立腺肥大症、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症(CADA−SIL)、多発性硬化症(MS)、ファロー四徴症(TOF)、アラジール症候群(AS)、黄斑変性および加齢性黄斑変性疾患、ならびに異常なErbB2活性を特徴とする他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択され得る。疾患または障害は原発性および転移性癌であり得る。疾患または障害は乳癌であり得る。女性生殖器系癌は、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌および妊娠性絨毛疾患からなる群から選択される。女性生殖器系癌は卵巣癌であり得る。疾患または障害は胃癌であり得る。疾患または障害は肺癌であり得る。髄膜癌は、星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫および髄膜腫からなる群から選択され得る。造血器腫瘍からの固形腫瘍は、白血病、ホジキン白血病、非ホジキン白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫であり得る。眼血管新生は、糖尿病性失明、網膜症、加齢性黄斑変性およびルベオーシスからなる群から選択され得る。疾患または障害が腫瘍である場合、治療方法は、対象の腫瘍の増殖を、例えば少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%阻害する工程をさらに含む。腫瘍はErbB2陽性であり得る。
治療方法によると、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、肋膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮からなる群から選択される少なくとも1つの様式によって対象に投与され得る。
治療方法は、1つまたは複数の追加の薬剤を同時または逐次のいずれかで投与する工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ErbB2に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ErbB2はヒトErbB2であり得る。1つまたは複数の追加の薬剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。本方法は、1つまたは複数の追加の薬剤と相乗的に、対象のErbB2活性を調節する工程をさらに含み得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと1つまたは複数の追加の薬剤の相乗効果は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと1つまたは複数の追加の薬剤による相加効果よりも少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%大きくなり得る。
治療方法は、同時または逐次のいずれかで、治療上有効量の第2の薬剤を投与する工程をさらに含み得る。第2の薬剤は、メトトレキサート;ヒトTNFに結合することができる抗体またはそのフラグメント;コルチコステロイド;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;非ステロイド性抗炎症薬(NSAID);放射線治療薬;抗新生物薬;化学療法薬;DNAアルキル化剤;シスプラチン;カルボプラチン;抗チューブリン剤;パクリタキセル;ドセタキセル;タキソール;ドキソルビシン;ゲムシタビン;ジェムザール;アントラサイクリン;アドリアマイシン;トポイソメラーゼI阻害剤;トポイソメラーゼII阻害剤;5−フルオロウラシル(5−FU);ロイコボリン;イリノテカン;受容体チロシンキナーゼ阻害剤;エルロチニブ;ゲフィチニブ;COX−2阻害剤;セレコキシブ;キナーゼ阻害剤;血管新生阻害剤;抗VEGF抗体;アフリベルセプト;同時刺激分子遮断薬;抗B7.1抗体;抗B7.2抗体;CTLA4−Ig;抗CD20抗体;接着分子遮断薬;抗LFA−1抗体;抗Eセレクチン抗体;および抗Lセレクチン抗体;小分子阻害剤;抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント;抗IL−18抗体;抗TNF抗体;抗IL−6抗体;抗サイトカイン受容体抗体;検出可能な標識またはレポーター;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋遮断薬;抗微生物薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;アナボリックステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制剤;成長ホルモン;ホルモン補充薬;放射性医薬品;抗うつ薬;統合失調症治療薬;刺激剤;喘息薬;βアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン;エピネフリン類似体;サイトカイン;およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択され得る。
各治療方法について、対象の疾患または障害を治療するための医薬品が提供される。疾患または障害ではErbB2活性が有害である。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は、1つまたは複数の追加の薬剤および/または第2の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを、薬学的に許容される担体ならびに場合により1つまたは複数の追加の薬剤および/または第2の薬剤と混合する工程を含む。
ErbB2陽性細胞の増殖を阻害する方法が提供される。阻害方法は、細胞を有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含む。ErbB2細胞の増殖が、少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%阻害され得る。ErbB2陽性細胞はBT474細胞であり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートは、BT474細胞の増殖を少なくとも70%阻害し得る。阻害方法は、細胞を1つまたは複数の追加の薬剤と接触させる工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ErbB2に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと1つまたは複数の追加の薬剤は細胞の増殖を相乗的に阻害し得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のErbB2抗体によるErbB2陽性細胞の増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のErbB2抗体による相加阻害よりも少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%大きくなり得る。1つまたは複数の追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。細胞は対象内にあり得る。対象は、ErbB2活性が有害である疾患または障害を患い得る。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。各阻害方法について、対象のErbB2陽性細胞の増殖を阻害するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は1つまたは複数の追加の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体および場合により1つまたは複数の追加の薬剤と混合する工程を含む。
ErbB2陽性腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。阻害方法は、腫瘍を有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含む。腫瘍の増殖が少なくとも約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%または約99%阻害され得る。阻害方法は、腫瘍を1つまたは複数の追加の薬剤と接触させる工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ErbB2に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと1つまたは複数の追加の薬剤は腫瘍の増殖を相乗的に阻害し得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のErbB2抗体による腫瘍増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のErbB2抗体による相加阻害よりも少なくとも約5%、約10%、約20%、約30%、約40%または約50%大きくなり得る。1つまたは複数の追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。腫瘍はトラスツズマブ耐性であり得る。追加のErbB2抗体がトラスツズマブであり、腫瘍がトラスツズマブ耐性である場合、トラスツズマブと組み合わせて使用すると、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートによって、腫瘍の増殖が少なくとも約70%阻害され得る。細胞は対象内にあり得る。対象は、ErbB2活性が有害である疾患または障害を患い得る。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。各阻害方法について、対象のErbB2陽性細胞の増殖を阻害するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は1つまたは複数の追加の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体および場合により1つまたは複数の追加の薬剤と混合する工程を含む。
本発明は、ヒトErbB2に特異的に結合し、場合によりトラスツズマブの抗腫瘍有効性を相乗的に増強する(例えば、ErbB2発現、活性および/またはシグナル伝達を阻害、拮抗、調節する)結合タンパク質を提供する。本発明は、細胞ベース機能的アッセイを使用することによる大規模なトラスツズマブベース相乗有効性スクリーニングから、トラスツズマブと使用した場合に、ペルツズマブよりも強力な相乗有効性を有するとものとして同定された5つの新規な抗体の発見に基づく。トラスツズマブとペルツズマブの併用処置と具体的に比較して、トラスツズマブとこれらの抗体のいずれか1つの組み合わせは、ErbB2陽性細胞または腫瘍、例えばErbB2陽性およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖の阻害について有意に高い有効性結果をもたらす。
抗ErbB2抗体4C9、4H2、4G6、5H12および5G9、ならびにこれらのキメラおよびヒト化変異体を含む、ErbB2に特異的に結合する結合タンパク質が提供される。一実施形態では、結合タンパク質が、これらの抗体のいずれか1つの重鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列ならびに軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む。別の実施形態では、これらの抗体のいずれか1つの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む結合タンパク質が提供される。さらに別の実施形態では、これらの抗体のいずれか1つの重鎖可変領域配列と少なくとも80%、85%、90%または95%同一のアミノ酸配列およびこれらの抗体のいずれか1つの軽鎖可変領域配列と少なくとも80%、85%、90%または95%同一のアミノ酸配列を含む結合タンパク質が提供される。
本発明の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子が提供される。このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
本発明の結合タンパク質を作製する方法が提供される。
トラスツズマブと本発明の結合タンパク質とを含む組成物が提供される。結合タンパク質は、トラスツズマブによって結合されるエピトープともペルツズマブによって結合されるエピトープとも異なる別個のエピトープに結合し得る。結合タンパク質は、トラスツズマブなどの別のErbB2抗体の内部移行を有意に改善し得る、ならびに/あるいはトラスツズマブなどの別のErbB2抗体と相乗的に、ErbB2媒介生理活性、例えば下流シグナル伝達経路のリン酸化および細胞増殖を調節し得る。
本発明の結合タンパク質と、抗癌剤とを含む結合タンパク質コンジュゲートが提供される。結合タンパク質コンジュゲートは、免疫毒性であり得る。結合タンパク質コンジュゲートと、トラスツズマブなどの別のErbB2抗体と、免疫毒性であり得る結合タンパク質コンジュゲートとを含む組成物も提供される。
本発明の結合タンパク質または組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象の疾患または障害を治療する方法。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。本方法は、トラスツズマブなどの別のErbB2抗体を対象に投与する工程をさらに含み得る。対象(例えば、ヒト)の疾患または障害(例えば、癌)を治療するための、結合タンパク質と、場合によりトラスツズマブなどの別のErbB2抗体とを含む医薬品も提供される。
トラスツズマブなどの別のErbB2抗体のErbB2陽性への内部移行を増強する方法が提供される。本方法は、細胞を本発明の結合タンパク質または組成物と接触させる工程を含む。
A.定義
「抗体」という用語は、広義の意味で使用され、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、具体的にはモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)を網羅する。抗体(Ab)および免疫グロブリン(Ig)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特異的標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体および免疫グロブリンは通常、2本の同一の軽(L)鎖および2本の同一の重(H)鎖で構成される、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、一端に、可変領域(VH)、引き続いていくつかの定常領域を有する。各軽鎖は、一端に、可変領域(VL)および他端に定常領域を有する。さらに、「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は、完全抗体と、タンパク質に特異的に結合することができる抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2フラグメントなど)の両方を含むことを意図している。FabおよびF(ab’)2フラグメントは、完全抗体のFcフラグメントを欠き、動物または植物の循環からより迅速になくなり、完全抗体よりも非特異的組織結合が少なくなり得る(Wahlら、J Nucl Med 24:316(1983))。
「抗体」という用語は、広義の意味で使用され、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、具体的にはモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)を網羅する。抗体(Ab)および免疫グロブリン(Ig)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特異的標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体および免疫グロブリンは通常、2本の同一の軽(L)鎖および2本の同一の重(H)鎖で構成される、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、一端に、可変領域(VH)、引き続いていくつかの定常領域を有する。各軽鎖は、一端に、可変領域(VL)および他端に定常領域を有する。さらに、「抗体」(Ab)または「モノクローナル抗体」(mAb)という用語は、完全抗体と、タンパク質に特異的に結合することができる抗体フラグメント(例えば、FabおよびF(ab’)2フラグメントなど)の両方を含むことを意図している。FabおよびF(ab’)2フラグメントは、完全抗体のFcフラグメントを欠き、動物または植物の循環からより迅速になくなり、完全抗体よりも非特異的組織結合が少なくなり得る(Wahlら、J Nucl Med 24:316(1983))。
「キメラ抗体」は、広義の意味で、ある抗体の1つまたは複数の領域と、1つまたは複数の他の抗体の1つまたは複数の領域とを含む抗体を指す。本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」は一般に、部分的にヒト起源であり、部分的に非ヒト起源である、すなわち一部はマウスまたはラットなどの非ヒト動物に由来する抗体である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Morrison、Science 229:1202(1985);Oiら、BioTechniques 4:214(1986);Gilliesら、J Immunol Methods 125:191(1989)を参照されたい。
「Kabatナンバリング」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも可変性(すなわち、超可変性)のアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す(Kabatら、Ann.NY Acad.Sci、190:382〜391(1971)およびKabatら Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH公開番号91−3242(1991))。重鎖可変領域(VH)については、超可変領域は、CDR1のアミノ酸31〜35位、CDR2のアミノ酸50〜66位およびCDR3のアミノ酸95〜102位の範囲である。軽鎖可変領域(VL)については、超可変領域は、CDR1のアミノ酸24〜34位、CDR2のアミノ酸50〜56位およびCDR3のアミノ酸89〜97位の範囲である。
「CDRグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、VHおよび/またはVLのCDR領域の1つまたは複数の配列が別の種のCDR配列で置き換えられている抗体、例えばマウスCDRの1つまたは複数(例えば、CDR3)がヒトCDR配列で置き換えられている、マウス重鎖可変領および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種(例えば、マウス)の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、VHおよび/またはVL配列の少なくとも一部がより「ヒト様」、すなわちヒト生殖系列可変配列に類似であるように改変された抗体を指す。「ヒト化抗体」は、目的の抗原に特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク(FR)領域と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域(CDR)とを含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくはフラグメントである。本明細書で使用する場合、CDRの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%同一のアミノ酸配列を有するCDRを指す。
本明細書で使用する場合、「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域(FR)の1つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%を提供またはコードする抗体または核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、「アクセプター」という用語が、定常領域を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、「アクセプター」という用語が、フレームワーク領域および定常領域の1つまたは複数を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。具体的な実施形態では、「アクセプター」という用語が、フレームワーク領域の1つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%または100%を提供またはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の1つまたは複数の特定の位置に生じない少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個または少なくとも10個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および/またはアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体(例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販の抗体)から誘導するまたは得ることができる。
「可変」という用語は、可変領域の一定の部分が抗体間で配列が広く異なり、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変領域にわたって均一に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方の超可変領域と呼ばれる3つのセグメントに濃縮されている。可変領域のより高度に保存された部分はフレームワーク領域(FR)と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、βシート構造を接続、ある場合にはβシート構造の一部を形成するループを形成する3つの超可変領域によって接続されたβシート配置を大いに採用する4つのFRを含む。各鎖の超可変領域がFRによって他の鎖の超可変領域と極めて接近して結合しており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版 Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991)参照)。定常領域は抗体と抗原の結合に直接的には関与していないが、抗体依存性細胞傷害(ADCC)への抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」すなわち「CDR」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変領域の残基24〜34(L1)、50〜56(L2)および89〜97(L3)と重鎖可変領域の31〜35(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3);Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版 Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991))および/または「超可変ループ」の残基(例えば、軽鎖可変領域の残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)と重鎖可変領域の26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3);ChothiaおよびLesk J. Mol. Biol. 196:901〜917(1987))を含む。「フレームワーク領域」すなわち「FR」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変領域残基である。
抗体のパパイン消化により、それぞれ単一抗原結合部位を有する「Fab」フラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名称が容易に結晶化することができることを反映している残留「Fc」フラグメントが得られる。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、まだ抗原と架橋を形成することができるF(ab’)2フラグメントが得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、密で非共有結合的に会合した1つの重鎖可変領域および1つの軽鎖可変領域の二量体からなる。各可変領域の3つの超可変領域が相互作用してVH−VL二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのがこの配置である。まとめると、6個の超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりは親和性が低いが、単一可変領域(または抗原に特異的な3つの超可変領域のみを含むFvの半分)でさえ抗原を認識し、これに結合する能力を有する。
Fabフラグメントはまた、軽鎖の定常領域および重鎖の第1の定常領域(CH1)も含む。Fab’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の1個または複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端の数個の残基の付加によってFabフラグメントとは異なる。Fab’−SHは、定常領域のシステイン残基が少なくとも1個の遊離チオール基を有するFab’についての本明細書での名称である。F(ab’)2抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有するFab’フラグメントのペアとして作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
脊椎動物種の抗体の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に異なる種類の一方に割り当てることができる。
「単鎖Fv」すなわち「scFv」抗体フラグメントは抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。scFvの概説については、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer−Verlag、ニューヨーク、269〜315頁(1994)を参照されたい。ErbB2抗体scFvフラグメントは、国際公開第93/16185号;米国特許第5571894号;および米国特許第5587458号に記載されている。
「免疫グロブリン」という用語は、血液または血清中に見られる抗体の混合物の総称として一般的に使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すためにも使用され得る。
「同族VHおよびVLコードペア」という用語は、同じ抗体産生細胞内に含まれるまたは同じ抗体産生細胞に由来するVHコード配列とVLコード配列の元のペアを記載するものである。よって、同族VHおよびVLペアは、このような細胞が得られたドナー中に元々存在するVHおよびVLペアリングを表す。「VHおよびVLコードペアから発現される抗体」という用語は、抗体または抗体フラグメントが、ベクター、プラスミドまたはVHおよびVLコード配列を含む他のポリヌクレオチドから産生されることを示す。同族VHおよびVLコードペアが、完全な抗体としてまたはその安定なフラグメントとして発現される場合、これらは、それらが得られた細胞から元々発現される抗体の結合親和性および特異性を保つ。同族ペアのライブラリーは同族ペアのレパートリーまたはコレクションとも呼ばれ、個別に保持され得るまたはプールされ得る。「組換え抗体」という用語は、抗体のコード配列(前記コード配列は自然には細胞に関連していない)を含む発現ベクター(または場合により2つ以上の発現ベクター、典型的には2つの発現ベクター)でトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現される抗体を指す。
本明細書で使用する場合、「カノニカル」残基という用語は、Chothiaら(J.Mol.Biol.、196:901〜917(1987);Chothiaら、J.Mol.Biol.、227:799〜817(1992))によって定義される特定のカノニカルCDR構造を規定するCDRまたはフレームワーク中の残基を指す。Chothiaらによると、多くの抗体のCDRの重要な部分は、アミノ酸配列レベルでは多様性が大きいにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。各カノニカル構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対するペプチド骨格ねじれ角のセットを指定する。
本明細書で使用する場合、「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からCDRを減じた残りの配列を指す。CDR配列の正確な定義は様々なシステム(例えば、上記参照)によって決定され得るので、それに対応してフレームワーク配列の意味は様々な解釈を受ける。6つのCDR(軽鎖のCDR−L1、−L2およびL3と重鎖のCDR−H1、−H2および−H3)はまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の4つの部分領域(FR1、FR2、FR3およびFR4)に分け、CDR1はFR1とFR2との間に、CDR2はFR2とFR3との間に、CDR3はFR3とFR4との間に位置する。特定の部分領域をFR1、FR2、FR3またはFR4として特定せず、他によって言及されるフレームワーク領域は、単一の、天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内に結合したFRを表す。本明細書で使用する場合、1つのFRは4つの部分領域の1つを表し、複数のFRはフレームワーク領域を構成する4つの部分領域のうちの2つ以上を表す。
当技術分野で公知の技術を使用して非ヒト抗体をヒト化するために重鎖および軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列(または単に、「アクセプター」配列)として使用され得るヒト重鎖および軽鎖フレームワーク(FR)配列が当技術分野で公知である。本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列が、公的に入手可能なデータベース、例えばVベース(ハイパーテキスト転送プロトコル://vbase.mrc−cpe.cam.ac.uk/)または国際IMMUNOGENETICS(登録商標)(IMGT(登録商標))情報システム(ハイパーテキスト転送プロトコル://imgt.cines.fr/texts/IMGTrepertoire/LocusGenes/)に列挙されているフレームワーク配列から選択される。
以下の表2は、当技術分野で公知のヒト重鎖アクセプター配列の例の非限定的なリストを提供する。
以下の表3は、当技術分野で公知のヒト軽鎖アクセプター配列の例の非限定的なリストを提供する。
本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列が以下の表2および表3に記載のアミノ酸配列から選択されるが、表2および表3に列挙されていない他のヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列も本発明による抗体をヒト化するために使用することができる。
一実施形態では、本発明によるErbB2に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するための表2の重鎖ヒトアクセプターフレームワーク配列が、hIGHV1−69 FR1;hIGHV1−69 FR2;hIGHV1−69 FR3;および、hIGHJ4 FR4;のアクセプター配列からなるセット;hIGHV1−46 FR1;hIGHV1−46 FR2;hIGHV1−46 FR3;および、hIGHJ4 FR4;のアクセプター配列からなるセットを含む。
別の実施形態では、本発明によるErbB2に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するための表3の軽鎖ヒトアクセプターフレームワーク配列が、hIGKV1−33 FR1;hIGKV1−33 FR2;hIGKV1−33 FR3;および、hIGKJ1 FR4;のアクセプター配列からなるセットと、hIGKV1−27 FR1;hIGKV1−27 FR2;hIGKV1−27 FR3;および、hIGKJ1 FR4;のアクセプター配列からなるセットを含む。
さらに別の実施形態では、本発明によるErbB2に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するためのヒトアクセプターフレームワーク配列のセットが、
重鎖フレームワーク−1(H−FR1):
Q−V−Q−L−V−Q−S−G−A−E−V−K−K−P−G−S−S−V−K−V−S−C−K−X24−S−G−G−T−F−X30(配列番号52)(式中、X24はAまたはTであり、X30はSまたはTである);
重鎖フレームワーク−2(H−FR2):W−V−R−Q−A−P−G−Q−G−L−E−W−M−G(配列番号4);
重鎖フレームワーク−3(H−FR3):
R−X67−T−I−T−A−D−X73−S−T−X76−T−A−Y−M−E−L−S−S−L−R−S−E−D−T−A−V−Y−Y−C−A−R(配列番号53)(式中、X67はAまたはVであり、X73はKまたはQであり、X76はSまたはNである)
重鎖フレームワーク−4(H−FR4):W−G−Q−G−T−L−V−T−V−S−S(配列番号6)
軽鎖フレームワーク−1(L−FR1):
D−I−Q−M−T−Q−S−P−S−S−L−S−A−S−V−G−D−R−V−T−I−T−C(配列番号7);
軽鎖フレームワーク−2(L−FR2):W−Y−Q−X38−K−P−G−K−G−P−K−L−L−I−X49(配列番号54)(式中、X38はQまたはHであり、X49はYまたはHである)、
軽鎖フレームワーク−3(L−FR3):
G−X58−P−S−R−F−S−G−S−G−S−G−X69−D−X71−T−X73−T−I−S−S−L−Q−P−E−D−F−A−T−Y−Y−C(配列番号55)(式中、X58はIまたはVであり、X69はK、TまたはRであり、X71はYまたはFであり、X73はLまたはFである);
軽鎖フレームワーク−4(L−FR4):F−G−Q−G−T−K−V−E−I−K(配列番号10)
からなる群から選択されるアクセプターフレームワーク配列の1つまたは複数(例えば、結合ドメイン1つ当たりいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つ)を含む。
重鎖フレームワーク−1(H−FR1):
Q−V−Q−L−V−Q−S−G−A−E−V−K−K−P−G−S−S−V−K−V−S−C−K−X24−S−G−G−T−F−X30(配列番号52)(式中、X24はAまたはTであり、X30はSまたはTである);
重鎖フレームワーク−2(H−FR2):W−V−R−Q−A−P−G−Q−G−L−E−W−M−G(配列番号4);
重鎖フレームワーク−3(H−FR3):
R−X67−T−I−T−A−D−X73−S−T−X76−T−A−Y−M−E−L−S−S−L−R−S−E−D−T−A−V−Y−Y−C−A−R(配列番号53)(式中、X67はAまたはVであり、X73はKまたはQであり、X76はSまたはNである)
重鎖フレームワーク−4(H−FR4):W−G−Q−G−T−L−V−T−V−S−S(配列番号6)
軽鎖フレームワーク−1(L−FR1):
D−I−Q−M−T−Q−S−P−S−S−L−S−A−S−V−G−D−R−V−T−I−T−C(配列番号7);
軽鎖フレームワーク−2(L−FR2):W−Y−Q−X38−K−P−G−K−G−P−K−L−L−I−X49(配列番号54)(式中、X38はQまたはHであり、X49はYまたはHである)、
軽鎖フレームワーク−3(L−FR3):
G−X58−P−S−R−F−S−G−S−G−S−G−X69−D−X71−T−X73−T−I−S−S−L−Q−P−E−D−F−A−T−Y−Y−C(配列番号55)(式中、X58はIまたはVであり、X69はK、TまたはRであり、X71はYまたはFであり、X73はLまたはFである);
軽鎖フレームワーク−4(L−FR4):F−G−Q−G−T−K−V−E−I−K(配列番号10)
からなる群から選択されるアクセプターフレームワーク配列の1つまたは複数(例えば、結合ドメイン1つ当たりいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つまたは8つ)を含む。
好ましい実施形態では、本発明によるErbB2抗体に結合する抗体が、上記のH−FR1、H−FR2、H−FR3、H−FR4、L−FR1、L−FR2、L−FR3およびL−FR4アクセプター配列からなるヒトアクセプター配列のセットを使用してヒト化される。
「抗体の組み合わせ」または「抗体組み合わせ」または「抗体混合物」という用語は、異なるCDR配列を有する少なくとも2つの別個の抗体を指す。
本明細書で使用される「相乗」という用語は、2つ以上のモノクローナル抗体の相加効果よりも有効な抗体組み合わせを指す。薬物組み合わせの相乗作用についての実験設計はChou(Pharmacol Rev 58:621〜681、2006)によって記載された。本発明によって提供される組み合わせはいくつかのアッセイシステムで評価され、抗癌剤間の相乗作用、相加作用(additivism)および拮抗作用を定量化するための標準的なプログラムを利用してデータを分析することができる。併用療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であると分かることがある、すなわち、有効成分を、同時または逐次のいずれかで一緒に使用した場合に達成される効果が、化合物を単独で使用して得られる効果の和よりも大きい。相乗効果は、2つ以上の抗体を(1)同時に処方して投与する、もしくは組み合わせ製剤で同時に送達する;(2)別々の製剤として交互に送達する場合、または(3)二重特異性IgGフォーマットなどのある他のレジメンによって達成され得る。
「中和」という用語は、抗体が抗原に特異的に結合する場合に、抗原の生物活性に対抗することを指す。一実施形態では、中和抗体が抗原に結合し、その生物活性を少なくとも約20%、約40%、約60%、約80%、約85%、約90%、約95%またはそれ以上中和する。
「別個のエピトープ」という用語は、本発明の2つの異なる抗体が別個のエピトープに結合する場合に、好ましくは抗原結合についての競合が80%未満、より好ましくは抗原結合についての競合が50%未満、最も好ましくは競合が可能な限り少ない、例えば抗原結合についての競合が約25%未満であるという事実を指す。同じ抗原への結合について互いに競合することができる抗体は、同じもしくは重複するエピトープに結合し得る、または互いに密接した結合部位を有し得、結果として競合が主に立体障害によって引き起こされるので、「同じエピトープ」という用語は、本発明の2つの異なる抗体が同じエピトープに結合する場合に、好ましくは抗原結合についての競合が80%超、より好ましくは抗原結合についての競合が85%超、より好ましくは抗原結合についての競合が90%超、最も好ましくは抗原結合についての競合が95%超であるという事実を指す。抗体ペアの「別個のエピトープ」または「同じエピトープ」についての分析は、当技術分野で公知の方法、例えば、ErbB2を発現する細胞および個々の蛍光標識抗体に対するFACS(蛍光活性化セルソーティング)もしくは他のフローサイトメトリー分析を使用した飽和抗体条件下での結合実験によって、またはフローセル表面に捕捉もしくはコンジュゲートしたErbB2抗原を使用した表面プラズモン共鳴(SPR)によって行うことができる。SPRを使用した抗体間の競合を決定する方法を実施例で記載する。
「抗体コンジュゲート」という用語は、治療薬または細胞傷害剤などの第2の化学部分に化学的に連結された抗体を指す。「剤」という用語は、本明細書において、化合物、化合物の混合物、生体高分子または生物材料から作製された抽出物を示すために使用される。好ましくは、治療薬または細胞傷害剤には、それだけに限らないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロンミトラマイシン、アクチノマイシンD、l−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体またはホモログが含まれる。
B.トラスツズマブ相乗抗ErbB2抗体の作製
本発明の一態様は、トラスツズマブ相乗中和能力を有するErbB2に結合する単離マウスモノクローナル抗体を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するキメラ抗体を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するCDRグラフト抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態では、抗体またはその部分が単離抗体またはその単離部分である。別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分が中和抗ErbB2抗体である。有利には、このようなErbB2に結合する抗体またはその抗原結合部分が、個体(ヒトまたは他の哺乳動物)へ投与され得るトラスツズマブ機能的相乗パートナーとしての用途を見出す。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合部分が、トラスツズマブと組み合わせると、ErbB2陽性癌細胞の増殖を相乗的に阻害する。
本発明の一態様は、トラスツズマブ相乗中和能力を有するErbB2に結合する単離マウスモノクローナル抗体を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するキメラ抗体を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するCDRグラフト抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明の別の態様は、ErbB2に結合するヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態では、抗体またはその部分が単離抗体またはその単離部分である。別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分が中和抗ErbB2抗体である。有利には、このようなErbB2に結合する抗体またはその抗原結合部分が、個体(ヒトまたは他の哺乳動物)へ投与され得るトラスツズマブ機能的相乗パートナーとしての用途を見出す。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合部分が、トラスツズマブと組み合わせると、ErbB2陽性癌細胞の増殖を相乗的に阻害する。
本発明により使用される抗体を作製するための代表的な技術に関しての説明は以下の通りである。抗体を作製するために使用されるErbB2抗原は、ErbB2の細胞外ドメインの可溶性形態であり得る。あるいは、細胞表面でErbB2を発現している細胞(例えば、SKBR3細胞などの癌細胞株、Stancovskiら PNAS(米国)88:8691〜8695(1991)参照)を使用して抗体を作製することができる。
(i)ハイブリドーマ技術を使用した抗ErbB2モノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む多種多様な当技術分野で公知の技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、第2版、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1988)に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。
ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む多種多様な当技術分野で公知の技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、第2版、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、1988)に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。
マウスをErbB2抗原またはErbB2過剰発現癌細胞で免疫化した後、抗体および/または抗体産生細胞を動物から得ることができる。抗ErbB2抗体含有血清を、動物から採血するまたは動物を屠殺することによって動物から得る。血清は動物から得られた状態のままで使用してもよいし、または抗ErbB2抗体を血清から精製してもよい。
いったんマウス血清で免疫反応が検出されたら(例えば、抗原ErbB2に特異的な抗体)、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞、例えばアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC、Manassas、Va.、米国)から入手可能な細胞株SP2/0の細胞に融合する。次いで、ハイブリドーマクローンを、ErbB2に結合することができる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によって分析する。陽性ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。マウスに陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって、一般に高レベルの抗体を含有する腹水液を作製することができる。
(ii)トラスツズマブ相乗抗腫瘍生理活性を有する抗体のスクリーニング
抗体を作製するための技術を上で説明してきた。本発明はさらに、相乗生理活性(細胞増殖阻害活性など)を含む抗体組み合わせを単離する方法を提供する。本発明の抗体組み合わせは、以下の所望の特性を有する少なくとも2つ以上のモノクローナル抗体を含む:<1>抗体がErbB2上に存在する別個の非重複エピトープに結合する;<2>抗体が新規な抗体であるまたは組み合わせの一部が新規な抗体である;<3>抗体組み合わせ(本発明の任意の抗体+トラスツズマブ)の有効性が、各個々の成分の有効性または各個々の有効性の和よりも強力である。好ましくは、本発明は、一方が本発明の5つのモノクローナル抗体で、他方がトラスツズマブである2つのモノクローナル抗体の相乗組み合わせを提供した。このような二抗体組み合わせの抗腫瘍活性は、いずれかの成分の抗腫瘍活性または各個々の有効性の和よりも強力である。
抗体を作製するための技術を上で説明してきた。本発明はさらに、相乗生理活性(細胞増殖阻害活性など)を含む抗体組み合わせを単離する方法を提供する。本発明の抗体組み合わせは、以下の所望の特性を有する少なくとも2つ以上のモノクローナル抗体を含む:<1>抗体がErbB2上に存在する別個の非重複エピトープに結合する;<2>抗体が新規な抗体であるまたは組み合わせの一部が新規な抗体である;<3>抗体組み合わせ(本発明の任意の抗体+トラスツズマブ)の有効性が、各個々の成分の有効性または各個々の有効性の和よりも強力である。好ましくは、本発明は、一方が本発明の5つのモノクローナル抗体で、他方がトラスツズマブである2つのモノクローナル抗体の相乗組み合わせを提供した。このような二抗体組み合わせの抗腫瘍活性は、いずれかの成分の抗腫瘍活性または各個々の有効性の和よりも強力である。
好ましくは、ErbB2陽性細胞の細胞増殖の阻害においてトラスツズマブと協同することができる抗体を同定するために、以下の手順に従うことができる:(a)ELISAまたは細胞ベース結合を行って、目的の抗体の特異的ErbB2結合活性を確認する。抗体が組換えヒトErbB2およびヒトErbB2を発現している細胞に結合する能力を測定することができる。(b)細胞増殖スクリーニングのトラスツズマブベース相乗阻害を行う。例えば、以下の実施例4に記載されるBT474ベース細胞増殖阻害アッセイを使用して、個々の抗ErbB2抗体および/または抗体組み合わせによるBT474細胞増殖の阻害を行うことができる。抗ErbB2モノクローナル抗体または抗体組み合わせを各ウェルに添加し、約144時間インキュベートすることができる。用量反応曲線を作成し、目的の抗体または目的の抗体組み合わせについてのIC50値を計算することができる。一実施形態では、増殖阻害性抗体組み合わせが、約0.5〜20μg/mLの濃度で、BT474細胞の増殖を、各個々の抗体よりも約20〜80%高く阻害することができる。
このような優れた相乗抗腫瘍活性の仮定される機序は、それだけに限らないが、以下の可能性の1つであり得るだろう:(a)標的(例えば、ErbB2)の2つ以上の機能的エピトープを遮断することによる相乗交差増強、および/または(b)2つ以上のモノクローナル抗体の標的(例えば、ErbB2)に対する結合活性もしくは相乗結合親和性が、単一モノクローナル抗体の親和性よりもはるかに高いこと、および/または(c)単一モノクローナル抗体の抗体−抗原三量体形成とは異なり、別個のエピトープを有する2つ以上のモノクローナル抗体によって媒介される抗体−抗原凝集体の形成は、はるかに大きく、クリアランスおよび/または細胞エンドサイトーシスのために免疫系が検出するのが容易となり得ること。上記機序のうちの1つもしくは上記全ての組み合わせ、または他の考えられる機序に基づいて、抗ErbB2相乗抗体組み合わせをErbB2陽性癌の予防または治療に使用することができる。好ましくは、本発明の抗体をトラスツズマブとの組み合わせとして使用して、ErbB2陽性癌またはトラスツズマブ耐性ErbB2陽性癌を治療することができる。
(iii)組換えErbB2抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって作製することができる。例えば、宿主細胞からの発現、ここでは重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、外因性DNAを真核宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。本発明の組換え抗体を発現するための代表的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、KaufmanおよびSharp、J.Mol.Biol.、159:1〜621(1982)に記載されるDHFR選択マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、77:4216〜4220(1980)に記載されるdhfr−CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。標準的なタンパク質精製法を使用して、抗体を培養培地から回収することができる。
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって作製することができる。例えば、宿主細胞からの発現、ここでは重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、外因性DNAを真核宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、DEAE−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。本発明の組換え抗体を発現するための代表的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(例えば、KaufmanおよびSharp、J.Mol.Biol.、159:1〜621(1982)に記載されるDHFR選択マーカーと共に使用される、UrlaubおよびChasin、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、77:4216〜4220(1980)に記載されるdhfr−CHO細胞を含む)、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞が含まれる。抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。標準的なタンパク質精製法を使用して、抗体を培養培地から回収することができる。
宿主細胞を使用して、FabフラグメントまたはscFv分子などの機能的抗体フラグメントを作製することもできる。上記手順に対する変形が本発明の範囲内にあることが理解されるだろう。例えば、宿主細胞を、本発明の抗体の軽鎖および/または重鎖の機能的フラグメントをコードするDNAでトランスフェクトすることが望ましいだろう。組換えDNA技術を使用して、目的の抗原に結合するために必要ではない軽鎖と重鎖のいずれかまたは両方をコードするDNAのいくらかまたは全てを除去することもできる。このような切断DNA分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。さらに、標準的な化学的架橋法によって、本発明の抗体を第2の抗体と架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体であり(すなわち、ヒトErbB2に結合する)、他方の重鎖および軽鎖がヒトErbB2以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することができる。
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための好ましいシステムでは、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってdhfr−CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子がそれぞれ、CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメントと作動可能に連結して、高レベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、DHFR遺伝子を有し、これにより、メトトレキサート選択/増幅を使用した、ベクターでトランスフェクトされたCHO細胞の選択が可能になる。選択された形質転換体宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、培養培地から完全抗体を回収する。標準的な分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。なおさらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培養培地で培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。本方法は、培養培地から組換え抗体を単離する工程をさらに含むことができる。
1.抗ErbB2抗体
ヒトErbB2に結合する単離マウスモノクローナル抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列を、表13A及び表13Bでクローン4C9、4H2、4G6、5F12および5G9について示す(以下の実施例参照)。本明細書に記載される単離抗ErbB2抗体CDR配列は、本発明によって単離され、そこから誘導されたCDR配列を含むポリペプチドを含むErbB2抗体のファミリーを確立する。モノクローナル抗体およびそのヒト化抗体誘導体の可変領域およびCDRの配列を表13A、表13B、表17A、表17B、表20Aおよび表20Bに列挙する。本発明による抗体について、ヒトErbB2に関して好ましいErbB2結合および/または中和活性を有するCDRを作製および選択するために、それだけに限らないが、本明細書に具体的に記載されるものを含む、本発明の抗体を作製し、これらの抗体のErbB2結合および/または中和特性を評価するための当技術分野で公知の標準的な方法を使用することができる。
ヒトErbB2に結合する単離マウスモノクローナル抗体のVHおよびVL領域のアミノ酸配列を、表13A及び表13Bでクローン4C9、4H2、4G6、5F12および5G9について示す(以下の実施例参照)。本明細書に記載される単離抗ErbB2抗体CDR配列は、本発明によって単離され、そこから誘導されたCDR配列を含むポリペプチドを含むErbB2抗体のファミリーを確立する。モノクローナル抗体およびそのヒト化抗体誘導体の可変領域およびCDRの配列を表13A、表13B、表17A、表17B、表20Aおよび表20Bに列挙する。本発明による抗体について、ヒトErbB2に関して好ましいErbB2結合および/または中和活性を有するCDRを作製および選択するために、それだけに限らないが、本明細書に具体的に記載されるものを含む、本発明の抗体を作製し、これらの抗体のErbB2結合および/または中和特性を評価するための当技術分野で公知の標準的な方法を使用することができる。
本明細書に記載される抗ErbB2抗体クローンの重鎖可変領域(VH)および軽鎖可変領域(VL)のCDRのアミノ酸配列のアラインメントに基づいて、本発明は、ヒトErbB2に結合することができる抗原結合ドメインを含むErbB2抗体を提供し、前記抗原結合ドメインは以下に定義される6つのCDR、すなわち、CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3の少なくとも1つまたは複数を含む:
CDR−H1は、
X1−X2−X3−X4−X5(配列番号11)(式中、
X1はSであり、
X2はYであり、
X3はTまたはYであり、
X4はMまたはIであり、
X5はHである)
4C9 CDR−H1(配列番号17)の残基31〜35
4H2 CDR−H1(配列番号19)の残基31〜35
4G6 CDR−H1(配列番号21)の残基31〜35
5F12 CDR−H1(配列番号23)の残基31〜35
4G9 CDR−H1(配列番号25)の残基31〜35
5F12 CDR−H2VH.V1(配列番号27)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.1(配列番号28)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.2(配列番号29)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.3(配列番号30)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.4(配列番号31)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.1(配列番号40)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.2(配列番号41)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.3(配列番号42)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.4(配列番号43)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.5(配列番号44)の残基31〜35
からなる群から選択され、
CDR−H2は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17(配列番号12)(式中、
X1はYであり、
X2はIであり、
X3はNであり、
X4はPであり、
X5はSであり、
X6はSであり、
X7はSまたはDであり、
X8はYであり、
X9はTであり、
X10はAまたはNであり、
X11はYであり、
X12はNであり、
X13はQであり、
X14はKまたはNであり、
X15はFであり、
X16はKまたはRであり、
X17はDである)
4C9 CDR−H2(配列番号17)の残基50〜66
4H2 CDR−H2(配列番号19)の残基50〜66
4G6 CDR−H2(配列番号21)の残基50〜66
5F12 CDR−H2(配列番号23)の残基50〜66
4G9 CDR−H2(配列番号25)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.V1(配列番号27)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.1(配列番号28)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.2(配列番号29)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.3(配列番号30)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.4(配列番号31)の残基50〜66
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.1(配列番号40)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.2(配列番号41)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.3(配列番号42)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.4(配列番号43)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.5(配列番号44)の残基50〜66
からなる群から選択され、
CDR−H3は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号13)(式中、
X1はAであり、
X2はSであり、
X3はAまたはSであり、
X4はFであり、
X5はSであり、
X6はLであり、
X7はDであり、
X8はFであり、
X9はWである)
4C9 CDR−H3(配列番号17)の残基95〜103
4H2 CDR−H3(配列番号19)の残基95〜103
4G6 CDR−H3(配列番号21)の残基95〜103
5F12 CDR−H3(配列番号23)の残基95〜103
4G9 CDR−H3(配列番号25)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.V1(配列番号27)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.1(配列番号28)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.2(配列番号29)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.3(配列番号30)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.4(配列番号31)の残基95〜103
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.1(配列番号40)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.2(配列番号41)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.3(配列番号42)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.4(配列番号43)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.5(配列番号44)の残基95〜103
からなる群から選択され、
CDR−L1は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号14)(式中、
X1はKであり、
X2はAであり、
X3はSであり、
X4はHまたはQであり、
X5はDであり、
X6はIであり、
X7はNであり、
X8はKであり、
X9はYであり、
X10はIであり、
X11はAである)
4C9 CDR−L1(配列番号18)の残基24〜34
4H2 CDR−L1(配列番号20)の残基24〜34
4G6 CDR−L1(配列番号22)の残基24〜34
5F12 CDR−L1(配列番号24)の残基24〜34
4G9 CDR−L1(配列番号26)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.V1(配列番号32)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.1(配列番号33)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.2(配列番号34)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.3(配列番号35)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.4(配列番号36)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.5(配列番号37)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.6(配列番号38)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.V1(配列番号45)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.1(配列番号46)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.2(配列番号47)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.3(配列番号48)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.4(配列番号49)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.5(配列番号50)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.6(配列番号51)の残基24〜34
からなる群から選択され、
CDR−L2は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号15)(式中、
X1はYまたはSであり、
X2はTであり、
X3はSであり、
X4はTであり、
X5はLであり、
X6はQまたはYであり、
X7はPである)
4C9 CDR−L2(配列番号18)の残基50〜56
4H2 CDR−L2(配列番号20)の残基50〜56
4G6 CDR−L2(配列番号22)の残基50〜56
5F12 CDR−L2(配列番号24)の残基50〜56
4G9 CDR−L2(配列番号26)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.V1(配列番号32)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.1(配列番号33)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.2(配列番号34)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.3(配列番号35)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.4(配列番号36)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.5(配列番号37)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.6(配列番号38)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.V1(配列番号45)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.1(配列番号46)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.2(配列番号47)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.3(配列番号48)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.4(配列番号49)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.5(配列番号50)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.6(配列番号51)の残基50〜56
からなる群から選択され、
CDR−L3は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号16)(式中、
X1はLであり、
X2はQまたはNであり、
X3はYであり、
X4はDであり、
X5はNであり、
X6はLであり、
X7はLであり、
X8はWであり、
X9はTである)
4C9 CDR−L3(配列番号18)の残基89〜97
4H2 CDR−L3(配列番号20)の残基89〜97
4G6 CDR−L3(配列番号22)の残基89〜97
5F12 CDR−L3(配列番号24)の残基89〜97
4G9 CDR−L3(配列番号26)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.V1(配列番号32)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.1(配列番号33)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.2(配列番号34)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.3(配列番号35)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.4(配列番号36)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.5(配列番号37)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.6(配列番号38)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.V1(配列番号45)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.1(配列番号46)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.2(配列番号47)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.3(配列番号48)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.4(配列番号49)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.5(配列番号50)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.6(配列番号51)の残基89〜97
からなる群から選択される。
CDR−H1は、
X1−X2−X3−X4−X5(配列番号11)(式中、
X1はSであり、
X2はYであり、
X3はTまたはYであり、
X4はMまたはIであり、
X5はHである)
4C9 CDR−H1(配列番号17)の残基31〜35
4H2 CDR−H1(配列番号19)の残基31〜35
4G6 CDR−H1(配列番号21)の残基31〜35
5F12 CDR−H1(配列番号23)の残基31〜35
4G9 CDR−H1(配列番号25)の残基31〜35
5F12 CDR−H2VH.V1(配列番号27)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.1(配列番号28)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.2(配列番号29)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.3(配列番号30)の残基31〜35
5F12 CDR−H1 VH.4(配列番号31)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.1(配列番号40)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.2(配列番号41)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.3(配列番号42)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.4(配列番号43)の残基31〜35
5G9 CDR−H1 VH.5(配列番号44)の残基31〜35
からなる群から選択され、
CDR−H2は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−X14−X15−X16−X17(配列番号12)(式中、
X1はYであり、
X2はIであり、
X3はNであり、
X4はPであり、
X5はSであり、
X6はSであり、
X7はSまたはDであり、
X8はYであり、
X9はTであり、
X10はAまたはNであり、
X11はYであり、
X12はNであり、
X13はQであり、
X14はKまたはNであり、
X15はFであり、
X16はKまたはRであり、
X17はDである)
4C9 CDR−H2(配列番号17)の残基50〜66
4H2 CDR−H2(配列番号19)の残基50〜66
4G6 CDR−H2(配列番号21)の残基50〜66
5F12 CDR−H2(配列番号23)の残基50〜66
4G9 CDR−H2(配列番号25)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.V1(配列番号27)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.1(配列番号28)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.2(配列番号29)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.3(配列番号30)の残基50〜66
5F12 CDR−H2VH.4(配列番号31)の残基50〜66
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.1(配列番号40)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.2(配列番号41)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.3(配列番号42)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.4(配列番号43)の残基50〜66
5G9 CDR−H2VH.5(配列番号44)の残基50〜66
からなる群から選択され、
CDR−H3は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号13)(式中、
X1はAであり、
X2はSであり、
X3はAまたはSであり、
X4はFであり、
X5はSであり、
X6はLであり、
X7はDであり、
X8はFであり、
X9はWである)
4C9 CDR−H3(配列番号17)の残基95〜103
4H2 CDR−H3(配列番号19)の残基95〜103
4G6 CDR−H3(配列番号21)の残基95〜103
5F12 CDR−H3(配列番号23)の残基95〜103
4G9 CDR−H3(配列番号25)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.V1(配列番号27)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.1(配列番号28)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.2(配列番号29)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.3(配列番号30)の残基95〜103
5F12 CDR−H3VH.4(配列番号31)の残基95〜103
5G9 CDR−H1 VH.V1(配列番号39)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.1(配列番号40)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.2(配列番号41)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.3(配列番号42)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.4(配列番号43)の残基95〜103
5G9 CDR−H3VH.5(配列番号44)の残基95〜103
からなる群から選択され、
CDR−L1は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11(配列番号14)(式中、
X1はKであり、
X2はAであり、
X3はSであり、
X4はHまたはQであり、
X5はDであり、
X6はIであり、
X7はNであり、
X8はKであり、
X9はYであり、
X10はIであり、
X11はAである)
4C9 CDR−L1(配列番号18)の残基24〜34
4H2 CDR−L1(配列番号20)の残基24〜34
4G6 CDR−L1(配列番号22)の残基24〜34
5F12 CDR−L1(配列番号24)の残基24〜34
4G9 CDR−L1(配列番号26)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.V1(配列番号32)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.1(配列番号33)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.2(配列番号34)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.3(配列番号35)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.4(配列番号36)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.5(配列番号37)の残基24〜34
5F12 CDR−L1VL.6(配列番号38)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.V1(配列番号45)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.1(配列番号46)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.2(配列番号47)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.3(配列番号48)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.4(配列番号49)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.5(配列番号50)の残基24〜34
5G9 CDR−L1VL.6(配列番号51)の残基24〜34
からなる群から選択され、
CDR−L2は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7(配列番号15)(式中、
X1はYまたはSであり、
X2はTであり、
X3はSであり、
X4はTであり、
X5はLであり、
X6はQまたはYであり、
X7はPである)
4C9 CDR−L2(配列番号18)の残基50〜56
4H2 CDR−L2(配列番号20)の残基50〜56
4G6 CDR−L2(配列番号22)の残基50〜56
5F12 CDR−L2(配列番号24)の残基50〜56
4G9 CDR−L2(配列番号26)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.V1(配列番号32)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.1(配列番号33)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.2(配列番号34)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.3(配列番号35)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.4(配列番号36)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.5(配列番号37)の残基50〜56
5F12 CDR−L2VL.6(配列番号38)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.V1(配列番号45)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.1(配列番号46)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.2(配列番号47)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.3(配列番号48)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.4(配列番号49)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.5(配列番号50)の残基50〜56
5G9 CDR−L2VL.6(配列番号51)の残基50〜56
からなる群から選択され、
CDR−L3は、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9(配列番号16)(式中、
X1はLであり、
X2はQまたはNであり、
X3はYであり、
X4はDであり、
X5はNであり、
X6はLであり、
X7はLであり、
X8はWであり、
X9はTである)
4C9 CDR−L3(配列番号18)の残基89〜97
4H2 CDR−L3(配列番号20)の残基89〜97
4G6 CDR−L3(配列番号22)の残基89〜97
5F12 CDR−L3(配列番号24)の残基89〜97
4G9 CDR−L3(配列番号26)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.V1(配列番号32)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.1(配列番号33)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.2(配列番号34)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.3(配列番号35)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.4(配列番号36)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.5(配列番号37)の残基89〜97
5F12 CDR−L3VL.6(配列番号38)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.V1(配列番号45)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.1(配列番号46)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.2(配列番号47)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.3(配列番号48)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.4(配列番号49)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.5(配列番号50)の残基89〜97
5G9 CDR−L3VL.6(配列番号51)の残基89〜97
からなる群から選択される。
好ましくは、ErbB2抗体は、上記の少なくとも1つのCDR、より好ましくは上記の任意の2つのCDR、より好ましくは上記の任意の3つのCDR、さらにより好ましくは上記の任意の4つのCDR、さらにより好ましくは上記の任意の5つのCDR、最も好ましくは上記の任意の6つのCDR(すなわち、上記のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3)を含む。3つのCDRを含む特に好ましいErbB2は、上記のCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含む。
2.抗ErbB2キメラ抗体
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。例えば、Morrison、Science、229 1202〜1207(1985);Oiら、BioTechniques、4:214(1986);Gilliesら、J.Immunol.Methods 125:191〜202(1989) 米国特許第5807715号;同第4816567号;および同第4816397号を参照されたい。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と合わせて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」を作製するために開発された技術を使用することができる。例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. 米国、81:6851〜6855(1984);Neubergerら、Nature、312:604〜608(1984);Takedaら、Nature、314:452〜454(1985)を参照されたい。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。例えば、Morrison、Science、229 1202〜1207(1985);Oiら、BioTechniques、4:214(1986);Gilliesら、J.Immunol.Methods 125:191〜202(1989) 米国特許第5807715号;同第4816567号;および同第4816397号を参照されたい。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と合わせて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」を作製するために開発された技術を使用することができる。例えば、Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. 米国、81:6851〜6855(1984);Neubergerら、Nature、312:604〜608(1984);Takedaら、Nature、314:452〜454(1985)を参照されたい。
3.抗ErbB2 CDRグラフト抗体
本発明の単離抗ErbB2抗体CDR配列を使用してCDRグラフト抗体を作製して元の抗体の特性を調節することができる。このような特性には、それだけに限らないが、結合速度論、親和性、生物活性、種交差反応性、分子交差反応性、エピトープ、物理化学特性、薬物動態特性、薬力学特性または薬理学特性が含まれる。CDRグラフト抗体はヒト抗体または非ヒト霊長類抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、VHおよび/またはVLのCDR領域の1つまたは複数が元の抗ErbB2抗体のCDR配列で置き換えられている。任意のヒトまたは非ヒト霊長類抗体のフレームワーク配列が、CDRグラフトのための鋳型として働き得る。しかしながら、このようなフレームワーク上での直鎖置換はしばしば、抗原に対する結合親和性のいくらかの喪失をもたらす。ヒトまたは他の種の抗体が相同性になればなるほど、CDRと新たなヒトフレームワークまたは非ヒト霊長類フレームワークを組み合わせることによって、親和性または他の特性を減少させ得るような歪みがCDRに導入される可能性が少なくなる。そのため、CDRから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも30%の配列同一性を有することが好ましい。CDRから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも40%の配列同一性を有することがより好ましい。CDRから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも50%の配列同一性を有することがより好ましい。CDRから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも60%の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも70%の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも75%の配列同一性を有することがさらにより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも80%の配列同一性を有することが最も好ましい。高度に相同性のヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークを使用して元のヒト抗ErbB2抗体のCDRをグラフトする場合でさえ、得られるグラフト抗体はなお、抗原に対する結合親和性をある程度喪失し得る。この場合、親和性を回復するために、新たにグラフトされた抗体の対応する部分に元の抗体の少なくとも1つまたは複数のキーフレームワーク残基置換を含めることが必要である。このような主要残基は、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
レア残基;
ヒトErbB2と相互作用することができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基;
Vernierゾーン内の残基;および
Chothiaによって定義された可変重鎖CDR1とKabatによって定義された第1の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の残基
からなる群から選択され得る。
本発明の単離抗ErbB2抗体CDR配列を使用してCDRグラフト抗体を作製して元の抗体の特性を調節することができる。このような特性には、それだけに限らないが、結合速度論、親和性、生物活性、種交差反応性、分子交差反応性、エピトープ、物理化学特性、薬物動態特性、薬力学特性または薬理学特性が含まれる。CDRグラフト抗体はヒト抗体または非ヒト霊長類抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、VHおよび/またはVLのCDR領域の1つまたは複数が元の抗ErbB2抗体のCDR配列で置き換えられている。任意のヒトまたは非ヒト霊長類抗体のフレームワーク配列が、CDRグラフトのための鋳型として働き得る。しかしながら、このようなフレームワーク上での直鎖置換はしばしば、抗原に対する結合親和性のいくらかの喪失をもたらす。ヒトまたは他の種の抗体が相同性になればなるほど、CDRと新たなヒトフレームワークまたは非ヒト霊長類フレームワークを組み合わせることによって、親和性または他の特性を減少させ得るような歪みがCDRに導入される可能性が少なくなる。そのため、CDRから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも30%の配列同一性を有することが好ましい。CDRから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも40%の配列同一性を有することがより好ましい。CDRから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも50%の配列同一性を有することがより好ましい。CDRから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも60%の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも70%の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも75%の配列同一性を有することがさらにより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとCDRから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも80%の配列同一性を有することが最も好ましい。高度に相同性のヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークを使用して元のヒト抗ErbB2抗体のCDRをグラフトする場合でさえ、得られるグラフト抗体はなお、抗原に対する結合親和性をある程度喪失し得る。この場合、親和性を回復するために、新たにグラフトされた抗体の対応する部分に元の抗体の少なくとも1つまたは複数のキーフレームワーク残基置換を含めることが必要である。このような主要残基は、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
レア残基;
ヒトErbB2と相互作用することができる残基;
カノニカル残基;
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基;
Vernierゾーン内の残基;および
Chothiaによって定義された可変重鎖CDR1とKabatによって定義された第1の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の残基
からなる群から選択され得る。
4.抗ErbB2ヒト化抗体
本発明の組成物はヒト化抗体を作製する必要を排除するが、本発明の組成物を使用して、ヒト化ErbB2抗体を調製することができる。ヒト化抗体は、1つまたは複数の非ヒト種の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体の抗体分子である。公知のヒトIg配列は、ワールドワイドウェブ(www.)を介して入手可能なウェブサイト、例えばncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;atcc.org/phage/hdb.html;sciquest.com/;abcam.com/;antibodyresource.com/onlinecomp.html;public.iastate.eduLabout.pedro−/research_tools.html;mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html;whfreeman.com/immunology−/CH05/kuby05.htm;library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;hhmi.org/grants/lectures/l996/vlab/;path.−cam.ac.uk/.about.mrcV/mikeimages.html;antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks−/Immunology.html;immunologylink.com/;pathbox.wustl.eduLabout.hcenter/index.html;bio−tech.ufl.edu/.about.hcl/;pebio.com/pa/340913−/340913.html;nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito−/Elisa.html;biodesign.com/table.asp;icnet.uk/axp/facs/davies/lin−ks.html;biotech.ufl.edu−/.about.fccl/protocol.html;isac−net.org/sites_geo.html;aximtl.imt.uni−marburg.de/.about.rek/AEP−Start.html;baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html;recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html;ibt.unam.mx/−virN_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html;anti−body.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;unizh.ch/.about.honegger/AHO−seminar/Slide01.html;cryst.bbk.ac.uk/about.ubcgOVs/;nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;path.cam.ac.uk/.about.mrcV/humanisation/TAHHP.html;ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.−html;biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages−/Pept/spottech.html;jerini.de/frroducts.htm;patents.ibm.com/ibm.html. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S.Dept.Health(1983)で開示されている。このようなインポート配列を使用して、免疫原性を減少させる、結合、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期または当技術分野で公知の任意の他の適切な特性を増強または改変することができる。
本発明の組成物はヒト化抗体を作製する必要を排除するが、本発明の組成物を使用して、ヒト化ErbB2抗体を調製することができる。ヒト化抗体は、1つまたは複数の非ヒト種の相補性決定領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体の抗体分子である。公知のヒトIg配列は、ワールドワイドウェブ(www.)を介して入手可能なウェブサイト、例えばncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi;atcc.org/phage/hdb.html;sciquest.com/;abcam.com/;antibodyresource.com/onlinecomp.html;public.iastate.eduLabout.pedro−/research_tools.html;mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html;whfreeman.com/immunology−/CH05/kuby05.htm;library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html;hhmi.org/grants/lectures/l996/vlab/;path.−cam.ac.uk/.about.mrcV/mikeimages.html;antibodyresource.com/;mcb.harvard.edu/BioLinks−/Immunology.html;immunologylink.com/;pathbox.wustl.eduLabout.hcenter/index.html;bio−tech.ufl.edu/.about.hcl/;pebio.com/pa/340913−/340913.html;nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/;m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito−/Elisa.html;biodesign.com/table.asp;icnet.uk/axp/facs/davies/lin−ks.html;biotech.ufl.edu−/.about.fccl/protocol.html;isac−net.org/sites_geo.html;aximtl.imt.uni−marburg.de/.about.rek/AEP−Start.html;baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html;recab.uni−hd.de/immuno.bme.nwu.edu/;mrc−cpe.cam.ac.uk/imt−doc/public/INTRO.html;ibt.unam.mx/−virN_mice.html;imgt.cnusc.fr:8104/;biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html;anti−body.bath.ac.uk/;abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html;unizh.ch/.about.honegger/AHO−seminar/Slide01.html;cryst.bbk.ac.uk/about.ubcgOVs/;nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm;path.cam.ac.uk/.about.mrcV/humanisation/TAHHP.html;ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.−html;biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages−/Pept/spottech.html;jerini.de/frroducts.htm;patents.ibm.com/ibm.html. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U.S.Dept.Health(1983)で開示されている。このようなインポート配列を使用して、免疫原性を減少させる、結合、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期または当技術分野で公知の任意の他の適切な特性を増強または改変することができる。
ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をCDRドナー抗体の対応する残基で置換して、抗原結合を変化させる、好ましくは改善することができる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定するためのCDRとフレームワーク残基の相互作用のモデル化によって、同定される(例えば、米国特許第5585089号(Queenら);Riechmannら、Nature、332:323〜327(1988)参照)。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、FR残基をコンセンサス配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、CDR残基が、抗原結合に直接的かつ最も実質的に関与している。それだけに限らないが、Jonesら、Nature、321:522〜525(1986);Verhoeyenら、Science、239:1534〜1536(1988);Simsら、J.Immunol.、151:2296〜2308(1993);ChothiaおよびLesk、J.Mol.Biol.、196:901〜917(1987);Carterら、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、89:4285〜4289(1992);Prestaら、J.Immunol、151:2623〜2632(1993);Padlan、Molecular Immunology、28(4/5):489〜498(1991);Studnickaら Protein Engineering、7(6):805〜814(1994);Roguskaら、Proc.Natl.Acad.Sci.米国、91:969〜973(1994);PCT公開番号:国際公開第91/09967号、国際公開第99/06834号(PCT/US98/16280)、国際公開第97/20032号(PCT/US96/18978)、国際公開第92/11272号(PCT/US91/09630)、国際公開第92/03461号(PCT/US91/05939)、国際公開第94/18219号(PCT/US94/01234)、国際公開第92/01047号(PCT/GB91/01134)、国際公開第93/06213号(PCT/GB92/01755)、国際公開第90/14443号、国際公開第90/14424号および国際公開第90/14430号;欧州公開番号 欧州特許第0592106号 欧州特許第0519596号および欧州特許第0239400号;米国特許第5565332号:同第5723323号;同第5976862号;同第5824514号;同第5817483号;同第5814476号:同第5763192号;同第5723323号;同第5766886号;同第5714352号;同第6204023号:同第6180370号;同第5693762号;同第5530101号;同第5585089号;同第5225539号;および同第4816567号に記載されている技術などの、当技術分野で公知の種々の技術を使用して、抗体をヒト化することができる。
C.抗体および抗体産生細胞株の作製
好ましくは、本発明の抗ErbB2抗体は、例えば当技術分野で公知のいくつかのin vitroおよびin vivoアッセイのいずれか1つによって評価されるように、トラスツズマブと組み合わせると、ErbB2陽性腫瘍増殖活性を阻害する高い能力を示す。例えば、トラスツズマブ+本発明のこれらの抗体のいずれか1つの組み合わせのIC50は、in vitro細胞増殖阻害アッセイ(表11)および/またはin vivo腫瘍モデル(表24)および同じin vitro細胞ベースバイオアッセイでの各個々の抗体のIC50の約50%であり、トラスツズマブ+本発明のこれらの抗体のいずれか1つの組み合わせの最大阻害能力は81%〜95%の範囲にあり、これに対して、各個々の抗体の最大阻害能力は13%〜70%の範囲にある。
好ましくは、本発明の抗ErbB2抗体は、例えば当技術分野で公知のいくつかのin vitroおよびin vivoアッセイのいずれか1つによって評価されるように、トラスツズマブと組み合わせると、ErbB2陽性腫瘍増殖活性を阻害する高い能力を示す。例えば、トラスツズマブ+本発明のこれらの抗体のいずれか1つの組み合わせのIC50は、in vitro細胞増殖阻害アッセイ(表11)および/またはin vivo腫瘍モデル(表24)および同じin vitro細胞ベースバイオアッセイでの各個々の抗体のIC50の約50%であり、トラスツズマブ+本発明のこれらの抗体のいずれか1つの組み合わせの最大阻害能力は81%〜95%の範囲にあり、これに対して、各個々の抗体の最大阻害能力は13%〜70%の範囲にある。
一定の実施形態では、抗体が、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMまたはIgD定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、IgG1重鎖定常領域またはIgG4重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかを含むことができる。好ましくは、抗体がκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分が、例えばFabフラグメントまたは単鎖Fvフラグメントであり得る。
一実施形態は、本発明の抗体または抗体部分が誘導体化されているかまたは別の機能的分子(例えば、別のペプチドもしくはタンパク質)に連結されている標識抗体を提供する。例えば、本発明の標識抗体は、(化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合などによって)本発明の抗体または抗体部分を別の抗体(例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ)、検出可能薬剤、細胞傷害剤、医薬品および/または抗体もしくは抗体部分と別の分子の会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチド(ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど)などの1つまたは複数の他の分子実体と機能的に連結させることによって、得ることができる。
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化することができる有用な検出可能薬剤には、蛍光化合物が含まれる。代表的な蛍光検出可能薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体を、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能酵素で誘導体化する場合、酵素が検出可能反応生成物を産生するために使用する追加の試薬を添加することによって、抗体を検出する。例えば、検出可能薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって、検出可能な着色反応生成物がもたらされる。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を通して検出することもできる。
D.ErbB2抗体の使用
(i)モノクローナル抗体
ヒトErbB2抗体に結合する能力を考慮すると、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)または組織免疫組織化学などの当技術分野で公知の従来の免疫測定法のいずれかを使用して、抗体およびその部分を含む、本明細書に記載されるErbB2抗体を使用して試料(例えば、混合物、溶液または生体試料、例えば血液、血清または血漿)中のErbB2を検出または測定することができる。
(i)モノクローナル抗体
ヒトErbB2抗体に結合する能力を考慮すると、酵素免疫測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)または組織免疫組織化学などの当技術分野で公知の従来の免疫測定法のいずれかを使用して、抗体およびその部分を含む、本明細書に記載されるErbB2抗体を使用して試料(例えば、混合物、溶液または生体試料、例えば血液、血清または血漿)中のErbB2を検出または測定することができる。
本発明は、試料をErbB2抗体と接触させる工程と、ヒトErbB2に結合したErbB2抗体または未結合抗体を検出することによって試料中のヒトErbB2を検出する工程とを含む、試料中のヒトErbB2を検出する方法を提供する。本明細書に記載されるErbB2抗体を検出可能物質で直接的または間接的に標識して、結合または未結合ErbB2抗体の検出を容易にすることができる。適切な検出可能物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、P−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ;適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンが挙げられ;適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ;発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ;適切な放射性物質の例としては、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Hoまたは153Smが挙げられる。
ErbB2について分析することができる生体試料には、尿、糞便、血液、血清、血漿、汗、唾液、口腔拭き取り検体(頬、舌、咽頭)、膣拭き取り検体、直腸拭き取り検体、皮膚拭き取り検体、皮膚切屑、組織生検ならびに当技術分野で利用可能な方法によって得ることができる任意の他の組織試料が含まれる。
抗体を標識する代わりに、検出可能物質で標識した組換えヒト(rh)ErbB2(rhErbB2)標準および本明細書に記載される非標識ErbB2抗体を利用した競合免疫測定法によって、生体体液中のヒトErbB2を分析することができる。このアッセイでは、生体試料、標識(rhErbB2)標準およびErbB2抗体を組み合わせ、非標識抗体に結合した標識ErbB2標準の量を測定する。生体試料中のヒトErbB2の量は、ErbB2抗体に結合した標識rhERBB2標準の量に反比例する。同様に、検出可能物質で標識したrhErbB2標準および本明細書に記載される非標識ErbB2抗体を利用した競合免疫測定法によって、生体体液中のヒトErbB2を分析することもできる。
本発明のErbB2抗体は、好ましくはin vitroとin vivoの両方で、ErbB2活性、特にヒトErbB2活性を中和することができる。したがって、本発明のこのような抗体を使用して、例えばヒト対象または本発明の抗体が交差反応するErbB2を発現する他の哺乳動物対象において、ErbB2を含有する細胞培養物のErbB2活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明は、ErbB2活性を阻害する方法であって、ErbB2活性が阻害されるように、ErbB2を本発明のErbB2抗体または抗体部分と接触させる工程を含む方法を提供する。例えば、ErbB2を含有するまたは含有することが疑われる細胞培養物で、本発明の抗体または抗体部分を培養培地に添加して、培養物のErbB2活性を阻害することができる。
別の実施形態では、本発明は、有利にはErbB2またはErbB2活性が有害である疾患または障害を患っている対象から、対象のErbB2活性を中和する方法を提供する。本発明は、このような疾患または障害を患っている対象のErbB2またはErbB2活性を中和する方法であって、対象のErbB2またはErbB2活性が中和されるように、本発明のErbB2抗体を対象に投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、ErbB2がヒトErbB2であり、対象がヒト対象である。あるいは、対象が、本発明のErbB2抗体が結合することができるErbB2を発現している哺乳動物であり得る。なおさらに、対象が、(例えば、ErbB2の投与によってまたはErbB2導入遺伝子の発現によって)ErbB2が導入された哺乳動物であり得る。本発明の抗体または他のErbB2抗体を治療目的でヒト対象に投与することができる。さらに、本発明のErbB2抗体を、獣医学目的でまたはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が結合することができるErbB2を発現している非ヒト哺乳動物に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体および他のErbB2抗体の治療有効性を評価するのに有用であり得る(例えば、投与量および投与時間経過の試験)。
(ii)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体はErbB2タンパク質の2つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、EGFR、ErbB3および/またはErbB4についてErbB2結合部位を組み合わせ得る。あるいは、抗ErbB2アームを、T細胞受容体分子(例えば、CD2もしくはCD3)などの白血球、またはIgGのためのFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)上の誘因分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をErbB2発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害剤を、ErbB2を発現している細胞に局在化させることもできる。これらの抗体は、ErbB2結合アームと、細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン)に結合するアームとを有する。二重結合性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。国際公開第96/16673号は二重特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体を記載しており、米国特許第5837234号は二重特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗体を開示している。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は国際公開第98/02463号に示されている。米国特許第5821337号は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示している。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体はErbB2タンパク質の2つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、EGFR、ErbB3および/またはErbB4についてErbB2結合部位を組み合わせ得る。あるいは、抗ErbB2アームを、T細胞受容体分子(例えば、CD2もしくはCD3)などの白血球、またはIgGのためのFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)上の誘因分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をErbB2発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害剤を、ErbB2を発現している細胞に局在化させることもできる。これらの抗体は、ErbB2結合アームと、細胞傷害剤(例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン)に結合するアームとを有する。二重結合性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製することができる。国際公開第96/16673号は二重特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体を記載しており、米国特許第5837234号は二重特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗体を開示している。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は国際公開第98/02463号に示されている。米国特許第5821337号は二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体を教示している。
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、2本の鎖が異なる特異性を有する2本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づく(Millsteinら、Nature、305:537〜539(1983))。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム組み合わせのために、これらのハイブリドーマ(クアドローマ)は、そのうちの1つのみが正確な二重特異性構造を有する10種の異なる抗体分子の潜在的な混合物をもたらす。通常はアフィニティクロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製はかなり厄介であり、生成物収率が低い。同様の手順が国際公開第93/08829号およびTrauneckerら、EMBO J.、10:3655〜3659(1991)に開示されている。
異なるアプローチによると、所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変領域を免疫グロブリン定常領域配列に融合する。融合は、好ましくはヒンジ、CH2およびCH3領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とである。融合体の少なくとも1つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第1の重鎖定常領域(CH1)を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトさせる。これにより、構築物に使用される不均等な比の3本のポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態で、3つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調整において大きな柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比の少なくとも2本のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合または比が特に重要でない場合、2本または全3本のポリペプチド鎖のコード配列を1つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体が、一方のアームの第1の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア(第2の結合特異性を提供する)とで構成される。二重特異性分子の2分の1のみの免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するので、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖組み合わせから分離するのを容易にすることが分かった。このアプローチは国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Sureshら、Methods in Enzymology、121:210(1986)を参照されたい。米国特許第5731168号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子のペア間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化することができる。好ましい界面は、抗体定常領域のC H 3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1の抗体分子の界面からの1つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が大きな側鎖(例えば、チロシンまたはトリプトファン)で置き換えられている。大きなアミノ酸側鎖を小さなもの(例えば、アラニンまたはトレオニン)で置き換えることによって、大きな側鎖と同一または同様のサイズの代償的「空洞」が第2の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終生成物に対してヘテロ二量体の収率を増加させる機序が提供される。
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンにカップリングさせ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化させるため(米国特許第4676980号)およびHIV感染症を治療するため(国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号および欧州特許第03089号)に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第4676980号に開示されている。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も文献に記載されている。例えば、化学的な連結を使用して、二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら、Science、229:81(1985)は、完全抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2フラグメントを作製する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐ。次いで、作製されたFab’フラグメントをチオニトロベンゾエート(TNB)誘導体に変換する。次いで、Fab’−TNB誘導体の1つをメルカプトエチルアミンによる還元によってFab’−チオールに再変換し、等モル量の他のFab’−TNB誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体を、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
近年の進歩により、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる大腸菌(E.coli)のFab’−SHフラグメントの直接回収が容易になった。Shalabyら、J.Exp.Med.、175:217〜225(1992)は、完全ヒト化二重特異性抗体F(ab’)2分子の作製を記載している。各Fab’フラグメントを大腸菌(E.coli)から別々に分泌させ、in vitroでの指示された化学カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。こうして形成された二重特異性抗体は、ErbB2受容体を過剰発現している細胞および正常なヒトT細胞に結合することができると同時に、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘因することができた。
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されてきた。Kostelnyら、J.Immunol.、148(5):1547〜1553(1992)。FosおよびJunタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって2つの異なる抗体のFab’部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を抗体ホモ二量体の作製に利用することもできる。Hollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90:6444〜6448(1993)によって記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機序を提供した。フラグメントは、同鎖上の2つのドメイン間でのペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変領域(VL)に結合した重鎖可変領域(VH)を含む。したがって、一方のフラグメントのVHおよびVLドメインを、別のフラグメントの相補的VLおよびVHドメインとペアリングさせ、それによって2つの抗原結合部位を形成する。単鎖Fv(sFv)二量体を使用することにより二重特異性抗体フラグメントを作製する別の戦略も報告されている。Gruberら、J.Immunol.、152:5368(1994)を参照されたい。3以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol.147:60(1991)。
(iii)イムノコンジュゲート
本発明の抗体および組成物の治療的使用の別の選択肢は、イムノコンジュゲート、すなわち、1つまたは複数の抗癌剤にコンジュゲートした抗体の形態にある。特に、別個のErbB2エピトープに結合する2つ以上の本発明の個々の抗体を含む組成物の場合、これにより、細胞表面上に架橋した抗体−受容体格子が生成され、それによって単一モノクローナル抗体の使用と比較して増加したレベルの受容体内部移行が潜在的に得られると考えられる。そのため、このような組成物の個々の抗体の1つまたは複数と1つまたは複数の抗癌剤のコンジュゲーションは、コンジュゲートした抗癌剤を腫瘍細胞の内側に特異的かつ有効に送達し、それによって、本発明の抗ErbB2抗体の、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供するとの効果を増強する。
本発明の抗体および組成物の治療的使用の別の選択肢は、イムノコンジュゲート、すなわち、1つまたは複数の抗癌剤にコンジュゲートした抗体の形態にある。特に、別個のErbB2エピトープに結合する2つ以上の本発明の個々の抗体を含む組成物の場合、これにより、細胞表面上に架橋した抗体−受容体格子が生成され、それによって単一モノクローナル抗体の使用と比較して増加したレベルの受容体内部移行が潜在的に得られると考えられる。そのため、このような組成物の個々の抗体の1つまたは複数と1つまたは複数の抗癌剤のコンジュゲーションは、コンジュゲートした抗癌剤を腫瘍細胞の内側に特異的かつ有効に送達し、それによって、本発明の抗ErbB2抗体の、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供するとの効果を増強する。
細胞傷害剤(従来の化学療法薬および他の小分子抗癌剤を含む)、サイトカイン(この場合、コンジュゲートが「免疫サイトカイン」と呼ばれ得る)、毒素(この場合、コンジュゲートが「免疫毒素」と呼ばれ得る)および放射性核種を含む種々のタイプの抗癌剤が、本発明の抗体にコンジュゲートしていてもよく、数種のイムノコンジュゲートが既に臨床使用について承認されている。これらには、ZEVALIN(登録商標)(90Yにコンジュゲートしたマウス抗CD20抗体)、BEXXAR(登録商標)(131Iにコンジュゲートしたマウス抗CD20抗体)およびMYLOTARG(登録商標)(カリチアマイシンにコンジュゲートしたヒト化抗CD33抗体)が含まれる。臨床試験で試験されている他のイムノコンジュゲートには、例えばドキソルビシンまたはマイタンシノイド化合物にコンジュゲートした抗体が含まれる。臨床試験で試験されている免疫毒素には、切断されたシュードモナス(Pseudomonas)外毒素Aにコンジュゲートした数種の抗体が含まれる。IL−2にコンジュゲートしたヒト化EpCAM抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
細胞傷害剤にコンジュゲートした本発明の抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤(例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン)、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン)、アントラサイクリン(例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンC)および植物アルカロイド(例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド)を含む化学療法薬の主要なクラスのいずれかに属し得る。イムノコンジュゲートの使用は、抗癌剤を腫瘍、特に内部移行後に腫瘍細胞の内部に特異的に向けるので、本発明の抗ErbB2抗体に基づくイムノコンジュゲートは、有利にはカリチアマイシンもしくはマイタンシノイド誘導体などの高度細胞傷害剤、または細菌毒素(例えば、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素A、ジフテリア毒素)もしくは植物毒素(例えば、リシン)などの毒素に基づき得る。イムノコンジュゲート中のコンジュゲートした抗癌剤は一般的に、血清中で比較的安定であるが、イムノコンジュゲートが標的細胞に内部移行すると薬剤の放出を可能にする不安定リンカーによって抗体に連結されている。適切なリンカーには、例えば、血清中の中性pHで安定であるが、内部移行後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画で酵素切断を受けるペプチドリンカーが含まれる。
種々のコンジュゲーションの配置が本発明の2つ以上の抗体を含有する組成物で想起され得る。例えば、2つの抗体では、抗体を2種以上の異なる抗癌剤とコンジュゲートする、または一方の抗体を他方の抗体にコンジュゲートした酵素などの薬剤によって活性化されるプロドラッグとコンジュゲートすることが可能であると予想される。プロドラッグがmAB−酵素コンジュゲートによって腫瘍に標的化された酵素によって活性化される、抗体指向性酵素プロドラッグ療法(antibody−directed enzyme prodrug therapy)(ADEPT)の一般的概念がモノクローナル抗体について記載されているが、本発明はこのアプローチを特定の状態に適合させる機会を提供し得る。よって、正常な組織への損傷を避けるまたは減少させながら、腫瘍細胞死滅を特異的に増加させることが可能となり得る。
抗癌イムノコンジュゲートについてのさらなる情報については、Wuら(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137〜1146;Schramaら(2006)Nature Reviews/Drug Discovery 5:147〜159;およびRohrer(2009)chimica oggi/Chemistry Today 27(5):56〜60を参照されたい。
(ivi)用量および投与経路
本発明の抗体および組成物は、当の状態を治療するのに有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与される。治療上有効量は、治療される特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗ErbB2抗体が単独治療として投与されているのか、1つまたは複数の追加の抗癌治療と組み合わせて投与されているのかどうかなどの因子によって変化し得る。
本発明の抗体および組成物は、当の状態を治療するのに有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与される。治療上有効量は、治療される特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗ErbB2抗体が単独治療として投与されているのか、1つまたは複数の追加の抗癌治療と組み合わせて投与されているのかどうかなどの因子によって変化し得る。
腫瘍療法のために有効量は、例えば腫瘍サイズを縮小させることによって、患者の疾患進行を安定化する、および/または症状を改善する、および好ましくは疾患進行を逆行させる能力によって測定され得る。本発明の抗体または組成物が癌を阻害する能力は、例えば実施例に記載されるin vitroアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における有効性を予測する適切な動物モデルで評価され得る。各特定の状況で最適な治療反応を提供するために適切な投与レジメンが選択され、例えば各症例の緊急性によって指示される投与量の可能な調節をして単一ボーラスとしてまたは持続注入として投与される。
本発明による抗体についての具体的な用量はまだ決定されていないが、治療的使用について承認されている同様の製品(抗ErbB2モノクローナル抗体)との比較を通して、一定の用量検討を決定することができる。よって、本発明の抗体組成物の適切な投与量は、抗ErbB2モノクローナル抗体トラスツズマブ(HERCEPTIN(登録商標))についての推奨投与量と同様であると考えられる。特定の状況に応じて、トラスツズマブは、初期用量4mg/kgおよびその後毎週用量2mg/kg、または初期用量8mg/kgおよびその後の用量3週間毎に6mg/kgのいずれかで、乳癌を治療するために(点滴によって)投与される。
本発明の抗体組成物の適切な用量は、約0.1〜100mg/kg、約0.5〜50mg/kgまたは約1〜20mg/kgの範囲にあると考えられる。抗体組成物を、少なくとも0.25、0.5、1、1.5、2、3、4もしくは5mg/kg;および/または最大約50、30、20もしくは15mg/kgの投与量で投与することができる。投与は通常、適切な間隔で、例えば毎週1回、2週間に1回、3週間に1回または4週間に1回、必要に応じて投与量を場合により増加または減少させることができる担当医師によって適切と考えられる間繰り返される。
3つの別個の送達アプローチが本発明の抗体を送達するために企図される。従来の静脈内送達が、おそらくは大部分の腫瘍のための標準的な送達技術となる。しかしながら、腹腔内の腫瘍、例えば卵巣、胆管、他の管などの腫瘍に関しては、腹腔内投与が、腫瘍部位で高い抗体用量を得て、抗体クリアランスを最小化するために好ましいと分かるだろう。同様に、一定の固形腫瘍は局所灌流に適した血管系を有する。局所灌流により、腫瘍部位で高い抗体用量を得て、抗体の短期クリアランスを最小化することが可能になり得る。
任意のタンパク質または抗体点滴ベース治療製品と同様に、安全性への懸念は、主に(i)サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、発熱、身震い、悪寒、(ii)タンパク質に対する免疫原性応答の発達(すなわち、組換え抗体製品に対する患者によるヒト抗体の発達)、および(iii)ErbB2受容体を発現する正常細胞、例えば多くの上皮細胞に対する毒性に関する。標準的な試験およびフォローアップ手順を利用してこのような安全性への懸念を監視する。
このような変動は適切であるので、量、百分率などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」という用語は、指定される値から±20%、または±10%、より好ましくは±5%、さらにより好ましくは±1%、なおさらにより好ましくは±0.1%の変動を包含することを意図している。
《実施例1》
[1−1]ハイブリドーマ技術を使用したマウス抗ErbB2モノクローナル抗体の作製
マウスを当技術分野で公知の方法に従って免疫した(例えば、E Harlow、D.Lane、Antibody:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1998))。
[1−1]ハイブリドーマ技術を使用したマウス抗ErbB2モノクローナル抗体の作製
マウスを当技術分野で公知の方法に従って免疫した(例えば、E Harlow、D.Lane、Antibody:A Laboratory Manual、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1998))。
ヒトHER2陽性細胞株BT474ならびに組換えヒトErbB2細胞外ドメイン(ErbB2−ECD)タンパク質を免疫原として使用した。高レベルのヒトErbB2(SK−BR3細胞)または低レベルのヒトErbB2(MCF7)を発現しているヒト細胞株を、抗血清を決定するためおよび抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。
免疫化投与量は、一次免疫と追加免疫の両方について1×106個のBT474細胞/マウス/注射を含有していた。マウスErbB2に対する免疫応答を増加させるために、マウスを、不完全フロイントアジュバント(Sigma、St.Louis、Mo.、米国)を用いたエマルジョン形態の組換えマウスErbB2−ECDでさらに追加免疫した。手短に言えば、ボルテックスを使用してバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント−抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントをバイアルから取り出し、オートクレーブ処理した1.5mL微量遠心管に入れた。抗原を0.5〜1.0mg/mLの範囲の濃度でPBSまたは生理食塩水中で調製した。次いで、計算した量の抗原を、アジュバントを含む微量遠心管に添加し、2分間穏やかにボルテックスすることによって溶液を混合して油中水型エマルジョンを生成した。次いで、アジュバント−抗原溶液を動物注射のために適切な注射器に引き込んだ。合計50μgの抗原を50〜100μL容量で注射した。各動物を免疫し、次いで、その力価に応じて2〜3回追加免疫した。
優れた力価(30000倍超の希釈)を有する動物に、融合前にヒトErbB2を発現しているBT474または25μgの組換えヒトErbB2−ECDによる最終的な皮下追加免疫を与えた。
[1−2]ハイブリドーマ融合およびELISAスクリーニング
SP2/0細胞(ATCC CRL−1581)を培養して融合直前に対数期段階に到達させた。当技術分野で公知の方法(例えば、Kohler GおよびMilstein C、「Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity」、Nature、256:495〜497(1975))に従って、免疫化マウス脾細胞を無菌的に調製し、SP2/0細胞と融合した。その後、融合した「ハイブリッド細胞」をDMEM/20%FCS/HAT培地中96ウェルプレートに分注した。融合7〜10日後に生存ハイブリドーマコロニーを顕微鏡下で観察し、その後、各ウェルの上清を以下の手順に従ってELISAフォーマットを使用してハイブリドーマスクリーニングに供した:<1>ELISAプレートを、4℃で一晩、50μLのヒトErbB2(PBS中2.0μg/mL)でコーティングした;<2>プレートを250μLのPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、200μLのブロッキング緩衝液(0.5%Tween20を含むPBS中2%BSA)でブロッキングした;<3>希釈血清またはハイブリドーマ上清(100μL)を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした;<4>次いで、プレートをPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRPを検出に使用し、結合ODを450nmで観察した。次いで、組換えヒトErbB2−ECDに結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、その後の細胞ベース結合スクリーニングのために新たな96ウェルプレートに移した。本発明の融合によって、約30000〜40000個のHAT耐性生存ハイブリドーマが生成され、1415個の組換えヒトErbB2−ECDタンパク質に特異的に結合する陽性ハイブリドーマが得られた。このようなハイブリドーマスクリーニングの1つのプレートを、陽性ハイブリドーマに下線を付し、イタリック体にして、以下の表4として例示する。
SP2/0細胞(ATCC CRL−1581)を培養して融合直前に対数期段階に到達させた。当技術分野で公知の方法(例えば、Kohler GおよびMilstein C、「Continuous cultures of fused cell secreting antibody of predefined specificity」、Nature、256:495〜497(1975))に従って、免疫化マウス脾細胞を無菌的に調製し、SP2/0細胞と融合した。その後、融合した「ハイブリッド細胞」をDMEM/20%FCS/HAT培地中96ウェルプレートに分注した。融合7〜10日後に生存ハイブリドーマコロニーを顕微鏡下で観察し、その後、各ウェルの上清を以下の手順に従ってELISAフォーマットを使用してハイブリドーマスクリーニングに供した:<1>ELISAプレートを、4℃で一晩、50μLのヒトErbB2(PBS中2.0μg/mL)でコーティングした;<2>プレートを250μLのPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、200μLのブロッキング緩衝液(0.5%Tween20を含むPBS中2%BSA)でブロッキングした;<3>希釈血清またはハイブリドーマ上清(100μL)を各ウェルに添加し、室温で1時間インキュベートした;<4>次いで、プレートをPBS/0.5%Tween20で3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRPを検出に使用し、結合ODを450nmで観察した。次いで、組換えヒトErbB2−ECDに結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、その後の細胞ベース結合スクリーニングのために新たな96ウェルプレートに移した。本発明の融合によって、約30000〜40000個のHAT耐性生存ハイブリドーマが生成され、1415個の組換えヒトErbB2−ECDタンパク質に特異的に結合する陽性ハイブリドーマが得られた。このようなハイブリドーマスクリーニングの1つのプレートを、陽性ハイブリドーマに下線を付し、イタリック体にして、以下の表4として例示する。
《実施例2》高比率の細胞膜ErbB2に対する差次的結合活性を有する抗体の細胞ベーススクリーニング
実施例1のELISAスクリーニングが完了したら、ErbB陽性ハイブリドーマを新たな69ウェルプレートに移し、HAT選択しないで新鮮なDMEM培地を供給し、3〜5日後、ハイブリドーマ培地を細胞結合スクリーニングに供した。手短に言えば、SK−BR3細胞(ATCC番号HTB−30、高レベルErbB2)またはMCF7細胞(ATCC番号HTB−30、低レベルErbB2)を、1〜5×105個細胞/ウェルで96ウェル(丸底)プレートに分注し、4℃で1時間、ハイブリドーマ上清(50μL)とインキュベートした。次いで、細胞をFACS緩衝液(2%FBSを含むPBS pH7.2)で3回洗浄し、100μLのヤギ抗マウスIgG−F(ab)2−Alexa(JIR番号:115−545−006)に再懸濁した。次いで、4℃で1時間インキュベートした後、細胞をFACS緩衝液(2%PBSを含むPBS pH7.2)で3回洗浄し、次いで、FACS緩衝液に再懸濁し、引き続いてFACS機器(FACSCalibur(商標)Flow Cytometer、BD Biosciences)によって結合シグナル収集および分析を行った。SK−BR3細胞およびMCF7細胞に対する同じハイブリドーマ上清の結合シグナルを計算し、SK−BR3結合/MCF7結合の比をさらに計算した。上記ELISAスクリーニングの1415個の陽性ハイブリドーマの中から、高比率のSK−BR3結合/MCF7結合クローン(クローンA2、クローンA7、クローンA11、クローンB2、クローンB5、クローンB7、クローンB9など)を含む上位672のハイブリドーマを、細胞バンキングおよびその後の機能的スクリーニングのために陽性クローンとして単離した。このような細胞結合スクリーニングの1つのプレートを以下の表5として例示する。
実施例1のELISAスクリーニングが完了したら、ErbB陽性ハイブリドーマを新たな69ウェルプレートに移し、HAT選択しないで新鮮なDMEM培地を供給し、3〜5日後、ハイブリドーマ培地を細胞結合スクリーニングに供した。手短に言えば、SK−BR3細胞(ATCC番号HTB−30、高レベルErbB2)またはMCF7細胞(ATCC番号HTB−30、低レベルErbB2)を、1〜5×105個細胞/ウェルで96ウェル(丸底)プレートに分注し、4℃で1時間、ハイブリドーマ上清(50μL)とインキュベートした。次いで、細胞をFACS緩衝液(2%FBSを含むPBS pH7.2)で3回洗浄し、100μLのヤギ抗マウスIgG−F(ab)2−Alexa(JIR番号:115−545−006)に再懸濁した。次いで、4℃で1時間インキュベートした後、細胞をFACS緩衝液(2%PBSを含むPBS pH7.2)で3回洗浄し、次いで、FACS緩衝液に再懸濁し、引き続いてFACS機器(FACSCalibur(商標)Flow Cytometer、BD Biosciences)によって結合シグナル収集および分析を行った。SK−BR3細胞およびMCF7細胞に対する同じハイブリドーマ上清の結合シグナルを計算し、SK−BR3結合/MCF7結合の比をさらに計算した。上記ELISAスクリーニングの1415個の陽性ハイブリドーマの中から、高比率のSK−BR3結合/MCF7結合クローン(クローンA2、クローンA7、クローンA11、クローンB2、クローンB5、クローンB7、クローンB9など)を含む上位672のハイブリドーマを、細胞バンキングおよびその後の機能的スクリーニングのために陽性クローンとして単離した。このような細胞結合スクリーニングの1つのプレートを以下の表5として例示する。
細胞ベーススクリーニングが完了したら、高ランキング比率のSK−BR3/MCF7を含む上位672のハイブリドーマを新たな96ウェルプレートに移した。3〜5日間培養した後、各ウェルのハイブリドーマ培地をその後のエピトープグループ分けおよび細胞ベース機能的スクリーニングのために回収し、対応する細胞を液体窒素で長期間保存用に凍結した。
《実施例3》トラスツズマブとの競合に基づくハイブリドーマ上清のエピトープグループ分け
実施例2の細胞結合スクリーニングからの陽性ハイブリドーマ細胞に基づいて、各細胞株のハイブリドーマ上清をベンチマーク抗体(例えば、トラスツズマブおよび/またはペルツズマブ)に基づくエピトープグループ分けでさらに評価して、本発明の抗体をベンチマーク競合群とベンチマーク非競合群の2つのカテゴリーに分けた。手短に言えば、96ウェルELISAプレートを組換えヒトErbB2−ECD(0.1μg/mL)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去し、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、37℃で2時間インキュベートする。50μLの目的の抗体を添加し、37℃で30分間インキュベートし、引き続いて50μLの0.03μg/mLビオチン標識ベンチマーク抗体(例えば、ビオチン−トラスツズマブまたはビオチン−ペルツズマブ)を添加し、37℃でさらに30分間インキュベートし、次いで、プレートをPBSTで3回洗浄する。100μL/ウェルのストレプトアビジン−HRP(1:5000)を添加し、37℃で30分間インキュベートする。PBSTで3回洗浄する。100μL/ウェルのTMB基質を添加し、室温で15分間インキュベートする。50μL/ウェルの1N HClを添加して反応を終了させる。450nmでMicroplate Readerによってプレートを読み取る。以下の表6は、トラスツズマブ競合ELISA結果を例示している。表6中、F7ウェルは正常なヒトIgG(対照として)であり、G7ウェルは正常なマウスIgG(対照として)であり、H7ウェルはベンチマーク対照(すなわち、トラスツズマブ、5μg/mL)である。表6に示されるように、トラスツズマブはビオチン−トラスツズマブのErbB2−ECD結合能力を遮断するが、ヒトIgGもマウスIgGも遮断しない。同様に、試料C6、C7、D2、D3、D4およびH1〜H6(太字、イタリックおよび下線)は一定の阻害活性を示し、これらがトラスツズマブエピトープと同じまたは重複するエピトープに結合することを示している。このプレートの残りの試料(A1〜A7など)は、組換えヒトErbB2−ECDに対するトラスツズマブ結合活性を阻害せず、これらの抗体がトラスツズマブエピトープとは別個のエピトープに結合することを示している。トラスツズマブエピトープ競合グループ分けに基づいて、本発明は、トラスツズマブ結合エピトープと別個のエピトープに結合するErbB2抗体を同定するのに成功した。
実施例2の細胞結合スクリーニングからの陽性ハイブリドーマ細胞に基づいて、各細胞株のハイブリドーマ上清をベンチマーク抗体(例えば、トラスツズマブおよび/またはペルツズマブ)に基づくエピトープグループ分けでさらに評価して、本発明の抗体をベンチマーク競合群とベンチマーク非競合群の2つのカテゴリーに分けた。手短に言えば、96ウェルELISAプレートを組換えヒトErbB2−ECD(0.1μg/mL)でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去し、200μL/ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、37℃で2時間インキュベートする。50μLの目的の抗体を添加し、37℃で30分間インキュベートし、引き続いて50μLの0.03μg/mLビオチン標識ベンチマーク抗体(例えば、ビオチン−トラスツズマブまたはビオチン−ペルツズマブ)を添加し、37℃でさらに30分間インキュベートし、次いで、プレートをPBSTで3回洗浄する。100μL/ウェルのストレプトアビジン−HRP(1:5000)を添加し、37℃で30分間インキュベートする。PBSTで3回洗浄する。100μL/ウェルのTMB基質を添加し、室温で15分間インキュベートする。50μL/ウェルの1N HClを添加して反応を終了させる。450nmでMicroplate Readerによってプレートを読み取る。以下の表6は、トラスツズマブ競合ELISA結果を例示している。表6中、F7ウェルは正常なヒトIgG(対照として)であり、G7ウェルは正常なマウスIgG(対照として)であり、H7ウェルはベンチマーク対照(すなわち、トラスツズマブ、5μg/mL)である。表6に示されるように、トラスツズマブはビオチン−トラスツズマブのErbB2−ECD結合能力を遮断するが、ヒトIgGもマウスIgGも遮断しない。同様に、試料C6、C7、D2、D3、D4およびH1〜H6(太字、イタリックおよび下線)は一定の阻害活性を示し、これらがトラスツズマブエピトープと同じまたは重複するエピトープに結合することを示している。このプレートの残りの試料(A1〜A7など)は、組換えヒトErbB2−ECDに対するトラスツズマブ結合活性を阻害せず、これらの抗体がトラスツズマブエピトープとは別個のエピトープに結合することを示している。トラスツズマブエピトープ競合グループ分けに基づいて、本発明は、トラスツズマブ結合エピトープと別個のエピトープに結合するErbB2抗体を同定するのに成功した。
《実施例4》相乗生理活性を有する抗体のトラスツズマブベーススクリーニング
標準的なアプローチとは異なり、本発明は、初期段階での大規模なトラスツズマブベース相乗生理活性スクリーニングを行った。実施例2から単離された抗原陽性ハイブリドーマについて、各ハイブリドーマの細胞培養上清を、BT474乳癌細胞および/またはMDA−MB−VII175細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力についてさらにスクリーニングした。手短に言えば、細胞を、2000個細胞/ウェルで100μL培地を含むプレートに播種する。細胞播種の翌日、40μLの細胞培養培地を吸引し、引き続いてベンチマーク抗体(トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ+ペルツズマブの組み合わせ)、実施例2からの個々のハイブリドーマ上清、およびトラスツズマブと実施例2からの各個々のハイブリドーマ上清の組み合わせを含む60μL抗体試料を添加する。120〜144時間細胞を培養し続ける。CellTiter Gloを10分間添加する。試験細胞培養プレートをSpectraMax M5プレートリーダーによって分析した。好ましくは、トラスツズマブの細胞増殖阻害を相乗的に促進するハイブリドーマ上清を明らかにするために、目的の試料のセットは、(a)トラスツズマブ単独活性群(HOA);ペルツズマブ単独活性群(POA);(c)トラスツズマブ/ペルツズマブ(50%トラスツズマブ/50%ペルツズマブ)組み合わせ群(HPC);(d)Mab非依存性活性群(MIA):試験中のハイブリドーマ上清試料;(e)トラスツズマブ相乗活性群(HSA):トラスツズマブ+試験中のハイブリドーマ上清試料;(f)陰性対照群(NC):ヒトIgG+マウスIgGを含む。トラスツズマブ相乗候補を選択するための基準は以下に基づく:同じ条件下で、HSAの細胞増殖阻害活性がHOAまたはMIAよりも高く、HOA+MIAの和の50%よりも高い場合、試験中の試料は細胞増殖阻害アッセイでトラスツズマブ相乗生理活性を含む。好ましくは、同じ細胞培養条件下で、HSAの細胞増殖阻害活性がHPC(トラスツズマブ/ペルツズマブ群)よりも高い場合、試験中の試料はペルツズマブよりも高いトラスツズマブ相乗生理活性を示すと考えられる。上記スクリーニング後、上位672の実施例2からのハイブリドーマ上清を細胞増殖阻害のトラスツズマブ相乗生理活性について評価およびランク付けし、上位15の候補を限界希釈によってサブクローニングして各細胞株のクローン性を確保した。その中でも、実施例としての5つのハイブリドーマ細胞株(4C9、4H2、4G6、5F12および5G9)を抗体産生のために使用し、対応する精製IgGを上記プロトコルに従ってトラスツズマブ相乗生理活性についてさらに確認した。結果を実施例5および表11に要約する。
標準的なアプローチとは異なり、本発明は、初期段階での大規模なトラスツズマブベース相乗生理活性スクリーニングを行った。実施例2から単離された抗原陽性ハイブリドーマについて、各ハイブリドーマの細胞培養上清を、BT474乳癌細胞および/またはMDA−MB−VII175細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力についてさらにスクリーニングした。手短に言えば、細胞を、2000個細胞/ウェルで100μL培地を含むプレートに播種する。細胞播種の翌日、40μLの細胞培養培地を吸引し、引き続いてベンチマーク抗体(トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ+ペルツズマブの組み合わせ)、実施例2からの個々のハイブリドーマ上清、およびトラスツズマブと実施例2からの各個々のハイブリドーマ上清の組み合わせを含む60μL抗体試料を添加する。120〜144時間細胞を培養し続ける。CellTiter Gloを10分間添加する。試験細胞培養プレートをSpectraMax M5プレートリーダーによって分析した。好ましくは、トラスツズマブの細胞増殖阻害を相乗的に促進するハイブリドーマ上清を明らかにするために、目的の試料のセットは、(a)トラスツズマブ単独活性群(HOA);ペルツズマブ単独活性群(POA);(c)トラスツズマブ/ペルツズマブ(50%トラスツズマブ/50%ペルツズマブ)組み合わせ群(HPC);(d)Mab非依存性活性群(MIA):試験中のハイブリドーマ上清試料;(e)トラスツズマブ相乗活性群(HSA):トラスツズマブ+試験中のハイブリドーマ上清試料;(f)陰性対照群(NC):ヒトIgG+マウスIgGを含む。トラスツズマブ相乗候補を選択するための基準は以下に基づく:同じ条件下で、HSAの細胞増殖阻害活性がHOAまたはMIAよりも高く、HOA+MIAの和の50%よりも高い場合、試験中の試料は細胞増殖阻害アッセイでトラスツズマブ相乗生理活性を含む。好ましくは、同じ細胞培養条件下で、HSAの細胞増殖阻害活性がHPC(トラスツズマブ/ペルツズマブ群)よりも高い場合、試験中の試料はペルツズマブよりも高いトラスツズマブ相乗生理活性を示すと考えられる。上記スクリーニング後、上位672の実施例2からのハイブリドーマ上清を細胞増殖阻害のトラスツズマブ相乗生理活性について評価およびランク付けし、上位15の候補を限界希釈によってサブクローニングして各細胞株のクローン性を確保した。その中でも、実施例としての5つのハイブリドーマ細胞株(4C9、4H2、4G6、5F12および5G9)を抗体産生のために使用し、対応する精製IgGを上記プロトコルに従ってトラスツズマブ相乗生理活性についてさらに確認した。結果を実施例5および表11に要約する。
《実施例5》本発明に係る抗体の生化学的特性
[5−1]本発明の精製IgGのErbB2結合活性確認
本発明の5つの抗体の対応する精製IgGをSDS−PAGE分析に供し、結果を図1に示した。全5つの抗体を、組換えErbB2−ECDおよびErbB2陽性細胞に結合することができるIgG1/κであるとしてアイソタイピングする(以下の表7参照)。
[5−1]本発明の精製IgGのErbB2結合活性確認
本発明の5つの抗体の対応する精製IgGをSDS−PAGE分析に供し、結果を図1に示した。全5つの抗体を、組換えErbB2−ECDおよびErbB2陽性細胞に結合することができるIgG1/κであるとしてアイソタイピングする(以下の表7参照)。
[5−2]本発明に係る抗体のErbB2結合EC50
本発明の5つの抗体の対応する精製IgGも、捕捉ELISAによって組換えヒトErbb2に対する結合活性について評価した。手順を以下のように手短に記載する:96ウェルプレートを0.5μg/mLの抗ErbB2抗体で一晩コーティングし、37℃で1時間、PBST中1%BSAによってブロッキングした。1:5系列希釈で、2μg/mLで開始するビオチン−ヒトErbB2−ECDの系列希釈試料を添加する。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μL/ウェルのTMBを添加して、室温で15分間展開し、引き続いて50μLの1N HClでクエンチする。OD値について450nmでプレートを読み取る。Prismソフトウェアを使用することによって結合EC50を計算し、結果は以下の表8にある。
本発明の5つの抗体の対応する精製IgGも、捕捉ELISAによって組換えヒトErbb2に対する結合活性について評価した。手順を以下のように手短に記載する:96ウェルプレートを0.5μg/mLの抗ErbB2抗体で一晩コーティングし、37℃で1時間、PBST中1%BSAによってブロッキングした。1:5系列希釈で、2μg/mLで開始するビオチン−ヒトErbB2−ECDの系列希釈試料を添加する。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μL/ウェルのTMBを添加して、室温で15分間展開し、引き続いて50μLの1N HClでクエンチする。OD値について450nmでプレートを読み取る。Prismソフトウェアを使用することによって結合EC50を計算し、結果は以下の表8にある。
[5−3]様々な種に由来するErbB2に対する本発明に係る抗体の結合能力
実施例1に記載される間接ELISA法を使用して、マウス、ラット、アカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル(Macacca fascicularis)およびヒトなどの様々な種に由来する組換えErbB2−ECDに対する本発明の抗体の結合活性を調査した。手短に言えば、96ウェルELISAプレートを、100μL/ウェルで1μg/mLの様々な種の組換えErbB2−ECDでコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去する。200μL/ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、37℃で1〜2時間インキュベートする。本発明の精製抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRP 100μL/ウェルを添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、15分後に100μL/ウェルのTMBを添加し、50μL/ウェルの1N HClを添加する。450nm波長でMicroplate Readerを用いてプレートを読み取る。本発明の5つの抗体はアカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル(Macacca fascicularis)に由来する組換えErbB2に交差反応性であるが、ラットおよびマウス対応物には交差反応性ではないことを示す結果を以下の表9に要約する。
実施例1に記載される間接ELISA法を使用して、マウス、ラット、アカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル(Macacca fascicularis)およびヒトなどの様々な種に由来する組換えErbB2−ECDに対する本発明の抗体の結合活性を調査した。手短に言えば、96ウェルELISAプレートを、100μL/ウェルで1μg/mLの様々な種の組換えErbB2−ECDでコーティングし、4℃で一晩インキュベートする。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去する。200μL/ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、37℃で1〜2時間インキュベートする。本発明の精製抗体を添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgG−HRP 100μL/ウェルを添加し、37℃で1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、15分後に100μL/ウェルのTMBを添加し、50μL/ウェルの1N HClを添加する。450nm波長でMicroplate Readerを用いてプレートを読み取る。本発明の5つの抗体はアカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル(Macacca fascicularis)に由来する組換えErbB2に交差反応性であるが、ラットおよびマウス対応物には交差反応性ではないことを示す結果を以下の表9に要約する。
[5−4]本発明に係る精製抗体のエピトープグループ分け
実施例3に記載される方法とは異なり、精製抗体のエピトープグループ分けを競合ELISA後の捕捉ELISAによって評価した。<1>捕捉ELISAを行って、ビオチン標識組換えErbB2−ECDの結合EC80の濃度を決定した。手短に言えば、96ウェルプレートを0.5μg/mLの抗ErbB2抗体で一晩コーティングし、37℃で1時間、PBST中1%BSAによってブロッキングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μL/ウェルのTMBを添加して、室温で15分間展開させ、引き続いて50μL 1N HClでクエンチする。OD値について450nmでプレートを読み取って、各試験抗体に対するビオチン標識組換えErbB2−ECDのEC80濃度を得た;<2>競合ELISAを行って、2つの抗体が別個のエピトープに結合するのか、同じエピトープに結合するのかを決定する。抗原に結合する2つの抗体の交差競合能力が高ければ高いほど、2つの抗体のエピトープがより同じになる(2つの試験抗体の別個のエピトープの可能性が少なくなる)。手短に言えば、上記と同じ手順後に96ウェルプレートをコーティングした。EC80の濃度のErbB2−ECD−ビオチンと10μg/mLの試験抗体のプレインキュベート混合物をプレートに添加し、1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。上記の捕捉ELISAと同じ手順に従って、OD450値を得て、交差競合能力を計算する。交差競合能力が80%以上である場合に、2つの抗体を同じエピトープに結合するとみなす。表10に示すように、4C9、4H2、4G6、5F12および5G9は互いに強力な交差競合性能力を示すが、ErbB2−ECDとの結合においてトラスツズマブともペルツズマブとも競合せず、本発明の抗体が同じエピトープまたは高度に重複するエピトープに結合するが、トラスツズマブエピトープともペルツズマブエピトープとも別個のエピトープに結合することを示す。
実施例3に記載される方法とは異なり、精製抗体のエピトープグループ分けを競合ELISA後の捕捉ELISAによって評価した。<1>捕捉ELISAを行って、ビオチン標識組換えErbB2−ECDの結合EC80の濃度を決定した。手短に言えば、96ウェルプレートを0.5μg/mLの抗ErbB2抗体で一晩コーティングし、37℃で1時間、PBST中1%BSAによってブロッキングした。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μL/ウェルのTMBを添加して、室温で15分間展開させ、引き続いて50μL 1N HClでクエンチする。OD値について450nmでプレートを読み取って、各試験抗体に対するビオチン標識組換えErbB2−ECDのEC80濃度を得た;<2>競合ELISAを行って、2つの抗体が別個のエピトープに結合するのか、同じエピトープに結合するのかを決定する。抗原に結合する2つの抗体の交差競合能力が高ければ高いほど、2つの抗体のエピトープがより同じになる(2つの試験抗体の別個のエピトープの可能性が少なくなる)。手短に言えば、上記と同じ手順後に96ウェルプレートをコーティングした。EC80の濃度のErbB2−ECD−ビオチンと10μg/mLの試験抗体のプレインキュベート混合物をプレートに添加し、1時間インキュベートする。プレートをPBSTで3回洗浄し、100μLのHRP−ストレプトアビジン(1:5000)を各ウェルに添加する。37℃でさらに40分間インキュベートする。上記の捕捉ELISAと同じ手順に従って、OD450値を得て、交差競合能力を計算する。交差競合能力が80%以上である場合に、2つの抗体を同じエピトープに結合するとみなす。表10に示すように、4C9、4H2、4G6、5F12および5G9は互いに強力な交差競合性能力を示すが、ErbB2−ECDとの結合においてトラスツズマブともペルツズマブとも競合せず、本発明の抗体が同じエピトープまたは高度に重複するエピトープに結合するが、トラスツズマブエピトープともペルツズマブエピトープとも別個のエピトープに結合することを示す。
[5−5]本発明に係る抗体のトラスツズマブ相乗生理活性
実施例4に記載される方法を使用することによって、本発明によって単離した精製抗体(4C9、4H2、4G6、5F12および5G9)のトラスツズマブ相乗生理活性を、BT474細胞増殖阻害アッセイによって評価した。結果(図2A〜図2Eおよび表11参照)は、本発明の抗体が、細胞増殖の一定の阻害活性を示すが、トラスツズマブと組み合わせると強力な相乗阻害活性を示すことを実証した。トラスツズマブ+本発明の抗体の細胞増殖阻害活性は、診療所で使用される公知の組み合わせであるトラスツズマブとペルツズマブの活性よりも高い。
実施例4に記載される方法を使用することによって、本発明によって単離した精製抗体(4C9、4H2、4G6、5F12および5G9)のトラスツズマブ相乗生理活性を、BT474細胞増殖阻害アッセイによって評価した。結果(図2A〜図2Eおよび表11参照)は、本発明の抗体が、細胞増殖の一定の阻害活性を示すが、トラスツズマブと組み合わせると強力な相乗阻害活性を示すことを実証した。トラスツズマブ+本発明の抗体の細胞増殖阻害活性は、診療所で使用される公知の組み合わせであるトラスツズマブとペルツズマブの活性よりも高い。
《実施例6》DNAクローニングおよび配列決定による抗ErbB2モノクローナル抗体の可変領域タンパク質配列の演繹法
以下のプロトコルを使用して、Trizol試薬(Invitrogen、15596)を使用して、全RNAをハイブリドーマ細胞ペレットから抽出した。1mLのTrizol試薬を添加して細胞(DPBS中で調製したおよそ1×107個細胞)を破壊し、室温で5分間インキュベートした。200μLのクロロホルムを添加する。15秒間激しく振盪する。室温で3分間インキュベートする。4℃で15分間、12000×gで遠心分する。水相を新たな1.5mL遠心管に移す。500μLのイソプロピルアルコールを添加する。室温で10分間インキュベートする。4℃で10分間、12000×gで遠心分離する。1mLの75%エタノールで洗浄する。4℃で5分間、7500rpmで遠心分離する。10分間風乾する。40μLのDEPC処理水に再懸濁する。55℃で10分間インキュベートする。NanodropでA260を測定する。
以下のプロトコルを使用して、Trizol試薬(Invitrogen、15596)を使用して、全RNAをハイブリドーマ細胞ペレットから抽出した。1mLのTrizol試薬を添加して細胞(DPBS中で調製したおよそ1×107個細胞)を破壊し、室温で5分間インキュベートした。200μLのクロロホルムを添加する。15秒間激しく振盪する。室温で3分間インキュベートする。4℃で15分間、12000×gで遠心分する。水相を新たな1.5mL遠心管に移す。500μLのイソプロピルアルコールを添加する。室温で10分間インキュベートする。4℃で10分間、12000×gで遠心分離する。1mLの75%エタノールで洗浄する。4℃で5分間、7500rpmで遠心分離する。10分間風乾する。40μLのDEPC処理水に再懸濁する。55℃で10分間インキュベートする。NanodropでA260を測定する。
その後、以下のプロトコルに従って、SuperScript III First−Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen、18080−400)を使用して、2μgの全RNAを使用して第1の鎖cDNAを合成した:
65℃、5分間、サーマルサイクラーを用いてインキュベートし、次いで、直ちに氷上に2分間置く。以下を氷上チューブに添加する:10μLの2×First−Strand Reaction Mixおよび2μLのSuperScriptR III/RNアーゼ OUT(商標)Enzyme Mix。ボルテックスによって試料を混合し、引き続いて手短に遠心分離する。50℃で50分間インキュベートする。85℃で5分間の反応を終了させる。氷上で冷却する。次いで、得られたcDNAを抗体の可変領域のPCR増幅用の鋳型として使用した。第1の鎖cDNA、マウスIg−プライマーセット(Novagen、カタログ番号69831−3)からのプライマーおよびPLATINUM(登録商標)Taq DNA Polymerase High Fidelity(Invitrogen、11304)を使用してPCRを行った。重鎖可変領域を増幅するために、PCR試料を以下の通りに組み立てた:27μLのPCR Super Mix+1μLの逆方向プライマーMuIgG VH3’−2+1μLのcDNA+1μLのMuIg−5’リーダープライマー。軽鎖可変領域を増幅するために、PCR試料を以下の通りに組み立てた:27μLのPCR Super Mix+0.25μLの逆方向プライマーMuIgK VL3’−1+1μLのcDNA+1μLのMuIg−5’リーダープライマー。
リーダープライマーVH−A、VH−B、VL−AおよびVL−Bとの反応のために、以下のPCRサイクルを使用する:工程1−94℃で2分間変性;工程2−94℃で30秒間変性;工程3−50℃で30秒間アニーリング;工程4−72℃で1分間伸長;工程2〜4を35サイクル;工程5−72℃で5分間、最後の伸長;工程6−4℃で永久的に冷却。
リーダープライマーVH−C〜VH−FおよびVL−C〜VL−Gとの反応のために、以下のPCRサイクルを使用する:工程1−94℃で2分間変性;工程2−94℃で30秒間変性;工程3−60℃で30秒間アニーリング;工程4−72℃で1分間伸長;工程2〜4を35サイクル;工程5−72℃で5分間、最後の伸長;工程6−4℃で永久的に冷却。
PCR産物を1.2%アガロースゲル上に泳動させ、予想されるサイズ(400〜500bp)で移動するバンドをDNA抽出用に切り出した。以下のプロトコルに従って、QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen、カタログ番号28704)を使用してDNAを精製した:ゲル切片を秤量した。1容量のゲルに対して3倍容量の緩衝液QGを各ゲル切片に添加した。ゲル切片が完全に溶解するまで、2〜3分毎に混合して、試料を50℃で10分間インキュベートした。次いで、1ゲル容量のイソプロパノールを各試料に添加し、混合した。次いで、試料をQIAquickカラムにアプライし、13000rpmで1分間遠心分離した。洗浄するために、750μLの緩衝液PEを試料に添加し、13000rpmで1分間スピンさせた。次いで、カラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して残留エタノールを完全に除去した。30μLのH2Oを各カラムに添加し、13000rpmで1分間スピンさせることによってDNAを溶出した。次いで、精製PCR産物を配列決定して可変領域配列を同定した(以下の表13Aおよび表13B)。
《実施例7》キメラ抗体の作製および特性評価
抗ErbB2モノクローナル抗体(上記の表13Aおよび表13B)の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれヒトIgG1重鎖およびκ軽鎖定常領域にインフレームでクローニングした。得られたキメラ抗体の活性を捕捉ELISAアッセイ(以下の表14)で確認したら、その親マウスモノクローナル抗体に匹敵していた。
抗ErbB2モノクローナル抗体(上記の表13Aおよび表13B)の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれヒトIgG1重鎖およびκ軽鎖定常領域にインフレームでクローニングした。得られたキメラ抗体の活性を捕捉ELISAアッセイ(以下の表14)で確認したら、その親マウスモノクローナル抗体に匹敵していた。
実施例5に記載されるのと同じ方法に従って、マウス、ラット、アカゲザル(Macaca mulatta)、カニクイザル(Macaca Fasciculari)およびヒトなどの様々な種に由来する組換えErbB2−ECDとの結合について本発明のキメラ抗体の結合活性を調査した。結果を以下の表15に示した。
キメラ抗体のトラスツズマブ相乗生理活性の確認
実施例5に記載されるのと同じ手順に従って、BT474乳癌細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力について、対応するキメラ抗体を評価した。結果を表16に要約する。
実施例5に記載されるのと同じ手順に従って、BT474乳癌細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力について、対応するキメラ抗体を評価した。結果を表16に要約する。
《実施例8》抗ErbB2マウスモノクローナル抗体5F12のヒト化
5F12マウス抗ErbB2抗体(上記の表13Aおよび表13B)をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(以下の表17Aおよび表17B)を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてDNA配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列hIGHV1−46 FR1、hIGHV1−46 FR2、hIGHV1−46 FR3およびhIGHJ4 FR4を使用した(上記の表2参照)。軽鎖変異体VL.1、VL.1aおよびVL.1bについては、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列hIGKV1−33 FR1、hIGKV1−33 FR2、hIGKV1−33 FR3およびhIGKJ1 FR4を使用した(上記の表3参照)。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を250mis Luriaブロス+アンピシリンに接種し、37℃で一晩培養した。Qiagen maxi prepキットを使用して、変異体培養物からDNAを抽出した。
5F12マウス抗ErbB2抗体(上記の表13Aおよび表13B)をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(以下の表17Aおよび表17B)を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてDNA配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列hIGHV1−46 FR1、hIGHV1−46 FR2、hIGHV1−46 FR3およびhIGHJ4 FR4を使用した(上記の表2参照)。軽鎖変異体VL.1、VL.1aおよびVL.1bについては、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列hIGKV1−33 FR1、hIGKV1−33 FR2、hIGKV1−33 FR3およびhIGKJ1 FR4を使用した(上記の表3参照)。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を250mis Luriaブロス+アンピシリンに接種し、37℃で一晩培養した。Qiagen maxi prepキットを使用して、変異体培養物からDNAを抽出した。
合計35個の変異体について、VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3またはVH.4の各重鎖変異体をVL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5およびVL.6の各軽鎖変異体と組み合わせることによって、ヒト化抗体を作製した(以下の表18)。
中でも、最小逆突然変異を有する11個の変異体を抗体産生および精製のために選択し、捕捉ELISAによってそのErbB2結合EC50について評価した。結果(以下の表19参照)は、1個を除く11個の変異体が5F12キメラ抗体と比較して同等のErbB2結合EC50を示すことを示している。
《実施例9》抗ErbB2マウスモノクローナル抗体5G9のヒト化
5G9マウス抗ErbB2抗体(上記の表13Aおよび表13B)をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(以下の表20Aおよび表20B)を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてDNA配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列hIGHV1−69 FR1、hIGHV1−69 FR2、hIGHV1−69 FR3およびhIGHJ1 FR4を使用した(上記の表2参照)。軽鎖変異体VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6については、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列hIGKV1−27 FR1、hIGKV1−27 FR2、hIGKV1−27 FR3およびhIGKJ1 FR4を使用した(上記の表3参照)。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を250mL Luriaブロス+アンピシリンに接種し、37℃で一晩培養した。Qiagen maxi prepキットを使用して、変異体培養物からDNAを抽出した。
5G9マウス抗ErbB2抗体(上記の表13Aおよび表13B)をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4、VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6(以下の表20Aおよび表20B)を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてDNA配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列hIGHV1−69 FR1、hIGHV1−69 FR2、hIGHV1−69 FR3およびhIGHJ1 FR4を使用した(上記の表2参照)。軽鎖変異体VL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5、VL.6については、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列hIGKV1−27 FR1、hIGKV1−27 FR2、hIGKV1−27 FR3およびhIGKJ1 FR4を使用した(上記の表3参照)。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を250mL Luriaブロス+アンピシリンに接種し、37℃で一晩培養した。Qiagen maxi prepキットを使用して、変異体培養物からDNAを抽出した。
合計42個の変異体について、VH.v1、VH.1、VH.2、VH.3、VH.4およびVH5の各重鎖変異体をVL.v1、VL.1、VL.2、VL.3、VL.4、VL.5およびVL.6の各軽鎖変異体と組み合わせることによって、ヒト化抗体を作製した(以下の表21)。
中でも、最小逆突然変異を有する12個の変異体を抗体産生および精製のために選択し、捕捉ELISAによってそのErbB2結合EC50について評価した。結果(以下の表22参照)は、6/12個の変異体が5G9キメラ抗体と比較して低いErbB2結合EC50を示すことを示している。
《実施例10》BT474異種移植片モデルにおける抗ErbB2抗体混合物のin vivo有効性
BT474乳癌異種移植片腫瘍モデルのin vivo試験を、契約番号E0627−T1401でCrown Bioscienceによって商業的に行った。本試験は、(a)トラスツズマブ単独での処置;(b)トラスツズマブと本発明によって単離された抗体のいずれか1つの組み合わせ;(c)トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせの抗腫瘍活性を調査した。
BT474乳癌異種移植片腫瘍モデルのin vivo試験を、契約番号E0627−T1401でCrown Bioscienceによって商業的に行った。本試験は、(a)トラスツズマブ単独での処置;(b)トラスツズマブと本発明によって単離された抗体のいずれか1つの組み合わせ;(c)トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせの抗腫瘍活性を調査した。
雌NOD/SCIDマウス、6〜8週齢;体重17.7〜26.0g(Beijing HFK Bioscience Co.,Ltd.中国)を、12時間明/12時間暗の日周期、室温21.9〜23.8℃、湿度40〜45%で、特定病原体除去条件下で維持する。到着後、動物を、動物施設の隔離部分に1週間収容して、新たな環境に観察のために馴らす。定期的に連続的な健康モニタリングを行う。規定食餌(放射性同位体60Coによって照射)および水を自由に与える。
ヒト乳癌細胞株BT474を、10%FBSを含むDMEMで培養した。細胞増殖が対数期段階に到達したら、細胞を回収し、PBSで洗浄し、その後、適切な濃度に希釈した。再構成基底膜(Matrigel;Collaborative Research、Bedford、Mass.)と1:1容量比で混合した後、細胞(1×107個細胞/マウス)をマウス乳腺パッドに接種した。移植した腫瘍の容量が約151mm3に到達したら、マウスを、(a)1群:PBS(ビヒクル対照);(b)2群:PC(トラスツズマブ単独、3mg/kg);(c)3群:トラスツズマブ+4C9の組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg);(d)4群:トラスツズマブ+4H2の組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg);(e)5群:トラスツズマブ+4G6の組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg);(f)6群:トラスツズマブ+5F12の組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg);(g)7群:トラスツズマブ+5G9の組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg);(h)8群:トラスツズマブ+ペルツズマブの組み合わせ(1.5mg/kg+1.5mg/kg)を含む8つの群(6匹のマウス/群)にランダムに分けた。マウスを最初の2週間は1週間に1回処置し、引き続いて後の2週間は1週間に2回処置し、合計7回投与した。試験抗体は尾静脈注射によって投与した。
この試験では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズが処置開始後32日目で1064mm3に到達した。PC群処置(トラスツズマブ単独、3mg/kg)は、残留抗腫瘍活性を示し、32日目で965mm3の平均腫瘍量が得られ、T/C値95%で、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して小さいが、有意な差は観察されず(P=0.24)、トラスツズマブが3mg/kgの低投与量で抗腫瘍活性をほとんど有さないことを示した。逆に、同じ投与スケジュール下で、トラスツズマブと本発明によって単離された抗体のいずれか1つまたはペルツズマブの組み合わせは、ビヒクル対照と比較して中等度〜有意に強力な抗腫瘍活性を示す。好ましくは、同じ投与処置下で、トラスツズマブ+5F12またはトラスツズマブ+5G9の組み合わせが、T/C値47%または53%(それぞれp<0.03またはp<0.001)で腫瘍増殖を阻害し、5F12または5G9がトラスツズマブ処置の抗腫瘍有効性を有意に増強することができることを実証している。より好ましくは、5F12および5G9は、診療所で現在使用されている公知の薬物であるペルツズマブよりも有意に高いトラスツズマブ媒介抗腫瘍有効性に対する相乗活性を実証した(それぞれp<0.07およびp<0.006)。トラスツズマブ+本発明によって単離された抗体の組み合わせの抗腫瘍有効性の結果を図3A〜図3Bおよび表23に示した。
《実施例11》NCI−N87胃モデルにおける抗ErbB2抗体混合物のin vivo有効性(5G9、5F12)
NCI−N87異種移植片モデルを使用して、トラスツズマブと組み合わせた本発明の抗体の相乗有効性をさらに評価した。この試験の手順を以下のように手短に要約する:<1>NCI−N87細胞を対数期に培養し、回収した;<2>NCI−N87細胞をPBSに再懸濁し、細胞密度を8×107個細胞/mLに調節し、その後、100μLまたは8×107個細胞を胸腺欠損ヌード雌マウスの左側腹領域に皮下注射した;<3>マウスを群にランダム化する前に、腫瘍をおよそ100〜200mm3のサイズに増殖させた;<4>動物に、1週間に2回、指示される用量で抗体の腹腔内投与を受けさせ、腫瘍サイズならびに体重を1週間に2回測定した。腫瘍量(TV)を、式TV=1/2×a×b2(式中、「a」は大きい腫瘍直径を表し、「b2」は最も小さい腫瘍直径を表す)を使用して計算した。
NCI−N87異種移植片モデルを使用して、トラスツズマブと組み合わせた本発明の抗体の相乗有効性をさらに評価した。この試験の手順を以下のように手短に要約する:<1>NCI−N87細胞を対数期に培養し、回収した;<2>NCI−N87細胞をPBSに再懸濁し、細胞密度を8×107個細胞/mLに調節し、その後、100μLまたは8×107個細胞を胸腺欠損ヌード雌マウスの左側腹領域に皮下注射した;<3>マウスを群にランダム化する前に、腫瘍をおよそ100〜200mm3のサイズに増殖させた;<4>動物に、1週間に2回、指示される用量で抗体の腹腔内投与を受けさせ、腫瘍サイズならびに体重を1週間に2回測定した。腫瘍量(TV)を、式TV=1/2×a×b2(式中、「a」は大きい腫瘍直径を表し、「b2」は最も小さい腫瘍直径を表す)を使用して計算した。
NCI−N87腫瘍増殖に対するトラスツズマブと5G9、5F12またはペルツズマブの組み合わせのin vivo有効性の試験設計を表24に示す。この試験の段階1は、様々な投与量(5mg/kg、10mg/kgおよび15mg/kg)での5G9、5E12およびこれらのトラスツズマブとの組み合わせの有効性を評価することを目的とする。この試験の段階2は、2つの側面に特に焦点を当てている:<1>26日目から開始し、低投与量(5mg/kg)での5G9および5F12の単一処置へのトラスツズマブ(5mg/kg)の追加が、トラスツズマブ高投与量群(15mg/kg)と比較して相乗有効性を再構成することができるかどうか。<2>26日目から開始し、さらなる処置なしで同じ投与量(5mg/kg+5mg/kg)下で、トラスツズマブと5G9または5E12の組み合わせが、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせと比較してその抗腫瘍有効性を維持することができるかどうか。
この試験の段階1の結果を表25に要約する。試験結果を以下のように要約する:<1>5mg/kg投与量でのトラスツズマブ処置は強力な抗腫瘍活性を示し、22日目で227mm3の平均腫瘍サイズが得られ、TGI値(すなわち、TGI=(1−平均処置腫瘍量/平均対照腫瘍量)×100%)が43.59%であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して統計学的に有意な差が観察された(2群対1群、P<0.01)。しかしながら、トラスツズマブ処置の3倍増加(15mg/kg)は、その有効性を有意には増強することができず(3群対2群、P>0.05)、トラスツズマブの抗腫瘍有効性が、5mg/kgなどの一定投与量に到達した後は改善されないことを実証している;<2>しかしながら、より低い投与量(5mg/kg+5mg/kg)でのトラスツズマブと5G9または5F12の組み合わせは、高投与量(15mg/kg)での5G9、5F12またはトラスツズマブの単一処置よりもはるかに高い抗腫瘍有効性を示す。腫瘍量に関して、22日目で、組み合わせ処置(8、10群)と単一処置(5、7および3群)との間で大いに有意な差が観察され(8または10群対5、7または3群、P<0.01)、トラスツズマブと5G9または5F12の組み合わせが強力な相乗抗腫瘍有効性を示すという証拠を提供している;<3>同じ投与量処置(5mg/kg+5mg/kgまたは15mg/kgまたは15mg/kg)下では、トラスツズマブと5G9の組み合わせは、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせよりもはるかに高い抗腫瘍活性を示し、22日目で平均腫瘍サイズ8.75mm3または7.23mm3が得られ、TGI値が98.31%または98.61%であった。トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ対照群と比較して、大いに有意な差が観察された(22日目で46.83mm3または21.41mm3、TGI値90.97%または95.87%、P<0.05またはP<0.01)。これらの結果は、ペルツズマブとは異なり、5G9が、トラスツズマブと組み合わせた場合に特有の相乗活性を有することを示している;<3>同じ投与量処置(15+15mg/kg)下で、トラスツズマブと5G12の組み合わせは、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせよりも大いに高い抗腫瘍活性を示し、22日目で平均腫瘍サイズ1.45mm3が得られ、TGI値が99.72%であった。トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ対照群と比較すると、大いに有意な差が観察された(22日目で21.41mm3、TGI値95.87%、P<0.01)。この結果は、ペルツズマブと異なり、5F12が、トラスツズマブと組み合わせた場合に特有の相乗活性を有することを実証している。
5G9または5F12の既存の単一処置にトラスツズマブを加えることによって相乗有効性が再構成されるかどうかを調査するために、5G9(5mg/kg)または5F12(5mg/kg)の単一処置を、段階1試験後〜段階2の最後に5mg/kgのトラスツズマブ投与量とさらに組み合わせた。表26に示すように、5mg/kg投与量の5G9または5F12の単一処置は15mg/kg投与量のトラスツズマブの処置よりも有意に低い抗腫瘍活性を示し、それぞれ26日目で平均腫瘍サイズ424.57mm3または386.92mm3であり、TGI値が54.23%または25.41%であった一方、15mg/kg投与量でのトラスツズマブ処置は26日目で平均腫瘍サイズ190.75mm3であり、TGI値が63.23%であった(4または6群対3群、P=0.003<0.01またはP=0.012<0.05)。しかしながら、26日目から開始して5mg/kg+5mg/kg投与量でさえ、5G9または5F12の単一処置にトラスツズマブを加えると、併用処置は、トラスツズマブ高用量単独処置の有効性に追いつく相乗抗腫瘍有効性を再構成することができ、57日目で最終腫瘍平均サイズ1305.11mm3または879.9mm3が得られ、TGI値が39.11%または58.95%となり、57日目で平均腫瘍サイズ888.57mm3でTGI値が58.55%である15mg/kg投与量でのトラスツズマブ処置との統計学的に有意な差はない(4または6群対3群、それぞれP=0.165>0.05またはP=0.491>0.05)。同様に、5mg/kg+5mg/kg投与量での5G9+トラスツズマブまたは5F12+トラスツズマブの併用処置の腫瘍量進行速度は、15mg/kgの高投与量でのトラスツズマブ処置の腫瘍量進行速度よりもはるかに低く、トラスツズマブ単独処置について292.92%に対して、5G9/トラスツズマブ組み合わせまたは5F12/トラスツズマブ組み合わせについて192.60%または130.97%が得られた一方、5mg/kg+5mg/kg投与量での5G9+トラスツズマブまたは5F12+トラスツズマブの併用処置のTGIの進行速度は、15mg/kgの高投与量でのトラスツズマブ処置の進行速度よりもはるかに高く、トラスツズマブ単独処置について−7.71に対して5G9/トラスツズマブ組み合わせまたは5F12/トラスツズマブ組み合わせについて39.93%または53.52%が得られる。まとめると、結果は、5G9または5F12とトラスツズマブの組み合わせが強力な相乗抗腫瘍有効性を示すことを示している。
トラスツズマブと5G9または5E12の組み合わせがトラスツズマブ/ペルツズマブ組み合わせよりも優れた抗腫瘍有効性を維持することができるかどうかを調査するために、全3つの組み合わせ(トラスツズマブ/5G9、トラスツズマブ/5F12およびトラスツズマブ/ペルツズマブ)の高投与量処置が22日目までに腫瘍のほぼ完全な除去をもたらしたので、より低投与量(5mg/kg+5mg/kg)処置をこの評価に使用した。表27に示すように、処置を停止した後、トラスツズマブ/5G9群またはトラスツズマブ/5F12群のいずれの腫瘍進行も極めて遅く、腫瘍進行速度はトラスツズマブ/5G9群またはトラスツズマブ/5F12群についてそれぞれ93.55%または125.81%であるが、トラスツズマブ/ペルツズマブ群については351.85%である。57日目に対する26日目の腫瘍量に関して、トラスツズマブ/5G9群(P=0.278>0.05)についてもトラスツズマブ/5F12群(P=0.064>0.05)についても統計学的に有意な差は観察されなかった。対照的に、57日目に対する26日目の腫瘍量に関して、トラスツズマブ/ペルツズマブ処置群については統計学的に有意な差が観察された(P=0.03<0.05)。さらに、トラスツズマブ/5G9群またはトラスツズマブ/5F12群のTGIは26日目と57日目の間で高度に維持されたが、トラスツズマブ/ペルツズマブ群ではわずかに減少した。まとめると、これらの結果は、トラスツズマブ/5G9またはトラスツズマブ/5F12の併用処置がトラスツズマブ/ペルツズマブ群よりも有意に優れた有効性を有することを示している。
《実施例12》本発明の抗体およびその組み合わせの細胞ベース内部移行速度
その内部移行速度に対する二抗体組み合わせの相乗効果を調査するために、細胞ベースエンドサイトーシスアッセイを行った。手短な手順は以下の通りである:<1>SKBR3細胞をPBSで洗浄し、次いで、37℃で約2分間、トリプシンで消化した。細胞を冷FACS緩衝液に再懸濁し、3×106個細胞/mLに調節した;<2>1mLの細胞懸濁液をFACS管に添加し、ここに最終濃度2μg/mLのFITCコンジュゲートまたはAPCコンジュゲート抗体(トラスツズマブ、またはペルツズマブ、または本発明の抗体)またはその組み合わせを添加した。細胞を氷上で1時間インキュベートした。次いで、細胞を1000rpm、5分間、4℃で遠心分離し、上清をデカントした。次いで、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、1mLのFACS緩衝液に再懸濁した。2×200μLの細胞懸濁液をそれぞれ0分で対照および試料として取った。細胞の残りを1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去した;<3>細胞を培地(DMEM+10%FBS+PS)に再懸濁し、内部移行のために37℃でインキュベートした。次いで、200μLの試料を30分および2時間でそれぞれ取った。試料を氷上で5分間冷却し、1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去し、次いで、FACS緩衝液で1回洗浄した;<4>250μLのストリップ緩衝液を細胞に添加し、室温で7分間インキュベートした。次いで、細胞を1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去し、FACS緩衝液で2回洗浄した;<5>200μLの固定緩衝液を細胞に添加し、4℃で少なくとも30分間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメーターによって分析した;<6>工程2で取った0分での対照および試料について、一方を固定緩衝液で直接固定し(工程5)、もう一方を工程4および工程5で処理した(ストリップ緩衝液および固定緩衝液を使用);<7>抗体または抗体組み合わせの内部移行速度を以下のように計算した:平均変化率=[内部移行群(MFI−MFIブランク)]/[結合親和性群(MFI−MFIブランク)]。
その内部移行速度に対する二抗体組み合わせの相乗効果を調査するために、細胞ベースエンドサイトーシスアッセイを行った。手短な手順は以下の通りである:<1>SKBR3細胞をPBSで洗浄し、次いで、37℃で約2分間、トリプシンで消化した。細胞を冷FACS緩衝液に再懸濁し、3×106個細胞/mLに調節した;<2>1mLの細胞懸濁液をFACS管に添加し、ここに最終濃度2μg/mLのFITCコンジュゲートまたはAPCコンジュゲート抗体(トラスツズマブ、またはペルツズマブ、または本発明の抗体)またはその組み合わせを添加した。細胞を氷上で1時間インキュベートした。次いで、細胞を1000rpm、5分間、4℃で遠心分離し、上清をデカントした。次いで、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、1mLのFACS緩衝液に再懸濁した。2×200μLの細胞懸濁液をそれぞれ0分で対照および試料として取った。細胞の残りを1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去した;<3>細胞を培地(DMEM+10%FBS+PS)に再懸濁し、内部移行のために37℃でインキュベートした。次いで、200μLの試料を30分および2時間でそれぞれ取った。試料を氷上で5分間冷却し、1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去し、次いで、FACS緩衝液で1回洗浄した;<4>250μLのストリップ緩衝液を細胞に添加し、室温で7分間インキュベートした。次いで、細胞を1000rpm、4℃で5分間遠心分離して上清を除去し、FACS緩衝液で2回洗浄した;<5>200μLの固定緩衝液を細胞に添加し、4℃で少なくとも30分間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメーターによって分析した;<6>工程2で取った0分での対照および試料について、一方を固定緩衝液で直接固定し(工程5)、もう一方を工程4および工程5で処理した(ストリップ緩衝液および固定緩衝液を使用);<7>抗体または抗体組み合わせの内部移行速度を以下のように計算した:平均変化率=[内部移行群(MFI−MFIブランク)]/[結合親和性群(MFI−MFIブランク)]。
表28に示すように、全ての試験抗体(トラスツズマブ、ペルツズマブ、4C9、4H2、4G6、5F12および4G9)がSKBR3細胞で抗原−抗体内部移行現象を示す。トラスツズマブおよびペルツズマブとは異なり、本発明の各個々の抗体(4C9、4H2、4G6、5F12および4G9)がトラスツズマブまたはペルツズマブよりもはるかに高い内部移行速度を示す。中でも、4C9および5F12がトラスツズマブよりも大いに有意に高い内部移行速度を示し(P<0.05)、本発明の抗体(特に、4C9、5F12および4G9)が抗体薬物コンジュゲート用途のためのより優れた候補となることができることを支持している。
表29に示すように、本発明の抗体と組み合わせると、トラスツズマブの内部移行速度はトラスツズマブ単独よりも大いに有意に高くなり(P<0.01)、本発明の抗体がトラスツズマブの内部移行速度を有意に増強することができ、結果としてトラスツズマブ−薬物コンジュゲート(すなわち、T−DM1)の処置の有効性を改善することができることを実証している。
《実施例13》PDX HERCEPTIN耐性胃モデル−HUPRIME(登録商標)胃癌異種移植片モデルにおける抗ErbB2抗体組み合わせのin vivo有効性
Crown Bioscience(Beijing)Inc.の確立され、検証されたPDXモデルとして、69歳女性アジア人患者由来のHUPRIME(登録商標)胃癌異種移植片モデルGA0060をこの有効性試験に選択する。Balb/cヌードマウスにおけるHUPRIME(登録商標)胃癌異種移植片モデルGA0060の処置での抗ErbB2抗体組み合わせのin vivo有効性試験を、契約番号E0627−T1501/T1502で、Crown Bioscience Inc.(Beijing)によって行った。手短に言えば、選択された原発ヒト胃癌組織を接種したストックマウスからの腫瘍断片を採取し、BALB/cヌードマウスへの接種に使用した。各マウスに、腫瘍発達のために、原発ヒト胃癌モデルGA0060断片(P7、直径2〜4mm)を右側腹部に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約200mm3に到達したら、処置を開始した。マウスを、1群当たり6匹で、その腫瘍サイズに従って、12の実験群にランダムに割り当てた。その日を0日目として示した。試験物を、以下の表30に示される所定のレジメンに従って、0日目〜28日目に腫瘍保有マウスに投与した。
Crown Bioscience(Beijing)Inc.の確立され、検証されたPDXモデルとして、69歳女性アジア人患者由来のHUPRIME(登録商標)胃癌異種移植片モデルGA0060をこの有効性試験に選択する。Balb/cヌードマウスにおけるHUPRIME(登録商標)胃癌異種移植片モデルGA0060の処置での抗ErbB2抗体組み合わせのin vivo有効性試験を、契約番号E0627−T1501/T1502で、Crown Bioscience Inc.(Beijing)によって行った。手短に言えば、選択された原発ヒト胃癌組織を接種したストックマウスからの腫瘍断片を採取し、BALB/cヌードマウスへの接種に使用した。各マウスに、腫瘍発達のために、原発ヒト胃癌モデルGA0060断片(P7、直径2〜4mm)を右側腹部に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約200mm3に到達したら、処置を開始した。マウスを、1群当たり6匹で、その腫瘍サイズに従って、12の実験群にランダムに割り当てた。その日を0日目として示した。試験物を、以下の表30に示される所定のレジメンに従って、0日目〜28日目に腫瘍保有マウスに投与した。
この試験の結果を表31および図4A〜図4Bに要約する。ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは、処置開始後35日目で1201.1mm3に到達した。同じ試験下で、<1>トラスツズマブ単独処置は微量の抗腫瘍活性を示し、35日目で平均腫瘍サイズ932.7mm3が得られ、T/C値が77.7%であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、有意な差は観察されなかった(P=0.161>0.05);<2>トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置と比較してさらに少ない抗腫瘍有効性を示し、35日目で平均腫瘍サイズ994.6mm3が得られ、T/C値が82.8%であり、ビヒクル対照と比較して、有意な差は観察されなかった(P=0.217>0.05);<3>トラスツズマブと5F12の組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置よりも強力な有効性を示し、35日目で平均腫瘍サイズ691.6mm3が得られ、T/C値が57.6%であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、大いに有意な差が観察された(P=0.004<0.01);<4>トラスツズマブと5G9の組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置よりも強力な有効性を示し、35日目で平均腫瘍サイズ608.8mm3が得られ、T/C値が50.7%であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、大いに有意な差が観察された(P=0.004<0.01)。
本明細書に引用される全ての文献、本、マニュアル、論文、特許、公開された特許出願、手引き、抄録および/または他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。本発明の他の実施形態は、明細書の検討および本明細書に開示される本発明の実施から当業者に明らかとなる。本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されており、明細書および実施例は単なる例示とみなされるべきであることを意図している。
Claims (18)
- 受容体チロシンプロテインキナーゼErbB−2(ErbB2)に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを含む結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントがCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含み、前記CDR−H1、CDR−H2、CDR−H3、CDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3は、下記(a)、(b)、(c)、(d)または(e)のいずれかである、前記結合タンパク質;
(a)それぞれ、CDR−H1がSEQ ID NO:25の残基31?35を含有し、CDR−H2がSEQ ID NO:25の残基50?66を含有し、CDR−H3がSEQ ID NO:25の残基99?106を含有し、CDR−L1がSEQ ID NO:26の残基24?34を含有し、CDR−L2がSEQ ID NO:26の残基50?56を含有し、かつ、CDR−L3がSEQ ID NO:26の残基89?97を含有する;
(b)それぞれ、CDR−H1がSEQ ID NO:23の残基31?35を含有し、CDR−H2がSEQ ID NO:23の残基50?66を含有し、CDR−H3がSEQ ID NO:23の残基99?106を含有し、CDR−L1がSEQ ID NO:24の残基24?34を含有し、CDR−L2がSEQ ID NO:24の残基50?56を含有し、かつ、CDR−L3がSEQ ID NO:24の残基89?97を含有する;
(c)それぞれ、CDR−H1がSEQ ID NO:17の残基31?35を含有し、CDR−H2がSEQ ID NO:17の残基50?66を含有し、CDR−H3がSEQ ID NO:17の残基99?106を含有し、CDR−L1がSEQ ID NO:18の残基24?34を含有し、CDR−L2がSEQ ID NO:18の残基50?56を含有し、かつ、CDR−L3がSEQ ID NO:18の残基89?97を含有する;
(d)それぞれ、CDR−H1がSEQ ID NO:19の残基31?35を含有し、CDR−H2がSEQ ID NO:19の残基50?66を含有し、CDR−H3がSEQ ID NO:19の残基99?106を含有し、CDR−L1がSEQ ID NO:20の残基24?34を含有し、CDR−L2がSEQ ID NO:20の残基50?56を含有し、かつ、CDR−L3がSEQ ID NO:20の残基89?97を含有する;
(e)それぞれ、CDR−H1がSEQ ID NO:21の残基31?35を含有し、CDR−H2がSEQ ID NO:21の残基50?66を含有し、CDR−H3がSEQ ID NO:21の残基99?106を含有し、CDR−L1がSEQ ID NO:22の残基24?34を含有し、CDR−L2がSEQ ID NO:22の残基50?56を含有し、かつ、CDR−L3がSEQ ID NO:22の残基89?97を含有する。 - 請求項1に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、配列番号17〜51からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも1つの可変領域を含む、前記結合タンパク質。
- 請求項1または請求項2に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、配列番号17および18;配列番号19および20;配列番号21および22;配列番号23および24;配列番号25および26;配列番号27および32;配列番号27および33;配列番号27および34;配列番号27および35;配列番号27および36;配列番号27および37;配列番号27および38;配列番号28および32;配列番号28および33;配列番号28および34;配列番号28および35;配列番号28および36;配列番号28および37;配列番号28および38;配列番号29および32;配列番号29および33;配列番号29および34;配列番号29および35;配列番号29および36;配列番号29および37;配列番号29および38;配列番号30および32;配列番号30および33;配列番号30および34;配列番号30および35;配列番号30および36;配列番号30および37;配列番号30および38;配列番号31および32;配列番号31および33;配列番号31および34;配列番号31および35;配列番号31および36;配列番号31および37;配列番号31および38;配列番号39および45;配列番号39および46;配列番号39および47;配列番号39および48;配列番号39および49;配列番号39および50;配列番号39および51;配列番号40および45;配列番号40および46;配列番号40および47;配列番号40および48;配列番号40および49;配列番号40および50;配列番号40および51;配列番号41および45;配列番号41および46;配列番号41および47;配列番号41および48;配列番号41および49;配列番号41および50;配列番号41および51;配列番号42および45;配列番号42および46;配列番号42および47;配列番号42および48;配列番号42および49;配列番号42および50;配列番号42および51;配列番号43および45;配列番号43および46;配列番号43および47;配列番号43および48;配列番号43および49;配列番号43および50;配列番号43および51;配列番号44および45;配列番号44および46;配列番号44および47;配列番号44および48;配列番号44および49;配列番号44および50;および配列番号44および51からなる群から選択される2つの可変領域を含む、前記結合タンパク質。
- 請求項1から請求項3のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、マウスモノクローナル抗体、マウス抗体由来抗原結合フラグメント、キメラ抗体、キメラ抗原結合フラグメント、ヒト化抗体およびヒト化抗原結合フラグメントからなる群から選択される抗体または抗原結合フラグメントである、前記結合タンパク質。
- 請求項1から請求項4のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、i)ErbB2媒介生理活性を調節する;ii)ErbB2陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行される;iii)ErbB2陽性細胞の増殖を阻害する;および/または、iv)ErbB2陽性腫瘍およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖をトラスツズマブと相乗的に阻害する、前記結合タンパク質。
- 請求項1から請求項5のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、単独で、または、トラスツズマブと組み合わせて、ErbB2陽性腫瘍およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖を少なくとも70%阻害する、前記結合タンパク質。
- 請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域と、薬剤とを含む結合タンパク質コンジュゲートであって、前記薬剤がイメージング剤、治療薬、細胞傷害剤および免疫付着分子からなる群から選択される、結合タンパク質コンジュゲート。
- 請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- i)請求項1から請求項6のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項7に記載のの結合タンパク質コンジュゲート、請求項8のポリヌクレオチドまたは請求項9に記載のベクターの、治療上有効量と、ii)薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項10に記載の医薬組成物であって、ErbB2活性が有害である障害を治療するための少なくとも1つの追加の薬剤をさらに含む、前記医薬組成物。
- 請求項11に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つの追加の薬剤が、治療薬;イメージング剤;抗新生物薬;化学療法薬;血管新生阻害剤;抗VEGF抗体;抗EGFR抗体;抗c−Met抗体;抗ErbB3抗体;抗ErbB2抗体;抗CD20抗体;アフリベルセプト;キナーゼ阻害剤;同時刺激分子遮断薬;抗B7.2抗体;CTLA4−Ig;接着分子遮断薬;抗Eセレクチン抗体;抗Lセレクチン抗体;抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント;抗IL−18抗体;抗TNF抗体;抗IL−6抗体;メトトレキサート;コルチコステロイド;シクロスポリン;ラパマイシン;FK506;DNAアルキル化剤;シスプラチン;カルボプラチン;抗チューブリン剤;パクリタキセル;ドセタキセル;ドキソルビシン;ゲムシタビン;ジェムザール;アントラサイクリン;アドリアマイシン;トポイソメラーゼI阻害剤;トポイソメラーゼII阻害剤;5−フルオロウラシル(5−FU);ロイコボリン;イリノテカン;受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アポトーシス阻害剤;Bcl2/Bclx阻害剤;エルロチニブ、ゲフィチニブ、COX−2阻害剤、セレコキシブ、シクロスポリン;ラパマイシン;検出可能な標識またはレポーター分子;TNFアンタゴニスト;抗リウマチ薬;筋弛緩薬;麻薬;鎮痛薬;麻酔薬;鎮静薬;局所麻酔薬;神経筋遮断薬;抗微生物薬;抗乾癬薬;コルチコステロイド;アナボリックステロイド;エリスロポエチン;免疫化;免疫グロブリン;免疫抑制剤;成長ホルモン;ホルモン補充薬;放射性医薬品;抗うつ薬;統合失調症治療薬;刺激剤;喘息薬;βアゴニスト;吸入ステロイド;エピネフリン;そのエピネフリン類似体;サイトカイン;およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも1つの追加の薬剤である、前記医薬組成物。
- 請求項11に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つの追加の薬剤が、ErbB2に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントである、前記医薬組成物。
- 請求項11から請求項13のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも1つの追加の薬剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含む少なくとも1つの追加の薬剤である、前記医薬組成物。
- 対象の疾患または障害の治療に用いるための、請求項10から請求項14のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、ErbB2活性が前記疾患または前記障害において有害である、前記医薬組成物。
- 請求項15に記載の医薬組成物であって、前記疾患または障害が、乳癌、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌(stomach cancer)、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿道癌、女性生殖系癌、男性生殖系癌、内分泌線癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血器腫瘍からの固形腫瘍、腫瘍転移、眼血管新生、浮腫、関節リウマチ、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、膵炎、多嚢胞性卵巣(POD)、子宮内膜症、子宮類線維症、良性前立腺肥大症、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症(CADA−SIL)、多発性硬化症(MS)、ファロー四徴症(TOF)、アラジール症候群(AS)、黄斑変性および加齢性黄斑変性疾患、ならびに異常なErbB2活性を特徴とする他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択される疾患または障害である、前記医薬組成物。
- 請求項15に記載の医薬組成物であって、前記疾患または障害が、乳癌、胃癌(gastric cancer)および肺癌からなる群から選択される疾患または障害である、前記医薬組成物。
- ErbB2陽性細胞の増殖を阻害するのに用いるための、請求項10から請求項14のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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2018
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