JP2020501612A5 - - Google Patents
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[00183]本発明の好ましい実施形態は、本明細書において示され、説明されているが、
このような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換は、ここでは、当業者に、本発明から逸脱することなく、想到される。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
国際出願時の特許請求の範囲
[項1] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項2] 1つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項1に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項3] 1つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項1または2に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項4] 表4からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項5] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、DNA結合およびオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにおいて1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、アミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項6] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、表1からの1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項7] 配列番号1と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項8] 配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸が、配列番号1に従って番号付けした場合、D223、D289、またはE589に近接して位置する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項9] 近接が、約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項7または8に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項10] 近接が、約70〜80アミノ酸の距離である、請求項7または8に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項11] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列が、全長の配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項12] 表2からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項13] 表3からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項14] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項15] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換K573EおよびE578Lを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項16] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452Kを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項17] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358Kを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項18] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V297Kを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項19] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換N85Sを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項20] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項21] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項22] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573EおよびE578Lを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項23] 転位効率が、突然変異型TcBusterトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するTcBusterトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項24] TcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、TcBusterトランスポザーゼ配列が全長の配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有する融合トランスポザーゼ。
[項25] DNA配列特異的結合ドメインが、TALEドメイン、ジンクフィンガードメイン、AAV Rep DNA結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項24に記載の融合トランスポザーゼ。
[項26] DNA配列特異的結合ドメインがTALEドメインを含む、請求項24または25に記載の融合トランスポザーゼ。
[項27] TcBusterトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する、請求項24〜26のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項28] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜27のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項29] 1つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項28に記載の融合トランスポザーゼ。
[項30] 1つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンでの置換を含む、請求項28または29に記載の融合トランスポザーゼ。
[項31] TcBusterトランスポザーゼ配列が、DNA結合およびオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜30のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項32] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表1からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜31のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項33] TcBusterトランスポザーゼ配列が、アミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する、請求項24〜32のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項34] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜33のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項35] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸置換が、配列番号1に従って番号付けした場合、D223、D289、またはE589に近接して位置する、請求項24〜34のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項36] 近接が、約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項34または35に記載の融合トランスポザーゼ。
[項37] 近接が、約70〜80アミノ酸の距離である、請求項34または35に記載の融合トランスポザーゼ。
[項38] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表2からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜37のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項39] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表3からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜38のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項40] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜39のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項41] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換K573EおよびE578Lを含む、請求項24〜40のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項42] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452Kを含む、請求項24〜41のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項43] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358Kを含む、請求項24〜42のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項44] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V297Kを含む、請求項24〜43のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項45] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換N85Sを含む、請求項24〜44のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項46] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜45のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項47] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜46のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項48] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573EおよびE578Lを含む、請求項24〜47のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項49] TcBusterトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号1に対して100%の同一性を有する、請求項24〜27のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項50] TcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項24〜48のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項51] リンカーが、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、または少なくとも50個のアミノ酸を含む、請求項50に記載の融合トランスポザーゼ。
[項52] リンカーが配列番号9を含む、請求項50または51に記載の融合トランスポザーゼ。
[項53] 請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項54] 請求項24〜49のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項55] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項53または54に記載のポリヌクレオチド。
[項56] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項57] mRNAが化学的に修飾されている、請求項56に記載のポリヌクレオチド。
[項58] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項53〜57のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項59] DNAベクター中に存在する、請求項53〜58のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項60] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
[項61] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
[項62] 請求項53〜60のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
[項63] 請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項64] 請求項24〜49のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項65] 導入する工程が、細胞を、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項63または64に記載の方法。
[項66] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項65に記載の方法。
[項67] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項65に記載の方法。
[項68] mRNAが化学的に修飾されている、請求項67に記載の方法。
[項69] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンを含有するDNAベクターと接触させることを含む、請求項63〜68のいずれか一項に記載の方法。
[項70] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項69に記載の方法。
[項71] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させることを含む、請求項65〜70のいずれか一項に記載の方法。
[項72] 導入する工程が、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させることを含む、請求項63〜71のいずれか一項に記載の方法。
[項73] トランスポゾンが、2つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項63〜72のいずれか一項に記載の方法。
[項74] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73に記載の方法。
[項75] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号3を含む、請求項73に記載の方法。
[項76] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
[項77] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号4を含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
[項78] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73に記載の方法。
[項79] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号5を含む、請求項73に記載の方法。
[項80] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73、78、または79に記載の方法。
[項81] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号6を含む、請求項73、78、または79に記載の方法。
[項82] カーゴカセットが、CMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、およびCumateからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
[項83] カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
[項84] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[項85] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[項86] 導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項63〜85のいずれか一項に記載の方法。
[項87] 導入する工程が、細胞をエレクトロポレートするステップを含む、請求項63〜86のいずれか一項に記載の方法。
[項88] 細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項63〜87のいずれか一項に記載の方法。
[項89] 対象がヒトである、請求項88に記載の方法。
[項90] 対象が疾患を有する患者である、請求項88または89に記載の方法。
[項91] 対象が癌または腫瘍と診断されている、請求項88〜90のいずれか一項に記載の方法。
[項92] 細胞が対象の血液から単離される、請求項88〜91のいずれか一項に記載の方法。
[項93] 細胞が初代免疫細胞を含む、請求項63〜92のいずれか一項に記載の方法。
[項94] 細胞が初代白血球を含む、請求項63〜93のいずれか一項に記載の方法。
[項95]
細胞が初代T細胞を含む、請求項63〜94のいずれか一項に記載の方法。
[項96] 初代T細胞が、ガンマデルタT細胞、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、エフェクターT細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項95に記載の方法。
[項97] 初代免疫細胞がCD3+細胞を含む、請求項93〜96のいずれか一項に記載の方法。
[項98] 細胞が幹細胞を含む、請求項63〜97のいずれか一項に記載の方法。
[項99] 幹細胞が、以下の細胞からなる群から選択される、請求項98に記載の方法:
胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項100] 幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項98に記載の方法。
[項101] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
[項102] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項101に記載の方法:
細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項103] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項101または102に記載の方法:
T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせ。
[項104] (a)トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する請求項1〜47のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成すること;ならびに
(b)遺伝子修飾された細胞を、治療を必要とする患者に投与すること
を含む治療の方法。
[項105] 遺伝子修飾された細胞が、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項104に記載の方法。
[項106] 患者が癌または腫瘍と診断されている、請求項104または105に記載の方法。
[項107] 投与するステップが、遺伝子修飾された細胞を患者の血管内に輸注するステップを含む、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
[項108] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項109] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項110] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項109に記載のシステム。
[項111] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項109または110に記載のシステム。
[項112] mRNAが化学的に修飾されている、請求項111に記載のシステム。
[項113] トランスポゾンがDNAベクター中に存在する、請求項108〜112のいずれか一項に記載のシステム。
[項114] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項113に記載のシステム。
[項115] ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンが同じプラスミド中に存在する、請求項109〜114のいずれか一項に記載のシステム。
[項116] トランスポゾンが、2つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項108〜115のいずれか一項に記載のシステム。
[項117] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも約98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116に記載のシステム。
[項118] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号3を含む、請求項116に記載のシステム。
[項119] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116〜118のいずれか一項に記載のシステム。
[項120] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号4を含む、請求項116〜118のいずれか一項に記載のシステム。
[項121] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはと少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116に記載のシステム。
[項122] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号5を含む、請求項116に記載のシステム。
[項123] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116、121、または122に記載のシステム。
[項124] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号6を含む、請求項116、121、または122に記載のシステム。
[項125] カーゴカセットが、CMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、およびCumateからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項116〜124のいずれか一項に記載のシステム。
[項126] カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項116〜116のいずれか一項に記載のシステム。
[項127] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項116〜126のいずれか一項に記載のシステム。
[項128] 導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項127に記載のシステム。
[項129] 導入遺伝子が、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項127または128に記載のシステム。
[項130] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項116〜129のいずれか一項に記載のシステム。
[項131] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項116〜129のいずれか一項に記載のシステム。
このような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換は、ここでは、当業者に、本発明から逸脱することなく、想到される。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
国際出願時の特許請求の範囲
[項1] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項2] 1つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項1に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項3] 1つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項1または2に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項4] 表4からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項5] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、DNA結合およびオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにおいて1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、アミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項6] 全長の配列番号1に対して少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を含み、表1からの1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項7] 配列番号1と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項8] 配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸が、配列番号1に従って番号付けした場合、D223、D289、またはE589に近接して位置する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項9] 近接が、約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項7または8に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項10] 近接が、約70〜80アミノ酸の距離である、請求項7または8に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項11] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼのアミノ酸配列が、全長の配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項12] 表2からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項13] 表3からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項14] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項15] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換K573EおよびE578Lを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項16] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452Kを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項17] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358Kを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項18] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V297Kを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項19] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換N85Sを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項20] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜19のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項21] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項22] 配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573EおよびE578Lを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項23] 転位効率が、突然変異型TcBusterトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するTcBusterトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
[項24] TcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、TcBusterトランスポザーゼ配列が全長の配列番号1に対して少なくとも70%の同一性を有する融合トランスポザーゼ。
[項25] DNA配列特異的結合ドメインが、TALEドメイン、ジンクフィンガードメイン、AAV Rep DNA結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項24に記載の融合トランスポザーゼ。
[項26] DNA配列特異的結合ドメインがTALEドメインを含む、請求項24または25に記載の融合トランスポザーゼ。
[項27] TcBusterトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号1に対して少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する、請求項24〜26のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項28] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜27のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項29] 1つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項28に記載の融合トランスポザーゼ。
[項30] 1つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンでの置換を含む、請求項28または29に記載の融合トランスポザーゼ。
[項31] TcBusterトランスポザーゼ配列が、DNA結合およびオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにおいて1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜30のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項32] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表1からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜31のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項33] TcBusterトランスポザーゼ配列が、アミノ酸配列の配列番号1を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する、請求項24〜32のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項34] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜33のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項35] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含み、1つ以上のアミノ酸置換が、配列番号1に従って番号付けした場合、D223、D289、またはE589に近接して位置する、請求項24〜34のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項36] 近接が、約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離である、請求項34または35に記載の融合トランスポザーゼ。
[項37] 近接が、約70〜80アミノ酸の距離である、請求項34または35に記載の融合トランスポザーゼ。
[項38] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表2からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜37のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項39] TcBusterトランスポザーゼ配列が、表3からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項24〜38のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項40] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜39のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項41] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換K573EおよびE578Lを含む、請求項24〜40のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項42] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452Kを含む、請求項24〜41のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項43] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358Kを含む、請求項24〜42のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項44] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V297Kを含む、請求項24〜43のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項45] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換N85Sを含む、請求項24〜44のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項46] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換I452F、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜45のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項47] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換A358K、V377T、E469K、およびD189Aを含む、請求項24〜46のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項48] TcBusterトランスポザーゼ配列が、配列番号1に従って番号付けした場合、アミノ酸置換V377T、E469K、D189A、K573EおよびE578Lを含む、請求項24〜47のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項49] TcBusterトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号1に対して100%の同一性を有する、請求項24〜27のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項50] TcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項24〜48のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項51] リンカーが、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、または少なくとも50個のアミノ酸を含む、請求項50に記載の融合トランスポザーゼ。
[項52] リンカーが配列番号9を含む、請求項50または51に記載の融合トランスポザーゼ。
[項53] 請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項54] 請求項24〜49のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項55] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項53または54に記載のポリヌクレオチド。
[項56] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項53〜55のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項57] mRNAが化学的に修飾されている、請求項56に記載のポリヌクレオチド。
[項58] 突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項53〜57のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項59] DNAベクター中に存在する、請求項53〜58のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項60] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項59に記載のポリヌクレオチド。
[項61] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
[項62] 請求項53〜60のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
[項63] 請求項1〜22のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項64] 請求項24〜49のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項65] 導入する工程が、細胞を、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項63または64に記載の方法。
[項66] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項65に記載の方法。
[項67] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項65に記載の方法。
[項68] mRNAが化学的に修飾されている、請求項67に記載の方法。
[項69] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンを含有するDNAベクターと接触させることを含む、請求項63〜68のいずれか一項に記載の方法。
[項70] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項69に記載の方法。
[項71] 導入する工程が、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させることを含む、請求項65〜70のいずれか一項に記載の方法。
[項72] 導入する工程が、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させることを含む、請求項63〜71のいずれか一項に記載の方法。
[項73] トランスポゾンが、2つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項63〜72のいずれか一項に記載の方法。
[項74] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73に記載の方法。
[項75] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号3を含む、請求項73に記載の方法。
[項76] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
[項77] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号4を含む、請求項73〜75のいずれか一項に記載の方法。
[項78] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73に記載の方法。
[項79] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号5を含む、請求項73に記載の方法。
[項80] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項73、78、または79に記載の方法。
[項81] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号6を含む、請求項73、78、または79に記載の方法。
[項82] カーゴカセットが、CMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、およびCumateからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項73〜81のいずれか一項に記載の方法。
[項83] カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項73〜82のいずれか一項に記載の方法。
[項84] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[項85] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項73〜83のいずれか一項に記載の方法。
[項86] 導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項63〜85のいずれか一項に記載の方法。
[項87] 導入する工程が、細胞をエレクトロポレートするステップを含む、請求項63〜86のいずれか一項に記載の方法。
[項88] 細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項63〜87のいずれか一項に記載の方法。
[項89] 対象がヒトである、請求項88に記載の方法。
[項90] 対象が疾患を有する患者である、請求項88または89に記載の方法。
[項91] 対象が癌または腫瘍と診断されている、請求項88〜90のいずれか一項に記載の方法。
[項92] 細胞が対象の血液から単離される、請求項88〜91のいずれか一項に記載の方法。
[項93] 細胞が初代免疫細胞を含む、請求項63〜92のいずれか一項に記載の方法。
[項94] 細胞が初代白血球を含む、請求項63〜93のいずれか一項に記載の方法。
[項95]
細胞が初代T細胞を含む、請求項63〜94のいずれか一項に記載の方法。
[項96] 初代T細胞が、ガンマデルタT細胞、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、エフェクターT細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項95に記載の方法。
[項97] 初代免疫細胞がCD3+細胞を含む、請求項93〜96のいずれか一項に記載の方法。
[項98] 細胞が幹細胞を含む、請求項63〜97のいずれか一項に記載の方法。
[項99] 幹細胞が、以下の細胞からなる群から選択される、請求項98に記載の方法:
胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項100] 幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項98に記載の方法。
[項101] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
[項102] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項101に記載の方法:
細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項103] 導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項101または102に記載の方法:
T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせ。
[項104] (a)トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する請求項1〜47のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成すること;ならびに
(b)遺伝子修飾された細胞を、治療を必要とする患者に投与すること
を含む治療の方法。
[項105] 遺伝子修飾された細胞が、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項104に記載の方法。
[項106] 患者が癌または腫瘍と診断されている、請求項104または105に記載の方法。
[項107] 投与するステップが、遺伝子修飾された細胞を患者の血管内に輸注するステップを含む、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
[項108] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項109] 請求項1〜49のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項110] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAを含む、請求項109に記載のシステム。
[項111] ポリヌクレオチドが、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーRNA(mRNA)を含む、請求項109または110に記載のシステム。
[項112] mRNAが化学的に修飾されている、請求項111に記載のシステム。
[項113] トランスポゾンがDNAベクター中に存在する、請求項108〜112のいずれか一項に記載のシステム。
[項114] DNAベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項113に記載のシステム。
[項115] ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンが同じプラスミド中に存在する、請求項109〜114のいずれか一項に記載のシステム。
[項116] トランスポゾンが、2つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項108〜115のいずれか一項に記載のシステム。
[項117] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも約98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116に記載のシステム。
[項118] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号3を含む、請求項116に記載のシステム。
[項119] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116〜118のいずれか一項に記載のシステム。
[項120] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号4を含む、請求項116〜118のいずれか一項に記載のシステム。
[項121] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはと少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116に記載のシステム。
[項122] 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号5を含む、請求項116に記載のシステム。
[項123] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の同一性を有する配列を含む、請求項116、121、または122に記載のシステム。
[項124] 2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号6を含む、請求項116、121、または122に記載のシステム。
[項125] カーゴカセットが、CMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、およびCumateからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項116〜124のいずれか一項に記載のシステム。
[項126] カーゴカセットがCMVプロモーターを含む、請求項116〜116のいずれか一項に記載のシステム。
[項127] カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項116〜126のいずれか一項に記載のシステム。
[項128] 導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項127に記載のシステム。
[項129] 導入遺伝子が、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項127または128に記載のシステム。
[項130] カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項116〜129のいずれか一項に記載のシステム。
[項131] カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項116〜129のいずれか一項に記載のシステム。
Claims (15)
- 全長の配列番号1に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1と比較して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、突然変異型TcBusterトランスポザーゼは、配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型TcBusterトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有し、
1つ以上のアミノ酸置換は、好ましくはリジンまたはアルギニンへの置換を含み、より好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含み、
転位効率は、好ましくは突然変異型TcBusterトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するTcBusterトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、
突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。 - 表4からの1つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項1に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- DNA結合およびオリゴマー化ドメイン;挿入ドメイン;Zn−BEDドメイン;またはそれらの組み合わせにおいて1つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。
- 表1、表2、および/または表3からの1つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型TcBusterトランスポザーゼであって、好ましくは、配列番号1に従って番号付けした場合、
? V377T、E469K、およびD189A;
? K573EおよびE578L;
? I452K;
? A358K;
? V297K;
? N85S;
? I452F、V377T、E469K、およびD189A;
? A358K、V377T、E469K、およびD189A; および
? V377T、E469K、D189A、K573E、およびE578L
から選択される1つ以上の置換または置換の組合せを含む、請求項1に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。 - 配列番号1と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性pHで正味電荷を増加させる1つ以上のアミノ酸置換を含み、
1つ以上のアミノ酸は、配列番号1に従って番号付けした場合、好ましくはD223、D289、またはE589に近接して位置し、
近接が、好ましくは約80、75、70、60、50、40、30、20、10、または5アミノ酸の距離であり、さらに好ましくは約70〜80アミノ酸の距離である、
請求項1〜4のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ。 - 請求項1〜5のいずれかに記載のTcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、DNA配列特異的結合ドメインは、好ましくは、TALEドメイン、ジンクフィンガードメイン、AAV Rep DNA結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み、さらに好ましくはTALEドメインを含む、融合トランスポザーゼ。
- TcBusterトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号1に対して100%の同一性を有する、請求項6に記載の融合トランスポザーゼ。
- TcBusterトランスポザーゼ配列およびDNA配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項6または請求項7に記載の融合トランスポザーゼであって、
リンカーは、好ましくは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、または少なくとも50個のアミノ酸を含み、リンカーは好ましくは配列番号9を含む、融合トランスポザーゼ。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼ、または請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
ポリヌクレオチドは、好ましくは、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするDNAまたはメッセンジャーRNA(mRNA)、好ましくは化学的に修飾されたmRNA、を含み、
ポリヌクレオチドは、好ましくは、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをさらにコードする、
ポリヌクレオチド。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼを産生する細胞であって、好ましくは、請求項9に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは請求項6〜8のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
- 請求項11に記載の方法であって、導入する工程が、細胞を、突然変異型TcBusterトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、好ましくはDNAまたはmRNA、好ましくは化学的に修飾されたmRNA、を含むポリヌクレオチド、と接触させることを含み、そして、好ましくは、細胞を、トランスポゾンを含有するDNAベクター、好ましくはミニサークルプラスミド、と接触させることを含み、
トランスポゾンは好ましくは2つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含み、好ましくは、
- 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、好ましくは、配列番号3に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%の同一性または配列番号3と100%の同一性を有する配列を含む;および/または、2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号4に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列を含む;または
- 2つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号5に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列を含む;および/または、2つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号6に対して少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%の同一性を有する配列を含む、方法。 - カーゴカセットが、CMV、EFS、MND、EF1α、CAGCs、PGK、UBC、U6、H1、およびCumateからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項11または12に記載の方法。
- 導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項11〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項11〜14のいずれか一項に記載の方法であって、細胞が、対象から単離された初代細胞、好ましくは対象の血液から単離された初代細胞であり、細胞は、好ましくは
− 幹細胞、好ましくは、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせから選択される幹細胞、または人工多能性幹細胞を含む;または
− 初代免疫細胞、好ましくは、初代白血球、初代T細胞、好ましくはガンマデルタT細胞、ヘルパーT細胞、メモリーT細胞、ナチュラルキラーT細胞、エフェクターT細胞、またはそれらの任意の組み合わせ、好ましくはCD3+細胞を含む、そして、
カーゴカセットを含むトランスポゾンは好ましくは導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、好ましくは、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする導入遺伝子であり、細胞受容体は、好ましくは、T細胞受容体(TCR)、B細胞受容体(BCR)、キメラ抗原受容体(CAR)、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される
方法。
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