JP2020122658A - 検体の展開を制御し得る、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験キット - Google Patents
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Abstract
Description
[1] (i) 亜硝酸塩溶液若しくは酸性溶液、並びに
(ii) 亜硝酸塩若しくは酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片
を含むイムノクロマト試験キットであって、
亜硝酸塩又は酸性溶液がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、第4級アンモニウム化合物、リン酸、水酸化ナトリウム、N-アセチル-L-システイン、NaCl、PVA、BSA、及びNaBrからなる群から選択される1つ以上を含む、イムノクロマト試験キット。
[2] サンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在する、[1]のイムノクロマト試験キット。
[3] 固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[1]又は[2]のイムノクロマト試験キット。
[4] 中和試薬が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[1]〜[3]のいずれかのイムノクロマト試験キット。
[5] 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[1]〜[4]のいずれかのイムノクロマト試験キット。
[6] ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがTriton Xであり、第4級アンモニウム化合物が塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムである、[1]〜[5]のいずれかのイムノクロマト試験キット。
イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、 中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を制御して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
本発明は、糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行えるように簡便化し、被検出物質である糖鎖抗原を迅速かつ正確に測定することを可能にするイムノクロマト試験キットに係る。
塩化ベンザルコニウム:5〜20%、好ましくは5〜15%、さらに好ましくは10%
塩化ベンゼトニウム:10mM〜200mM、好ましくは50〜150mM、さらに好ましくは100mM
リン酸緩衝液:100〜500mM、好ましくは150〜350mM、さらに好ましくは250mM
NAOH:0.05N〜3N、好ましくは0.05N〜2N、さらに好ましくは0.1N〜1N
NALC:10mM〜200mM、好ましくは50〜150mM、さらに好ましくは100mM
NaCl:1〜5N、好ましくは2〜4N、さらに好ましくは3N
BSA:0.5〜3%、好ましくは0.5〜2%、さらに好ましくは1%
NaBr:10mM〜200mM、好ましくは50〜150mM、さらに好ましくは100mM
以下の実施例において、%は、特に断らない場合はw/v%を示す。
A群溶連菌連鎖球菌測定イムノクロマト試験片の例
亜硝酸塩、固形状酸性試薬及び中和試薬として以下のものを用いた。
亜硝酸塩(液状試薬) 3.0M亜硝酸ナトリウム
固形状酸性試薬(イムノクロマト試験片に含浸) 1.0Mクエン酸
中和試薬(イムノクロマト試験片に含浸) 3.0Mトリス塩基(Trizma BASE)
抗Streptococcus pyogenes抗体を希釈した液及び抗ウサギIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Streptococcus pyogenes抗体、吸収帯側に抗ウサギIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを乾燥させ、抗Streptococcus pyogenes抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。
抗Streptococcus pyogenes抗体希釈液に着色ポリスチレン粒子を加え、攪拌後、カルボジイミドを加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、緩衝液に再浮遊し、抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子浮遊液を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子(着色ポリスチレン)」と呼ぶ。
2で作製した抗体固定化着色ポリスチレン粒子浮遊液を不織布に所定量を塗布し、乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「C.Pad」と呼ぶ。
上記の中和試薬(塩基性試薬)を濾紙に塗布した。
上記の固形状酸性試薬を不織布に塗布した。塗布後に直ちに乾燥して、固形状酸性試薬含浸領域として固形状酸性試薬含浸不織布を得た。
ストリップのバッキングシートに、まず抗体固定化メンブレン(支持体)を下流から20mmの部分に貼付した。
メンブレンの上流にメンブレンとの間に2mmの重なりをもたせて、抗体結合着色ポリスチレン粒子が塗布された10mm幅のグラスファイバー(C.Pad)を貼付した。
実施例1のイムノクロマト試験片をテストデバイスケース(イムノクロマト試験片を格納する樹脂製のケース)に入れた。3.0M亜硝酸Na溶液のみを含む溶液を対照とし、Triton X-100、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、リン酸、水酸化ナトリウム、NALC、NaCl、PVA、BSA、NaBrを、表1に記載の濃度で3M亜硝酸Na溶液に加えた各条件の溶液を準備した。非特異反応が生じることがわかっている陰性のヒト鼻汁検体を使用し、亜硝酸Na溶液及び上記の各物質を添加した亜硝酸Na溶液で検体を調製し(溶液4:検体1)、試料とした。調製した試料を75μL滴下し、5分後に判定した。
実施例1のイムノクロマト試験片をテストデバイスケースに入れた。亜硝酸Na溶液として、(1)2M亜硝酸Na溶液(PVA無し)、(2)2M亜硝酸Na+ 0.5% PVAを準備した。ヒト咽頭ぬぐい検体にStreptococcus pyogenes生菌を加えた各亜硝酸Na溶液で検体を調製し、試料とした。調製した試料を75μL滴下し、5分後に判定した。
2 標識体領域
3 検出領域
5 固形状酸性試薬領域
6 中和試薬領域
7 吸収帯
8 バッキングシート
9 トップラミネートシート
10 サンプルパッド
Claims (7)
- (i) 亜硝酸塩溶液若しくは酸性溶液、並びに
(ii) 亜硝酸塩若しくは酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片
を含むイムノクロマト試験キットであって、
亜硝酸塩又は酸性溶液がポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、第4級アンモニウム化合物、リン酸、水酸化ナトリウム、N-アセチル-L-システイン、NaCl、PVA、BSA、及びNaBrからなる群から選択される1つ以上を含む、イムノクロマト試験キット。 - サンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在する、請求項1記載のイムノクロマト試験キット。
- 固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、請求項1又は2に記載のイムノクロマト試験キット。
- 中和試薬が、トリスヒドロキシメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のイムノクロマト試験キット。
- 糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のイムノクロマト試験キット。
- ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルがTriton Xであり、第4級アンモニウム化合物が塩化ベンザルコニウム又は塩化ベンゼトニウムである、請求項1〜5のいずれか1項に記載のイムノクロマト試験キット。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載のイムノクロマト試験キットを用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、 中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を制御して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
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