JP2020127427A - アルカリホスファターゼの下流プロセシング - Google Patents

Abstract

【課題】低減された宿主細胞タンパク質含有量と、向上した物理的安定性とを有するアルカリホスファターゼを含む医薬組成物の製造方法、および、該組成物の提供。【解決手段】単離されたアルカリホスファターゼを含む物理的に安定な組成物を製造する方法であって、緩衝液中のＡＰの溶解または希釈を含み、６．５〜７．５のｐＨを有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロール、および／または５〜４０ｍＭヒスチジン、および／または１０〜４０ｍＭクエン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物をもたらす、方法。【選択図】なし

Description

本発明は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）の下流プロセシング（ＤＳＰ）の分野に関する。より具体的には、ＡＰを含む組成物における宿主細胞タンパク質含有量を低減する方法に関する。本発明は、ＡＰを含む組成物、および低減した宿主細胞タンパク質含有量にさらに関する。

ＡＰ；ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従ったＥＣ３．１．３．１、一般的な名称は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）であり、ホスファターゼモノエステルおよびＨ_２Ｏをアルコールおよびリン酸塩にする反応を触媒する酵素である。ＡＰの他の名称は、アルカリホスホモノエステラーゼ、ホスホモノエステラーゼ、グリセロホスファターゼ、アルカリホスホヒドロラーゼ、アルカリフェニルホスファターゼ、オルトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼである（アルカリ至適）ＡＰの系統名は、リン酸塩モノエステルホスホヒドロラーゼである（アルカリ至適）。

ＡＰは、幅広い特異性の酵素であり、トランスリン酸化も触媒する。ヒト、および他の哺乳類において、少なくとも４つの個別であるが、関連したアルカリホスファターゼが知られている。これらは、腸型（ＡＬＰＩ）、胎盤型（ＡＬＰＰ；ヒトおよび霊長類のみ）、胎盤様型（ＧＣＡＰ）、および肝臓／骨／腎臓（または組織非特異的型）アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＰ）である。最初の３つは、２番染色体上に共に位置するが、組織非特異的型は、１番染色体上に位置する。

アルカリホスファターゼのアミノ酸配列、ならびに触媒およびクラウンドメインの相対的な位置は、当業者に公知である。一例として、特に、４つのヒトアルカリホスファターゼのアミノ酸配列を示す、Millによる哺乳類アルカリホスファターゼのテキスト(哺乳類アルカリホスファターゼ, Wiley-VCH (2006), ISBN-13: 978-3-527-31079-1）が参照される。

医薬用途のためのＡＰ
以前に、ＡＰは、広範囲の疾患（急性腎障害（ＡＫＩ）、敗血症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）など）において医薬として有用であること示した。これらの研究は、単離されたウシＡＰ、ならびに単離、および組換えヒトＡＰなどの天然に生じたＡＰを使用した。いくつかの動物モデルにおいて、ヒト腸型ＡＰの触媒ドメインと、ヒト胎盤型ＡＰのクラウンドメインとを含む組換えキメラアルカリホスファターゼが使用された（ＷＯ２００８１３３５１１に記載された）。現時点において、新規の改良された組換えキメラアルカリホスファターゼであって、図１８に示されたような配列を有するアルカリホスファターゼを含む医薬組成物が、医薬としての使用のために開発されている。

医薬組成物の開発の間に、使用は、特に、アフィニティ（Mimetic Blue AP（登録商標））、陰イオン交換（Poros 50 HQ（登録商標））、および混合モード（Capto-Adhere（登録商標））クロマトグラフィーなどのタンパク質の標準（ＤＳＰ）処理でなされた。ＤＳＰの後、工程は、最適化され、医薬組成物が、監督官庁によって以前に設定され、要求された規格を満たし、調合が臨床的バッチ製造のためになされた。しかし、最終段階の安定性試験の間に、粒子形成が観察された。

これは、予期できない問題であった。なぜなら、粒子形成は、医薬組成物における望ましくない態様であり、解決策を見出さなければならないからである。

粒子同一性とはどのようなものであるかは不明であったが、遠心分離および分析によって粒子を回収すると、銀染色された非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの非ＡＰバンドが濃縮された。このバンドの酵素消化の質量分析は、宿主細胞タンパク質の存在を明らかにしたが、ＡＰは存在しなかった。このことは、特に予期されなかった。なぜなら、宿主細胞タンパク質についての以前の試験によれば、比較的多量の粒子の理由を説明するには、組成物中のＨＣＰ量は非常に少ないものであったからである（＜１００ｐｐｍ）。

宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）
ＨＣＰは、細胞または器官によって産生またはコードされたタンパク質であり、産生処理において使用され、意図される生成物とは無関係である。いくつかは、増殖、生存、および通常の細胞プロセシングに必須であるが、他のものは必須でなくてもよい。企図された生成物のように、ＨＣＰは、多くの翻訳後修飾を用いて宿主細胞によって修飾されてもよい。有用性の有無にかかわらず、ＨＣＰは一般的に、最終的な薬剤内容物において望ましくない。一般的に少量で存在する（目的タンパク質のミリグラムあたりナノグラムとして表わされる百万分率）が、それらを取り除くために、非常に多くの労力および費用が産業によって費やされる（Wang et al; Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, No. 3, June 15, 2009）。

治療用途についての生物由来生成物の承認前に、生成物に残存するＨＣＰのレベルは、米国食品医薬局によって出版された「Points to Consider」、および欧州委員会の「Notes for Guidance」に従って、定量的に測定されなければならない。したがって、ＨＣＰは通常、除去されなければならず、除去は、ＤＳＰの間に明示されなければならない。組換え生物由来生成物における混入ＨＣＰの存在を分析するための現在の分析法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロット法、およびＥＬＩＳＡを含む。ＨＣＰ混入の除去と、たとえば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Shukla et al, Biotechnol. Prog. 2002, 18, 556-564）、プロテインＡクロマトグラフィー（Shukla et al, Biotechnol. Prog. 2008, 24, 11151121）、または塩耐性陰イオン交換リガンド（Riordan et al, Biotechnol. Prog.2009, Vol. 25, No. 6）を用いる除去とについて多くの刊行物が存在する。

したがって、低減されたＨＣＰ含有量と、向上した物理的安定性とを有するアルカリホスファターゼを含む医薬組成物を提供するために、最適化された、ＤＳＰおよび製剤が必要とされている。

本発明は、ａ）ＨＣＰ含有量を低減し、ｂ）観察される粒子形成を低減するために、ＤＳＰおよび最終的製剤の双方を採用した。ＤＳＰ採用の主な目的は、ＨＣＰ含有量を減少させることであるが、製剤採用の主な目的は、任意の残存ＨＣＰが原因の、（可視）粒子の形成を減少させることである。ＤＳＰ採用、ならびに製剤採用の双方は、安定性試験の間に粒子形成を減少させる点で協働する。少なくとも組み合わせたとき、改良されたＤＳＰ、および新規の製剤は、医薬組成物をもたらし、当該組成物は、ＨＣＰ含有量を減少させ、安定性試験の間に可視粒子の形成は、生じない。

第１の実施形態において、本発明は、単離されたアルカリホスファターゼを含み、低減した含有量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、好ましくは１００ｐｐｍ ＨＣＰ未満を含む組成物を製造するための方法であって、
以下の化学式を有するリガンドを含む固相であって、Ｒが当該リガンドを当該固相に結合するスペーサを示す固相を提供する工程と、
前記リガンドを、配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたＡＰとＨＣＰとを含む組成物に接触させる工程と、
いくつかの洗浄工程であって、少なくとも１つの洗浄工程が、ＨＣＰの少なくとも一部をリガンドから分離するが、リガンドに結合したＡＰの少なくとも一部を保持することができる洗浄緩衝液を用いて実施される、いくつかの洗浄工程を実施する工程と、
前記ＡＰの少なくとも一部をリガンドから分離することができる溶出緩衝液を用いてＡＰを得る工程とを含む方法を提供する。好ましくは、ＨＣＰの少なくとも一部が、この最後の工程を実施する間に、リガンド、または固相に結合したままである。

アミノ酸もしくは核酸配列の同一性パーセンテージ、または「％配列同一性」との用語は、本明細書において、必要であれば最大の同一性パーセントをもたらすために２つの配列を整列させ、間隙を導入した後、参照配列における残基と同一である、候補アミノ酸、または核酸配列における残基のパーセンテージとして定義される。好ましい実施形態において、前記少なくとも配列同一性パーセンテージの計算は、間隙の導入なしに行われる。整列のための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野で周知であり、たとえば、「Ａｌｉｇｎ ２」、または国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴサービスである。

ＤＳＰは、以下の式を有する、アルカリホスファターゼに対する公知のリガンドであって、Ｒが固相に結合する反応基またはスペーサであるリガンドを用いるアフィニティ精製に関する精製工程を含み、
洗浄工程は、高い純度および収率をもたらすとともに、得られるＡＰ含有組成物の物理的安定性を最適化するために最適化された。化学式（Ｉ）のリガンドは、カラムの形態で、商標Mimetic Blue AP（商標）（MMBAP; Prometic社, UK）から市販されており、Ｒは、カラムの固相マトリックスとリガンドとの間の距離を生み出すために機能するスペーサ分子である。この距離は、大きなＡＰ分子がリガンドに効率よく結合することを可能にする。

化学式Ｉのリガンドは、当該技術分野において公知であり、たとえば、仔ウシ腸型アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）の精製について、Lindner（J Chromatography, 473 (1989) 227 - 240; Figure 1, compound IV）に記載されている。Lindnerは、リガンドが腸型アルカリホスファターゼ（ＡＬＰＩ）のＤＳＰにおいて有用であることを示した。しかし、Linderは、ＨＣＰの低減を記載しておらず、特に、Linderは、ＨＣＰ混入の問題に向き合っていなかった。なぜなら、彼らは、ＡＰを治療用途のために精製していないからである。精製のために標準的な洗浄、および溶出緩衝液を用いて、Linderは、ＣＩＡＰの３３０倍の精製を達成した。本発明者らが見出したように、Linderにおいて記載された条件は、しかし、医薬品製造の間のＤＳＰの間に観察された、粒子形成、およびＨＣＰ混入の問題を解決しなかった。

本願において、「宿主細胞」は、活性（任意に修飾された）ＡＰ遺伝子を含む、動物またはヒト細胞を意味し、このＡＰ遺伝子は、ｉｎ ｖｉｖｏ（たとえば、非ヒト動物において）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ（細胞培養）において、細胞内で転写および翻訳される。ＡＰ遺伝子は、好ましくは調節エレメントを用いて、この宿主細胞に外来遺伝子として導入することができ、既に宿主細胞において活性内在遺伝子として存在することができ、または内在性の非活性遺伝子として活性化することができる。そのような内在性遺伝子の活性化は、たとえば、ゲノムに、たとえば相同組換えによって、調節エレメントを特異的に導入することによって達成することが可能である。

哺乳類細胞は通常、宿主細胞として用いられる。内在性ＡＰ遺伝子が導入された場合、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、またはヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞は、たとえば、宿主細胞として使用することが可能である。ＨＣＰは、内在性ＡＰを発現する（非修飾）動物細胞から得られた沈殿に存在してもよく、この場合、得られたＡＰタンパク質は通常、「精製された」または「単離された」と称される。これに対して、「組換え」タンパク質は一般的に、上述されたような、外来性の、任意に修飾されたＡＰ遺伝子を含む細胞によって、または相同組換えによってＡＰを発現している細胞によって、発現されたタンパク質と考えられる。組換えタンパク質は、たとえば精製されたとき、「単離された」と称されてもよい。本発明に係る方法は、内在的に発現された、ならびに組換えで発現されたＡＰの双方に使用することが可能であると理解されるべきである。「単離された」および「精製された」との用語は、混入物を除去するための、細胞からの単離、およびタンパク質の精製などの異なる精製工程を示すために、組換えタンパク質のＤＳＰの過程において使用されてもよい。本願において使用されるように、単離された、および精製されたとの用語は、これらの用語の使用される文脈に応じて後者の意味を有してもよい。

新規の改良された組換えアルカリホスファターゼを含む組成物について、しかし、標準的な精製方法は、十分なＨＣＰ除去をもたらさない。また、ＨＣＰ測定について使用された市販の試験は、ＨＣＰ含有量を過小評価していた。なぜなら、ＡＰは、ＨＣＰと共に精製されるからであり、特に双方が同様の等電点を有するからであり、おそらくＨＣＰは、精製の間にＡＰに結合したからである。組成物におけるＨＣＰの存在は、医薬組成物における不必要な出来事である粒子形成をさらにもたらす。なぜなら、特に、粒子は、可溶性タンパク質よりもさらに免疫原性である不溶性タンパク質凝集体を含み得るからである。

本発明者らは、医薬用途のための組成物が比較的高濃度のＨＣＰを含み、保存後に粒子を形成するとの問題に向き合い、解決策を探した。

解決されるべき問題の１つは、したがって、特定の組換えアルカリホスファターゼを含む組成物の提供であり、当該組成物は、低含有量のＨＣＰを含み、好ましくは、２〜８℃において２月間にわたる安定性試験の間に可視粒子形成を示さない。可視粒子形成は、粒子が、任意に拡大鏡などの拡大手段を用いる当業者によって裸眼で観察され得ることを意味する。規制の世界では、可視粒状物質と不可視粒状物質とは区別されている。可視粒状物質は、裸眼で検出することができる任意の微粒子として大まかに定義される。通常、可視物体は、０．０５ｍｍ以上の物体として定義される。本明細書において使用されるような「可視粒子」との用語は、０．０５ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、より好ましくは０．５ｍｍ以上、最も好ましくは１ｍｍ以上である粒子を意味する。

そのような可視粒子を検出するために設計された装置を用いて可視粒子形成を検出することも可能である。透明溶液における微粒子の検査を自動化するための最も一般的なアプローチは、本発明に係る（方法によって得られた）組成物とともに、溶液を撹拌し、経時的に溶液を画像化することである。画像化システムは一般的に、機械ビジョンカメラ、照明（本件の場合、バックライト）、および画像を分析するためのビジョンプロセッサからなる。画像が取得されるとすぐに、それらは、続いて画像対画像の相違を連続して分析される。相違は、気泡および微粒子などの溶液内部で動いている物体として解釈することができる。より大きく高密度の微粒子において、検出は、分析から気泡を濾過することによってなされる。なぜなら、それらは、微粒子が沈み込む間に上昇するからである。

約１ｍｍの直径よりも小さな微粒子を見出すことが目的である場合、攪拌するためのより注意深いアプローチが、気泡を視野から除去するために使用されなければならない。このことは、加速および減速速度に慎重な注意を払って、回転によって溶液を撹拌することによって実施することができる。

本発明の目的について、しかし、検出方法は、上述されたような直径を有する粒子である限り、「可視粒子」を定義するために重要ではない。

上述のように、組換えアルカリホスファターゼのための、標準ＤＳＰ、および製剤は、組成物自体をもたらさない。なぜなら、ＨＣＰ含有量は、一般的に使用される標準値の１００ｐｐｍをはるかに超え、安定性試験の間、粒子形成が観察されたからである。

制御標準値を満たすために、本発明に係る方法は、アルカリホスファターゼ含有量に関して、好ましくは、１００ｐｐｍ ＨＣＰ未満を含む組成物をもたらす。

好ましい実施形態において、洗浄緩衝液は、ＭｇＣｌ_２，ＺｎＣｌ_２，およびＴｒｉｓをさらに含む。これらの成分は、新規で進歩的な洗浄工程においてＨＣＰを除去するためには必要ではないが、一般的に、アルカリホスファターゼの安定特性にとって、ｐＨ感受性の金属結合酵素であるＡＰにとって有用である。好ましくは、Ｍｇは、０．１ｍＭを超える濃度で存在する。好ましくは、Ｍｇ濃度は、１００ｍＭを超えない。Ｍｇ濃度は、好ましくは、０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭである。Ｚｎは、好ましくは１０μｍを超える濃度で存在する。好ましくは、Ｚｎ濃度は、１ｍＭを超えない。Ｚｎ濃度は、好ましくは１０〜１０００μＭ、より好ましくは２０〜１００μＭ、より好ましくは４０〜６０μＭ、最も好ましくは約５０μＭである。

固相は、たとえば、樹脂であってもよく、通常、カラムの形態であり、それ自体で市販されている。本発明に係る方法において、カラムの使用が好ましい。なぜなら、ＤＳＰ設定において容易に規模を拡大することができるからである。本発明の方法において好適なカラムは、たとえば、Mimetic Blue AP（登録商標）である。しかし、たとえば、前記リガンドを含むビーズを使用し、遠心分離、デカント、および溶解による接触、および洗浄工程を実施することが可能である。洗浄工程の間に、磁気ビーズ、および磁気分離を使用することも可能である。当業者は、アフィニティ精製についての様々な処理に精通しており、本発明に係る方法における使用のためのそのような処置に容易に適用することが可能である。

通常、リガンドは、式（Ｉ）におけるＲによって表わされるスペーサを用いて固相に付着される。そのようなスペーサは、当該技術分野において公知であり、任意の好適なスペーサは、たとえば、ヘキサメチルジアミン（１，６−ジアミノヘキサン）（Dye-Ligand Affinity Absorbents for Enzyme Purification N.E. Labrou Molecular Biotechnology Vol 20, 2002 p77-84）、または３’，３’−ジアミノジプロピルアミンである。

好ましい実施形態において、本発明は、本発明に係る方法であって、洗浄緩衝液が、２０〜１００ｍＭ Ａｒｇ、好ましくは３０〜５０ｍＭ Ａｒｇ、最も好ましくは約４０ｍＭ Ａｒｇを含む方法を提供する。

発明者らは、驚くべきことに、ＡＰのための標準的なＤＳＰ処理に上述の洗浄工程を組み込むことによって、ＨＣＰ含有量を、最終組成物において１００ｐｐｍ未満の値に減少させることが可能であることを示した。上述の洗浄工程は、したがって、この点において医薬組成物に定められている規則を満たし、それ自体が１００ｐｐｍＨＣＰ未満の含有量を有する組成物の提供を可能にする。そのような組成物は、本発明以前には得られなかった。なぜなら、標準（最適化された）ＤＳＰ工程であって、本発明の新規かつ進歩的なＤＳＰ工程の使用がなされなかったＤＳＰ工程は、１００ｐｐｍ ＨＣＰ未満を含む組成物をもたらなさかったからである。さらに、そのような組成物は、２〜８℃で２カ月にわたって保存されたとき、可視粒子形成を示さなかったが、標準の最適化されたＤＳＰ工程によって作製された組成物は、示した。

発明者らは、同様に、低減したＨＣＰ含有量をもたらす本発明に係る方法において使用されたとき、０．５〜２Ｍ 尿素、好ましくは１〜２Ｍ 尿素、より好ましくは約１Ｍ 尿素を含む洗浄緩衝液をさらに示した。尿素およびＡｒｇの双方を含む洗浄緩衝液も、非常に良好な結果をもたらした。したがって、本発明に係る方法であって、洗浄緩衝液が、０．５〜２Ｍ 尿素、好ましくは１〜２Ｍ 尿素、より好ましくは約１Ｍ 尿素を含む方法がさらに提供される。好ましくは、洗浄緩衝液は、上述されたような濃度で、Ａｒｇおよび尿素の双方を含む。

５〜１５％、好ましくは約１０％エチレングリコールを洗浄緩衝液に添加することは、同様に良好な結果をもたらした。したがって、本発明は、本発明に係る方法であって、洗浄緩衝液が、５〜１５％エチレングリコール、好ましくは約１０％エチレングリコールを含む方法を提供する。

本発明は、ＨＣＰ低減を増加させるため、および／またはＡＰの収率を向上するために、洗浄緩衝液が、好ましくはＮａＣｌを含まないことをさらに示す。好ましい実施形態において、したがって、本発明に係る方法であって、好ましくは、上述されたような濃度で、Ａｒｇ、尿素、エチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む洗浄緩衝液が、実質的にＮａＣｌを含まない方法が提供される。実質的にＮａＣｌを含まないとは、洗浄緩衝液が、好ましくは、１ｍＭ未満、より好ましくは１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、より好ましくは１００ｎｍ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは１ｎＭ未満のＮａＣｌを含むことを意味する。

低減した含有量とは、本発明に係る方法を採用した後、Ａｒｇ、尿素、またはエチレングリコールが洗浄の間に使用されない同様の方法であって、ＮａＣｌが洗浄緩衝液中に実質的な量（たとえば、１ｍＭを超える）で存在する方法に比較したとき、ＨＣＰ：ＡＰの比率が、低下することを意味する。好ましくは、本発明に係る方法は、ＤＳＰ工程一式に組み込まれたとき、ＡＰ含有量に比べて、１００ｐｐｍ未満、より好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは５ｐｐｍ未満、より好ましくは２ｐｐｍ未満、より好ましくは１ｐｐｍ未満のＨＣＰ含有量をもたらす。

同様に、向上した収率とは、ＡＰ_ＯＵＴ対ＡＰ_ｉｎパーセンテージで測定されたＡＰの収率が、本発明に係る洗浄工程を使用しない方法であって、ＡＰ_ＯＵＴが処理工程後に得られたＡＰ量であり、ＡＰ_ｉｎが、洗浄前にリガンドに接触するＡＰ量である方法に比べて高いことを意味する。

本発明に係る方法における洗浄工程の次に、溶出工程も、本発明に先行して当該技術分野で公知の方法に比べて改良された。本発明によれば、本発明に係る方法において使用される溶出緩衝液は、ＡＰの少なくとも一部を、構造式（Ｉ）を有するリガンドから効率的に脱離させるために、好ましくは、１００ｍＭ未満のＮａＣｌを含む。最も良好な結果は、約４０ｍＭ Ａｒｇを含み、約８のｐＨを有し、実質的にＮａＣｌを含まない洗浄緩衝液と、好ましくは実質的にＮａＣｌを含まない溶出緩衝液との組み合わせを用いることによって得られた。好ましい実施形態において、したがって、本発明に係る方法であって、洗浄緩衝液が、約４０ｍＭのＡｒｇを含み、約８のｐＨを有し、当該洗浄緩衝液および溶出緩衝液の双方が実質的にＮａＣｌを含まない方法が提供される。ＮａＣｌを実質的に含まないとは、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液が、好ましくは、１ｍＭ未満、より好ましくは１００μＭ、より好ましくは１０μＭ未満、より好ましくは１μＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、最も好ましくは１ｎＭ未満のＮａＣｌを含むことを意味する。

上述されたアフィニティＤＳＰ工程の次に、アルカリホスファターゼのための完全ＤＳＰは通常、精製のための工程をさらに含む。そのような工程の１つは、以下の構造式（ＩＩ）によって記載されたようなリガンドを用いる混合型精製工程と称される。リガンドは、「Capto Adhere」として当該分野において公知であり、疎水性相互作用、およびイオン交換の双方を組み合わせられる。本発明者らは、最適な収率でＨＣＰ含有量をさらに低下させるために、混合型精製工程を実施する間に、洗浄条件を採用した。

好ましい実施形態において、本発明は、したがって、本発明に係る方法であって、第２精製工程をさらに含み、当該工程が、
以下の式を有する第２リガンドを含む第２固相を提供することと、
前記第２リガンドを、単離されたＡＰおよびＨＣＰを含む組成物に接触させることと、
いくつかの洗浄工程であって、少なくとも１つの洗浄工程が、７．５〜８．５のｐＨを有し、０．０５〜０．２Ｍ ＮａＣｌと、０．１〜０．５Ｍ Ｌ−Ａｒｇとを含む第２洗浄緩衝液を用いて行われる、いくつかの洗浄工程を行うこととを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、前記第２洗浄緩衝液は、１〜２０％、好ましくは２〜１０％、より好ましくは４〜６％、最も好ましくは約５％グリセロールをさらに含む。

固相は、たとえば樹脂であってもよく、通常、カラムの形態であり、それ自体で市販されている。本発明に係る方法において、カラムの使用が好ましい。なぜなら、ＤＳＰ設定で容易に規模を拡大することができるからである。本発明の方法において好適な樹脂は、たとえば、Capto-Adhere（登録商標）であり、カラムの形態で使用することができる。しかし、たとえば、前記リガンドを含むビーズを使用し、遠心分離による洗浄および接触工程、デカント工程、ならびに溶解工程を実施することも可能である。洗浄工程の間に、磁気ビーズおよび磁気分離を使用することも可能である。当業者は、アフィニティ精製のための様々な処理に精通しており、本発明に係る方法における使用のためのそのような処理を容易に採用することが可能である。

ＤＳＰ工程の順序は、組成物を効率的に処理するために変更されてもよいが、好ましい実施形態において、前記第２精製工程は、前記第１精製工程に先行して、すなわち、前に行われる。アルカリホスファターゼのための完全なＤＳＰは、陰イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、ウイルス濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにそれらの任意の組み合わせなどの他の精製工程を含んでもよいか、または好ましくは含む。

好ましい実施形態において、本発明に係る方法は、以下の工程の、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは全てを、好ましくは列挙された順番で含む。
混合型クロマトグラフィー（たとえば、Capto Adhere（式ＩＩ））
界面活性剤に基づくウイルスの不活性化（たとえば、Triton X-100）
陰イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、Poros 50 HQ)
アフィニティクロマトグラフィー（たとえば、Mimetic Blue AP（式Ｉ））
疎水性相互作用クロマトグラフィー（たとえば、Butyl 650 M）
限外濾過／透析濾過
ウイルス濾過
バルク充填

一実施形態において、本発明は、製剤工程であって、安定性試験中に、粒子形成が低減し、好ましくは可視粒子形成が生じないように、単離されたＡＰ組成物の物理安定性が改善されている、好ましくはＨＣＰ含有量が低減されている結果をもたらす製剤工程をさらに提供する。好ましくは、本発明に係る方法であって、単離されたアルカリホスファターゼを含み、ＨＣＰの低減した含有量を含む組成物を製造するための本発明に係る方法は、本発明に係る製剤工程の前に行われる。

好ましい実施形態において、前記製剤工程は、得られる組成物が、６．５〜７．５のｐＨ、好ましくは６．８〜７．２、より好ましくは約７．０のｐＨを有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭ ソルビトール、より好ましくは２２５〜２７５ｍＭ ソルビトール、最も好ましくは約２５０ｍＭ ソルビトールを含み、および／または１０〜４０％グリセロール、より好ましくは２０〜３０％グリセロール、最も好ましくは約２５％グリセロールを含むように、緩衝液中に溶出したＡＰの、溶解または希釈を含む。好ましい実施形態において、組成物は、１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、より好ましくは１５〜３０ｍＭ クエン酸塩、最も好ましくは約２０ｍＭ クエン酸塩を含む。別の好ましい実施形態において、組成物は、５〜４０ｍＭ ヒスチジン、好ましくは１０〜３０ｍＭ ヒスチジン、より好ましくは１５〜２５ｍＭ ヒスチジン、最も好ましくは約２０ｍＭ ヒスチジンを含む。

本発明は、したがって、単離されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含む物理的に安定な組成物を製造するための方法であって、緩衝液中にＡＰを溶解または希釈することを含み、６．５〜７．５のｐＨを有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭ ソルビトールおよび／または１０〜４０％グリセロールを含む組成物をもたらすことを含む方法を提供する。好ましくは、前記組成物は、５〜４０ｍＭ ヒスチジン、および／または１０〜４０ｍＭ クエン酸塩を含む。

好ましい実施形態において、ＡＰを含む組成物は、１００ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む。好ましくは、前記組成物は、組成物であって、単離されたアルカリホスファターゼを含み、低減されたＨＣＰ含有量を含む組成物を製造するための本発明に係る方法によって得られた溶出されたＡＰを含む。

好ましい実施形態において、したがって、本発明は、単離または組換えアルカリホスファターゼを含む組成物を製造するための本発明に係る方法であって、得られたＡＰを緩衝液中に溶解または希釈する工程をさらに含み、６．５〜７．５のｐＨ、好ましくは６．８〜７．２、より好ましくは約７．０を有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭ ソルビトール、より好ましくは２２５〜２７５ｍＭ ソルビトール、最も好ましくは約２５０ｍＭ ソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロール、より好ましくは２０〜３０％グリセロール、最も好ましくは約２５％グリセロールを含む組成物をもたらす方法を提供する。好ましい実施形態において、組成物は、１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、より好ましくは１５〜３０ｍＭ クエン酸塩、より好ましくは約２０ｍＭ クエン酸塩、および／または５〜４０ｍＭ ヒスチジン、より好ましくは１０〜３０ｍＭ ヒスチジン、より好ましくは１５〜２５ｍＭ ヒスチジン、最も好ましくは約２０ｍＭ ヒスチジンを含む。

好ましくは、組成物を得るためにＡＰが溶解または希釈される緩衝液は、ＭｇＣｌ_２などのマグネシウム（Ｍｇ）塩、および／またはＺｎＣｌ_２などの亜鉛（Ｚｎ）塩を含む。好ましくは、Ｍｇは、０．１ｍＭを超える濃度で組成物中に存在する。好ましくは、Ｍｇ濃度は、１００ｍＭを超えない。Ｍｇ濃度は、好ましくは０．１〜１００ｍＭ、より好ましくは０．５〜２０ｍＭ、より好ましくは１〜５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭである。Ｚｎは、１０μｍを超える濃度で存在する。好ましくは、Ｚｎ濃度は、１ｍＭを超えない。Ｚｎ濃度は、好ましくは、１０〜１０００μＭ、より好ましくは２０〜１００μＭ、より好ましくは４０〜６０μＭ、最も好ましくは約５０μＭである。以前に述べたように、ＭｇおよびＺｎ塩は、可視粒子形成の点で組成物の物理的安定性に必ず影響を与えるわけではないが、金属配位酵素であるＡＰは、ＺｎおよびＭｇイオンが存在するとき、一般的により安定である。組成物は、ＮａＣｌ、好ましくは生理的濃度、すなわち約０．９％ｗ／ｖ ＮａＣｌでＮａＣｌをさらに含んでもよい。このことは、組成物が医薬として使用されるとき、特に静脈内投与に使用されるとき、特に有用である。

本発明に係る方法は、同様に他の組換えタンパク質に適用されてもよいが、本発明に係る方法は、好ましくは、アミノ酸配列であって、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性を有する、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有する、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアルカリホスファターゼを含む組成物を用いて実施される。好ましい実施形態において、宿主細胞タンパク質は、哺乳類細胞タンパク質であり、好ましくはカテプシン様タンパク質（ｃａｔＡ）、より好ましくはカテプシンＡのハムスターホモログであり、および／または組換えアルカリホスファターゼは、好ましくは哺乳類宿主細胞、より好ましくはＣＨＯ宿主細胞を含む細胞系発現システムにおいて発現される。

本発明は、単離されたアルカリホスファターゼを含み、低減した含有量の宿主細胞タンパク質を含む組成物を製造する方法を提供する。本発明は、本発明に係る方法によって得ることが可能なそのような組成物をさらに提供する。

一実施形態において、したがって、本発明は、単離されたアルカリホスファターゼと、薬理学的に受容可能な賦形剤とを含む組成物であって、前記組成物は、１００ｐｐｍ未満、より好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは５ｐｐｍ未満、より好ましくは２ｐｐｍ未満、最も好ましくは１ｐｐｍ未満、またはより少ない宿主細胞タンパク質を含む組成物が提供される。好ましくは、組成物は、２〜８℃、好ましくは約５℃で２カ月、より好ましくは３ヶ月にわたる安定性試験の間において、実質的に可視粒子形成を示さない。実質的に可視粒子形成がないとは、１ｍＬの組成物中に２０個未満の可視粒子が形成されることを意味する。好ましくは、１５個未満の粒子、より好ましくは１０個未満、より好ましくは５個未満、最も好ましくは１ｍＬ組成物あたり１粒子未満が、組成物の保存に特化された条件における安定性試験の間に形成される。

好ましくは、本発明に係る組成物は、本発明に係る方法によって得られるか、または得ることが可能である。好ましくは、組成物は、６．５〜７．５のｐＨ、好ましくは約７のｐＨを有し、好ましくは１０〜４０ｍＭ、好ましくは１５〜３０ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ クエン酸塩、および／または１０〜４０％、好ましくは２０〜３０％、より好ましくは約２５％ グリセロール、および／または２００〜３００ｍＭ、好ましくは２２５〜２７５ｍＭ、より好ましくは約２５０ｍＭ ソルビトール、および／または５〜４０ｍＭ ヒスチジン、好ましくは１０〜３０、最も好ましくは約２０ｍＭ ヒスチジンを含む。好ましい実施形態において、組成物は、６．５〜７．５のｐＨ、好ましくは約７のｐＨを有し、１０〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ クエン酸塩、または５〜４０ｍＭ、好ましくは約２０ｍＭ ヒスチジンを含む。本発明者らは、そのような製剤組成物を用いる、２〜８℃で２カ月にわたる安定性試験の間に、優れた物理的安定性、すなわち、実質的に可視粒子が形成されないことを観察した。上述されたように、本明細書において使用されるような「可視粒子」との用語は、５０μｍ以上の直径、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは５００μｍ以上、最も好ましくは１ｍｍ以上の直径の粒子を示している。粒子は、任意に拡大手段を用いて裸眼によって、またはたとえば、上述されたような、フィルムカメラ、およびフィルム材料を分析するための好適な手段などの自動化処理によって観察することができる。

好ましい実施形態において、本発明に係る組成物は、好ましくは哺乳類細胞、より好ましくはＣＨＯ宿主細胞を含む細胞系発現システムにおいて発現された単離アルカリホスファターゼを含む。好ましい実施形態において、ＨＣＰは、カテプシン様タンパク質、より好ましくはカテプシンＡのハムスターホモログである。

好ましくは、アルカリホスファターゼは、配列であって、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する配列を有する。本発明は、ＨＣＰを低減する方法と、組成物であって、単離されたアルカリホスファターゼを含み、１００ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物とを提供し、本発明は、本発明に係る組成物の医薬としての使用をさらに提供する。

本発明に係る組成物の医薬としての使用は、好ましくは、疾患に関連するアルカリホスファターゼ処置における使用である。アルカリホスファターゼ関連疾患とは、アルカリホスファターゼの欠損に関する疾患もしくは症状、またはアルカリホスファターゼの外来性投与によって改善することができる疾患または症状を意味する。特に、アルカリホスファターゼ関連疾患は、以下の疾患：敗血症、または敗血症ショック、炎症性腸疾患または消化管の他の炎症疾患、（急性）腎損傷または他の腎臓病、虚血性再灌流障害、（外科的）外傷、および低ホスファターゼ症の任意の１つであってもよい。

本発明は、以下の、非限定的な実施例においてより詳細に説明される。

アルカリホスファターゼ組成物における粒子形成は、０〜７日目において示された緩衝液中で形成された。ｙ軸は、定性的粒子形成を示し、１＝〜１０粒子／ｍＬ；２＝１０〜１５粒子／ｍＬ、および／またはより大きな粒子；３＝〜１５粒子／ｍＬ、および／または大部分大きな粒子；４＝１５〜２０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；５＝〜２０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；６＝〜３０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；７＝３０〜４０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；８＝４０〜５０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子。各組のバー内において（各組のＡ内，Ｂ内，Ｃ内など）、凡例、すなわち、第１バー＝０日目、第２バー＝１日目などに示された順番（左から右へ）Ａ，Ｂ，Ｃなどは、表２に説明されているように、異なる添加剤を示している。 アルカリホスファターゼ組成物における粒子形成は、７日目において、示された緩衝液中で製剤化された。ｙ軸は、定量的粒子形成を示し、１＝〜１０粒子／ｍＬ；２＝１０〜１５粒子／ｍＬ、および／またはより大きな粒子；３＝〜１５粒子／ｍＬ、および／または大部分大きな粒子；４＝１５〜２０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；５＝〜２０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；６＝〜３０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；７＝３０〜４０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子；８＝４０〜５０粒子／ｍＬ、および／または非常に大きな粒子である。 アルカリホスファターゼ組成物における粒子形成は、示された緩衝液中で製剤化された。ｙ軸は、定量的な粒子形成を示し、１＝可視粒子なし；２＝１〜５個の小粒子／ｍＬ；３＝６〜１５個の小さな粒子／ｍＬ；４＝１６〜２５個の小さな粒子／ｍＬを示す。 異なる製剤におけるｒｅｃＡＰの高分子量（ＨＭＷ）種の形成における物理的ストレス条件の効果。サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された、メインピークパーセンテージと、パーセンテージＨＭＷとのグラフ表示。 ＨＣＰクリアランスにおけるCapto Adhere中間洗浄の効果、および第１選別の生成物収率。（Ａ）標準化ＨＣＰ（基準溶出液について標準化）のグラフ表示に対する各溶出液についての生成物収率。各ランにおいて試験された中間洗浄は、グラフに示されたものに対応する着色円によって標識される。（Ｂ）残留ＨＣＰレベル、および完了した各実験についての収率の表。試験された各中間洗浄の製剤、および未加工の残留ＨＣＰデータの結果、標準化ＨＣＰ、ならびに生成物収率は、各ランについて列挙される。表に示された着色円は、（Ａ）における標識に対応する。全ての緩衝液製剤は、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２および５０μＭ ＺｎＣｌ_２を包含した。 処理中の試料内のｃａｔＡの検出のためのウエスタンブロット分析。（Ａ）ウエスタンブロットは、約１０μｇの各処理中の試料についてｃａｔＡ抗体検出を用いて非還元条件下で行われた。分析された各試料についての残留ＨＣＰおよび収率などの同定は、（Ｂ）に列挙される。基準コントロール実験溶出液（レーン５）は、中間洗浄が含まれた溶出液（レーン２および４）よりも多くのｃａｔＡを包含した。レーン３は、０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０を含む中間洗浄工程の間に除去されたｃａｔＡを示す。全ての緩衝液製剤は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５０μＭ ＺｎＣｌ_２を含んでいた。 ＨＣＰクリアランスおよび生成物収率における第２選別からのCapto Adhere中間洗浄の効果。（Ａ）標準化ＨＣＰに対する各溶出液の生成物収率のグラフ表示。ＨＣＰ値は、同一の導入材料を用いて基準溶出液に標準化された。各ランにおいて試験された中間洗浄は、グラフに示されたものに対応する着色円によって標識される。（Ｂ）グラフに示されたデータを概略する表。中間試験洗浄条件と、各実験ランについて導入材料とが列挙される。各溶出液についての、未加工ＨＣＰデータ、標準化されたＨＣＰ値、および生成物収率も列挙される。表に示された着色円は、（Ａ）における標識に対応する。全ての中間緩衝液製剤も、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５０μＭ ＺｎＣｌ_２を含んでいた。 第１、および第２スクリーニング試験に由来する有望な候補を含む抗ｃａｔＡウエスタンブロット分析。（Ａ）ｃａｔＡ ＨＣＰに対する抗体を用いるウエスタンブロット。（Ｂ）処理中の試料の銀染色。（Ｃ）ウエスタンブロットにおける各レーンについての試料同定。レーン毎に導入された生成物の量が示される。溶出液についての残留ＨＣＰ値も列挙される。基準コントロール実験溶出液（レーン３）は、５％グリセロールを含む（レーン７）、または含まない（レーン５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０の中間洗浄を含む溶出液よりもｃａｔＡを多く含んでいた。レーン４および６は、５％グリセロールの存在下（レーン６）、または非存在下（レーン４）における０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０を含む様々な中間洗浄工程の間に除去されたｃａｔＡを示す。全ての緩衝液製剤も、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、およびＺｎＣｌ_２を含んでいた。 第１の選別について、ＨＣＰクリアランス、および生成物収率におけるＭＢＡＰ中間洗浄の効果。（Ａ）各溶出液について、ＨＣＰ濃度に対する生成物収率のグラフ表示。（Ｂ）完了した各実験についての、ＨＣＰレベルおよび収率の表。各中間洗浄緩衝液の製剤、未加工ＨＣＰデータ、標準化ＨＣＰ、および生成物収率が、各ランについて列挙される。表中に示される着色円は、（Ａ）における標識に対応する。１Ｍ 尿素洗浄のみが、ＨＣＰを減少させるが高い収率を維持した。 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析；第１の選別に由来する、ＭＢＡＰラン１（基準）、およびラン４（１Ｍ 尿素洗浄）。（Ａ）Gelcode Blue stainを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ラン１およびラン４溶出液は、同等の結合パターンを示した。（Ｂ）ｃａｔＡ抗体検出を用いるウエスタンブロット。基準コントロール溶出液（レーン４）は、ラン４溶出液（レーン６）よりも多くｃａｔＡを含んでいた。レーン５は、１Ｍ 尿素、ｐＨ８．０を含む中間洗浄の間に除去されたｃａｔＡを示す。 第１の選別について、ＨＣＰクリアランス、および生成物収率におけるＭＢＡＰ中間洗浄の効果。（Ａ）各溶出液について、ＨＣＰ濃度に対する生成物収率のグラフ表示。（Ｂ）完了した各実験について、残留ＨＣＰレベルおよび収率の表。試験された各中間洗浄の製剤、溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度、ＨＣＰ結果物、標準化ＨＣＰ、および生成物収率が、各ランについて列挙される。表に示される着色円は、（Ａ）における標識に対応する。作製された全ての中間緩衝液製剤は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および５０μＭ ＺｎＣｌ_２を含んでいた。 複数のＨＣＰ除去洗浄スクリーニングランのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析。（Ａ）試料濃度、およびＨＣＰ ＥＬＩＳＡデータを有するゲル導入表。（Ｂ）ｃａｔＡ抗体検出を用いるウエスタンブロット。（Ｃ）銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。 最終洗浄工程改善ランについて、ＨＣＰクリアランスおよび生成物収率におけるＭＢＡＰ中間洗浄の効果。（Ａ）各溶出液について、ＨＣＰ濃度に対する生成物収率のグラフ表示。赤い円は、ラン２８の結果を強調する。（Ｂ）完了した各実験についてのＨＣＰレベルおよび収率の表。各中間洗浄緩衝液の製剤が、列挙され、同様に、各ランについての、未加工ＨＣＰデータの結果、標準化ＨＣＰ、および生成物収率が列挙される。表に示された着色円は、（Ａ）における標識に対応する。４０ｍＭ アルギニン洗浄緩衝液は、３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂の導入（ラン２８、黄色で強調された）において最も高いＨＣＰクリアランスと高いｒｅｃＡＰ回収率とを示した。 確認ラン処理中間物の抗ｃａｔＡウエスタンブロット分析。（Ａ）ｃａｔＡ ＨＣＰに対する抗体を用いるウエスタンブロット。（Ｂ）処理中の試料の銀染色。（Ｃ）ウエスタンブロットにおける各レーンについての試料同定。ウエスタンブロットおよび銀染色についての試料ローディングが含まれる。 ＨＣＰ低減確認ラン処理中間物およびＢＤＳの分析結果。 デモランについての各下流処理中間物についての分析試験の要約。デモランに由来する処理中間物についての分析結果。 ヒスチジン緩衝液、およびクエン酸塩緩衝液において製剤化された実施例３で得られた製剤の３ヶ月にわたる安定性試験。 改良された組換えアルカリホスファターゼのアミノ酸配列。

実施例において使用された定義
ＡｍＳＯ_４：アンモニウム硫酸塩；ＡＰ：アルカリホスファターゼ；ＡＵ：吸光度ユニット；ＢＤＳ：原薬；ＢＨ：ベッド高；ＢＰＣ：バイオプロセス容器；ｃａｔＡ：カテプシン様タンパク質；細胞培養回収物；ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣；ＣＶ：カラム体積；ＥＬＩＳＡ：酵素免疫測定法；ＥＱ：平衡；ＨＣＰ：宿主細胞タンパク質；ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィー；ＨＭＷ：高分子量化学種；ＩＤ：内径；Ｌ−Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン；ＬＯＤ：検出限界；ＬＯＱ：定量限界；ＭＢＡＰ：Mimetic Blueアルカリホスファターゼ樹脂；ＮａＳＣＮ：ナトリウムチオシアネート；ＰＤ：工程開発；ＰＥＳ：ポリエチレンスルホン；ｐｐｍ：パーツパーミリオン；ＰＳＩ：重量ポンド毎平方インチ；ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応；ｒｅｃＡＰ：組換えアルカリホスファターゼ；ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：サイズ排除クロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＴＭＰ：膜圧；ＵＦＤＦ：限外濾過／透析濾過；ｖ／ｖ：体積 対 体積；ＷＦＩ：注入のための水

実施例において使用される機器
AKTA Avant；AKTA Bioprocess skid（GE Healthcare社）；AKTA Process；AKTA Purifier；BioPhotometer Plus UV-Vis 分光光度計（Eppendorf社）；BPG 10 cm and 14 cm 径 クロマトグラフィーカラム（GE Healthcare社）；Eppendorf Plus UV-Vis 分光光度計；Fisher Scientific Mini 遠心機；フロアスケール (Ohaus社)；Invitrogen Novex Mini Cell；Mettler Toledo Seven Multi ｐＨおよび伝導率メータ；Millipore Vantage-L カラム；ペリスタポンプ（Millipore社）；スイングバケット遠心機

実施例において使用される材料
１０Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）；２０Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）；１００Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）Invitrogen ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳゲル；15N Planova 中空繊維フィルタ（Asahi Kasei社）５Ｌ ＢＰＣ（Hyclone)；酢酸；Butyl 650M樹脂（Tosoh Bioscience社）；Capto Adhere 樹脂（GE Healthcare社）；Ｄ−ソルビトール；エタノール；Ｌ−アルギニン；Ｌ−アルギニン塩酸塩；Ｌ−ヒスチジン；塩化マグネシウム六水和物；Mimetic Blue AP 樹脂（ProMetic Biosciences社）；Pellicon 2 Ultrafiltration Biomax 10 kDa 0.1 m² (Millipore社)；Pellicon Biomax 10 kDa 50 cm² UF/DF カセット（Millipore社）；Planova 15N ウイスルフィルタ（Asahi Kasei社）；Poros 50 HQ 樹脂（Applied Biosystems社）；塩化ナトリウム；水酸化ナトリウム，50%；リン酸ナトリウム；Ｔｒｉｓ塩酸塩；トロメタミン；Ｔｒｉｓ塩基；Ｔｒｉｓ塩酸塩；ＷＦＩ(Hyclone)；塩化亜鉛

実施例１
製剤安定性試験
ｒｅｃＡＰのための多くの製剤試験は、米国のＫＢＩ ＢｉｏＰｈａｒｍａ社によって行われた。ＣＭＯは、処理の開発および製造のためにＡＭ−Ｐｈａｒｍａ社によって契約された。初期の製剤は、ＡＭ−Ｐｈａｒｍａ社によって以前に開発されたＡＰの形態ＢＩＡＰに使用されたものに基づいた。ＢＩＡＰは、高レベルのグリセロール（２５〜４０％）を含むＴｒｉｓ緩衝液において非常に安定であることが示された。初期の緩衝液の組成物は、以下の通りである。
５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μｍ ＺｎＣｌ_２、２５％（ｗ／ｖ）グリセロール ｐＨ８ ｒｅｃＡＰは、１０ｍｇ／ｍＬにおいてこの緩衝液中で製剤される。この緩衝液中におけるｒｅｃＡＰの最大の溶解度は、確立されなかった。しかし、３５ｍｇ／ｍＬまでのｒｅｃＡＰの濃度は、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μｍ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．２においてもたらされた。

ロバスト性試験
第１の製剤安定性は、以下に注目して行われた。
・ ｐＨロバスト性（７．５〜８．５）、およびＴｒｉｓ緩衝液濃度 ５ 対 ５０ｍＭ
・ 添加剤の種類、および濃度（グリセロール２５％、２％ 対 ２５０ｍＭ ソルビトール）
・ 注射器性能
試料は、ｐＨ、ＤＳＣ、ＤＬＳ、浸透圧、粘度によって分析された。
ｒｅｃＡＰの物理的安定性の軽微な減少は、２５％グリセロール製剤において、ｐＨの低下を用いるＤＬＳによって観察された。Ｚ平均径は、１０ｎｍから１２ｎｍまで増加する。試料均一性は、ｐＨとともに減少し（０．１２〜０．３３ ＰｄＩ）、および粒子寸法分布のピーク幅の増加。
２％グリセロール、または２５０ｍＭ ソルビトール製剤において傾向は、観察されなかった。

５ｍＭ 製剤のｐＨロバスト性は、不適切と考えられたが、有意な問題点は、その他に観察されなかった。

これらの試験において、ｒｅｃＡＰのための製剤緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μｍ ＺｎＣｌ_２、２５％（ｗ／ｖ）グリセロール ｐＨ８に変更された。
強制分解試験
・ 熱ストレス：５０℃で１週間にわたるインキュベーション
・ 凍結／融解ストレス
o ２．５ｍＬ ｍＬ −７５℃のフリーザにおいて２４時間直接凍結し、続いて室温で融解させた。
o ２．５ｍＬを−６５℃まで凍結乾燥器中において０．０５℃／分で凍結させ、０．０５℃／分で２５℃に融解させた。
o １、３、または５回の凍結／融解サイクルへの曝露
・ 攪拌ストレス：室温で５日間にわたる、回転式ラック、および軌道振とうによる。
・ 脱アミド化／塩基加水分解：１ＭＴｒｉｓ塩基を用いて試料をｐＨ≧１０とし、３７℃で５日間にわたるインキュベーション
・ 脱アミド化／酸加水分解：試料を１Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨ≦４とし、３７℃で５日間にわたるインキュベーション
・ 酸化：３７℃で４時間にわたって、０．０４％（ｖ／ｖ）過酸化水素に曝露
・ 光安定性：クールライト ８．００ｋｌｕｘに１５０時間にわたって曝露し、２０時間にわたるＵＶ光の１０．０ワット 時間／平方メートル
全ての試料は、以下によって分析された。
・ ＳＥＣ
・ ＲＰ−ＨＰＬＣ
・ 活性（動態）
・ ｃＩＥＦ
・ Ａ２８０
・ ＳＤＳ−ＣＧＥ
・ ＰｅｐＭａｐ ｗ／ＬＣ／ＭＳ。

加速度的な安定性試験
加速度的な安定性試験が、１０Ｌ／５〜１０グラムスケールの製造工程に由来する原薬を用いて進行中である（表１を参照）。ｒｅｃＡＰ試料は、−７５℃、２〜８℃、および２５℃で保存され、試料は、１月間にわたって試験された。

ｔ＝２月において、ｐＨおよび活性における効果は、見ることができなかった。２５℃におけるいくらかの蒸発は、タンパク質含有量における増加から明らかであり、付随物は、容積測定活性において増加した。Ｔ＝２月の試料の試験に由来するデータセットは、未だ完全ではない。しかし、粒子形成は、これらの試料において存続することが明らかとなった。

粒子形成および性質決定の検討
最近、粒子形成は、１０グラムスケールで製造されたｒｅｃＡＰのバッチにおいて観察された。粒子は、０．２２μｍ濾過後、数日以内で再出現した。視覚的に、粒子は、タンパク性の性質のようである。

寸法分布分析は、広い寸法分布を示す。濾過は、大きな粒子において１００倍の減少をもたらすが、小さな粒子においては１０倍の減少しかもたらさない。

第１の再形成試験が行われ、ｐＨ（７．０〜８．５）、緩衝液の種類（クエン酸塩 対
Ｔｒｉｓ）、緩衝液の強度（５ 対 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ）、および添加剤（ソルビトール、スクロース、グリセロール、ＮａＣｌ、およびアルギニン）が試験された（表２を参照）。２６の製剤のいずれも、濾過後に粒子の形成を抑制しない。しかし、より迅速な粒子形成およびより高いｐＨに向かう傾向があるようである。

製剤スクリーニング試料の外観は、粒子含有量（表３）に基づいて７日間の期間にわたって１〜８のランキングに割り当てられ、結果は、図１および図２に示された。

実施例２
ｒｅｃＡＰ製剤開発
３つの製剤は、凍結−融解、および熱ストレスの間における、ｒｅｃＡＰの粒子形成、および安定性／凝集体を評価するために評価された。製剤は、評価され、以下に列挙される。
２０ｍＭ ヒスチジン、２５０ｍＭ ソルビトール、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．０ ２０ｍＭ クエン酸塩、２５０ｍＭ ソルビトール、５０μＭ
ＺｎＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．０
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５％ グリセロール、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ８．０

試験のための標的タンパク質濃度は、１０ｍｇ／ｍＬであった。試験は、未濾過の、および（０．２μｍ ＰＥＳ膜を通して）濾過されたＤｅｍｏ４ ＤＳを用いて、試料の２つの個別のセットとして行われた。タンパク質試料は、Amicon Ultra 15, 10k MWCO再生セルロースフィルタを用いて製剤緩衝液に緩衝液置換された。フィルタは、タンパク質の添加前に好適な緩衝液で洗浄された。２ｍＬのｒｅｃＡＰの全てが、各ＵＦ／ＤＦ装置に添加された。１０ｍＬの体積の特定緩衝液は、試料に添加され、総量は、〜２ｍＬまで減少した。工程は、全部で４サイクル繰り返された。製剤化試料は、３つのアリコートに分けられた。１ｍＬのアリコートは、２〜８℃で静置され、ゼロ時間、３日目、および１週間における粒子形成を観察された。２つの０．５ｍＬアリコートは、ストレスを受け、１つは、５０℃で１週間にわたって静置され、１つは、５回の凍結融解サイクルに曝露された。試験の結論において、２〜８℃、ストレスを受けた試料は、ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および活性によって共に分析された。

外観の結果
全ての時点において、全ての試料は、透明で無色のようであった。緩衝液置換の前に、未濾過のＤｅｍｏ４ ＤＳは、ゼロ時間において、および試験の最後において〜５０個の小さな粒子を有し、透明で無色のようであった。

緩衝液置換の前に、濾過されたＤｅｍｏ４ ＤＳは、透明で無色のようであり、ゼロ時間において可視粒子なく、試験の最後に１ｍＬあたり４個の小さな粒子を有した。

製剤化試料において、濾過されたおよび未濾過の出発材料の両方から、１〜５個の小さな可視粒子から２０個未満の可視粒子までの粒子の存在が観察され、かなり多くの粒子がＴｒｉｓ／グリセロール製剤において観察された（図３）。

複数回の凍結融解は、ＨＭＷ形成を誘導しない。心臓ストレスは、クエン酸塩／ソルビトール、およびヒスチジン／ソルビトール系製剤において限定されたＨＭＷ形成を生じる。有意なＨＭＷ形成は、Ｔｒｉｓ／グリセロール系製剤における心臓ストレスによって誘導される（表４および図４）。

実施例３
中間洗浄のスクリーニング計画
２つのカラム工程は、宿主細胞タンパク質クリアランスを提供するために、特定の中間洗浄の開発のために選択された。洗浄は、生成物の収率を保つことに焦点を合わされたが、カラム溶出液におけるＨＣＰレベルを有意に減少させた。中間洗浄は、混合型Capto Adhere樹脂、またはアフィニティMimetic Blue樹脂に基づいて最初に選択された。

第１の選別における有望な条件の特定によって、特異的な移動相修飾因子を含む一連の洗浄は、カテプシン様ＨＣＰと樹脂リガンドとの間の潜在的相互作用、ＨＣＰと生成物との間の相互作用、または双方を阻害することができる洗浄製剤を特定するために試験された。表５に示された移動相修飾因子は、単独で、連続して、組み合わせて試験された。

各カラム工程のためのトップ３の洗浄条件は、さらに改善がなされ、続いて、追加効果を実証するために連続したカラム工程の試験がなされた。全精製工程のベンチスケールランは、続いて、改善された処理工程が、原薬であって、ｒｅｃＡＰ比活性を減少させる、または全処理収率に重度の影響を与えることなく、ＨＣＰ規格を満たす原薬をもたらすことを確認するために実施された。研究を通じて、ｃａｔＡ検出を用いる、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットは、ベースラインランに対する比較のための様々な中間洗浄を組み込んで、ＨＣＰクリアランスのレベルを観察するために常に利用された。

Capto Adhereクロマトグラフィー改善
第１中間洗浄の選別
本試験の目的は、生成物と公知のＨＣＰ不純物との間の潜在的相互作用、ＨＣＰ不純物と樹脂リガンドとの間の相互作用、または双方を、生成物：リガンド相互作用に干渉することなく阻害することができるCapto Adhereカラム工程のための中間洗浄を特定することであった。ＨＣＰ不純物との相互作用を阻害することは、究極的には、向上した生成物の精製度をもたらすことであろう。したがって、最初の選別は、Capto Adhere 回収工程のための様々な中間洗浄を試験することと、それらのＨＣＰクリアランスを高める能力を調べるために採用された。第１の選別において利用される中間洗浄は、静電相互作用、疎水性相互作用、または２つの組み合わせを阻害するための組み合わせを含む混合型クロマトグラフィーのための現存する溶出機序に基づいて選択された。修飾因子（すなわち、カオトロピック剤、疎水性修飾因子、塩、またはアルキルグリコール）を含む中間洗浄工程の包含は、ＨＣＰ不純物を用いる任意の現存する相互作用を減少させることができるが、生成物：リガンド相互作用は無傷のままであった。修飾因子の効果のスクリーニングに加えて、ｐＨ７．０および８．０が評価された。

第１の選別のための導入材料は、細胞培養回収物Ｂ０２−１４ＯＣＴ２０１２（すなわち、１×１５Ｌ ＣＣＨ 導入）であった。この細胞培養回収物は、２０１２年１０月に採用された、改訂された供給計画／捕足に組み込まれた（１）。基準コントロール実験は、以下の確立された処理を行われ、カラムは、７．５ＣＶの高塩緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いて洗浄され、続いて平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いて３．０ＣＶ洗浄された（２）。コントロールランに由来する残留ＨＣＰレベルは、７．５ＣＶの高塩の後導入洗浄の直後であって、平衡緩衝液を用いる３．０ＣＶ洗浄前の、合計５．０ＣＶについての図３に挙げた、中間洗浄緩衝液を組み込む一連の実験と比較された。各スクリーニング実験についての生成物は、上流に溶出されるとすぐに、ＵＶ２８０吸光度が≧１．７５ＡＵ／ｃｍの開始条件に達した後、２．０ＣＶについて回収された。

図５は、試験された中間洗浄の製剤と、ＨＣＰレベルおよび生成物収率とを概説した。グラフに示される残留ＨＣＰ値は、基準溶出液に標準化された。生成物の収率（ＲＰ力価を用いて測定された）、およびＨＣＰクリアランスのレベル（ＨＣＰ ＥＬＩＳＡを用いて測定された）は、これらのスクリーニング試験の間に分析された主要な応答であった。基準値よりも高いＨＣＰクリアランスを有する溶出液を生じる中間洗浄は、有望な洗浄候補として選択された。この計画に基づいて、第１選別の結果は、３つの中間洗浄候補を明らかにした。（１）０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０、（２）１Ｍ 尿素、ｐＨ８．０、および（３）０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０他の全ての試験された中間洗浄製剤は、基準コントロールに比べて、２０％を超えて残留ＨＣＰレベルを低減することができなかった。中間洗浄工程の組み込みは、最も高いＨＣＰクリアランスを有する実験を含む、いくつかの実例において得られる生成物に悪影響を与えた（図５）。しかし、生成物収率のわずかな低下は、ＨＣＰクリアランスにおける有意な影響によって正当化することができる。さらなる緩衝液製剤の第２選別は、このカラム工程の間の生成物収率およびＨＣＰクリアランスのバランスを保つことを可能にする中間洗浄を特定するために計画された。

特定の残留ＨＣＰ、カテプシン様タンパク質の量は、非還元条件下においてウエスタンブロットによって観察された。図６は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０、または０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０を含む有望な中間洗浄の２つを組み込む効果を示す。コントロール実験に由来する溶出液（レーン５）と、中間洗浄を含む実験の溶出液（レーン２および４）との比較、ｃａｔＡ不純物の低減を確認した。レーン３は、０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０を用いる中間洗浄の間にカラムから溶出したカテプシン様タンパク質不純物を表した。０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄もｃａｔＡ除去を示したが、洗浄試料は、この特定のウエスタンブロットに含まれなかった。基準溶出液に対する比較によれば、溶出液について０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０洗浄を組み込んだ溶出液についてのカテプシン様タンパク質の約３０％低減があり、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄（レーン２）を有する溶出液について約５０％の低減があった。ウエスタンブロットの結果は、図５に示されたＨＣＰ ＥＬＩＳＡデータと一致し、スクリーニング試験を導くために両方の分析の信頼性を確認した。

生成物の収率とＨＣＰクリアランスとの収集された結果に基づいて（ウエスタンブロット、およびＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって測定されたように）、第１選別から特定された中間洗浄候補のトップは、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０であった。

第２中間洗浄の選別
第１の選別は、残留ＨＣＰにおける少なくとも５０％の減少を提供することができる１つの中間洗浄（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０）を明らかにした。生成物収率は、この特定の洗浄によって悪影響を受けたので、修飾因子であって、タンパク質：リガンドの相互作用を潜在的に強化することができる修飾因子を処理する中間洗浄緩衝液が、第２の選別に組み込まれた。第１の選別からの最も効果的な中間洗浄緩衝液は、それらの追加効果、およびｐＨ値の変化を評価するために、連続して、および組み合わせて試験された（図７）。

上述の処理条件を用いて、基準コントロール実験が行われ、ＨＣＰレベルは、図７に示された中間洗浄緩衝液を組み込んだ一連の実験と比較された。４つの洗浄ブロックを含む中間洗浄の有効性を評価する全ての実験：（１）高塩緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．２５Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いる７．５ＣＶ洗浄、（２）平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いる１．５ＣＶ洗浄、（３）図７に列挙された緩衝液製剤の１つを用いる５．０ＣＶ中間洗浄、および（４）生成物溶出前に平衡緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０）を用いる３．０ＣＶ洗浄。一連の中間洗浄工程を有する実験について、カラム洗浄ブロックは、中間洗浄緩衝液の混合を抑制するために、平衡緩衝液を用いる１．５ＣＶ洗浄によって分離された２つの５．０ＣＶ中間洗浄段階を含めるために変更された。増加した生成物：リガンド結合の可能性を特定するために、回収された導入材料に低濃度の修飾因子を含んだ実験が終了した。各スクリーニング実験からの生成物は、ＵＶ２８０吸光度が≧１．７５ＡＵ／ｃｍの開始条件に到達するとすぐに上流で溶出され、２．０ＣＶの回収に続いた（２）。

試験された中間洗浄の製剤と、標準化ＨＣＰレベルおよび収率値とは、図７に示される。標準化されたＨＣＰレベルは、グラフ（図７Ａ）に含まれた。なぜなら、回収導入材料の２つの異なるロットは、第２選別の間にわたって利用されたからである。残留ＨＣＰレベルは、同一の回収導入材料を用いる基準コントロールラン（すなわち、１×１５Ｌ、または２００Ｌ ＰＤ ＣＣＨ 導入）に標準化された（１）。中間洗浄条件のいくつかは、残留ＨＣＰレベルを減少させ、生成物回収率を維持するが、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０を含む中間洗浄から最も良い結果が得られた。この中間洗浄の組み込みは、基準コントロール実験に比べて、残留ＨＣＰ濃度を２．９倍減少させた。０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０に続いて０．５Ｍ ＡｍＳＯ_４、ｐＨ８．０を用いる一連の洗浄を組み込んだ溶出液も、基準溶出液に比べて２．５倍まで有意なＨＣＰクリアランスを示した。

第１選別と同様に、カテプシン様タンパク質残留ＨＣＰの量は、非還元条件下においてウエスタンブロットによって観察された。図８は、５％グリセロールの有無で、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄を組み込む効果を示す。０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄は、第１選別の間に同定された。コントロール実験（レーン３）に由来する溶出液と、中間洗浄を含む実験からの溶出液（レーン５および７）との比較は、ｃａｔＡ不純物の減少を確認した。レーン４および６は、それぞれ５％グリセロールの有無で、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０を用いる中間洗浄の間にカラムから溶出されたｃａｔＡ不純物を表した。基準溶出液に対する比較後、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄におけるグリセロールの包含は、グリセロール無しの中間洗浄を組み込んだ溶出液の約５０％に比べて、約６５％のわずかに高いｃａｔＡ除去を示した。これらの結果は、様々な修飾因子（すなわち、グリセロール、塩、およびアルギニン）を単一の中間洗浄に組み込んだ追加効果を示した。

Capto Adhere中間洗浄の選択
Capto Adhere中間洗浄スクリーニング試験の終了後、収集された分析データ、特にＨＣＰ ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットの結果は、Capto Adhere回収工程について中間洗浄の選択に利用された（図５、図７、および図８）。スクリーニング試験を通じて、２つの中間洗浄は、基準コントロールランに比べて、有意なＨＣＰ減少を明確に示した。２つの中間洗浄は、（１）０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０、および（２）０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０であった。図８におけるウエスタンブロットは、これらの中間洗浄を組み込んだランに由来する溶出液の直接比較をもたらした。両方の中間洗浄は、基準ランに比べて、特定のＨＣＰ、カテプシン様タンパク質における有意に多い減少をもたらした。しかし、減少のレベルは、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０中間洗浄を受けた溶出液においてわずかに高かった。ＨＣＰ ＥＬＩＳＡデータに基づいて、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０中間洗浄を受けた溶出液は、基準溶出液に比べて、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０にて約４６％に対して、約６５％減少した。より高いＨＣＰクリアランスに加えて、生成物収率は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０中間洗浄を受けた溶出液で高かった。より高いＨＣＰクリアランスおよび生成物収率を考えると、Capto Adhereカラム工程のために選択された中間洗浄は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０であった。

Capto Adhereカラム工程のためのスクリーニング試験は、基準処理を超える明らかなＨＣＰ減少レベルを可能にする中間洗浄を特定することに成功した。回収工程の間にカテプシン様タンパク質不純物の除去のために選択された洗浄は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０であり、カラム洗浄総体積で１７．０ＣＶを含む改善された処理に組み込まれる。改善されたCapto Adhere条件は、最適化された条件が、処理シークエンスにおいて有意に減少したＨＣＰレベルをもたらすことを確認するために小規模処理ランに統合される。

Mimetic BlueAPクロマトグラフィー改善
第１中間洗浄の選別
本試験の目的は、生成物：リガンド干渉を妨げることなく、生成物と公知のＨＣＰ不純物との間の潜在的な相互作用、ＨＣＰ不純物と樹脂リガンドとの間の相互作用、または双方を阻害することができるMimetic Blue APカラム工程のための中間洗浄を特定することであった。Mimetic Blue AP（ＭＢＡＰ）は、特に、アルカリホスファターゼ精製のために開発された合成アフィニティ吸着剤である。リガンドは、機能的なホスホン酸基に結合した青い発色団からなる。ｒｅｃＡＰとリガンドとの間の結合は、リン酸塩の非存在下で生じる。リン酸塩が移動相に導入されるとき、溶出がなされる。この結合機序の特異性は、洗浄緩衝液が、ｒｅｃＡＰ−ＨＣＰ相互作用、および／または樹脂−ＨＣＰ相互作用を阻害するために製剤化することができ、リン酸塩を用いる溶出まで樹脂におけるｒｅｃＡＰ固着を維持するが、移動相においてＨＣＰを除去することができることを示唆した。

第１洗浄スクリーニング実験は、８つのクロマトグラフィーランからなり、それぞれは、異なる中間洗浄工程を含むものであった。本発明の制限の１つは、開発の間に発見された。すなわち、供給流および洗浄緩衝液における高いＮａＣｌ濃度（１３０ｍＭ）の存在は、樹脂の性能を減少させた。この観察は、静電引力もＭＢＡＰ結合機序に必要であり、これが疑似アフィニティ樹脂であることを示唆した。高い収率を維持するために、中間洗浄緩衝液のイオン強度は、このクロマトグラフィーモードにおいて生じる静電相互作用によって制限されるであろう。

Mimetic Blue APカラム導入材料は、洗浄された細胞培養回収物Ｂ０２−１４ＯＣＴ２０１２から作製された。この細胞培養回収物は、２０１２年１０月に採用された、改訂された供給計画／補足に組み込まれた（１）。回収物は、確立された精製方法に従って、Capto Adhere回収、およびPoros HQクロマトグラフィー工程によって精製された（２）。Capto Adhere、およびPoros HQ溶出液は、力価、活性、および残留ＨＣＰについて分析された。Poros HQ 溶出の結果物は、処理の代表として評価され、この調査の第１の１２種のMimetic Blue APランのための導入材料として使用された。

基準コントロール実験は、確立されたＭＢＡＰ精製方法に従って行われた。Mimetic Blue AP樹脂ロットＦＡ０３４５は、２．２ｃｍ径カラムに１６．２ｃｍのベッド高まで充填され、６１．６ｍＬのカラムを得た。基準時において、ＭＢＡＰランが行われ、導入の力価（２×希釈のPoros HQ溶出液）は、未測定であった。したがって、ＵＶ２８０分析は、導入の濃度を近似するために使用された。この近似値を用いて、１０８ｍＬの導入が、２〜３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂のｒｅｃＡＰローディング密度をもたらすことが計算された。

カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒され、平衡化された。１０８ｍＬの２×希釈されたPoros HQ溶出液が、カラムに導入された。第１のスクリーニング試験ランについて、導入後のＥＱ洗浄工程の後に、各ランについて図９に列挙された試験緩衝液を用いる≧３ＣＶ中間洗浄工程が続いた。ランは、洗浄工程の間、タンパク質溶出について観察された。中間洗浄後、カラムは、試験洗浄緩衝液成分を除去するためにＥＱ緩衝液を用いて再度洗浄された。生成物は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ リン酸塩、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０を用いて溶出された。溶出回収物は、ＵＶゲートによるものであった。なぜなら、ピークは、それが５０ｍＡＵに下降するまで２５ｍＡＵに上昇するからである。カラムは、ランの間に取り除かれ、消毒された。溶出液は、力価（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、活性、および残留ＨＣＰ（ＨＣＰ ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット）について分析された。溶出液における残留ＨＣＰ濃度を、収率に有意な影響を与えることなく減少させる任意の洗浄条件は、本試験の第２スクリーニング段階の前に実施されるであろう。

第１のスクリーニングランの結果は、図９および図１０に示される。基準ラン条件は、ｒｅｃＡＰの収率１００％をもたらし、残留ＨＣＰ濃度は、２０４７ｐｐｍであった。４つの中間洗浄条件（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＳＣＮ、および２００ｍＭ アルギニン）は、洗浄工程の間に多くの生成物の損失をもたらした。５％グリセロール、および１０％エチレングリコール洗浄は、収率に不都合に影響を与えなかったが、基準ランに比べて、有意なＨＣＰクリアランスを示さなかった。高い収率（９０％）と、有意なＨＣＰ減少（１０６６ｐｐｍ）との判断基準を満たす条件は、１Ｍ 尿素洗浄工程（ラン４）のみであった。カテプシン様タンパク質検出を用いるウエスタンブロット（図１０Ｂ）は、ラン４に由来する溶出液が、基準ランに比べて、減少したｃａｔＡバンドを示すことを実証した。ブロットは、１Ｍの尿素洗浄においてｃａｔＡを検出し、洗浄が、ｒｅｃＡＰおよびこのＨＣＰ種の間、ならびに／または樹脂およびＨＣＰの間の結合を効果的に阻害することを示した。この結果は、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ分析の知見を裏付けた。

第２中間洗浄の選別
第２スクリーニング試験は、第１スクリーニングランにおいて観察されたＨＣＰクリアランスを向上することを試みて新規の洗浄条件を導入した。塩化ナトリウムおよびＬ−アルギニンは、第１スクリーニングランよりも低濃度で再度試験された。アルギニンは、Capto Adhere第１スクリーニングランにおける選択的ＨＣＰ除去を示したので、我々は、この種類のクロマトグラフィーにおけるアルギニンの使用をさらに検討する必要があった。カオトロープ尿素は、ＭＢＡＰ第１スクリーニングランにおける中程度のＨＣＰクリアランスを示したので、尿素は、塩化ナトリウムと組み合わせて、連続で試験された。１０％のエチレングリコールも、ＨＣＰにおいて低い減少を示したので、ＨＣＰとｒｅｃＡＰとの間、またはＨＣＰとカラムマトリックスとの間の分離を増加させることを試みるために、ＮａＣｌと組み合わせて試験された。最後に、洗浄緩衝液は、ｐＨ依存性相互作用を検出するために、ｐＨ７．０および８．０の双方で試験された。

ＨＣＰクリアランスにおける中間洗浄工程の効果の試験に加えて、我々は、溶出緩衝液中のＮａＣｌを除去する効果を試験した。第１のスクリーニング実験において、我々は、リン酸塩の存在なしで、１００ｍＭ ＮａＣｌが中間洗浄中に約６０％の生成物ブレークスルーをもたらし、２００ｍＭ ＮａＣｌが完全な生成物ブレークスルーをもたらすことを観察した。高いイオン強度において、静電機序は、結合動態を支配し、リガンドにタンパク質を移動相に解放させると理論付けられた。樹脂の選択性は、溶出液であって、低いリン酸塩濃度を有し、ＮａＣｌを含まず、ｒｅｃＡＰの分離とリガンドのホスホン酸塩基とのみを好み、１Ｍ ＮａＣｌ ＋ ０．５Ｍリン酸塩が除去されるまで、ＨＣＰが樹脂に静電気的に結合したままにする溶出液によって向上させることができた。

導入材料の新規ロットは、１２回のＭＢＡＰ試験ランの後に作製された。Capto Adhere精製方法の同時検討は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８．０中間洗浄工程が、Capto溶出液中のＨＣＰを５０％減少させることを示した。したがって、ＭＢＡＰ第２スクリーニングランのための新規ロットの導入材料は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、ｐＨ８．０中間洗浄工程をCapto Adhere精製工程に包含することによって作製された。Poros HQ 50精製方法は、変更されないままであった。

第２のスクリーニングランの結果の要約は、図１１に示される。ラン１０において、基準方法からのずれは、溶出緩衝液中のＮａＣｌの排除のみであり、導入材料およびＥＱ緩衝液を用いる導入後洗浄は、同等であった。溶出緩衝液製剤におけるこの変更のみで、基準ランに比べて、ＭＢＡＰ溶出液のＨＣＰ濃度を約４０％減少させた。したがって、残りのランは、ＮａＣｌなしの溶出緩衝液を用いた。ラン１４〜２０は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−アルギニン、ｐＨ８．０を含む中間ＨＣＰ除去洗浄を組み込んだCapto Adhere溶出液から製造されたＭＢＡＰ導入の新規ロットを用いて行われた。ラン１４は、ＭＢＡＰ溶出緩衝液中のＮａＣｌの除去を組み合わせたCapto工程においてもたらされたＨＣＰ減少が、ＭＢＡＰ精製方法における修飾因子を含む洗浄緩衝液の包含なしで、ＭＢＡＰ溶出液のＨＣＰレベルを６６７ｐｐｍに減少させたことを示した。多くのランは、ＨＣＰ濃度を５００ｐｐｍ未満まで減少させたが、容認可能な生成物収率をもたらさなかった。１０％エチレングリコールと、ｐＨ８のＮａＣｌとの組み合わせ洗浄は、収率に重度の影響を与えることなく（７７％）、ＨＣＰクリアランスを向上させた唯一の中間洗浄製剤であった。この洗浄は、ＨＣＰクリアランスに有効ではなかったが、中間洗浄緩衝液におけるＮａＣｌの包含は、容認できないリスクと考えられた。なぜなら、洗浄緩衝液中のＮａＣｌを用いる多くのランは、大量のｒｅｃＡＰ生成物の損失を示したからである。

ラン１０画分のウエスタンブロット分析であって、ＮａＣｌなしのＭＢＡＰ溶出緩衝液製剤を用いる分析は、溶出液ＨＣＰ濃度の減少が、リン酸塩を用いる溶出工程（ＮａＣｌなし）の間にＨＣＰが樹脂に結合したままであることが原因である可能性があるとの結論を導いた。ＨＣＰ ＥＬＩＳＡの結果は、ラン１０小片における残留ＨＣＰ濃度が、溶出液に比べて上昇したことを示した（図１２Ａ）。ＥＬＩＳＡの結果は、ウエスタンブロットによって確認された（図１２Ｂ）。約５０ｋＤａにおけるｃａｔＡバンドは、導入（レーン２）、ラン１溶出液（レーン３）、およびラン１０小片（レーン６）において観察された。ｃａｔＡバンドは、ラン１０溶出液（レーン５）において存在せず、このことは、ｃａｔＡ ＨＣＰが、この試料のアッセイの検出限界（＜１０００ｐｐｍと推定された）以下に減少したことを示す。同一のバンドは、ラン１０小片のピーク試料においてより明白であった。

２０、４０、６０、および８０ｍＭ Ｌ−アルギニン洗浄工程を組み込んだラン１２は、ＨＣＰの最大の減少を示した。溶出液ＨＣＰ濃度は、＜４０ｐｐｍであったが、収率は、３７％で不十分であった。このランにおいて、アルギニン工程は、ｒｅｃＡＰが樹脂から解離したアルギニン濃度を測定するために個別に集められた。ウエスタンブロットによる洗浄画分の分析（図１２Ｂ）は、ｃａｔＡ ＨＣＰ不純物が、アルギニン洗浄の全てに存在するが、生成物の有意な損失は、６０および８０ｍＭのアルギニン工程まで生じないことを示した。この発見は、４０ｍＭ アルギニン洗浄工程が、ｒｅｃＡＰ：リガンド結合相互作用を妨げることなく、有意な量のＨＣＰをｒｅｃＡＰおよび／または樹脂から選択的に除去することができることを示した。４０ｍＭ アルギニン洗浄は、ＭＢＡＰ中間洗浄スクリーニング実験の第３回においてさらに検討するために選択された。

ＭＢＡＰ中間洗浄工程改善
３つの中間洗浄修飾因子は、さらなる改善のために以前の実験から選択された。第１の洗浄スクリーニング試験において、１Ｍ 尿素は、生成物の回収率に影響を与えることなく、溶出液におけるＨＣＰ減少を示した。第２の洗浄スクリーニング試験において、エチレングリコール ＋ ＮａＣｌは、重度の生成物損失をもたらすことなく、ＨＣＰを減少させた。アルギニンは、選択的なＨＣＰ除去を示したが、４０ｍＭを超える濃度は、収率に悪影響を与えた。実験の次段階は、これらの修飾因子の検討に発展した。ＮａＣｌなしの溶出緩衝液の使用は、同様に進められた。最終のランは、修飾因子洗浄によるカラム性能の減少を試験するために、上位３つの候補を３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂カラムローディングにおいて試験した。

特定の試験洗浄緩衝液製剤と、改善ランの結果の要約とは、図１３に示される。１Ｍ 尿素洗浄は、リン酸塩のみの溶出緩衝液と組み合わせて前もって試験していた。ラン２１および２２は、それぞれ１Ｍおよび２Ｍ 尿素を用いる洗浄緩衝液を利用し、新規のリン酸塩のみの緩衝液を用いて溶出された。ラン２７は、１Ｍ 尿素洗浄を用いて行われたが、カラムに導入されたｒｅｃＡＰの量は、３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂の標的導入密度を増加させた。ラン２１は、１Ｍ 尿素洗浄緩衝液に組み合わされた、１．８ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂におけるカラムローディングが、５９ｐｐｍ ＨＣＰの溶出液と、８３％のｒｅｃＡＰ回収率とをもたらしたことを示した。洗浄緩衝液における尿素濃度、またはｒｅｃＡＰ導入密度の増加は、生成物溶出液におけるより高い残留ＨＣＰ濃度をもたらした（それぞれ、２９９、および３７１ｐｐｍ ＨＣＰ）。

１Ｍ 尿素と１０％エチレングリコール、または４０ｍＭ アルギニンとを組み合わせた中間洗浄緩衝液は、ＨＣＰクリアランス、および生成物収率について評価された。１０％エチレングリコール／１Ｍ 尿素の組合せ洗浄は、高い残留ＨＣＰ濃度を有する生成物をもたらした（７７７ｐｐｍ）。４０ｍＭ アルギニン／１Ｍ 尿素の組み合わせは、２．３ｇ、および３．０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂のカラムローディングで行われた。より低下した生成物導入において、アルギニン／尿素洗浄は、低い残留ＨＣＰ濃度、４６ｐｐｍを有する溶出液をもたらした。得られた７１％のｒｅｃＡＰ生成物収率は、有望な回収率以下であった。同一の精製が、より高いｒｅｃＡＰ導入密度において行われたとき、ＨＣＰクリアランスは、依然として容認可能である（６８ｐｐｍ）が、回収率は、６６％までさらに減少した。

ラン２３および２９は、洗浄工程において、４０ｍＭ アルギニン ｐＨ８．０を用いて行われた。カラムは、ラン２３および２９について、それぞれ１．８ｇおよび３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂の双方で充填された。双方のランは、低い残留ＨＣＰ濃度（５４および５９ｐｐｍ）の溶出液をもたらし、容認可能な収率（８３および８８％）をもたらした。この中間洗浄は、最大のカラム導入容量において、ＨＣＰクリアランス能力、および高い生成物収率を維持した候補のみであった。

Mimetic Blue APカラム工程のためのスクリーニング試験は、生成物の保存における残留ＨＣＰ濃度を約６０ｐｐｍに減少させる、２つの処理の変更を特定した。第１の処理改良は、中間洗浄工程をＨＣＰの選択的クリアランスのためのクロマトグラフィー法に追加することであった。カテプシン様タンパク質不純物の除去のために選択される洗浄は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ｍＭ Ｌ−Ａｒｇ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０であった。この選択された中間洗浄緩衝液の３．０ＣＶの包含は、ＭＢＡＰ処理時間に２０〜３０分間追加するであろう。第２の処理改良は、溶出緩衝液からＮａＣｌを除去することであった。これらの処理改良の組み合わせは、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって測定されたように、残留ＨＣＰにおいて３０倍を超える減少をもたらした。ＭＢＡＰ条件は、これらの知見を確認するために、小規模処理ランに統合された。

処理確認ラン
ＨＣＰ減少実験を終えた後、小規模の確認ランが、改良された処理条件を組み込んで遂行された。細胞培養回収物（２００Ｌ ＰＤ １６ＯＣＴ２０１２）は、ウイルス濾過を除いて、全ての単位操作によって処理された。最終生成物分析は、濾過されたＵＦ／ＤＦ残留物に実施された。各クロマトグラフィー工程の１つのサイクルが行われた。処理中間物は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（力価、および％イソダイマーＡ）、ＥＬＩＳＡ（活性、およびＨＣＰ）、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析された。分析結果の要約は、図１５に見ることができる。新規処理は、３４％の全処理収率で５３ｍｇの精製ｒｅｃＡＰを回収した。

Capto Adhere回収クロマトグラフィー
ＨＣＰ減少実験のCapto AdhereランNo.３２は、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−Ａｒｇ、５％グリセロール、ｐＨ８．０中間洗浄を用いて行われた（セクションＶＩ．Ｃを参照）。この洗浄製剤は、最も高いＨＣＰクリアランスをもたらすことを示し、Capto Adhere法における包含のために選択された。したがって、ランNo.３２に由来する溶出液を、精製処理の残留物を通して精製した。

２００Ｌ ＰＤ １６ＯＣＴ２０１２細胞培養回収物の２９７ｍＬの全ては、Capto AdhereランNo.３２において処理された。回収物の力価は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより、０．６３ｇ／Ｌ ｒｅｃＡＰであった。実際のローディングファクタは、７．８ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。溶出の間に、１８７ｍｇの生成物が回収された。クロマトグラムは、新規の洗浄工程が開始する前に見られたものとは異なる溶出ピーク特性を示した。このランにおいて、ＵＶ２８０溶出ピークは、分割されたが、以前のランにおいて、溶出は、単一ピークであるように見えた（２）。ピーク形状におけるこの変化の理由は、未確定であるが、追加のアルギニン洗浄工程が最大の原因であるようである。クロマトグラムは異なるように見えたが、全ｒｅｃＡＰ収率（９３％）および活性収率（８６％）は、以前のデモランと同等であった。溶出液は、０．２μｍ ＰＥＳフィルタを通して濾過され、２〜８℃で保存された。

ウイルス不活性化、およびPoros 50 HQ 精製
Capto Adhere溶出液は、室温に平衡化された。１．０％トライトン Ｘ−１００の濃度（ＷＦＩにおいて）をもたらすために、４．６５ｍＬの１０％トライトン Ｘ−１００が４１．９ｍｌのCapto Adhere溶出液に添加された。溶出液は、完全に混合され、続いてウイルス不活性化を遂行するために６０分間にわたって静的にインキュベートされた。インキュベーション後、材料は、５１４ｍＬのＷＦＩを用いて１２×希釈された。伝導率の標的は、≦４．５ｍＳ／ｃｍであった。溶液の最終伝導率は、４．１３ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、７．７４であった。

Poros HQ 50樹脂は、１．１ｃｍカラムに、１８．６ｍＬの最終カラム体積について１９．６ｃｍのベッド高まで充填された、カラムの非対称性は、１．１６であり、プレート高は、０．０２５ｃｍであった。このランの実際のローディングファクタは、９．１ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。クロマトグラフィー法は、デモラン５の操作パラメータから変更されなかった（２）。５６ｍＬの溶出液が回収された。分析は、６１％のｒｅｃＡＰ質量収率と、活性において６６％の回収率とを示した。溶出液は、０．２μｍＰＥＳフィルタを通して濾過され、２〜８℃で保存された。Poros HQ 50クロマトグラフィーは
、予期されたように行われた。

Mimetic Blue AP精製
Mimetic Blue APクロマトグラフィー工程は、２つの方法の改良を組み込んだ。４０ｍＭ アルギニンを含む３．０ＣＶ中間洗浄緩衝液が添加された。また、溶出緩衝液は、緩衝液中のＮａＣｌを除去することによって変更された。双方の改良は、処理中間物において、ＨＣＰを減少させるために実施された。

Mimetic Blue AP（ＭＢＡＰ）樹脂は、２．２ｃｍカラムに、６０．８ｍＬの最終カラム体積について１６．０ｃｍのベッド高まで充填された。カラムは、ＨＥＴＰおよび非対称性について試験されなかった。充填カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨ中で浄化され、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ８．０を用いて平衡化された。このランの実際のローディングファクタは、１．６ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。Poros溶出液は、結合の伝導率を減少させるために、ＷＦＩを用いて１：１希釈された。溶出液の体積は、４１ｍＬであった。分析は、８４％のｒｅｃＡＰ質量収率と、活性において８０％の回収率とを示し、デモラン５に見られる回収率をわずかに下回った（２）。ＭＢＡＰ溶出液のＨＣＰ濃度は、３４ｐｐｍであり、導入材料から２５００倍低下した。溶出液は、０．２μｍ ＰＥＳフィルタを通して濾過され、２〜８℃で保存された。

Butyl 650M精製
処理における次の工程は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる最終精製工程を包含した。Butyl 650M樹脂は、１．１ｃｍカラムに、８．３ｍＬの最終カラム体積について８．７ｃｍのベッド高まで充填された。ブチル精製工程のための標的のベッド高は、１９．５ｃｍであるが、高さは、容量近くまで樹脂を導入するために、このランにおいて低下された。カラム非対称性は、１．１７であり、プレート高は、０．０３４ｃｍであった。試料採取後のＭＢＡＰ溶出液は、３７．８ｍＬであった。ＭＢＡＰ溶出液は、３１．９ｇの２．１Ｍ ＡｍＳＯ_４の添加によって、１．０Ｍ ＡｍＳＯ_４に調整された。導入の伝導率は、１３５ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、７．６７であった。このランにおける実際の導入係数は、９．２ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。クロマトグラフィー法は、デモラン５操作パラメータから変更されなかった（２）。４８ｍＬの溶出体積が集められた。沈殿形成の抑制のために、溶出液は、ＡｍＳＯ_４濃度を低下させるために、９６ｍＬ ＷＦＩを用いて１４４．５ｍＬの最終希釈体積まで直ちに希釈された。分析は、８６％ｒｅｃＡＰ質量の収率と、活性において８１％の回収率とを示した。溶出液は、０．２μｍ ＰＥＳ フィルタを通して濾過され、２〜８℃で保存された。Butyl 650Mクロマトグラフィーは、予期されたように行われた。

限外濾過／透析濾過
５０ｃｍ２ Pellicon（Millipore社）Biomax １０ｋＤａ ＰＥＳ限外濾過カセットは、ＵＦ／ＤＦ工程について使用され、１３ｇ／ｍ２の面積に対する質量の比がもたらされた。カセットは、ＷＦＩを用いて洗浄され、続いて製剤緩衝液を用いて平衡化された（２０ｍＭ ヒスチジン、２５０ｍＭ Ｄ−ソルビトール、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．０）。１４５ｍＬの希釈されたブチル溶出液は、４０ｍＬまで約３倍に濃縮された。生成物の少ない体積が原因で、残留分は、さらに濃縮されなかった。濃縮の間に、膜を横断するＴＭＰは、≦１５ｐｓｉで維持された。濃縮後、生成物は、製剤緩衝液を用いて、１０×透析濾過された。材料は、集められ、０．２μＭ ＰＥＳボトルトップフィルタを通して濾過された。生成物の回収後、３０ｍＬの製剤緩衝液は、膜表面から生成物を回収するために、カセットを通して再循環された。緩衝液フラッシュは、残留分に添加されなかったが、別個に保存された。このことは、ＵＦ／ＤＦ残留分の希釈を防ぐために行われた。ＵＦ／ＤＦ工程収率は、残留分におけるｒｅｃＡＰ質量収率６７％、緩衝液フラッシュにおいて１５％であり、全ｒｅｃＡＰ回収率８２％に同等であった。ＨＣＰ濃度は、２ｐｐｍのＬＯＱ未満であった。生成物は、２〜８℃において保存された。

ＨＣＰ減少確認ランの要約
この精製ランの目的は、Capto AdhereおよびMimetic Blue APクロマトグラフィー工程に対してなされる処理の変更が組み込まれる、回収工程からＵＦ／ＤＦおよび最終製剤までの全精製処理を行うことであった。我々は、これらの変更が、ｒｅｃＡＰ分子の活性、または全処理の収率に悪影響を与えることなく、ＢＤＳにおけるＨＣＰ濃度を、≦１００ｐｐｍの標的規格以下に大きく減少させることができると考えた。処理中間物のウエスタンブロット分析は、ｃａｔＡが、Mimetic Blue中間洗浄工程後に検出不可能であることを示した。ＨＣＰ ＥＬＩＳＡによって測定されるように、このランにおいてもらされるＢＤＳにおける残留ＨＣＰ濃度は、＜２ｐｐｍであった（ＬＯＱ未満）。５４３Ｕ／ｍｇの比活性は、規格内であり、全収率は、３４％であった。ＵＦ／ＤＦ工程における生成物回収率は、デモラン４および５におけるよりも低かったが、ＵＦ／ＤＦにおける少ない残留体積は、不十分な生成物回収率をもたらした。ＵＦ／ＤＦ工程の他、工程の収率は、デモラン４および５と同等であり、Capto AdhereおよびＭＢＡＰ処理が、処理の全収率を有意に減少しないことを示した。

実施例４
精製処理
ｒｅｃＡＰについての精製処理は、６つの単位操作を含む。Capto Adhereクロマトグラフィー回収工程は、１％トライトンＸ−１００を用いる溶出液のウイルス不活性化に続く。Poros HQ 50を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーは、界面活性剤を除去し、供給流を部分的に精製する。２つの追加のクロマトグラフィー工程（Mimetic Blue AP およびButyl 650M）は、不純物（すなわち、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ）を規格まで減少させるために行われる。材料は、濃縮され、緩衝液は、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ ＰＥＳ膜を用いて製剤緩衝液に交換された。最後に、精製されたｒｅｃＡＰは、15N Planova中空繊維フィルタを用いてウイルス濾過された。

Capto Adhere回収クロマトグラフィー
回収工程の目的は、細胞培養培地から標的分子を分離し、生成物を濃縮し、部分的にｒｅｃＡＰを精製することである。混合モード樹脂Capto Adhereは、精製処理における回収工程として選択された。Capto Adhereカラムの容量は、８ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂として以前に測定された（３）。

浄化された細胞培養回収物１４ＯＣＴ２０１２ Ｂ０１およびＢ０３は、下流精製のための約２０Ｌの回収物をもたらすために組み合わされた。Capto Adhere樹脂は、消毒されたBPG100カラム（GE Healthcare社）に、１．９Ｌの最終カラム体積について２３．７ｃｍのベッド高まで充填された。カラムの非対称性は、１．４４であり、プレート高は、０．０４９ｃｍであった。充填カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨ中で消毒され、平衡化された。組み合わされた回収物の力価は、ＲＰ−ＨＰＬＣにて０．７ｇ／Ｌであるので、２０Ｌの回収物の全てが処理された。実際のローディングファクタは、７．３ｇ／Ｌ 樹脂であった。回収物をカラムに充填した後、ＮａＣｌ塩洗浄工程が行われ、続いてＮａＣｌ濃度を減少させるためにＥＱ緩衝液洗浄が行われた。溶出は、０．５５Ｍ Ｌ−アルギニン ＋ ０．１Ｍ ＮａＣｌを用いてなされた。方法の溶出段階の間に、流れ方向は、溶出体積を最小化するために反転された。溶出ピーク回収は、ＵＶ２８０が１．７５ＡＵ／ｃｍに上昇したとき、開始した。溶出の２つのＣＶは、０．２μＭ ＰＥＳフィルタを通して、無菌の５０Ｌ ＢＰＣに集められた。溶出体積は、３．９Ｌであった。伝導率は、３８．２ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、７．７９であった。大量のＢＰＣは、次のクロマトグラフィー工程において行われる１３×水希釈を可能にするために選択された。ランは、以前のデモランと同等に行われた。

ウイルス不活性化、およびPoros 50 HQ精製
Capto Adhere溶出液は、室温に平衡化された。５３３ｍＬの１０％トライトンＸ−１００（ＷＦＩ中）は、溶出液に添加され、１．２％の最終濃度をもたらした。（１．０％濃度の標的は、重量測定誤差が原因で超過した。）溶出液は、完全に混合され、続いて静的に６０分間インキュベートされた。インキュベーションの後、材料は、６３．９ＬのＷＦＩを用いて１３×希釈された。伝導率の標的は、≦４．５ｍＳ／ｃｍであった。溶液の最終伝導率は、３．２１ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、７．７２であった。

Poros HQ 50樹脂は、消毒されたBPG100カラム（GE Healthcare社）に、１．６Ｌのカラム体積について２０．０ｃｍのベッド高まで充填された。カラムの非対称性は、１．６３であり、プレート高は、０．０２０ｃｍであった。Poros HQ 50工程の精製パラメータは、以下の１０に列挙されている。充填カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨ中で消毒され、平衡化された。Poros HQ 50カラムの容量は、以前に測定されたように、１０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった（３）。このランの実際のローディングファクタは、８．０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。カラムのローディング後、５０ｍＭ ＮａＣｌ塩洗浄工程は、不純物を除去するために行われた。溶出は、１３０ｍＭ ＮａＣｌを用いて下流で行われた。溶出ピーク回収は、ＵＶ２８０が０．５ＡＵ／ｃｍまで上昇したときに開始した。溶出液の３つのＣＶは、０．２μＭ ＰＥＳフィルタを通して、無菌の１０Ｌ ＢＰＣに集められた。体積は、４．７Ｌであった。溶出液の伝導率は、１４．６ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、８．２２であった。

ランは、ｒｅｃＡＰ収率（６１％）がデモラン４（８５％）におけるよりも低下したことを除けば、以前のデモランと同等に行われた。収率の低下の理由は、不明である。溶出緩衝液の伝導率は、間違った緩衝液製剤が低い収率の原因であるか否か決定するために調べられた。緩衝液は、当該緩衝液の標的伝導率である１４ｍＳ／ｃｍであったので、低いＮａＣｌ濃度は、原因として除かれた。洗浄緩衝液の伝導率は、規格内で良好であり、低い収率が、洗浄緩衝液における生成物損失が原因でないことを示唆する。Poros HQ 50溶出液は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（力価、および％イソダイマーＡ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（純度）、ならびにＥＬＩＳＡ（活性およびＨＣＰ）によって分析された。分析は、６１％のｒｅｃＡＰ質量収率、および活性において６０％回収率を示した。Poros溶出液を導入材料に比較すると、イソダイマーＡの割合は、８２％から９３％まで増加し、ＳＥＣによる純度は、３６％から８７％まで増加した。ＨＣＰは、３倍減少した。溶出液は、２〜８℃で保存された。

Mimetic Blue APの精製
Mimetic Blue AP（ＭＢＡＰ）樹脂は、消毒されたQuickscale１４ｃｍ径カラム（Millipore社）に、２．６Ｌの最終カラム体積について１７．０ｃｍのベッド高まで充填された。カラム非対称性は、１．３７であり、プレート高は、０．０３９ｃｍであった。充填カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒され、平衡化された。ＭＢＡＰカラムの容量は、以前に測定されたように３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった（３）。このランの実際のローディングファクタは、２．９ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。Poros溶出液は、伝導率を減少させるために、ＷＦＩを用いて１：１に希釈された。希釈されたPoros溶出液をカラムに充填した後、未結合材料は、ＥＱ緩衝液洗浄を用いて除去された。溶出は、２５ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌを用いて下流で行われた。溶出は、ＵＶ２８０が０．１２５ＡＵ／ｃｍを超えて上昇し、それがピーク末端にて０．２５ＡＵ／ｃｍに低下するまで集められた。溶出液は、０．２μＭ ＰＥＳフィルタを通して無菌の１０Ｌ ＢＰＣに集められた。体積は、２．４Ｌ、または０．９ＣＶであった。

ランは、以前のデモランと同様に行われた。溶出液は、ＵＶ２８０（力価）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％イソダイマーＡ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（純度）、およびＥＬＩＳＡ（活性およびＨＣＰ）によって分析された。分析は、９２％のｒｅｃＡＰ質量収率と、活性における９６％回収率とを示した。ＳＥＣによる生成物純度は、８７％から９９．６％まで増加した。ＨＣＰは、約５０倍減少した。溶出液は、２〜８℃で保存された。

Butyl 650M精製
Butyl 650M樹脂は、消毒されたBPG100カラム（GE Healthcare社）に、１．５Ｌの最終カラム体積について１９．０ｃｍのベッド高まで充填された。カラム非対称性は、１．３７であり、プレート高は、０．０３９ｃｍであった。充填カラムは、０．５Ｍ ＮａＯＨで消毒され、１．０Ｍ ＡｍＳＯ_４を用いて平衡化された。２．４Ｌ ＭＢＡＰ溶出液は、２．２Ｌの２．１Ｍ ＡｍＳＯ_４の添加によって１．０Ｍ ＡｍＳＯ_４に調整された。導入の伝導率は、１２５．７ｍＳ／ｃｍであり、ｐＨは、７．７７であった。Butyl 650Mカラムの容量は、１０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂として以前に設定された（４）が、現在の処理条件下におけるカラムの真の容量は、厳密に試験されなかった。このランにおける実際の導入は、４．６ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であり、標的ローディングファクタの約半分であった。カラムのローディング後、未結合材料は、ＥＱ緩衝液洗浄によって除去された。溶出は、０．６Ｍ ＡｍＳＯ_４を用いてもたらされた。溶出ピークは、ＵＶが、ピーク末端において０．２５ＡＵ／ｃｍまで低下するまで０．２５ＡＵ／ｃｍの間で集められた。溶出液は、０．２μＭ ＰＥＳフィルタを通して、２０Ｌ ＢＰＣに集められた。体積は、４．４Ｌであった。沈殿形成を防ぐために、溶出液は、ＡｍＳＯ_４濃度を低下させるために、８．８Ｌ ＷＦＩを用いて直ちに希釈された。ランは、以前のデモランと同等に行われた。

限外濾過／透析濾過
デモラン５において、新規の製剤緩衝液は、粒状化する傾向がある物質の溶解性を向上させるために使用された。新規の製剤は、２０ｍＭ ヒスチジン、２５０ｍＭ Ｄ−ソルビトール、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．０であった。２５％グリセロールのＶＦ後添加は、処理から除かれたので、ＵＦ／ＤＦ最終濃度標的は、≧１３．５ｇ／Ｌから≧１１．５ｇ／Ｌまで変化した。

デモラン５について、０．１ｍ２ Pellicon XL（Millipore社）Biomax １０ｋＤａ ＰＥＳ限外濾過カセットが使用され、５７ｇ／ｍ２の面積に対する質量比にもたらした。カセットは、ＷＦＩを用いて洗浄され、続いて製剤緩衝液を用いて平衡化された。希釈されたＨＩＣ溶出液は、１５ｇ／Ｌまで濃縮された。濃縮の間に、膜を横断するＴＭＰは、８〜１５ｐｓｉで維持された。濃縮後、生成物は、製剤緩衝液を用いて１０×透析濾過された。材料は、１Ｌ ＰＥＴＧボトルに集められた。生成物の回収後、１００ｍＬの製剤緩衝液は、膜表面から生成物を回収するためにカセットを通して再循環された。緩衝液フラッシュは、残留分に添加され、溶液は、０．２μＭ ＰＥＳボトルトップフィルタを通して濾過された。最終体積は、４６０ｍＬであった。生成物は、ＵＶ２８０（力価）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％イソダイマーＡ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（純度）、およびＥＬＩＳＡ（活性およびＨＣＰ）によって分析された。分析結果は、表６：デモラン５ ＵＦ／ＤＦの分析結果に示される。ＵＦ／ＤＦ工程の収率は、１０５％のｒｅｃＡＰ質量収率と、活性において８５％の回収率とであった。ＨＣＰ濃度は、１２０ｐｐｍであり、標的の１００ｐｐｍよりも高かった。溶出液は、２〜８℃で保存された。

ウイルス濾過、およびバルク充填
０．０１ｍ２ Planova 15N 中空繊維ウイスルフィルタ（Asahi社）は、ウイルス濾過工程に使用された。カートリッジは、保存緩衝液を抜き取られ、ペリスタポンプを用いて製剤緩衝液によって平衡化された。流速は、膜を横切って１５ｐｓｉ圧力をもたらすために５ｍＬ／分に調節された。ＵＦ／ＤＦ残留分は、室温に平衡化するために冷却保存液から除去された。５〜１０個の小さな白色粒子が、一晩残留分において形成された。残留分は、５ｍＬ／分でフィルタを通って押し出され、無菌のＰＥＴＧボトルに集められた。濾過は、１８０分で終了し、圧力は、処理を通じて１５ｐｓｉで維持された。１０ｍＬの製剤緩衝液は、カートリッジを通って押し出され、集められ、回収率を最大化するために生成物に添加された。濃度は、９６ｍＬの製剤緩衝液の添加によって、９．９ｇ／Ｌに調整された。ウイルス濾過の最終体積は、４９０ｍＬであり、４．８ｇの生成物を得た。試料は、ＵＶ２８０（力価）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（％イソダイマーＡ）、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（純度）、およびＥＬＩＳＡ（活性およびＨＣＰ）によって分析された。ＶＦについて工程収率は、ＵＦ／ＤＦ残留分に比べて、９５％のｒｅｃＡＰ質量収率と、活性において９４％の回収率とであった。

処理における最終工程は、０．２μＭ ＰＥＳボトルトップフィルタによるＶＦ生成物の濾過であった。最終ＢＤＳは、濾過直後、透明であり、粒子を含まなかった。ＢＤＳの分析（表７）は、ウイルス濾過に比べて、９７％のｒｅｃ質量収率と、活性において９８％の回収率とを示した。ＨＣＰ濃度は、１２３ｐｐｍで変化せず、標的の１００ｐｐｍよりも高かった。ＢＤＳは、２〜８℃で保存された。

デモラン５の要約
デモラン５中間処理工程と、最終ＢＤＳとの分析の要約は、表８に示される。

デモラン５のスケールアップ全累積処理質量収率は、４０％であり、活性収率は、４３％であった（表９）。この収率は、４５〜５０％の予期される収率よりもわずかに低いものである。濃度、活性、純度、および残留ＤＮＡの規格は、満たされた。ＢＤＳにおけるＨＣＰ濃度は、１２３ｐｐｍであり、標的の１００ｐｐｍよりも高かった。

実施例５
デモラン結果、および考察
処理の記述
全体処理のためのパラメータは、様々な上流の細胞培養回収物を用いる一連の小規模精製の間に初めて開発された。Capto Adhere および Mimetic Blueクロマトグラフィー工程の処理パラメータは、宿主細胞タンパク質クリアランスのレベルを増加させるためにさらに改良され、以前のデモランに由来するＢＤＳのロットにおいて、粒子の発見、カテプシン様宿主細胞タンパク質（より具体的には、カテプシンＡのハムスターホモログとして質量分析を用いて確認された）として同定された。下流精製処理が改良されるとすぐに、小規模の確認ランを行い、最終処理条件を確認した（１）。デモランの結果は、最終的な上流処理の代表である、浄化された細胞培養回収物（２００Ｌ ＰＤ産生）を利用したこの報告において示された（５）。このデモランについて、上流処理開発チームは、約０．６ｇ／Ｌ ｒｅｃＡＰの逆相（ＲＰ）−力価を有する約７０リットルの浄化された細胞培養回収物をもたらした。回収材料の一部、約２４リットルは、デモラン６に利用された。

約１４グラムの生成物は、列挙された、カラム寸法、カラムローディング、流速、滞留時間、および溶出方法を用いる４つのクロマトグラフィー工程によって精製された（表１０）。生成物が４つのクロマトグラフィー工程によって精製されるとすぐに、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）を行い、生成物を濃縮し、Butyl 650M処理中間物内に存在する硫酸アンモニウムを除去した。ＵＦ／ＤＦ残留物は、続いてPlanova 15Nウイルスフィルタを通して濾過された。最終的に、生成物は、バルク原薬をもたらすために好適な容器に濾過された０．２ミクロンＰＥＳであった。このデモランは、ＵＶ２８０に依拠する全ての濃度計算について１．０１ｍＬ／ｍｇ*ｃｍの測定されたｒｅｃＡＰ減衰係数の使用を組み込まれたことに留意すべきである。

Capto Adhere回収工程
Capto Adhereカラム工程は、浄化された回収物内のｒｅｃＡＰ生成物を回収し、供給流を濃縮するために使用された。回収導入材料の条件は、Capto Adhere樹脂に必須ではなかった。なぜなら、この樹脂は、高い伝導率を有する供給流に耐えることができるからである。導入材料は、環境温度まで平衡化され、１．８６Ｌの充填されたCapto Adhereカラムに導入され、表１１に列挙された条件を用いて精製された。導入される生成物の最大量は１４．０ｇであったので、充填されたCapto Adhereカラムのために８ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂を導入するたった１回のサイクルが必要であっただけである。生成物溶出は、最初のwatch UVコマンドで起こり、続いて２．０カラム体積（ＣＶ）で回収された。溶出に続いて、中間物は、ウイルス不活性化に順応させるために１００Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）に０．２ミクロン濾過され、１２倍希釈された。回収されるとすぐに、Capto Adhere中間物は、ウイルス不活性化および希釈工程に直ちに移された。

Capto Adhereカラムへの実際のローディングは、７．５ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂であった。高塩洗浄（２５０ｍＭ ＮａＣｌ）は、混合モード樹脂にイオン性に結合した不純物（すなわち、ＤＮＡ、ＨＣＰ）を除去するために採用された。高塩洗浄に続いて、平衡化緩衝液を用いる１．５ＣＶ洗浄は、高塩洗浄緩衝液と、塩、Ｌ−アルギニン、およびグリセロールを用いる中間洗浄との潜在的混合が原因である、生成物の損失を防ぐために遂行された。中間洗浄（０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ Ｌ−ａｒｇ、５％グリセロール）は、宿主細胞タンパク質、具体的にはカテプシン様タンパク質（ｃａｔＡ）の除去を増加させるために、改良された下流処理に組み込まれ、基準下流処理を通じて行われた。中間洗浄と、溶出緩衝液との混合を抑制するために、３．０ＣＶ平衡化洗浄が処理に含まれた。生成物の溶出は、予備的開発の間に確立されたように、Ｌ−アルギニンおよび塩化ナトリウムの組み合わせを用いて上流でなされた。watch UV 条件が生じると、最大溶出体積は、２．０ＣＶであった。供給流は、Capto Adhereカラム工程後、２３．７リットルから約３．７リットルまで減少した。

修飾因子の組み合わせを有する中間洗浄（洗浄No.３）の組み込みは、下流処理内の回収工程についてのＨＣＰクリアランスのレベルを向上するために有益であった。全体的に、Capto Adhere処理中間物の分析結果は、以前のデモランに高度に比較することができるが、ＨＣＰクリアランスは有意に増加した。

ウイルス不活性化、およびPoros 50 HQ精製
ウイルス不活性化工程は、効果的に不活性化された潜在的エンベロープウイルスに包含された。不活性化に利用されたトライトンＸ−１００界面活性剤は、生成物充填と、ヒトおよび動物への投与との前に生成物から除去されなければならず、このことは、不活性化に続く処理工程によって達成することができた。ウイルス不活性化に続く精製工程は、Poros HQ樹脂を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーを包含した。この処理工程は、残留トライトンＸ−１００と、追加の不純物（すなわち、ＤＮＡ、ＨＣＰ）とを生成物から除去することを補助するであろう。約１３．８ｇの生成物は、回収工程後に回収され、３８．８ｍＳ／ｃｍの伝導率を有していた。Poros HQ樹脂について最大ローディングは、１０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂を超えず、したがって、１つのサイクルのみが１．５３リットルPoros HQカラムに必要であった。

Capto Adhereクロマトグラフィーと、ウイルス不活性化とは、同日に遂行された。ウイルス不活性化のために、１：９ ｖ／ｖの１０％トライトンＸ−１００保存溶液が、１％トライトンＸ−１００最終濃度をもたらすために、Capto Adhere溶出液に添加された。生成物は、完全に混合され、続いてウイルスの不活性化を遂行するために環境温度で１時間静的に保たれた。充填されたPoros HQカラムへのローディング前に、ウイルス不活性化Capto溶出液は、伝導率を、≦４．５ｍＳ／ｃｍの規格内である４．４ｍＳ／ｃｍに減少させるために、ＷＦＩを用いて１２×（１＋１１）希釈された。ウイルス不活性化、および希釈化Capto Adhere溶出液は、約９ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂のローディングで１．５３Ｌ Poros HQカラムに導入された。生成物は、表１２に列挙された確立された条件を用いて精製された。低塩洗浄（５０ｍＭ ＮａＣｌ）は、材料が導入された後に不純物を除去するために行われた。UV watch条件が起これば、生成物溶出が、３．０ＣＶの最大溶出液回収物について高塩（１３０ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてもたらされた。溶出液は、２〜８℃における保存前に、１０Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）に０．２ミクロン濾過された。

Poros HQ工程のためのクロマトグラフィー特性は、以前の結果と一致し、導入材料中のトライトンＸ−１００の存在が原因で、ローディング間のわずかなＵＶ吸光度をもたらした。クロマトグラムは、３．２ＡＵの最大吸光度で鋭い溶出ピークを明らかにした。２Ｍ ＮａＣｌ除去の間に強いピークが存在し、これは、非生成物に関する不純物であると以前に特定された。

Poros HQ 溶出液は、Capto Adhere中間物に比べて、ＲＰ−ＨＰＬＣ力価法、エンドポイント活性分析、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。精製工程の間の、ｒｅｃＡＰ、および活性回収率は、デモラン５、およびベンチスケール確認ランと同様であり、それぞれ６３％および６８％であった（１，２）。導入材料に比べて、残留ＨＣＰにおいて３倍を超える減少があり、このことは、第１の２つの処理工程が、実際に有意なＨＣＰ減少を可能にするが、追加の精製工程が、≦１００ｐｐｍの標的ＨＣＰ規格を満たす必要があったことを示唆する。％イソダイマーＡは、中間物内において増加し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにて９８．６％の高いｒｅｃＡＰ純度を維持していた。

Mimetic Blue精製
Poros 50 HQ精製の遂行後、後続の精製工程は、Mimetic Blue AP樹脂を用いるアフィニティクロマトグラフィーを包含した。Mimetic Blueカラム工程によって精製されるべき約９ｇの生成物が存在した。２．６Ｌ充填カラムについて、１つのサイクルのみが、約３．３ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ ローディングを必要とした。Poros HQ溶出液は、環境温度に温められ、続いてローディングの前に伝導率を減少させるために、ＷＦＩを用いて２×（１＋１）希釈された。アリコートが希釈されるとすぐに、充填された２．６Ｌ Mimetic Blueカラムに導入され、表１３に列挙された改良条件を用いて精製された。処理条件は、残留ＨＣＰを除去するために、Ｌ−アルギニンを用いる中間洗浄を包含する以前に確立された条件からわずかに修正され、緩衝液混合が原因の生成物損失を抑制するために、平衡緩衝液を用いる洗浄を行った。中間洗浄に加えて、溶出条件は、ナトリウムリン酸塩と塩との組み合わせに代えて、ナトリウムリン酸塩のみの使用による以前のデモランから修正された。Mimetic Blueカラム工程についての改善試験は、溶出緩衝液中における塩を除去した処理中間物について残留ＨＣＰの著しい減少を示したので、処理から排除された（１）。溶出の間、≧０．１２５ＡＵ／ｃｍから≦０．２５ＡＵ／ｃｍの予め規定されたＵＶゲートは、生成物の回収について利用された。生成物は、２〜８℃で保存される前に、無菌の５Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）０．２ミクロンＰＥＳ濾過された。

クロマトグラフィー溶出特性は、以前のデモランに非常によく似ていた。溶出液は、ＲＰ−力価について分析基、残留ＤＮＡについてｑＰＣＲ、酵素活性、残留ＨＣＰ、およびＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度によって分析された。Mimetic Blue精製工程の結果は、ｒｅｃＡＰについて９２％、および活性について９１％の回収率を明らかにした。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度は、約１００％に増加し、ｒｅｃＡＰが中間物内に存在する主要な生成物であることを確認した。残留ＤＮＡのレベルは、≦３５ｐｇ／ｍｇの標的規格をはるかに下回る＜０．５ｐｇ／ｍｇまで減少した。ベンチスケール確認ランと一致して、Mimetic Blue溶出液内に存在する残留ＨＣＰは、改善されたMimetic Blue条件を用いて、約２０００倍に顕著に減少し、このことは、デモラン５において示された５０倍の減少を超える大きな改良であった（１，２）。残留ＨＣＰは、原薬についての≦１００ｐｐｍの標的規格よりも顕著に低下した。Mimetic Blue精製に由来する結果は、Mimetic Blueカラム工程が、以前のカラム工程に比べて最も高いＨＣＰクリアランスをもたらすことを証明した。

Butyl 650M最終精製
処理内における最終的なクロマトグラフィー工程は、Butyl 650M樹脂を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を包含した。ＨＩＣクロマトグラフィーの前に、Mimetic Blue溶出液は、硫酸アンモニウムの添加前に、環境温度に温められた。Mimetic Blue溶出液のＵＶ２８０は、１０ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂を超えない、Butyl 650Mサイクルの最少の数を計算するために使用された。充填された１．４８ＬButyl 650Mカラムについて、１つのサイクルのみが、５．５ｇ ｒｅｃＡＰ／Ｌ 樹脂の最大ローディングに必要であると思われた。カラムローディングの直前に、Mimetic Blue溶出液は、２．１Ｍ ＡｍＳＯ_４ ｐＨ８．０を用いて、１．０Ｍ ＡｍＳＯ_４の最終濃度まで希釈された。カラムローディングは、潜在的な沈殿形成を減少させるために、アンモニウム硫酸塩の添加の１時間以内に遂行された。生成物は、続いて、表１４に列挙された確定条件を用いて精製された。生成物は、≧０．２５ＡＵ／ｃｍから≦０．２５ＡＵ／ｃｍの予め定められたＵＶゲートを用いて、０．６Ｍ ＡｍＳＯ_４で溶出された。カラムから溶出されるとすぐに、溶出液は、ＷＦＩを用いて直ちに３×（１＋２）希釈され、２〜８℃の保存前に、無菌の２０Ｌ ＢＰＣ（Hyclone）に０．２ミクロンＰＥＳ濾過された。

ＨＩＣ工程のためのクロマトグラムは、以前の実験と一致し、１．６ＡＵの最大吸光度を有する溶出ピークをもたらした。Butyl 650M処理中間物は、Mimetic Blue中間物に比較して、濃度、エンドポイント活性アッセイ、ＲＰ−力価、残留ＤＮＡについてのｑＰＣＲ、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ、および純度に関するＳＥＣ−ＨＰＬＣについて、ＵＶ２８０によって分析された。溶出液は、高い比活性と、ｒｅｃＡＰおよび活性について８０％を超える回収率とを維持していた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣによるｒｅｃＡＰの純度は、９９．９％で維持された。高分子量（ＨＭＷ）凝集体は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって観察されず、このことは、アンモニウム硫酸塩が、生成物の品質を変化させず、または生成物の凝集を生じなかったことを示唆する。残留ＨＣＰ濃度は、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡアッセイについて検出限界未満であった（≦３ｐｐｍ）。したがって、残留ＨＣＰ濃度は、ＨＩＣクロマトグラフィー工程後に少なくとも１２倍減少し、このことは、ＨＩＣ工程が、処理の間にＨＣＰのさらなるクリアランスに必要であることを示唆する。

限外濾過／透析濾過
処理のうち次工程は、緩衝液置換に対する限外濾過／透析濾過、ならびに生成物の濃縮を包含した。１０ｋＤａのカットオフ分子量を有する０．１ｍ２ Pellicon 2 Ultrafiltration Biomax カセットは、生成物の濃縮に利用され、続いてアンモニウム硫酸塩を除去するために透析濾過された。膜は、第１に０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて１時間消毒され、ＷＦＩで洗浄され、製剤緩衝液（２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、２５０ｍＭ Ｄ−ソルビトール、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．０）を用いて平衡化された。希釈されたＨＩＣ溶出液は、膜上へのローディング前に環境温度に温められた。膜上にローディングされた生成物は、７０ｇ／ｍ２であった。ＴＭＰは、０．１ｍ２膜について１分毎に０．５Ｌの横断流速を用いるランを通じて、≦１５ＰＳＩに維持された。希釈されたButyl 650M溶出液は、１４ｇ／Ｌまで最初に濃縮され、続いて、製剤緩衝液を用いて１０×透析濾過された。膜は、続いて、ＵＶ２８０による１１．５ｇ／Ｌの標的濃度に達するために、約３１ｍＬの製剤緩衝液を用いて洗浄された。標的濃度に達するとすぐに、残留分は、０．２ミクロンＰＥＳフィルタユニットを用いて濾過され、直ちにウイルス濾過によって処理された。

導入、およびＵＦ／ＤＦ残留分（フラッシュを有する）は、活性、ＵＶ２８０による濃度、ｑＰＣＲによる残留ＤＮＡ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度、および残留ＨＣＰについて分析された。ｒｅｃＡＰの純度は、１００％を維持し、このことは、凝集体形成がないことを示す。ＵＦ／ＤＦ工程の回収率は、約７０％であり、回収率１００％のデモラン５のものよりも低かった（２）。デモラン５処理において利用された同一の膜は、このデモランについて使用され、その再利用は、生成物の損失に起因してもよい。ＵＦ／ＤＦ残留分における残留ＨＣＰ濃度は、ＨＣＰ ＥＬＩＳＡの定量化限度未満であった。

ウイルス濾過、およびバルク充填
バルク充填前において、処理における最終工程は、ウイルス濾過であった。０．００１ｍ２ Planova 15Nフィルタは、５０Ｌ／ｍ２製剤緩衝液を用いて平衡化された（２０ｍＭ Ｌ−ヒスチジン、２５０ｍＭ Ｄ−ソルビトール、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５０μＭ ＺｎＣｌ_２、ｐＨ７．０）。ＵＦ／ＤＦ残留分は、４３０Ｌ／ｍ２ローディングにおける平衡化ウイルスフィルタに適用され、≦１５ｐｓｉの差分圧力を維持した。全ての材料が適用されるとすぐに、フィルタは、フィルタハウジングにおけるタンパク質を回収するために、１０Ｌ／ｍ２の製剤緩衝液を用いて洗浄された。洗浄液は、続いて濾液に添加され、１０．４ｇ／Ｌの最終濃度をもたらした。バルク原薬についての標的規格は、９．０〜１１．０ｍｇ／ｍＬであったので、最終濃度は、ＰＥＳ濾過前の規格範囲内であった。ＢＤＳの作製について、ウイルス濾液は、続いて０．２ミクロンＰＥＳフィルタシステムを通じて１Ｌ ＰＥＴＧ容器に濾過され、２〜８℃で保存された。

導入、フラッシュを有するウイルス濾液、およびバルク原薬は、酵素活性、ｑＰＣＲによる残留ＤＮＡ、ＲＰ−力価、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる純度、ＵＶ２８０による濃度、およびＥＬＩＳＡによる残留ＨＣＰについて分析された。生成物の約９８％は、ウイルス濾過工程後に回収された。比活性、および純度は、双方とも濾過の間に維持された。残留ＨＣＰは、バルク原薬内における≦１００ｐｐｍの標的規格をはるかに下回った。この結果は、改善された処理が、基準処理をはるかに超えるＨＣＰクリアランスを可能にし、以前のデモランを通じて１００ｐｐｍ辺りを示した。

デモラン結果の要約
デモランの終了後、各処理中間物についての分析結果は、図１６に代表して示された。このデモランに関する最も重要な要因は、＜０．５ｐｐｍまでのＨＣＰの顕著なクリアランスであり、Capto AdhereおよびMimetic Blueカラム工程のためにさらに確立された改善された条件を用いて、標的規格の＜１００ｐｐｍをはるかに下回った（１）。

安定性試験
安定性試験は、実施例３で得られた製剤を用いて行われた。示された条件下におけるヒスチジン緩衝液、およびクエン酸塩緩衝液における製剤の結果は、図１７に要約される。

本発明は、以下の実施形態が可能である。
（ａ）単離されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含み、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含む組成物を製造するための方法であって、
以下の化学式を有するリガンドを含む固相であって、Ｒが当該リガンドを当該固相に結合するスペーサ分子を示す固相を提供する工程と、
前記リガンドを、配列番号１に少なくとも９０％の配列同一性を有する単離されたＡＰとＨＣＰとを含む組成物に接触させる工程と、
いくつかの洗浄工程であって、少なくとも１つの洗浄工程が、２０〜１００ｍＭ アルギニン（Ａｒｇ）、０．５〜２Ｍ 尿素、もしくは５〜１５％エチレングリコール、またはそれらの組み合わせを含む洗浄緩衝液を用いて実施される、いくつかの洗浄工程を実施する工程と、
前記ＡＰの少なくとも一部をリガンドから分離することができる溶出緩衝液を用いてＡＰを得る工程とを含むことを特徴とする方法。
（ｂ）洗浄緩衝液は、１ｍＭ未満のＮａＣｌを含むことを特徴とする方法。
（ｃ）溶出緩衝液は、１ｍＭ未満のＮａＣｌを含むことを特徴とする方法。
（ｄ）洗浄緩衝液は、約４０ｍＭ Ａｒｇを含むことを特徴とする方法。
（ｅ）第２精製工程をさらに含み、当該工程が、
以下の式を有する第２リガンドを含む第２固相を提供することと、
前記第２リガンドを、単離されたアルカリホスファターゼとＨＣＰとを含む組成物に接触させることと、
いくつかの洗浄工程であって、少なくとも１つの洗浄工程が、７．５〜８．５のｐＨを有し、０．０５〜０．２Ｍ ＮａＣｌと、０．１〜０．５Ｍ Ｌ−Ａｒｇとを含む第２洗浄緩衝液を用いて行われる、いくつかの洗浄工程を行うこととを含むことを特徴とする方法。
（ｆ）第２の洗浄緩衝液は、１〜２０％グリセロールをさらに含むことを特徴とする方法。
（ｇ）第２の精製工程は、第１の精製工程に先行することを特徴とする方法。
（ｈ）陰イオン交換クロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、ウイルス濾過、および疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる精製工程を含むことを特徴とする方法。
（ｉ）単離されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含む物理的に安定な組成物を製造する方法であって、
緩衝液中のＡＰの溶解または希釈を含み、６．５〜７．５のｐＨを有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭ ソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロール、および／または５〜４０ｍＭ ヒスチジン、および／または１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物をもたらすことを特徴とする方法。
（ｊ）組成物は、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み、当該組成物は、好ましくは、上述の（ａ）〜（ｉ）のいずれか１つの方法によって得られるＡＰを含むことを特徴とする方法。
（ｋ）組成物は、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含み、当該組成物は、２月にわたる２〜８℃における安定性試験の間に可視粒子形成を示さないことを特徴とする組成物。
（ｌ）６．５〜７．５、好ましくは約７のｐＨを有し、１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、または５〜４０ｍＭ ヒスチジンを含むことを特徴とする組成物。
（ｍ）２００〜３００ｍＭ ソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロールを含むことを特徴とする組成物。
（ｎ）アルカリホスファターゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するタンパク質であることを特徴とする方法、または組成物。
（ｏ）ＨＣＰは、カテプシン様タンパク質であり、および／または組換えアルカリホスファターゼは、好ましくは哺乳類宿主細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を含む細胞系発現システムから得られることを特徴とする、方法、または組成物。
（ｐ）医薬としての使用のための組成物。

Claims (8)

1. 単離されたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含む物理的に安定な組成物を製造する方法であって、
   緩衝液中のＡＰの溶解または希釈を含み、６．５〜７．５のｐＨを有し、好ましくは、２００〜３００ｍＭ ソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロール、および／または５〜４０ｍＭ ヒスチジン、および／または１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、またはそれらの任意の組み合わせを含む組成物をもたらすことを特徴とする方法。
2. 前記組成物は、１００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み、好ましくはＡＰをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. １００ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質を含み、２月にわたる２〜８℃における安定性試験の間に可視粒子形成を示さないことを特徴とする組成物。
4. ６．５〜７．５、好ましくは約７のｐＨを有し、１０〜４０ｍＭ クエン酸塩、または５〜４０ｍＭ ヒスチジンを含むことを特徴とする請求項３に記載の組成物。
5. ２００〜３００ｍＭ ソルビトール、および／または１０〜４０％グリセロールを含むことを特徴とする請求項４に記載の組成物。
6. 前記アルカリホスファターゼは、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性、最も好ましくは１００％の配列同一性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 前記ＨＣＰは、カテプシン様タンパク質であり、および／または前記組換えアルカリホスファターゼは、好ましくは哺乳類宿主細胞、より好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞を含む細胞系発現システムから得られることを特徴とする請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
8. 医薬としての使用のための請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。