JP2020503841A - 非細胞傷害性改変細胞およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/406,005号の優先権を主張するものであり、上記出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる.
本発明は細胞療法の分野に関する。
a.疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
b.少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができず、標的受容体が疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを細胞に発現させることと、
c.対象にキメラ膜貫通ポリペプチドを発現する細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している対象を治療する、方法が提供される。
本発明は、標的細胞上の受容体の活性を調節することにより疾患を治療するための組成物および方法を提供する。本発明は、免疫系の細胞が体内に移動し器官内の特定のニッチに集積する能力を利用するものである。このような免疫細胞は、その膜に発現し係留される目的分子の送達プラットフォームとして使用される。係留される治療用分子は、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない細胞内ドメインを含むキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞外ドメイン内にある。このようにして、治療用分子がその標的受容体にとどまることによって標的受容体が調節される(例えば、活性化または不活性化される)が、免疫細胞自体は活性化されない。
a.免疫細胞を準備することと、
b.少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができず、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記免疫細胞に発現させることと、
c.前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記免疫細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法が提供される。
a.前記疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
b.少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインが不活性であり、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記細胞に発現させることと、
c.前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記細胞を投与することと
を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法が提供される。
また別の態様により、少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、細胞内ドメインが免疫細胞活性化シグナルを伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞が提供される。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインはいかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは不活性である。いくつかの実施形態では、標的細胞を本発明の改変細胞と接触させることにより本発明の方法を実施する。いくつかの実施形態では、必要とする対象に本発明の改変細胞を投与することにより本発明の方法を実施する。
いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは標的受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは抗体の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは2つ以上の標的受容体結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは2つ以上の標的受容体と結合し得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、標的受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストを2つ以上含み得る。いくつかの実施形態では、標的受容体結合ドメインは、免疫グロブリン可変重鎖ドメイン(VH)と免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン(VL)とを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは2つ以上の抗体抗原結合ドメインを含む。本発明の方法は標的受容体を調節するためのものであるため、単に標的受容体とは結合するが、受容体を活性化することも阻害することもない細胞外ドメインは本発明の実施形態ではないことが理解されよう。さらに、単に改変細胞を標的細胞に標的化するために使用する標的受容体結合ドメインも標的受容体のシグナル伝達を調節するとは考えられず、これも本発明の実施形態ではない。
膜貫通ドメインは当該技術分野で周知であり、一般に疎水性残基を含むものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然のタンパク質に由来する既知の膜貫通ドメインである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはマウス膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインはヒト膜貫通タンパク質に由来する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは合成膜貫通ドメインである。本発明の方法および組成物は、本発明のキメラポリペプチドを細胞膜内に係留し、細胞外領域に標的受容体結合ドメインがあり、細胞内領域が免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない、任意の膜貫通ドメインを用いて実施し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、免疫細胞活性化シグナルを伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、改変細胞が標的細胞に害を及ぼす結果となるいかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは、いかなるシグナルも伝達することができない。いくつかの実施形態では、本発明のキメラ膜貫通ポリペプチドの細胞内ドメインは不活性である。本明細書で使用される「不活性な」という用語は、タンパク質領域が決してシグナル伝達に影響を及ぼすことができないことを指す。不活性なタンパク質ドメインはシグナルを伝達することができないのみならず、シグナルを制御することも調節することもできない。不活性な細胞質ドメイン依然として、タンパク質が膜内で移動する能力に影響を及ぼし得るか、または膜内でのタンパク質の発現もしくは配向に影響を及ぼし得る。
いくつかの実施形態では、標的受容体は、成長ホルモン受容体(GHR)、グルカゴン様ペプチド1受容体(GLP1R)、チロシン受容体キナーゼB/トロポミオシン受容体キナーゼB(TrkB)およびプログラム細胞死タンパク質1(PD−1)から選択される。
また別の態様により、本発明のいずれかの改変細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または補助剤とを含む、医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本発明の改変細胞を含む。
いくつかの実施形態では、準備することは、対象から初代細胞を抽出することを含む。いくつかの実施形態では、対象から初代細胞を抽出することは、血液試料または血清試料を採取することを含む。いくつかの実施形態では、対象から初代細胞を抽出することは、リンパ試料を採取することを含む。いくつかの実施形態では、初代細胞は、キットを用いた単離である。このようなキットは当該技術分野では一般的なものであり、特に限定されないが、Miltenyi細胞単離および細胞分離キット、CD4+磁気ビーズキット、CD8+磁気ビーズキットなどがこれに含まれる。いくつかの実施形態では、抗体コンジュゲートカラムを用いて初代細胞を単離する。いくつかの実施形態では、FACS分取を用いて初代細胞を単離する。細胞分取には、標的細胞を同定する任意の適切なFACS抗体を使用し得る。
本明細書で用いる命名法および本発明に用いる実験法には一般に、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えDNA技術が含まれる。このような技術は文献で十分に説明されている。例えば、「Molecular Cloning:A laboratory Manual」,Sambrookら(1989);「Current Protocols in Molecular Biology」第I〜III巻,Ausubel,R.M.編(1994);Ausubelら,「Current Protocols in Molecular Biology」,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning」,John Wiley & Sons,New York(1988);Watsonら,「Recombinant DNA」,Scientific American Books,New York;Birrenら(編)「Genome Analysis:A Laboratory Manual Series」,第1〜4巻,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York(1998);米国特許第4,666,828号;同第4,683,202号;同第4,801,531号;同第5,192,659号および同第5,272,057号に記載されている方法論;「Cell Biology:A Laboratory Handbook」,第I〜III巻,Cellis,J.E.編(1994);Freshney著「Culture of Animal Cells−A Manual of Basic Technique」,Wiley−Liss,N.Y.(1994),第3版;「Current Protocols in Immunology」第I〜III巻,Coligan J.E.編(1994);Stitesら(編),「Basic and Clinical Immunology」(第8版),Appleton & Lange,Norwalk,CT(1994);MishellおよびShiigi(編),「Strategies for Protein Purification and Characterization−A Laboratory Course Manual」CSHL Press(1996)(上記のいずれも参照により組み込まれる)を参照されたい。その他の一般的な参考文献については、本明細書全体を通じて記載されている。
キメラ膜貫通タンパク質のクローニングおよびBW5147細胞のレトロウイルス形質導入
抗TrkBには、リーダーペプチド−VL−リンカー−VH−ヒンジ−TM細胞質内部分−GFP(TrkB−GFP−WT)およびVL−リンカー−VH−ヒンジ−変異TM細胞質内部分−GFP(TrkB−GFP−Mut)およびVL−リンカー−VH−Myc−ヒンジ−TM細胞質内部分(TrkB−Myc−WT)およびVL−リンカー−VH−Myc−ヒンジ−変異TM細胞質内部分(TrkB−Myc−Mut)を含むキメラ膜貫通(TM)タンパク質配列を合成した。GLP1RおよびPD−1には、リーダーペプチド−VL−リンカー−VH−MYC+ヒンジ−TM−細胞質内部分を含むキメラ膜貫通タンパク質配列を2種類合成した。
TrkB−Myc−WT:
DVVMTQLPLSLPVILGDQASISCRSSQSLIHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIKRAGGSSRSSSSGGGGSGGGGQVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPRDGSIKFNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMELHSLTSEDSAAYFCARRGRLLLYGFAYWGQGTLVTVSAXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR(配列番号17)。
TrkB−Myc−Mut:
DVVMTQLPLSLPVILGDQASISCRSSQSLIHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIKRAGGSSRSSSSGGGGSGGGGQVQLQQSGPELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYDINWVKQRPGQGLEWIGWIYPRDGSIKFNEKFKGKATLTVDTSSSTAYMELHSLTSEDSAAYFCARRGRLLLYGFAYWGQGTLVTVSAXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR(配列番号18)。
TrkB−GFP−WT:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTHVPYTFGGGTKLEIKRAGGSSRSSSSGGGGSGGGGQVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGTIDPETAGTAYNNQKFKGKAILTAGKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTGVTTWFAYWGQGTLVTVSAXXALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPREGRGSLLTCGDVEENPGPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(配列番号19)。
TrkB−GFP−Mut:
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPNLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQGTHVPYTFGGGTKLEIKRAGGSSRSSSSGGGGSGGGGQVQLQQSGAELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYEMHWVKQTPVHGLEWIGTIDPETAGTAYNNQKFKGKAILTAGKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCTGVTTWFAYWGQGTLVTVSAXXALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPREGRGSLLTCGDVEENPGPMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK(配列番号20).
GLP1R−Myc−WT:
IVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSSXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR(配列番号21)。
GLP1R−Myc−Mut:
IVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSRVTYMHWYQQRSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWGNNPQYTFGGGTRLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLSHIWWDDVKRYNPALKSRLTISRDTSYSQVFLRIASVDTADTATYYCARILDGTGPMDYWGQGTSVTVSSXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR(配列番号22)。
PD−1−Myc−WT:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGSSRSSSSGGGGSGGGGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR(配列番号27)
PD−1−Myc−Mut:
QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGGSSRSSSSGGGGSGGGGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR(配列番号28)。
EGSADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR(配列番号23)。
GHR−Myc−MuT:
EGSADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFXXEQKLISEEDLALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR(配列番号24)。上記のいずれの配列も、XXは任意のアミノ酸であっても、いずれのアミノ酸でなくてもよい。XXは、タンパク質をコードする核酸配列内の制限酵素部位によるものである。使用した実際のタンパク質では、XXがバリン−アスパラギン酸であった。
T2A−GFPを有するpMP71−PRE発現ベクターにマウスTrkB cDNA(Sino Biological社)をクローニングした。10cmのプレートでパッケージング細胞系Platinum−E(Cellbiolabs社)にプラスミドDNA 20μgおよびPolyJet(商標)(SignaGen社)60μLをトランスフェクトした。16時間後、培地をDMEM完全培地10mlと交換した。24時間後および48時間後、レトロウイルス上清を収集し、0.45μmのフィルターでろ過した。簡潔に述べれば、ヒト胎児腎(HEK293T)細胞、RAW5147細胞および3T3細胞を24ウェルプレート(NUNC社)に播種した。翌日、細胞をウイルス上清および4μg/mLの硫酸プロタミン(Sigma−Aldrich社)とともにインキュベートした。分取(FACS Aria細胞分取器(BD biosciences社、サンノゼ、カリフォルニア州、米国))から48〜72時間後、形質導入されたT細胞を染色し解析した。
細胞ベースの結合アッセイでは、TrkB受容体を発現するRaw264.7細胞をDMEMベースの培地(10%FBS、PSN)に入れ12ウェルプレート(Nunc社)に播種した。集密度85〜95%に達した後、細胞を2回洗浄し、0.2%FBSを含むDMEMメイダ(meida)を4時間加えた。次いで、細胞を洗浄し、FBSを含まないDMEMで1時間インキュベートした後、ニューロトロフィンまたはBW5147細胞を加えた。その後、TrkB発現Raw264.7細胞をBDNF(50ng/ml)およびキメラ受容体を有するBW5147細胞とともに30分間および1時間インキュベートした。共培養した細胞を回収し、ウエスタンブロット解析用に処理した。
プロテアーゼ阻害剤(Sigma社)およびホスファターゼ阻害剤(Sigma社)を含有するRIPA緩衝液(50mMトリス−Cl、pH8.0、150mM NaCl、1%Triton、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム)中で細胞を溶解させた。溶解物30〜50μgを12%トリス−グリシンSDS−PAGEゲル上で分離し、次いでPVDFまたはニトロセルロース膜に写した。膜をpTrkB(Tyr706/707)、Cell Signaling社の全長型TrkB(TrkB(80E3))およびアクチンに対する抗体とともにインキュベートした。WesternBright Quantum(Advansta社)をシグナルの可視化に用いた。バイオイメージング解析装置(Fusion−FX;Vilber社、フランス)を用いて画像を取得し、ImageJプログラムを用いて解析した。リン酸化TrkBのウエスタンブロットの定量化。デンシトメトリー(ImageJ)を用いてウエスタンブロットのバンドの総合密度の値を求め、データをアクチンおよび全長型TrkBに正規化した。
TrkB受容体を発現するRaw264.7細胞とRaw264.7細胞をDMEMベースの培地(10%FBS、PSN)に入れ96ウェルプレート(Nunc社)に播種した。集密度85〜95%に達した後、細胞を2回洗浄し、0.2%FBSを含むDMEMメイダ(meida)100ulを4時間加えた。4時間後、FBSを含まないDMEM培地100ulにBW5147細胞を入れウェルに一晩加えた。16時間後、上清を収集し、サンドイッチELISA法(BioLegend社)で製造業者の指示通りにIL−2に関して解析した。試料を3連で解析した。
統計解析はいずれもGraphPad Prism version 5.02 for Windows(GraphPad Software社、サンディエゴ、カリフォルニア州)で実施した。図の説明文に示されるように、変数をいずれも平均値6SEMまたはSDで表す。p値を一元配置ANOVA検定で算出した。
TRAMMICS発現細胞が標的細胞上のチロシン受容体キナーゼB(TrkB)受容体のリン酸化を誘導することができるかどうかを試験するため、以下の実験を実施した。TrkBを安定に発現するRAW264.7細胞を作製した。このRAW−TrkB細胞を未形質転換BW5147、変異型(Mut)ゼータ鎖を有するBW−αTrkB−GFP(配列番号20)およびBW−αTrkB−Myc−Mut(配列番号18)と30分間および60分間インキュベートした。この実験の結果を図1A〜1Bに示す。図1Aでは、145kDaの位置にTrkBのチロシン706のリン酸化に対応するタンパク質バンドがみられ、図1Bはこれを定量化したものである。未改変BW5147細胞(図1B、番号5)との共培養と比較すると、30分間の共培養後のRAW−TrkB細胞のリン酸化TrkB(pTrkB)のレベルがBW−αTrkB−GFP−Mut細胞(図1B、番号6)との共培養では増大し、BW−αTrkB−Myc−Mut細胞(図1B、番号7)との共培養ではそれより大幅に増大していた。1時間の共培養後、BWαTrkB−GFP−Mut細胞(図1B、番号9)およびBWαTrkB−Myc−Mut細胞(図1B、番号10)ともに、RAW−TrkB細胞でのpTrkB誘導がみられた。基準として総TrkB受容体発現レベルおよびアクチン負荷対照の発現レベルを用いた。
次に、野生型または変異型ITAM領域を有するキメラ受容体を発現するBW細胞にIL−2の分泌を誘導することができるかどうかを検討した。TrkB受容体を発現するRaw264.7細胞およびWT Raw264.7細胞を96ウェルプレートのDMEMベースの培地(10%FBS、PSN)に播種した。集密度85〜95%に達した後、細胞を2回洗浄し、0.2%FBSを含むDMEM培地100ulを4時間加えた。4時間後、FBSを含まないDMEM培地100ulにBW5147細胞を入れウェルに加えて一晩インキュベートした。16時間後、共培養した細胞から上清を収集し、サンドイッチELISA法により製造業者の指示通りにIL−2に関して解析した。試料を3連で解析した。
T細胞上でのキメラ受容体の膜関連発現を評価するため、マウスT細胞系BW5147.3(ATCC(登録商標)TIB−47)または初代マウスTヘルパー細胞を用いた。細胞に6種類の異なるキメラ受容体をコードする組換えレトロウイルスベクターを形質導入した。形質導入から48〜72時間後、Myc発現(Mycタグがキメラ受容体の一部である場合)またはGFP発現(GFPがキメラ受容体の一部である場合)の染色を用いて、細胞を受容体陽性細胞に関して分取した(図3A〜3G)。いずれの場合も表面での明らかなキメラ受容体の高発現が観察された。具体的には、αTrkB−Myc−WT(図3A、配列番号17)、αTrkB−Myc−Mut(図3B、配列番号18)、αGLP1R−Myc−WT(図3E、配列番号21)、αGLP1R−Myc−Mut(図3F、配列番号22)、αTrkB−GFP−WT(図3C、配列番号19)およびαTrkB−GFP−Mut(図3D、配列番号20)がBW細胞の表面に高発現した。さらに、αGLP1R−Myc−Mut(図3G、配列番号22)も形質導入マウスTヘルパー細胞の表面に高発現することがわかった。
プラスチック結合抗Myc抗体によりMyc含有キメラタンパク質を発現するT細胞を活性化させてIL−2を分泌させることができるかどうかを試験するため、以下の実験を実施した。6種類の異なるMyc含有構築物、すなわち、実施例3で言及した4種類のMyc含有構築物およびαGH−Myc−WT(配列番号23)、αGH−Myc−Mut(配列番号24)をBW細胞に発現させた。得られた6種類の細胞系を、漸増量(コーティング溶液中2500〜4.8ng/ml)のプラスチックと結合した市販の抗Myc Abと16〜18時間インキュベートした(50000個/96プレートウェル)。抗CD16(コーティング溶液中2500ng/ml)を抗Mycに対する陰性対照として用いた。一晩インキュベートした後、市販のELISAキットにより上清中のmIL−2レベルを求めた。
次に、GLP1Rを発現する細胞(CHO−GLP1R、カタログ番号MOO451、GenScript社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国)がキメラ抗GLP1R受容体を発現するT細胞を活性化させてIL−2を分泌させることができるかどうかを検討した。図5に、αGLP1R−Myc−WTまたはαGLP1R−Myc−Mutを発現するT細胞、キメラ受容体(BW5147)のないT細胞およびT細胞を加えていないCHO−GLP1R(PBS)を示す。対照として、T細胞の代わりにGLP1Rアゴニストのエキセンジン4(Exn4)も加えた。最初に、市販のGLP1R発現CHO細胞を予め播種し、24時間付着させた。T細胞または対照と18時間インキュベートした後、上清を回収し、市販のELISAキットによりマウスIL−2のレベルを求めた。
αGLP1R−Myc−Mutを発現するBW細胞自体は活性化することができないことが明らかになったため、同細胞がGLP1Rを発現する細胞を活性化させてmTNFαを分泌させることができるかどうか検討した。RAW264.7細胞(RAW264.7 ATCC(登録商標)TIB−71(商標))は、生来的にマウスGLP1Rを発現するマウスマクロファージ/単球細胞系である。GLP1Rが活性化すると、このRAW細胞によるTNFα分泌が誘導されることがわかっている。WT BW細胞、キメラ抗GLP1R受容体を発現するBW細胞またはGLP1RアゴニストのExn4と共インキュベートした後、Raw細胞の上清を回収し、市販のELISAキットにより上清中のマウスTNFαレベルを求めた(図6)。
PD1陽性NK細胞と、抗PD1 SCAAB(配列番号28)を発現する免疫細胞とをインキュベートする。次に、PD−1L陽性腫瘍細胞を加え、NK活性化を測定する。あるいは、抗原媒介性T細胞活性化アッセイを用いてNK細胞活性化をアッセイする。
Claims (73)
- 標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する方法であって、前記標的細胞を、少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがシグナルを伝達しないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と接触させることを含み、前記改変細胞がリガンドとしての役割を果たし、それにより標的細胞の標的受容体によるシグナル伝達を調節する、方法。
- 疾患または障害に罹患している対象を治療する方法であって、
a.前記疾患または障害の部位にホーミングすることができる細胞を準備することと、
b.少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができず、前記標的受容体が前記疾患または障害に関連するものである、キメラ膜貫通ポリペプチドを前記細胞に発現させることと、
c.前記対象に前記キメラ膜貫通ポリペプチドを発現する前記細胞を投与することと を含み、
それにより疾患または障害に罹患している前記対象を治療する、方法。 - 標的細胞による前記シグナル伝達が、前記標的細胞内でのシグナル伝達カスケードを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記調節することが、誘導すること、または阻害することを含む、請求項1または3に記載の方法。
- 前記シグナル伝達を誘導することが、前記標的受容体のシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記シグナル伝達を誘導することが、前記標的受容体の下流標的のレベルの上方制御を含む、請求項4または5に記載の方法。
- 前記シグナル伝達を阻害することが、前記標的受容体の下流標的のレベルの下方制御を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、異なるタンパク質に由来する細胞外ドメインと細胞内ドメインとを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞外ドメインが、前記標的受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的受容体結合ドメインが、免疫グロブリン可変重鎖ドメイン(VH)と免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン(VL)とを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記VHとVLがペプチドリンカーによって連結している、請求項10に記載の方法。
- 前記リンカーが、アミノ酸配列GGSSRSSSSGGGGSGGGG(配列番号4)またはGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号5)を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記膜貫通ドメインが1回膜貫通ドメインである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記膜貫通ドメインがCD3膜貫通ドメインを含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CD3膜貫通ドメインが配列LCYLLDGILFIYGVIITALYL(配列番号29)を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、細胞外膜近位ドメインヒンジ領域をさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ヒンジ領域がCD−8ヒンジ領域を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記CD−8ヒンジ領域が、アミノ酸配列ALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLD(配列番号7)を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記シグナルが、前記細胞内ドメインのシグナル伝達ドメイン内の残基のリン酸化を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、免疫細胞のエフェクター機能の活性化を誘導する、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記シグナルが、前記改変細胞からの少なくとも1つのサイトカインの分泌を誘導する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのサイトカインがインターロイキン2(IL−2)である、請求項21に記載の方法。
- 前記シグナルがZAP−70キナーゼの活性化を誘導する、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、前記改変細胞の表面での検出可能な前記キメラ膜貫通ポリペプチドの発現を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変細胞の表面での前記キメラ膜貫通ポリペプチドの検出がFACSを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、前記改変免疫細胞の膜内での前記キメラ膜貫通ポリペプチドの移動を可能にするのに十分な長さおよび電荷の人工アミノ酸配列を含む、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、CD3、CD28、OX−40 CD80、CD86およびT細胞受容体(TCR)以外の任意の膜貫通タンパク質の細胞内ドメインを含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、活性化シグナルを伝達することができないよう変異したCD3ゼータ鎖を含む、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記CD3ゼータ鎖が、アミノ酸配列RAKFSRSAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR(配列番号30)を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記CD3ゼータ鎖の少なくとも1つのチロシンが変異しており、前記変異が、前記細胞内ドメインが活性化シグナルを伝達することができないようにするものである、請求項28または29に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのチロシンがフェニルアラニンに変異している、請求項30に記載の方法。
- 前記CD3ゼータ鎖の全チロシンが変異している、請求項28〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 全チロシンがフェニルアラニンに変異している、請求項32に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、アミノ酸配列RAKFSRSAETAANLQDPNQLFNELNLGRREEFDVLEKKRARDPEMGGKQQRRRNPQEGVFNALQKDKMAEAFSEIGTKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQTLAPR(配列番号31)を含む、請求項28〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが、前記改変細胞が前記標的細胞に対して有害となるいかなるシグナルも伝達することができない、請求項1〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞内ドメインが不活性である、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドがタグをさらに含む、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タグがGFPタグおよびMycタグから選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記標的受容体が疾患または障害に関連するものである、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的受容体が、GHR、GLP1R、TrkBおよびPD−1から選択される、請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的受容体がTrkBであり、前記抗TrkB抗原結合ドメインが、配列番号10、配列番号11、配列番号12または配列番号13のいずれか1つで記載される配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号18または配列番号20で記載されるアミノ酸配列を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記標的受容体がGLP1Rであり、前記抗GLP1R抗原結合ドメインが、配列番号14または配列番号15のいずれか1つで記載される配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号22で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項43に記載の方法。
- 前記標的受容体がGHRであり、前記標的受容体結合ドメインが成長ホルモン(GH)を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記GHが、配列番号16で記載される配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項45に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号24で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項46に記載の方法。
- 前記標的受容体がPD−1であり、前記抗PD−1抗原結合ドメインが、配列番号25または配列番号26で記載される配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号28で記載されるアミノ酸配列を有する、請求項48に記載の方法。
- 前記キメラ膜貫通ポリペプチドが、配列番号18、20、22、24および28のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性を有し、シグナルを伝達することができない、請求項1〜49のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変細胞または準備する細胞が免疫細胞である、請求項1〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、骨髄性細胞、マクロファージ、単球、好中球、抗原提示細胞および樹状細胞から選択される、請求項51に記載の方法。
- 前記改変細胞または準備する細胞が、ヒトドナー由来の初代ヒト細胞に由来するものであり、前記改変初代ヒト細胞が、ヒトの治療に使用するのに適している、請求項1〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的細胞が培養されているものである、請求項1〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的細胞が対象内に存在するものである、請求項1〜53のいずれか1項に記載の方法。
- 前記準備する細胞が前記対象に対して自家性である、請求項2〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記準備する細胞が前記対象に対して異種性である、請求項2〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 前記準備することが、前記対象から初代細胞を抽出することを含む、請求項2〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の細胞上の前記標的受容体の活性化によって前記疾患または障害を治療し、前記細胞外受容体結合ドメインが前記標的受容体のアゴニストを含む、請求項2〜58のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象の細胞上の前記受容体の阻害によって前記疾患または障害を治療し、前記細胞外受容体結合ドメインが前記標的受容体のアンタゴニストを含む、請求項2〜59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的受容体がTrkBであり、前記疾患または障害が神経疾患または神経障害である、請求項2〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記神経疾患または神経障害が、アルツハイマー病、うつ病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、癲癇および脳腫瘍から選択される、請求項61に記載の方法。
- 前記標的受容体がGLP1Rであり、前記疾患または障害が、代謝疾患もしくは代謝障害または心血管疾患もしくは心血管障害である、請求項2〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記代謝疾患または代謝障害が、糖尿病、肥満、糖原病、パーキンソン病およびミトコンドリア性ミオパチーから選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記心血管疾患または心血管障害が、脳卒中、心筋梗塞、心虚血および冠動脈疾患から選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記標的受容体がGHRであり、前記疾患または障害が成長疾患または成長障害である、請求項2〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記成長疾患または成長障害が、先端巨大症、成長ホルモン分泌不全症、癌、ターナー症候群およびプラダー・ウィリー症候群から選択される、請求項66に記載の方法。
- 前記標的受容体がPD−1であり、前記疾患または障害が、免疫疾患もしくは免疫障害または癌である、請求項2〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記免疫疾患または免疫障害が、狼瘡、関節リウマチ、乾癬、グレーブス病、免疫介在性炎症およびセリアック病から選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記疾患または障害が癌であり、前記標的受容体結合ドメインがPD−1アンタゴニストを含む、請求項68に記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞外標的受容体結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含み、前記細胞内ドメインがいかなるシグナルも伝達することができないキメラ膜貫通ポリペプチドを含む、改変細胞と、薬学的に許容される担体、賦形剤または補助剤とを含む、医薬組成物。
- 前記標的受容体に関連する疾患または障害の治療に使用する、請求項71に記載の医薬組成物。
- 前記組成物が少なくとも100万個の改変細胞を含む、請求項71または72に記載の医薬組成物。
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