JP2020503858A5 - - Google Patents

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  1. 核酸のメチル化状態を決定するためのカートリッジのセットであって:
    試料を受け取るチャンバー;
    第1のマトリックス材料を含むカラム;
    温度制御チャネル又はチャンバー;
    試料除去チャンバー;並びに
    試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
    を含む第1のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、亜硫酸水素塩試薬を含有する、第1のカートリッジ;並びに
    試料を受け取るチャンバー;
    第2のマトリックス材料を含むカラム;
    温度制御チャネル又はチャンバー;並びに
    試薬及び/又はバッファーを含有する複数のチャンバー
    を含む第2のカートリッジであって、使用時に、前記チャンバーの少なくとも1つが、脱スルホン化及び/又は溶出試薬を含有する、第2のカートリッジ
    を含む、カートリッジのセット。
  2. 前記第1のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、請求項1に記載のカートリッジのセット。
  3. 前記第2のカートリッジ中の温度制御チャネル又はチャンバーが、熱サイクリングチャネル又はチャンバーである、請求項1又は2に記載のカートリッジのセット。
  4. 前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  5. 前記亜硫酸水素塩試薬が、亜硫酸水素アンモニウムを含む、請求項4に記載のカートリッジのセット。
  6. 前記亜硫酸水素塩が、亜硫酸酸化を防ぐためのスカベンジャー及び/又は触媒を含む試薬混合物において提供される、請求項1から5のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  7. 前記亜硫酸水素塩が、Trolox及びヒドロキノンからなる群から選択されるスカベンジャーを含む試薬混合物において提供される、請求項6に記載のカートリッジのセット。
  8. 前記亜硫酸水素塩が、ポリアミンを触媒として含む試薬混合物において提供される、請求項6又は7に記載のカートリッジのセット。
  9. 前記第1のカートリッジが、試料がカートリッジに入れられる時又はそれと近い時に亜硫酸水素塩試薬が加えられるように構成されている、請求項1から8のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  10. 亜硫酸水素塩試薬が、前記第1のカートリッジ中の前記複数のチャンバーの1つにおいてコンポーネントとして提供される、請求項1から9のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  11. 前記第2のカートリッジ中の複数のチャンバーを含む少なくとも1つのチャンバーが、PCRプライマー、及び/又はPCRプローブ、及び/又はPCRマスターミックスを含有する、請求項1から10のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  12. 前記第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する1つ又は複数のチャンバーを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  13. 前記第2のカートリッジが、メチル化特異的PCRプライマー、メチル化特異的PCRプローブ、PCR酵素、及びPCR反応バッファーからなる群から選択される1つ又は複数の試薬を含有する少なくとも2つのチャンバーを含有する、請求項12に記載のカートリッジのセット。
  14. 前記第2のカートリッジが、変換されたDNAのフォワード鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、請求項1から13のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  15. 前記第2のカートリッジが、変換されたDNAのリバース鎖のメチル化の検出のためのプライマー及びプローブを含有する少なくとも1つのチャンバーを含有する、請求項1から14のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  16. 前記PCRプライマー、及び/又はプローブ、及び/又は酵素が、ビーズとして提供される、請求項12から15のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  17. 前記第2のカートリッジが、配列番号２から３９０に示される1つ又は複数のプライマー、及び/或いは配列番号２から３９０に示される1つ又は複数のプローブを含有する、請求項1から16のいずれか一項に記載のカートリッジのセット。
  18. 前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してMGMTのメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
    ヌクレオチド配列GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT(配列番号:263)を含む外部フォワードプライマー(248b);
    ヌクレオチド配列:AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC(配列番号:265)を含む外部リバースプライマー(249b);
    ヌクレオチド配列TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC(配列番号:266)を含む内部フォワードプライマー(250);
    ヌクレオチド配列GCACTCTTCCGAAAACGAAACG(配列番号:267)を含む内部リバースプライマー(251);及び
    ヌクレオチド配列 蛍光-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-ブロッカー(配列番号:268)を含むプローブ(252a)
    を含有する、請求項17に記載のカートリッジのセット。
  19. 前記第2のカートリッジが、ネステッドPCR反応を使用してACTB(例えば、対照として)のメチル化を決定するための次のプローブ及びプライマー:
    ヌクレオチド配列GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT(配列番号:103)を含む外部フォワードプライマー(102);
    ヌクレオチド配列CCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA(配列番号:104)を含む外部リバースプライマー(103);
    ヌクレオチド配列GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG(配列番号:149)を含む内部フォワードプライマー(148);
    ヌクレオチド配列CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC(配列番号:150)を含む内部リバースプライマー(149);及び
    ヌクレオチド配列 蛍光-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-ブロッカー(配列番号:179)を含むプローブ(178)
    を含有する、請求項17又は18に記載のカートリッジのセット。
  20. 生物学的試料において核酸のメチル化を決定するためのシステムであって:
    1つ又は複数の試料処理モジュールを含有するように構成されたエンクロージャーを含み、それぞれの試料処理モジュールが、請求項1〜19のいずれか一項に記載のカートリッジの前記セットの、取り外し可能なカートリッジである第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを保持するように構成され;
    前記システムが、カートリッジの前記セットの第1のカートリッジを操作して、前記第1のカートリッジに導入された試料において核酸の亜硫酸水素塩変換を行うために、試料処理モジュールを操作して試料処理を行うよう、並びに/又は
    対応する取り外し可能な試料カートリッジ内の1つ又は複数の標的核酸の脱スルホン化を行うよう、及びメチル化を決定するよう
    構成される、システム。
  21. 核酸のメチル化状態を決定する方法であって:
    請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第1のカートリッジの試料チャンバーにおいて生物学的試料を用意する工程;及び前記第1のカートリッジを操作して、
    前記試料中のDNAを前記第1のマトリックス材料に結合させ;
    結合したDNAを洗浄し;
    結合したDNAをマトリックス材料から溶出し;
    溶出したDNAを前記亜硫酸水素塩試薬と組合せ;
    前記温度制御チャネル又はチャンバーにおいてDNAと亜硫酸水素塩試薬の混合物を加熱して、前記DNAの亜硫酸水素塩変換を行い;
    亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第1のカートリッジの試料除去チャンバーに移す
    工程を含む方法。
  22. 請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットにおける第2のカートリッジの試料チャンバーにおいて亜硫酸水素塩で変換されたDNAを用意する工程;及び前記第2のカートリッジを操作して、
    前記亜硫酸水素塩変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料に結合させ;
    結合した亜硫酸水素塩で変換されたDNAを洗浄し;
    洗浄された亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出し;
    亜硫酸水素塩変換されたDNAを脱スルホン化する
    工程を更に含む、請求項21に記載の方法。
  23. 前記第2のカートリッジが、脱スルホン化前に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、請求項22に記載の方法。
  24. 前記第2のカートリッジが、脱スルホン化後又はその最中に、亜硫酸水素塩で変換されたDNAを前記第2のマトリックス材料から溶出するよう操作される、請求項22に記載の方法。
  25. 前記第2のカートリッジを操作して、前記変換された核酸上でメチル化特異的PCR及び/又は核酸配列決定、及び/又は高分解能融解解析(HRM)を行い、前記核酸のメチル化を決定する工程を含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 対象において癌又は癌の素因を検出する方法であって:
    前記対象由来の生物学的試料を用意する工程であって、前記生物学的試料はDNAを含む、工程;
    請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットを利用する工程を含み、カートリッジの前記セットの前記第1のカートリッジを使用して、前記DNAの亜硫酸水素塩変換が行われ;カートリッジの前記セットの前記第2のカートリッジを使用して、変換されたDNAが脱スルホン化され、メチル化状態が癌についてのマーカーである前記DNAにおける1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化が検出され、前記1つ又は複数の遺伝子プロモーターのメチル化における増大が、癌若しくは癌の素因の存在又は癌若しくは前癌の段階の指標である、方法。
  27. DNAメチル化を決定するためのキットであって、
    請求項1から19のいずれか一項に記載のカートリッジのセットの第1のカートリッジ及び/又は第2のカートリッジを含有する容器を含むキット。
  28. 前記カートリッジ又はカートリッジと離れた容器において変換試薬を含む、請求項27に記載のキット。
  29. カートリッジと離れた容器において前記変換試薬を含む、請求項28に記載のキット。
  30. カートリッジのチャンバーにおいて提供される前記変換試薬を含む、請求項28に記載のキット。
  31. 前記変換試薬が、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素カリウム、亜硫酸水素セシウム、亜硫酸水素アンモニウム、及びDABSOからなる群から選択される化合物を含む、請求項28から30のいずれか一項に記載のキット。
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