JP2020174582A - 抗炎症活性を有するシソ科植物の葉の発酵物 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)シソ科植物の葉の糸状菌発酵物。
(2)シソ科植物がシソまたはバジルである(1)または(2)記載の発酵物。
(3)糸状菌がテンペ菌である(1)記載の発酵物。
(4)(1)〜(3)のいずれか記載の発酵物の抽出物。
(5)糸状菌を用いてシソ科植物の葉を発酵させることを含む、シソ科植物の葉の発酵物の製造方法。
(6)発酵物が抗炎症活性を有するものである(5)記載の方法。
(7)シソ科植物がシソまたはバジルである(5)または(6)記載の方法。
(8)糸状菌がテンペ菌である(5)〜(7)のいずれか記載の方法。
(9)(1)〜(3)のいずれか記載の発酵物または(4)記載の抽出物を含む食品組成物。
(10)炎症を抑制するために用いられる(9)記載の食品組成物。
(11)(1)〜(3)のいずれか記載の発酵物または(4)記載の抽出物を含む医薬組成物。
(12)炎症を抑制するために用いられる(11)記載の医薬組成物。
(13)(1)〜(3)のいずれか記載の発酵物または(4)記載の抽出物を含む化粧品または医薬部外品。
(14)炎症を抑制するために用いられる(13)記載の化粧品または医薬部外品。
(15)(1)〜(3)のいずれか記載の発酵物または(4)記載の抽出物を含む、抗炎症剤の補助剤。
(A−1)ホーリーバジルの葉の発酵物の調製
ホーリーバジルの葉を洗浄し、除湿した部屋(湿度40〜50%、室温30〜35℃)に5〜7日間置いた。その後、温度55℃で5時間〜7時間機械乾燥を行って、水分値を6〜8%とした。乾燥した葉を、68℃〜75℃で10分〜15分焙煎した。焙煎した葉を2〜3mmに裁断した。裁断した葉100重量部、テンペ種菌1重量部、雑菌抑制剤5重量部、水130重量部を混合し、27℃〜30℃で44時間〜50時間発酵を行った。発酵後、電磁波殺菌装置にて800秒間殺菌を行い、発酵物を得た。
乾燥、刻み済みのシソの葉を、115℃〜120℃で21分〜30分焙煎した。焙煎した葉100重量部、テンペ種菌1重量部、雑菌抑制剤5重量部、水180重量部を混合し、27℃〜30℃で44時間〜50時間発酵を行った。発酵後、電磁波殺菌装置にて800秒間殺菌を行い、発酵物を得た。
ホーリーバジルの葉の発酵物、シソの葉の発酵物、桑の葉の発酵物、発酵させていないホーリーバジルの葉、発酵させていないシソの葉、発酵させていない桑の葉、緑茶および紅茶それぞれ2.3グラムあたり1リットルの熱湯を加え、3分間煮沸抽出した水溶液を試料とした。発酵させていないシソ葉、ホーリーバジルの葉、桑の葉、および上記と同様にして得た桑の葉の発酵物についても、それぞれ2.3グラムあたり1リットルの熱湯を加え、3分間煮沸抽出した水溶液を試料とした。
以下に述べる材料および方法を用いて、試料の抗炎症活性について調べた。
(C−1)細胞培養
マウス血管内皮細胞(MBE)は、北海道医療大学の浜田淳一教授より提供を受けた。予め1%ゼラチン(富士フィルム和光純薬、071−06291、大阪)溶液で1昼夜コーティングした10cmディッシュ(Corning 430167、NY)のゼラチン溶液をPBSで洗い流したディッシュを使用した。培地は、DMEM培地(日水製薬株式会社、05919、東京)とF−12 Ham培地(Sigma 05910、東京)を等量混和したものに10%のウシ胎児血清(FBS フナコシ、S1780、東京)を加えて使用した。MBE細胞は、37℃、5% CO2インキュベーター内で維持した。
炎症細胞の回収は以下の手順に従い回収した。麻酔をした雌性C57BL/6マウスの腹腔内に10mm×5mm×3mmの止血用ゼラチンスポンジ(スポンゼル:アステラス製薬、東京)を移入した後、ミッヘル針(夏目製作所、C−21−M、東京)にて閉腹した。スポンジ移入5日目にマウスを犠牲死させ、500mLのPBSに5mLのヘパリン溶液(20units/mL、持田製薬 873334、東京)を加えた氷冷溶液を10mLシリンジ(テルモ株式会社、SS−10EZS、東京)に22G針(株式会社トップ、00811、東京)を装着させた注射筒を用いて腹腔内に5mL注入し、腹腔浸出細胞を回収した。この腹腔浸出細胞の回収操作は3回繰り返した。腹腔浸出細胞は1500rpm、5分間の遠心後,細胞ペレットに37℃の溶血バッファー(NH4Cl:Tris−HCl=9:1、pH=7.65)10mLを加えて1分間作用させ赤血球を除去した。さらに1500rpm、5分間遠心して回収した細胞は、次にPKH67(Sigma Aldrich MIDI67−1KT、東京)で蛍光標識し、炎症細胞として用いた。
1%ゼラチンで1昼夜コーティングした96−wellプレートにMBE細胞を5×103個/well播種し、単層コンフルエントになるまで数日間培養した。培地を捨て、PKH67標識炎症細胞を5×105個/well重層した。そこに上記(B)で調製した試料を添加した。なお、試料の添加量は最終濃度3%となるように調整した。試料は培養液に添加する直前に0.45μmのフィルターを通して滅菌した。対照は抽出に用いた水を同様に煮沸したものを用いた。
16時間後に血管内皮細胞と接着しなかった炎症細胞を生理食塩水で洗い流し、接着した炎症細胞は、蛍光プレートリーダー485/535nm(励起/測定)を用いて、蛍光量として測定した。
麻酔したマウスの背部皮膚を1cm程切開し、皮下組織内に10mm×5mm×3mmのゼラチンスポンジを移入し、切開傷をミッヘル針にて閉じた。移入5日目にゼラチンスポンジ毎に取り出し、ハサミで細切後に37℃に保った0.2%コラゲナーゼ(富士フィルム和光純薬、034−10533、大阪)を溶かした無血清MEM培地5mLを含む15mLチューブ中で約30分間処理して完全にゼラチンを溶解した。その後スポンジ内に滲出した細胞は、1500rpm、5分間で遠心後、3mLの上記同様の溶血バッファーを加えて37℃で1分間作用させ赤血球を除去した。その後、再度遠心して回収した細胞を炎症細胞として血球計算盤にて細胞数を計測した。なお、マウスにはゼラチンスポンジ移入2日前から上記(B)の方法で調製した試料を飲料水として実験終了時まで自由摂取させた。
(D−1)滲出性炎症細胞の接着性を指標とした抗炎症活性の測定(in vitroアッセイ)の結果
上記(C−2)の方法に従って測定した蛍光量に基づいて、細胞の接着率を計算した。接着率が低いほど、試料の抗炎症活性が高いと判断した。結果を図1に示す。発酵シソ葉抽出物および発酵ホーリーバジル葉抽出物はいずれも炎症細胞の接着率を大幅に減少させた。発酵させていないシソの葉および発酵させていないホーリーバジルの葉も炎症細胞の接着率をある程度減少させた。発酵させていない桑の葉、発酵させた桑の葉、緑茶、および紅茶は、炎症細胞の接着率を有意に低下させないか、あるいはわずかしか低下させなかった。これらの結果は、シソ科植物の糸状菌による発酵物が強力な抗炎症活性を有することを示すものである。
上記(C−3)の方法に従って回収した炎症細胞数が少ないほど、試料の抗炎症活性が高いと判断した。結果を図2に示す。発酵シソ葉抽出物および発酵ホーリーバジル葉抽出物はいずれも炎症細胞の数を大幅に減少させた。発酵させていないシソの葉も炎症細胞の数を減少させた。発酵させていない桑の葉、発酵させた桑の葉、緑茶、および紅茶は、炎症細胞の数を有意に減少させなかった。これらの結果は、シソ科植物の糸状菌による発酵物が、動物に経口投与された場合に、強力な抗炎症活性を有することを示すものである。
Claims (11)
- シソ科植物の葉の糸状菌発酵物。
- シソ科植物がシソまたはバジルである請求項1記載の発酵物。
- 糸状菌がテンペ菌である請求項1記載の発酵物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の発酵物の抽出物。
- 糸状菌を用いてシソ科植物の葉を発酵させることを含む、抗炎症活性を有するシソ科植物の葉の発酵物の製造方法。
- シソ科植物がシソまたはバジルである請求項5記載の方法。
- 糸状菌がテンペ菌である請求項5または6記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の発酵物または請求項4記載の抽出物を含む、炎症を抑制するための食品組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の発酵物または請求項4記載の抽出物を含む、炎症を抑制するための医薬組成物。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の発酵物または請求項4記載の抽出物を含む、炎症を抑制するための化粧品または医薬部外品。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の発酵物または請求項4記載の抽出物を含む、抗炎症剤の補助剤。
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