JP2020109114A - Mhc多量体のバーコード標識による抗原認識の判定 - Google Patents
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Abstract
Description
主鎖分子によって連結された2つ以上のMHCと、
前記主鎖と連結された少なくとも1つの核酸分子とを含み、
前記核酸分子が、例えばPCRによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)を含む、多量体主要組織適合複合体(MHC)に関する。
本発明による組成物と、
核酸分子を増幅させる1つまたは複数のセットのプライマーと
を含む、キット・オブ・パーツ(kit of parts)を提供することである。
本発明による1つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体(MHC)または本発明による組成物を準備することと、
前記多量体MHCと前記試料とを接触させることと、
多量体MHCと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、MHCのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、1つまたは複数のMHCと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法を提供することである。
これより、本発明を以下でさらに詳細に説明する。
本発明をさらに詳細に記載する前に、最初に以下の用語および慣例を定義する。
MHC:主要組織適合複合体
多量体MHC:多量体主要組織適合複合体
この文脈では、核酸バーコードとは、10〜50超のヌクレオチドの範囲の固有のオリゴヌクレオチド配列のことである。バーコードには、3’末端と5’末端の増幅配列および中央の固有の配列が共通して存在する。この配列は、シーケンシングによって明らかにすることが可能であるほか、所与の分子に特異的なバーコードとしての役割を果たし得る。
この態様では、シーケンシングは、例えば、増幅されたバーコード(PCR産物)のシーケンシングを多数回反復(総リード数が例えば100,000リード)するディープシーケンシングまたは次世代シーケンシングにも関連することが理解される。いずれのDNAバーコードもほぼ同じ増幅特性を有するため、個々のバーコード配列のリード数はその増幅産物中の存在量と関係があり、それはさらに、増幅前の存在量を表す。したがって、総リード数に対する特定のバーコード配列のリード数は、被験試料中の抗原応答性細胞の存在と相関する。
本発明の一態様は、
主鎖分子によって連結された2つ以上のMHCと、
前記主鎖と連結された少なくとも1つの核酸分子と
を含み、前記核酸分子が、例えばPCRによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)を含む、多量体主要組織適合複合体(MHC)に関する。
MHCは様々な要素からなるものであり、その一部は細胞系で発現および精製され得るもの(例えば、MHC重鎖およびβ−2−ミクログロブリン要素など)である。あるいは、諸要素を化学的に合成してもよい。特異的ペプチドは化学的に合成するのが好ましい。
図2に完全なバーコードライブラリーの作製を示す。図2Aのこのライブラリーは、1000を超える可能性のある多数の異なるペプチド−MHC多量体であって、それぞれが特異的DNAバーコードを有するペプチド−MHC多量体からなる。したがって、それぞれが特異的バーコードを有する数千の異なる特異性の混合物が可能になるまで、バーコード番号1はペプチド−MHC複合体番号1をコードし、バーコード番号2はペプチド−MHC複合体番号2をコードし、バーコード番号3はペプチド−MHC複合体番号3をコードするなどとなる。図2Bは最終試薬を表し、この試薬は、それぞれが各ペプチド−MHC特異性の標識として特異的DNAバーコードを有する多数の異なるMHC−多量体の混合物である。
本発明の組成物はキットの一部を形成し得る。したがって、本発明のさらなる態様は、
本発明による組成物と、
DNA分子を増幅させるための1つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ(kit of parts)に関する。
図3には、このライブラリーを単一試料中の抗原応答性細胞の染色に用いることができる仕組みが示されている。図3Aでは、単細胞懸濁液中の細胞(例えば、限定されるわけではないが、末梢血、組織生検をはじめとする体液に由来し得る)と、図2Bに示されるペプチドライブラリーとを混合する。図3Bでは、染色後、細胞を順次洗浄し、遠心分離して、細胞表面と結合していない残りのMHC多量体を除去する。フローサイトメトリーをはじめとする細胞分取/選別手段により、特定の細胞集団、例えばT細胞(CD8またはCD4拘束性)、その他の免疫細胞またはMHC多量体特異的結合T細胞を分取し得る。図3Cでは、細胞集団から単離されたDNAバーコードオリゴヌクレオチド配列をPCRによって増幅させる。図2Dでは、この増幅産物にディープシーケンシング(10〜100,000のリードが得られる)によるシーケンシングを実施する。選別後、標本中の細胞と結合したDNAバーコードはMHC多量体の非特異的結合のバックグランドによる配列よりも高い頻度で現れるため、シーケンシングによってその特異的バーコード配列が明らかになる。任意の非特異的MHC多量体が1/1000の異なるバーコード(ライブラリーの大きさに左右される)とランダムに結合することによって「シグナル対ノイズ」が相殺されるため、通常の多量体染色よりも感度がさらに高くなる。
本発明による1つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体(MHC)または組成物を準備することと、
前記多量体MHCと前記試料とを接触させることと、
多量体MHCと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、MHCのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、前記結合が、1つまたは複数のMHCと(主鎖を介して)連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、方法に関する。
この技術を用いて様々な特性と細胞集団の抗原特異性とを関連付けることができる仕組みを図4に示す。図4Aは、細胞とバーコード標識したMHC多量体ライブラリーとを結合させた後に特定の刺激に曝露され得る仕組みを示している。この刺激に対する機能的応答(例えば、限定されるわけではないが、サイトカイン分泌、リン酸化、カルシウム放出をはじめとする多数の尺度)に基づいて細胞集団を選別することができる。(図2の諸段階の後に)応答性または非応答性集団を選別した後、DNAバーコードのシーケンシングを実施して抗原応答性を解読し、所与の応答に関与する抗原特異性を判定することができる。
概略的な実施形態では、本発明は、単一試料中の多数の抗原応答性細胞のハイスループットな評価、抗原応答性と機能および表現型の特徴、TCR特異性との結びつけならびに大型のペプチド−MHCライブラリーの所与のTCRに対する定量的結合の判定へのバーコード標識したMHC多量体の使用である。
項目1:単一試料中の異なるT細胞特異性の多重検出へのバーコード標識したMHC多量体の使用であって、可能性として1000超の異なるT細胞特異性の同時検出を可能にし、バーコード標識のシーケンシングによって特異性を明らかにする、使用。
本願に引用されるあらゆる特許および特許以外の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
1.多量体主要組織適合複合体(MHC)であって、
主鎖分子によって連結された2つ以上のMHCと、
主鎖と連結された少なくとも1つの核酸分子と
を含み、
核酸分子が、例えばPCRによって増幅されるよう設計された核酸の中央ストレッチ(バーコード領域)を含む、
多量体主要組織適合複合体(MHC)。
核酸分子を増幅させるための1つまたは複数のプライマーセットと
を含む、キット・オブ・パーツ(kit of parts)。
項目1〜12のいずれかに記載の1つもしくは複数の多量体主要組織適合複合体(MHC)または項目13〜15のいずれかに記載の組成物を準備することと、
前記多量体MHCと前記試料とを接触させることと、
多量体MHCと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、MHCのセットに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、
前記結合が、1つまたは複数のMHCと連結された前記核酸分子のバーコード領域を増幅させることによって検出される、
方法。
実施例1
特許請求される本発明の原理証明としての役割を果たす結果を図5に示す。図5Aは、健常ドナーの末梢血単核球(PBMC)のフローサイトメトリーのデータである。
特異的ヌクレオチド−バーコードと結合したCMV特異的ペプチド−MHC多量体でPBMCを染色した。CMVペプチド−MHC試薬に加え、陰性対照試薬、すなわち、別の特異的バーコード標識と結合したHIV−ペプチドMHC多量体およびバーコードのない追加の陰性対照ペプチド−MHC試薬(p*)の存在下で細胞を染色した(多量体はいずれもPE蛍光標識でさらに標識した)。バックグランド染色が真陽性シグナルに干渉するかどうかの痕跡を得るため、PBMCの染色に用いたMHC多量体の量を1000の異なるペプチド−MHC特異性、すなわち、1×オリゴ標識CMV特異的MHC多量体、1×オリゴ標識HIV特異的MHC多量体および998×非標識p*MHC多量体の染色に必要な量と同じにした。MHC多量体を除去した後、追加の洗浄段階を実施し(0分(A)、30分(B)または60分(C)のいずれか)、全実験のデータを示す。蛍光標識細胞分取(FACS)によりPE−MHC−多量体陽性細胞を分取した。
CMV MHC多量体結合用のDNAバーコードオリゴ:
5GAGATACGTTGACCTCGTTGAANNNNNNTCTATCCATTCCATCCAGCTCACTTAAGCTCTTGGTTGCAT
HIV MHC多量体結合用のDNAバーコードオリゴ:
5GAGATACGTTGACCTCGTTGAANNNNNNTCTATAGGTGTCTACTACCTCACTTAAGCTCTTGGTTGCAT
5=ビオチン−TEG。
結果は、CMVペプチド−MHC多量体と結合したバーコードのみに検出可能なCt値のみを示しており、HIV−ペプチドMHC多量体と結合したバーコードは検出されなかった。
この実験は、他の抗原特異性に関して実施した複数の同様の実験の代表的例である。これらのデータ全体から、以下のことが実現可能であることがわかる:
1)単一試料中の1000の異なるMHC−多量体で染色すると同時に、依然として特異的シグナルを維持すること、
2)DNAバーコードをMHC多量体に結合させること、
3)細胞選別段階の後にDNAバーコードを増幅させること、
4)QPCRにバーコード特異的プローブを用いてバーコードを読み取ること、
5)非特異的MHC多量体のバーコードは検出されないと同時に、試料中に存在する抗原特異的T細胞集団に対応する特異的シグナルを得ること。
この実施例は以下のことに関するものである:
i)本発明の一実施形態で使用するDNAオリゴヌクレオチドの血液標本中での安定性ならびに
ii)特定のタグ化デキストラマー(結合分子がいくつかのペプチド−MHC複合体であり、標識がDNAオリゴヌクレオチドである検出分子)を増加させる本発明の実施形態。被験細胞試料中の特定の細胞(細胞のサブ集団)に対する結合特異性を有するデキストラマーの特定を可能にすること。
DNAタグオリゴの設計。5’プライマー領域(22nt、黄色)−ランダムバーコード領域(6×N−nt)−コドン領域(21nt、緑色/下線部)−3’プライマー領域(20nt、青色)からなる69ヌクレオチド長のビオチン化被験オリゴを調製した:
この実験では、それぞれが固有の特異性を有する以下の3つのDNAタグ化デキストラマー:
デキストラマー1:インフルエンザ(HLA−A*0201/GILGFVFTL/MP/lnfluenza)
デキストラマー2:CMV(HLA−A*0201/NLVPMVATV/pp65/CMV)
デキストラマー3:陰性(HLA−A*0201/ALIAPVHAV/Neg.Control)
を作製する。
a.以下のようにpMHC複合体を作製し、個々のpMHC複合体を同定するための固有のDNAタグとともにデキストランと結合させる。
i.インフルエンザ(HLA−A*0201/GILGFVFTL/MP/lnfluenza)、CMV(HLA−A*0201/NLVPMVATV/pp65/CMV)および陰性(HLA*0201/ALIAPVHAV/Neg.Control)を有するDNAタグ化デキストラマーの作製。
1.デキストラマーストックを160ナノモル(nM)とし、被験オリゴストックを500nMに希釈する。160nMデキストラマーストック10マイクロリットル(μL)と500nM被験オリゴストック10μLとを混合する。室温で10分間インキュベートする。所望の特異性のpMHC複合体1.5μgと混合する。PBSまたはトリス(pH7.4)などの中性pH緩衝液で体積を50μLに調整し、4℃で保管する。これにより、デキストラマー1個当たり約3個のオリゴタグと12個のpMHC複合体とをそれぞれ有するDNAタグ化デキストラマーが得られる。
a.Dex−Oligo−03=被験オリゴ−03とHLA−A*0201/NLVPMVATV/pp65/CMVとを有するデキストラマー。
b.Dex−Oligo−04=被験オリゴ−04とHLA−A*0201/GILGFVFTL/MP/lnfluenzaとを有するデキストラマー。
c.Dex−Oligo−05=被験オリゴ−05とHLA−A*0201/ALIAPVHAV/Neg.Controlとを有するデキストラマー。
a.抗原特異的T細胞の特定に適した細胞試料は、リンパ系細胞の標本、例えば末梢血単核細胞(PBMC)または抗凝固処理血液の標本などである。このような細胞試料の標本は、当業者に公知の標準的技術によって調製される。
b.1E7の範囲のリンパ系細胞(PBMCまたはEDTA抗凝固処理血液由来)を12×75mmのポリスチレン試験管に入れる。
c.5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4)2mlを加える。300×gで5分間遠心分離する。上清を除去し、総体積2.5mlの5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4)に細胞を再懸濁させる。
a.10μMビオチン5μlと、Dex−Oligo−03、Dex−Oligo−04およびDex−Oligo−05それぞれ10μlとを混合する。
a.1E7のリンパ系細胞(2bで得られたもの)2.5mlとDNAタグ化デキストラマーのライブラリー(3aで得られたもの)30μLとを混合する。
b.室温で30分間インキュベートする。
c.300×gで5分間遠心分離し、上清を除去する。
d.5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4)2.5mlにペレットを再懸濁させる。300×gで5分間遠心分離し、上清を除去する。
e.5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4)2.5mlにペレットを再懸濁させる。
a.4eで再懸濁させたリンパ系細胞にWhole Blood CD8 MicroBead(Miltenyi Biotec社、カタログ番号130−090.878)100μLを加える。室温で15分間かき混ぜてCD8+T細胞を捕捉させる。
b.適切なMACS Separatorの磁場にWhole Blood Columnを置く。詳細はWhole Blood Column Kitのデータシートを参照されたい。
c.分離緩衝液(autoMACS Running Bufferまたは5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4))3mlですすぐことによりカラムを調製する。
d.調製したWhole Blood Columnに磁気標識した細胞懸濁液(4e)を加える。未標識細胞を含有する通過画分を収集する。
e.分離緩衝液(autoMACS Running Bufferまたは5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4))3×3mlでWhole Blood Columnを洗浄する。
f.分離器からWhole Blood Columnを取り出し、そこに新たな収集チューブを置く。
g.Whole Blood ColumnにWhole Blood Column Elution Bufferまたは5%ウシ胎児血清を含有するPBS(pH7.4)5mLをピペットで加えることによりCD8+T細胞を捕捉する。直ちにプランジャーをカラムの中に強く押し込むことにより、磁気標識された細胞を洗い流す。
h.300×gで5分間遠心分離し、上清を除去する。収集したCD8+細胞を50μLで再懸濁させ、のちの解析まで−20℃で保管する。
a.シーケンシングあるいはDNAタグ特異的プローブであるLNA−3、LNA−4およびLNA−5を用いるQPCRによって、入力物(3a)と捕捉された画分(5h)に含まれるDNAオリゴタグの比を定量化することにより、リンパ系細胞試料中の抗原特異的T細胞の相対存在量が明らかになる。
i.DNAタグ特異的プローブであるLNA−3、LNA−4およびLNA−5を用いるQPCRによる入力物(3a)と捕捉された画分(5h)に含まれるDNAオリゴタグの比の定量化。
1.a.DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)
b.DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)
c.10〜1E8の被験オリゴ−03、被験オリゴ−04および被験オリゴ−05それぞれの標準曲線
のQPCR反応物25μLを作製する。
2.JumpStart Taq ReadyMix(Sigma−Aldrich社、番号D7440)12.5μlと、順方向−01および逆方向−01それぞれの100μMプライマー0.125μL、10μMのプローブLNA−3、LNA−4またはLNA−5のいずれか0.625μl、参照色素(Sigma−Aldrich社、番号R4526)0.025μlならびにDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)、DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)または10〜1E8の被験オリゴ−03、被験オリゴ−04および被験オリゴ−05それぞれの標準曲線のいずれかの入力物12.5μLとを混合する。
3.2段階のQPCR温度プロファイルのサイクル1=95℃で5分間、サイクル2〜40=95℃で30秒間および60℃で1分間を実施する。
4.被験オリゴ−03、被験オリゴ−04および被験オリゴ−05それぞれのQPCR標準曲線のQPCサイクル時間(Ct)値のプロットにDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)、DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)のCt値をプロットすることにより、3つのMHCデキストラマーのうちの1つに対する抗原特異性を有するT細胞の相対存在量を推定する。
ii.ウルトラディープシーケンシングによる入力物(3a)と捕捉された画分(5h)に含まれるDNAオリゴタグの比の定量化。
1.a.DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)
b.DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)
のPCR反応物25μLを作製する。
2.任意の標準的なPCRマスターミックスを用いて、PCR反応物と、順方向−01および逆方向−01それぞれの10μMプライマー1.25μLおよびDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)またはDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)のいずれか12.5μLとを混合する。純水で25μLまで満たす。例えば、Taq DNAポリメラーゼ、dNTPs、MgCl2および反応緩衝液を含有するPromega社の2×PCR Master Mixを用いる。
3.上記のPCR産物のウルトラディープシーケンシングは、十分に確立された次世代シーケンシング技術、例えばRoche 454、Ion Torrent、Illumina技術をはじめとするPCRアンプリコンシーケンシングのハイスループットシーケンシング技術などを用いて、例えばEurofins Genomics社、GATC Biotech社またはBeckman Coulter Genomics社などの多数の供給業者によって提供され得る。
4.DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)、DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)の相対存在量のPCRアンプリコン解析により、3つのMHCデキストラマーのうちの1つに対する抗原特異性を有するT細胞の相対存在量が明らかになる。
a.QPCRまたはシーケンシングによって推定されるDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)に含まれるDNAオリゴタグの相対存在量および比は、主として3つのパラメータ、すなわち、i)DNAタグ化デキストラマーの作製時(1.a.i.1)にDNAオリゴタグが供給された比、ii)ライブラリー入力物を混合する方法(3a)、およびiii)PCR反応で個々のDNAオリゴタグが増幅される効率による影響を受けることが予想される。
i.1つの例では、3aで作製されQPCRまたはシーケンシングにより測定されるDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物に含まれるDNAオリゴタグの相対比は、互いに1〜10倍になるものと考えられる。
b.QPCRまたはシーケンシングによって推定されるDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)に含まれるDNAオリゴタグの相対存在量および比は、7aに挙げた3つのパラメータに加え、主として3つのほかのパラメータ、すなわち、i)3つのMHC−ペプチドの組合せのうちの1つに対する特異性を有する抗原特異的T細胞の数、ii)所与のMHC−ペプチド複合体に対する所与のT細胞のT細胞受容体の親和性および最後にiii)抗原特異的T細胞およびそれに結合したDNAタグ化MHCデキストラマーを洗浄および細胞捕捉によって未結合のDNAタグ化MHCデキストラマーから分離する効率による影響を受けることが予想される。
i.1つの例では、5hで作製されQPCRまたはシーケンシングにより測定されるDNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物に含まれるDNAオリゴタグの相対比は、リンパ系細胞試料中に抗原特異的T細胞が存在するMHC−ペプチド複合体を有するMHCデキストラマーと結合したDNAオリゴタグが10倍超高くなるものと考えられる。
1.HLA−A*0201/NLVPMVATV/pp65/CMVおよびHLA−A*0201/GILGFVFTL/MP/lnfluenzaに対する抗原特異的T細胞を有し、HLA−A*0201/ALIAPVHAV/Neg.Controlに対する抗原特異的T細胞を有さないインフルエンザ陽性、CMV陽性のHLA−A0201ドナーのリンパ系細胞試料では、被験オリゴ−03(Dex−Oligo−03=被験オリゴ−03とHLA−A*0201/NLVPMVATV/pp65/CMVとを有するデキストラマー)、被験オリゴ−04(Dex−Oligo−04=被験オリゴ−04とHLA−A*0201/GILGFVFTL/MP/lnfluenzaとを有するデキストラマー)および被験オリゴ−05(Dex−Oligo−05=被験オリゴ−05とHLA−A*0201/ALIAPVHAV/Neg.Controlとを有するデキストラマー)の相対比は、被験オリゴ−03および被験オリゴ−04が被験オリゴ−05の10倍超になると予想される。つまり、DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの入力物(3a)に等量供給した場合、被験オリゴ−03および被験オリゴ−04は、DNAタグ化デキストラマーのライブラリーの出力物(5h)のシーケンシングまたはQPCRによる測定で被験オリゴ−05の10倍超の量または頻度でみられると予想される。
これは、あるCMV陽性HIV陰性ドナーの血液を改変して末梢血単核球(PBMC)を得たものを試料とした実施例である。主鎖は、ストレプトアビジンおよび蛍光色素を有するデキストランコンジュゲート(Immudex社のデキストラマー主鎖)とした。
a.試料の取得:Danish Blood Bankから血液を入手した。
b.試料の改変:密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球(PBMC)を単離した。密度勾配媒体であるLymphoprep(Axis−Shield社)は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をRPMI(RPMI1640、GlutaMAX、25mM Hepes;gibco−Life technologies社)で1:1に希釈し、Lymphoprepの上に慎重に重層した。490gで30分間遠心分離した後、細胞の中間層からPBMCを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート(BC)をRPMIで2回洗浄し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO;Sigma−Aldrich社)を含有するウシ胎児血清(FCS;gibco−Life technologies社)中、−150℃で凍結保存した。この実施例に用いたBCをそれぞれのウイルス特異性とともに表6に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のMHC多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
a.この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン(主鎖1つ当たり5〜10個)およびPE形態の蛍光色素(主鎖1つ当たり2〜20個)が共有結合した1000〜2000KDaの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Immudex社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をSAコンジュゲートとも呼ぶ。
a.合成:この実施例のMHC分子は、UV条件的9残基ペプチドリガンド(p*)を有する選択されたHLA−I単量体のUV交換により生成した特異的pMHC単量体とした。条件的リガンドをUV光(366nm)に曝露すると、切断されて結合溝が空になる。空になったMHC−I分子は不安定であるため、そのHLAタイプに適合する別のペプチドに置き換わってレスキューされなければ、その複合体は迅速に分解する。このように、過剰の所望のHLAリガンドとp*MHC単量体とを混合することによって特異的pMHC単量体を生成した。p*MHC単量体は、既に記載されている通りにリフォールディングさせ、ビオチン化し、精製した(Hadrupら,2009)。
i.抗原HIVポリメラーゼ由来のHIV由来ペプチドであるILKEPVHGVおよび抗原pp65TPRに由来するCMV由来ペプチドであるTPRVTGGGAM(Pepscan Presto社、オランダ)をリン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Lonza社)で希釈し、最終濃度100μg/ml:200μM(HLA−A02:ILKEPVHGVおよびHLA−B07:TPRVTGGGAM)になるまで混合した。混合物を366nmのUV光(UVキャビネット;CAMAG社)に1時間曝露し、任意選択で4℃で最大24時間保管した。
b.改変:それ以上改変は実施しなかった。
c.精製:MHC分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、5000gで5分間遠心分離して、溶液中にMHC分子が残らないように沈降させた。
a.合成:標識は、DNA Technology社(デンマーク)から購入し凍結乾燥粉末として送付されたDNAオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で100μMの標識ストック希釈液を作製し、−20℃で保管した。
i.使用した標識は2OS標識システムと命名され、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑度を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。2OSと呼ばれるこの戦略では、2つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列(AオリゴおよびBオリゴ)のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをDNAオリゴヌクレオチド標識として用いた。例えば、22のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列(A標識前駆体)と、55の別の固有のオリゴヌクレオチド配列(B標識前駆体)とを組み合わせることにより、(例えば、表9の100個を有する)1,210の異なる(Ax+By)標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
1.部分的に相補的なAオリゴヌクレオチドとBオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったA+Bオリゴヌクレオチド標識を2つ得た(A1+B1からA1B1が得られ、A2+B2からA2B2が得られた)。AオリゴとBオリゴを表3に記載される通りに混合し、65℃に2分間加熱し、15〜30分で35℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたAオリゴとBオリゴを表3に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で5分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング(左)および伸長(右)に用いた試薬を表3に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(Affymetrix社、番号70770)のものである。
b.改変:いずれの標識も、0.1%Tweenを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度(640nM)に希釈した。
c.精製:標識の精製はそれ以上実施しなかった。
a.合成:MHC分子の調製には、主鎖をビオチン化AxBxオリゴの形態の標識で標識した後、pMHCを加えた。
i.主鎖の2倍過剰の標識(標識:主鎖=2:1)を加えることによりMHC分子の作製を実施し、4℃で少なくとも30分間インキュベートした。標識を結合させた後、任意選択で主鎖を4℃で最大24時間保管した。MHC分子、pMHC単量体を結合させる前に、これらを3300gで5分間遠心分離した。表1に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン(SA)および蛍光色素(PE)を有するSAコンジュゲート(デキストラマー主鎖、Immudex社)をプレートに等分した。等分したSAコンジュゲートに沈殿を避けながらMHC分子を加え、室温で30分間インキュベートした。複合体が形成された後、D−ビオチン(Avidity Bio200)を表1に記載されるpMHC単量体の最終濃度になるまでNaN2の0.02%PBS溶液とともに加え、4℃で少なくとも30分間または最大24時間インキュベートした。組み立てたMHC分子を4℃で最大4週間保管した。2つのMHC分子を2組作製した。2つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように2つの組の間で逆転させた。
1.1×CMV特異的pMHCと2OS−A1B1とを結合させ、1×HIV特異的pMHCと2OS−A2B2とを結合させた。
2.1×CMV特異的pMHCと2OS−A2B2とを結合させ、1×HIV特異的pMHCと2OS−A1B1とを結合させた。
b.改変:それ以上改変は実施しなかった。
c.精製:MHC分子を試料に加える前に3300gで5分間遠心分離して、溶液中にMHC分子が残らないように沈降させた。
a.試料の量:BC形態の1×10E6〜2×10E6の細胞を用いた。
b.MHC分子の量:表1に従った。インキュベーション1回当たり、MHC分子(ペプチド−MHC分子)それぞれについて算出された1μg/mlが必要であった。
c.条件:10%ウシ胎児血清(FBS)を含む37℃のRPMI 10ml中でBCを融解させ、490gで5分間遠心分離し、10%FBSを含むRPMI 10mlで2回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、490gで5分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。2×10E6の細胞をバーコード緩衝液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA/100μg/mlニシンDNA)200μlで洗浄し、染色1回当たり約20μlになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をMHC分子とインキュベートする前に、細胞を50nMダサチニブと37℃で30分間インキュベートした(Lissinaら,2009)。MHC分子を細胞に加える前に、3300gで5分間遠心分離した。インキュベーション1回当たり、5つのMHC分子がそれぞれ(pMHC当たり)1μg/ml必要であった。MHC分子を加えた後、細胞を37℃で15分間インキュベートした。表2に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近IR生存能色素(Invitrogen社、L10119)0.1μlとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のMHC多量体染色と同じであった。細胞を4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞をバーコード緩衝液200μlで2回洗浄し、パラホルムアルデヒドの1%リン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Lonza社)溶液200μl中、4℃で一晩インキュベートした。
a.適用:3つのレーザー(488nm青、633nm赤および405紫)を備えたBD FACSAriaで細胞を分取した。BD FACSDivaソフトウェアバージョン6.1.2を用いてフローサイトメトリーデータの解析を実施した。以下のゲーティング戦略を適用した。FSC/SSCプロットでリンパ球を同定した。単一細胞(FSC−A/FSC−H)、生細胞(近IR生存能色素陰性)およびCD4、CD14、CD16、CD19、CD40陰性(FITC)/CD8陽性細胞(PerCP)に対する追加のゲーティングを用いてCD8T細胞集団を定義した(表2)。MHC分子と結合した細胞は、PerCP陽性集団内にあると定義した。
b.洗浄:フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で2回洗浄した。任意選択で、細胞を1%パラホルムアルデヒドで4℃にて一晩固定し、バーコード緩衝液で2回洗浄した。固定した細胞を4℃で最大1週間保管した。
c.分離:任意選択で、1%パラホルムアルデヒドで固定してから最大で1週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を7aに記載される通りにFACSによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために2%BSA溶液で2時間〜一晩予め飽和させバーコード緩衝液200μlを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素(PE)陽性細胞を5000gで5分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を−80℃で保管した。
a.分取された細胞に由来する標識を表4に記載のQPCRによって解析した。QPCRは以下のキット:Brilliant II QRT_PCR Low ROX Master Mix Kit(Agilent technologies社、番号600837)を用いて実施した。温度プロファイルを表5に記載する。PCRはサーマルサイクラー:Mx3000P qPCRシステム(Agilent Technologies社)で実施した。
分取およびqPCRの後、得られたCt値から、CMVエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、HIVエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された(図7)。
陰性対照バーコード標識pMHCデキストラマーにおけるB7 CMV pp65 TPR特異性の検出。1では固有の2OSバーコードを陽性対照試薬と結合させ、2では別の固有の2OSバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをHIV陰性対照試薬と結合させた。Aは、別個の2OSバーコードを有するCMV pMHC多量体およびHIV pMHC多量体で染色した後のPE陽性集団を示す代表的なドットプロットである。Bは、分取されたPE−pMHC−デキストラマー陽性細胞のマルチプレックスqPCRから得られたCt値である。細胞を1および2でそれぞれ染色した。染色時、陽性対照(CMV)2OSバーコードを結合させた試薬および陰性対照(HIV)2OSバーコードを結合させた試薬は存在したが、陰性対照(HIV)バーコード標識pMHCデキストラマーは明らかに洗い流された。2つの個々の実験から得られた結果は別個のバーで示されている。別個のPCRにそれぞれ約200個の細胞を供した。QPCRは二重反復で実施したものであり、Ct値は二重反復の平均±範囲で示されている。
これは、あるCMV陽性HIV陰性ドナーの血液を改変して(1b)末梢血単核球(PBMC)を得たものを試料(1)とした実施例である。
a.試料の取得:Danish Blood Bankから血液を入手した。
b.試料の改変:密度勾配遠心分離により全血から末梢血単核球(PBMC)を単離した。密度勾配媒体であるLymphoprep(Axis−Shield社)は、炭水化物ポリマーと濃ヨウ素化合物とからなり、血液の個々の成分の分離を促進するものである。血液試料をRPMI(RPMI1640、GlutaMAX、25mM Hepes;gibco−Life technologies社)で1:1に希釈し、Lymphoprepの上に慎重に重層した。490gで30分間遠心分離した後、細胞の中間層からPBMCを血小板とともに回収した。単離された細胞であるバフィーコート(BC)をRPMIで2回洗浄し、10%ジメチルスルホキシド(DMSO;Sigma−Aldrich社)を含有するウシ胎児血清(FCS;gibco−Life technologies社)中、−150℃で凍結保存した。この実施例に用いたBCをそれぞれのウイルス特異性とともに表6に記載する。これらのウイルス特異性は、従来のMHC多量体染色プロトコルによって明らかにされたものである。
a.この実施例では、主鎖は、ストレプトアビジン(主鎖1つ当たり5〜10個)およびPE形態の蛍光色素(主鎖1つ当たり2〜20個)が共有結合した1000〜2000KDaの直鎖状および分岐鎖状デキストラン分子とした。主鎖は実質的には、Immudex社によって記載されているデキストラマー主鎖である。この実施例では、主鎖をSAコンジュゲートとも呼ぶ。
a.合成:実験1のA。
i.実験1と同じ。
b.改変:それ以上改変は実施しなかった。
c.精製:実験1と同じ。
a.合成:この実施例では、標識は、DNA Technology社(デンマーク)から購入し凍結乾燥粉末として送付されたDNAオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で100μMの標識ストック希釈液を作製し、−20℃で保管した。
i.実験1と同じ。
ii.部分的に相補的なAオリゴヌクレオチドとBオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったA+Bオリゴヌクレオチド標識を2つ得た(A1+B1からA1B1が得られ、A2+B2からA2B2が得られた)。AオリゴとBオリゴを表3に記載される通りに混合し、65℃で2分間加熱し、15〜30分で35℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたAオリゴとBオリゴを表3に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で5分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング(左)および伸長(右)に用いた試薬を表3に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(Affymetrix社、番号70770)のものである。
b.改変:いずれの標識も、0.1%Tweenを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度(640nM)に希釈した。
c.精製:標識の精製はそれ以上実施しなかった。
5.MHC分子の調製:必ず所与のpMHCと所与のオリゴヌクレオチドとが結合するように、MHC分子(pMHC)および標識(オリゴヌクレオチド)と主鎖(主鎖、デキストラン−ストレプトアビジン−蛍光色素コンジュゲート)とを結合させてMHC分子を形成した。
a.合成:MHC分子の調製には、主鎖をビオチン化AxBxオリゴの形態の標識で標識した後、pMHCを加えた。
i.主鎖の2倍過剰の標識(標識:主鎖=2:1)を加えることによりMHC分子の作製を実施し、4℃で30分間インキュベートした。MHC分子、pMHC単量体を結合させる前に、これらを3300gで5分間遠心分離した。表1に従って、コンジュゲートしたストレプトアビジン(SA)および蛍光色素(PE)を有するSAコンジュゲート(デキストラマー主鎖、Immudex社)をチューブに等分して入れた。等分したSAコンジュゲートに沈殿を避けながらMHC分子を加え、室温で30分間インキュベートした。複合体が形成された後、D−ビオチン(Avidity Bio200)を表1に記載されるpMHC単量体の最終濃度になるまでNaN2の0.02%PBS溶液とともに加え、4℃で30分間インキュベートした。組み立てたMHC分子を4℃で最大4週間保管した。2つのMHC分子を2組作製した。2つの特異性を有する各組を個々に標識した。標識は、以下に記載するように2つの組の間で逆転させた。
1.iv.1×CMV特異的pMHCと2OS−A1B1とを結合させ、1×HIV特異的pMHCと2OS−A2B2とを結合させた。
2.v.1×CMV特異的pMHCと2OS−A2B2とを結合させ、1×HIV特異的pMHCと2OS−A1B1とを結合させた。
b.改変:それ以上改変は実施しなかった。
c.精製:MHC分子を試料に加える前に5000gで5分間遠心分離して、溶液中にMHC分子が残らないように沈降させた。
a.試料の量:BC形態の1×10E6〜2×10E6の細胞を用いた。
b.MHC分子の量:表1に従った。インキュベーション1回当たり、各MHC分子が5μl必要であった(pMHCに関しては1μg/ml)。
c.条件:10%ウシ胎児血清(FBS)を含む37℃のRPMI 10ml中でBCを融解させ、1500gで5分間遠心分離し、10%FBSを含むRPMI 10mlで2回洗浄した。のちの細胞の洗浄はいずれも、490gで5分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。1×10E6〜2×10E6の細胞をバーコード緩衝液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA/100μg/mlニシンDNA)で洗浄し、染色1回当たり約20μlになるようこの緩衝液に再懸濁させた。細胞をMHC分子とインキュベートする前に、細胞を50nMダサチニブと37℃で30分間インキュベートした。MHC分子を細胞に加える前に、3300gで5分間遠心分離した。インキュベーション1回当たり、各MHC分子がそれぞれ(pMHC当たり)5μl必要であった(pMHCに関しては1μg/ml)。MHC分子を加えた後、細胞を37℃で15分間インキュベートした。表2に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近IR生存能色素(Invitrogen社、L10119)0.1μlとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のMHC多量体染色と同じであった。細胞を4℃で30分間インキュベートした。
a.適用:取得に2つの異なるフローサイトメータを用いた。3つのレーザー(488nm青、633nm赤および405紫)を備えたBD FACSCanto IIおよび5つのレーザーを備えたBD LSR IIサイトメータである。LSR IIのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは4つのみである(488nm青色レーザー、640nm赤色レーザー、355nm UVレーザーおよび405nm紫色レーザー)。さらに、3つのレーザー(488nm青、633nm赤および405紫)を備えたBD FACSAriaおよびFACSAria IIで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、BD FACSDivaソフトウェアバージョン6.1.2を用いた。以下のゲーティング戦略を適用した。CD8陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。FSC/SSCプロットでリンパ球を同定した。単一細胞(FSC−A/FSC−H)、生細胞(近IR生存能色素陰性)およびダンプチャネル陰性/CD8陽性細胞(FITC/PerCP)に対する追加のゲーティングを用いてCD8T細胞集団を定義した。
b.洗浄:フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で2回洗浄した。任意選択で、細胞を1%パラホルムアルデヒドで4℃にて一晩固定し、FACS緩衝液またはバーコード緩衝液で2回洗浄した。固定した細胞を4℃で最大1週間保管した。
c.分離:任意選択で、1%パラホルムアルデヒドで固定してから最大1週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を7aに記載される通りにFACSによって分取し、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、2%BSA溶液で2時間〜一晩予め飽和させ、バーコード緩衝液200μlを入れたチューブに入れた。分取された蛍光色素(PE)陽性細胞を5000gで5分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を−80℃で保管した。
a.分取された細胞に由来する標識を実験1と同様にQPCRにより解析した。
分取およびqPCRの後、得られたCt値から、CMVエピトープと結合した場合にのみ標識を回収し濃縮することに成功し、HIVエピトープと結合した場合には標識は検出されないことが確認された(図8)。
陰性対照バーコード標識pMHCデキストラマーにおけるCMV特異性の検出。1では固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させ、2では別の固有のバーコードを陽性対照試薬と結合させた。各実験の予備のバーコードをHIV陰性対照試薬と結合させた。さらに、1、2ともに998×未標識陰性対照試薬が存在する。
これは、血液を改変して(1b)末梢血単核球(PBMC)を得たものを試料(1)とした実施例である。
a.試料の取得:Danish Blood Bankから血液を入手した。
b.試料の改変:
i.実験1と同じ。
ii.上記の2つの血液試料を混合した。
a.合成:実験1に記載される通り。
i.MHC重鎖およびB2Mの両方を既に記載されている通りに大腸菌(E.coli)に発現させた(Hadrupら,2009)。
ii.p*MHC単量体を既に記載されている通りにリフォールディングさせ精製した(Hadrupら,2009)。
b.修飾:p*UV条件的ペプチドリガンドを検討対象のペプチド抗原に交換して、特異的ペプチドMHC単量体を得た。
i.ペプチド(Pepscan Presto社)をリン酸緩衝生理食塩水(DPBS;Lonza社)で希釈し、384ウェルプレートの個々のウェルで最終濃度100μg/ml:200μM(単量体:ペプチド)になるまで混合した。各ウェルフォーマットで最大体積70μlを調製した。混合物を366nmのUV光(UVキャビネット;CAMAG)に1時間曝露し、任意選択で4℃で最大24時間保管した。
c.精製:実験2と同じ。
a.合成:この実施例では、標識は、DNA Technology社(デンマーク)から購入し凍結乾燥粉末として送付されたDNAオリゴヌクレオチドとした。ヌクレアーゼフリー水で100μMの標識ストック希釈液を作製し、−20℃で保管した。2種類のDNAオリゴヌクレオチド標識を使用し、それぞれ1OSおよび2OSと命名した。
i.120 1OS標識は、5’ビオチン化修飾を有する一本鎖DNAオリゴヌクレオチドとしてDNA Technology社に注文したものである。標識を0.1%Tweenを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度(640nM)に希釈した。1OS標識の配列については表9および10を参照されたい。
ii.2OS標識システムは、限られた数のオリゴヌクレオチド配列の複雑性を組合せ標識作製戦略により増大させて、より限定された数の標識前駆体から多数の固有の標識が得られるよう開発したものである。2OSと呼ばれるこの戦略では、2つの部分的に相補的なオリゴヌクレオチド配列のアニーリングとそれに続く伸長によって新たな固有のオリゴヌクレオチド配列を生じさせ、それをDNAオリゴヌクレオチド標識として用いた(表9および10)。例えば、20のいずれも部分的に相補的な固有のオリゴヌクレオチド配列(A標識前駆体)と、60の別の固有のオリゴヌクレオチド配列(B標識前駆体)とを組み合わせることにより、1,200の異なる(Ax+By)標識のコンビナトリアルライブラリーが得られた。
1.部分的に相補的なAオリゴヌクレオチドとBオリゴヌクレオチドとをアニールさせて、組み合わさったA+Bオリゴヌクレオチド標識を得た。AオリゴとBオリゴを表3に記載される通りに混合し、65℃で2分間加熱し、15〜30分で35℃未満になるまで徐々に冷却した。次いで、アニールしたAオリゴとBオリゴを表3.4に記載される通りに伸長させた。伸長反応の構成成分は使用直前に混合した。混合後、反応物を室温で5分間放置し、アニールしたオリゴヌクレオチドを伸長させた。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのアニーリング(左)および伸長(右)に用いた試薬を表3に記載する。イタリック体で示されている試薬は、Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit(Affymetrix社、番号70770)のものである。
b.改変:いずれの標識も、0.1%Tweenを含むヌクレアーゼフリー水で作業濃度(640nM)に希釈した。次いで、伸長したオリゴヌクレオチド配列2OS標識を1OS標識と同様に処理した。
a.合成:MHC分子の調製には、主鎖をビオチン化オリゴヌクレオチドの形態で標識した後、pMHCを加えた。
i.MHC分子の作製は、別途記載されない限り、主鎖の2倍過剰の標識(標識:主鎖=2:1)を加えることによって実施し、4℃で30分間インキュベートした。新たなバッチの主鎖および/または標識を用いた場合、漸増法を実施した後に必ず標識と主鎖(主鎖)との結合を判定した。MHC分子、pMHC単量体を結合させる前に、これらを3300gで5分間遠心分離した。コンジュゲートしたストレプトアビジン(SA)および蛍光色素(PE)を有するSAコンジュゲート(デキストラマー主鎖、Immudex社)をペプチド交換反応の設定に適合する新たな96ウェルプレートに等分した。PEを組み立てる方法の違い。等分したSAコンジュゲートに沈殿を避けながらMHC分子を加え、室温で30分間インキュベートした。複合体が形成された後、D−ビオチン(Avidity Bio200)をNaN2の0.02%PBS溶液とともに加え、4℃で30分間インキュベートした。組み立てたMHC分子を4℃で最大4週間保管した。
b.改変:組み合わせたMHC分子のパネルの総体積が試料とのインキュベーション1回当たり100μlを上回った場合、体積を減らした。
i.カットオフが300kDaのサイズ排除スピンカラムVivaspin 500(Sartorius社)に2%BSA/PBS 500μlを加えることにより飽和させ、その分量が通過するまで5000gで遠心分離した。次いで、PBS 500μlを加えることによりカラムを2回洗浄し、カラムに分量がほとんどの残らなくなるまで5000gで遠心分離した。組み合わせたMHC分子のパネルをスピンカラムに加え、カラムに所望の分量が存在するまで4℃、5000gで遠心分離した(試料とのインキュベーション1回当たり約80μl)。
c.精製:MHC分子のパネルを細胞に加える前にエッペンドルフチューブに移し、5000gで5分間遠心分離して、溶液中にMHC分子が残らないように沈降させた。
a.試料の量:BC形態の細胞2×10E6。
b.MHC分子の量
c.条件:細胞の洗浄はいずれも、490gで5分間遠心分離した後、上清を除去することを指す。2×10E6の細胞を96ウェルプレートの個々のウェルに移し、バーコード緩衝液(PBS/0.5%BSA/2mM EDTA/100μg/mlニシンDNA)で洗浄し、染色1回当たり約20μlになるようこの緩衝液に再懸濁させた。試料をMHC分子とインキュベートする際、細胞を50nMダサチニブと37℃で30分間インキュベートした(Lissinaら,2009)。MHC分子を細胞に加える前に、3300gで5分間遠心分離した。インキュベーション1回当たり、各MHC分子が3μl必要であった(pMHCに関しては1μg/ml)。MHC分子を加えた後、細胞を37℃で15分間インキュベートした。表2に記載される抗体混合物を、遊離アミンを染色する近IR生存能色素(Invitrogen社、L10119)0.1μlとともに加えた。抗体染色は、実質的に従来のMHC多量体染色と同じであった。細胞を4℃で30分間インキュベートした後、細胞と結合していないMHC分子または抗体を洗浄した。次いで、1%パラホルムアルデヒド50μlを加えることにより細胞を固定した。
a.適用:この実験全体を通じて、取得に2つの異なるフローサイトメータを使用した。3つのレーザー(488nm青、633nm赤および405紫)を備えたBD FACSCanto IIおよび5つのレーザーを備えたBD LSR IIサイトメータである。LSR IIのレーザーのうち、この実験全体を通じて使用したのは4つのみである(488nm青色レーザー、640nm赤色レーザー、355nm UVレーザーおよび405nm紫色レーザー)。さらに、3つのレーザー(488nm青、633nm赤および405紫)を備えたBD FACSAriaおよびFACSAria IIで細胞を分取した。フローサイトメトリーデータの解析にはいずれも、BD FACSDivaソフトウェアバージョン6.1.2を用いた。
i.以下のゲーティング戦略を用いた。CD8陽性細胞の最初のゲーティングはいずれも同じように実施した。FSC/SSCプロットでリンパ球を同定した。単一細胞(FSC−A/FSC−H)、生細胞(近IR生存能色素陰性)およびダンプチャネル陰性/CD8陽性細胞(FITC/PerCP)に対する追加のゲーティングを用いてCD8T細胞集団を定義した。
b.洗浄:フローサイトメトリーによる取得の準備ができた後に細胞をバーコード緩衝液で2回洗浄した。任意選択で、細胞を1%パラホルムアルデヒドで4℃にて一晩固定し、FACS緩衝液またはバーコード緩衝液で2回洗浄した。固定した細胞を4℃で最大1週間保管した。
c.分離:任意選択で、1%パラホルムアルデヒドで固定してから最大1週間後に細胞を取得した。多量体陽性細胞を、分取された細胞に付随するオリゴヌクレオチドの安定性を増大させるために、2%BSAで2時間〜一晩予め飽和させバーコード緩衝液200μlを入れたチューブに分取した。分取された多量体陽性細胞を5000gで5分間遠心分離して、余分な緩衝液をすべて除去した。細胞を−80℃で保管した。
i.単一のコンジュゲート蛍光色素、すなわちPEまたはAPCによる陽性事象を明確にするべくゲートをかけた。
ii.平均蛍光強度(MFI)または染色指数(SI)に基づきpMHCデキストラマーの能力を評価した。SIとは、陰性集団(バックグラウンド)に対する影響の可能性およびバックグラウンドの幅も考慮に入れた集団分離の尺度のことである。
a.シーケンシングを実施する前に、分取された細胞に由来する標識をPCRによって増幅させた。PCRの組成については表4を参照されたい。PCRはキット:Taq PCR Master Mix Kit(Qiagen社、番号201443)を用いて実施した。温度プロファイルを表5に記載する。PCRはサーマルサイクラー:GeneAmp、PCR System 9700(Applied Biosystem社)で実施した。Bio−Rad Gel Doc EZ Imagerでゲル電気泳動を実施した後、PCR産物を可視化した。
i.順方向プライマーおよび逆方向プライマーにはシーケンシング反応のためのアダプター(それぞれIon Torrenシーケンシング(Life Technologies社)に適合したAキーおよびP1キー)を含めた。
ii.さらに、順方向プライマーは試料識別バーコードを有していた(表8)。特異的な試料識別配列を有するプライマーを用いて、個々の試料に由来する分取細胞上の標識およびそれに付随するMHC分子を増幅させた(表8)。これにより、単一試料ごとに由来する配列リードの分布が容易になった。さらに、濃縮されたMHC分子のパネルの入力物(細胞と混合する前)にPCRにより試料識別バーコードを割り付けた(パネル入力物と呼ぶ)。パネル入力物のシーケンシングにより、解析した配列出力物の正規化が可能になるものと思われた。
iii.陽性配列リードをpMHCバーコードアイデンティティの初めから終わりまで、5’末端の試料バーコードアイデンティティから読み取った配列と比較した。リード数を同じ試料バーコードアイデンティティにマッピングされた総リード数およびパネル入力物のリード数によって正規化した。
MHC分子へのデコンボリューション
b.314 Ion Torrentチップ(GeneDx社)でDNAオリゴヌクレオチド標識のシーケンシングを実施した。PCRの際にプライマーを介してアダプターを導入した(アダプター配列については表8を参照されたい)。
i.15個の試料識別バーコードおよび358個のpMHCバーコード(1OS 118個+2OS 240個)の可能な組合せのほか、1OSシステムおよび2OSシステムの両方のプライマー配列およびアニーリング配列からなる配列データベースを作製した。これを集積すると、1回のシーケンシングから予想され得る5370の配列が得られた。次いで、各シーケンシングリードを用いて、マッチリワード1、ミスマッチリワード−2およびギャップ開始、ギャップ伸長ともにギャップコスト2としたヌクレオチドBLASTアルゴリズムにより、データベースでアライメントを検索した。このようにして、シーケンシングリードに実際の配列と比較して塩基がミスコールされていても、挿入/削除されていても、シーケンシングエラーに等しくペナルティを加えた。
ii.以下の基準によりアライメントを破棄した:
1.E値>1e−12;アライメントの長さが不十分である(1OSシステムおよび2OSシステムは、それぞれ60塩基または102塩基を超えなければならない)。
2.対象配列の開始位置が2個以上である、すなわち、試料識別バーコードの固有の部分の6塩基のうちアライメントに含まれる塩基が4個以下である。
3.任意のシーケンシングリードに対して依然として複数のアライメントがみられた場合、パーセント同一性が最も高いアライメントのみを残した。最後に、データベース内の各バーコードにマッピングされたリード数をカウントした。
iii.大きな比率を占めるバーコードの特定:各リードを同じ試料アイデンティティバーコードにマッピングされた総リードカウントに正規化することにより、相対リードカウントを計算した。次いで、相対リードカウントを用いて、対照試料バーコード入力物(細胞と混合しなかったバーコード標識検出分子パネル)と比較した1バーコード当たりの変化倍数を計算した。未処理のリードカウントの割合の同等性を試料と対照バーコード入力物とで比較する2試料検定を用いて、有意に大きな比率を占めるバーコードを特定し、ベンジャミーニ=ホッホベルクFDR法を用いて多重検定のp値を補正した。
この実施例は、異なるpMHC多量体(MHC分子)からなる大きい混合物中に抗原応答性T細胞を検出することが実現可能であることを示している。本発明者らは、バーコード標識MHC多量体の感度が少なくともCD8T細胞の中から0.00032%の特異的T細胞を検出することが可能なものであることを示す。既に記載されている(ロースループットな)方法と正確な相関があることがわかる。
実施例6は、用いた試料が異なる点を除いては実施例5と全く同じように実施される。ここでは、5種類の異なるドナー血液試料中に抗原応答性T細胞を検出する。
この実施例は、DNAバーコードで標識したMHC多量体を用いて異なるドナー試料の多数の異なる特異性を検出することが実現可能であることを示している。得られたデータは、多数のドナーのT細胞反応性をハイスループットにスクリーニングして、疾患発現、ワクチン接種、感染などに関連する免疫反応性を評価することが実現可能であることを示している。
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Claims (23)
- 多量体主要組織適合複合体(MHC)であって、
主鎖分子によって連結された2つ以上のMHC分子と、
前記主鎖と連結された少なくとも1つの核酸分子と
を含み、
前記少なくとも1つの核酸分子が、5’第一プライマー領域と、中央領域(バーコード領域)と、3’第二プライマー領域とを含み、
前記バーコードが、前記2つ以上のMHC分子に固有の特異的な標識として機能する、
多量体MHC。 - 前記少なくとも1つのバーコードが、3’末端および5’末端にPCR反応でバーコードを同時に増幅させることを可能にする共通の増幅配列を有する、請求項1に記載の多量体MHC。
- 前記主鎖分子が、多糖類、例えばデキストランなどのグルカンなど、ストレプトアビジンおよびストレプタマー多量体からなる群より選択される、請求項1または2に記載の多量体MHC。
- 前記2つ以上のMHC分子が、ストレプトアビジン−ビオチン結合および/またはストレプトアビジン−アビジンを介して、ならびに/あるいは前記MHC重鎖および/または軽鎖(B2M)を介して前記主鎖と結合している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記多量体MHCが、少なくとも4個のMHC分子、例えば少なくとも8個、例えば少なくとも10個、2〜30個、2〜20個、例えば2〜10個、例えば4〜10個または例えば15〜30個などのMHC分子からなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、20〜200ヌクレオチド、例えば20〜150ヌクレオチド、例えば20〜100ヌクレオチド、例えば30〜100ヌクレオチド、例えば30〜80ヌクレオチド、例えば30〜50ヌクレオチドなどの範囲の長さを有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、ストレプトアビジン−ビオチン結合および/またはストレプトアビジン−アビジン結合を介して前記主鎖と連結されている、請求項1〜6のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記少なくとも1つの核酸分子が、DNA、RNAおよび/または人工ヌクレオチド、例えばPNAもしくはLNAなどを含むか、これよりなるものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記MHCが、クラスI MHC、クラスII MHC、CD1またはその他のMHC様分子を含む群より選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 前記主鎖が、例えば蛍光標識、Hisタグおよび金属イオンタグからなる群から選択される1つまたは複数の標識などの、1つまたは複数の選択可能な標識をさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の多量体MHC。
- 請求項1〜10のいずれかに記載の多量体主要組織適合複合体(多量体MHC)の異なるサブセットのプールを含む化合物であって、
多量体MHCの各サブセットが、T細胞認識に決定的な役割を果たす異なるペプチドと、関連するバーコード領域を含む固有の核酸分子とを含む、組成物。 - 少なくとも10の異なる多量体MHCのサブセット、例えば少なくとも100、例えば少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、例えば10〜100000、例えば10〜50000、例えば10〜1000または例えば50〜500などの範囲などの多量体MHCのセットを含む、請求項11に記載の組成物。
- 前記固有の核酸分子のプライマー領域は、多量体MHCの各サブセットに対して同一である、請求項7に記載の組成物。
- 試料中の1つまたは複数の抗原応答性細胞を検出する方法であって、
i)請求項1〜10のいずれかに記載の1つもしくは複数の多量体MHCまたは請求項11〜13のいずれかに記載の組成物を準備することと、
ii)前記多量体MHCと前記試料とを接触させることと、
iii)前記多量体MHCと前記抗原応答性細胞との結合を検出して、前記1つもしくは複数の多量体MHCに存在する抗原に応答性の細胞を検出することと
を含み、
前記結合が、
a)前記1つまたは複数の多量体MHCと連結された前記核酸分子の前記バーコード領域をPCRにより増幅させることと、
b)増幅させた前記バーコード領域のシーケンシングと
によって検出される、方法。 - 前記試料が、末梢血試料などの血液試料、血液由来試料、組織試料、または髄液もしくは唾液などの体液からなる群より選択される、請求項14に記載の方法。
- 増幅の前に抗原応答性細胞の1つもしくは複数の集団を選別または選択する、1つまたは複数のステップをさらに含む、請求項14または15に記載の方法。
- 増幅の前に単一細胞選別の1つまたは複数のステップをさらに含む、請求項14〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞選別または選択が、例えばFACSなどのフローサイトメトリー、磁気ビーズによる選択、サイズ排除、勾配遠心分離、カラム吸着およびゲルろ過からなる群より選択される方法を含む、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 抗原応答性細胞の結合の前記検出が、測定値を、例えば陰性対照および/または総応答レベルなどの参照レベルと比較することを含む、請求項14〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記増幅されるバーコード領域のシーケンシングが、ディープシーケンシング、ハイスループットシーケンシングまたは次世代シーケンシングを含む、請求項14〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 所与の選別された単一細胞の抗原特異性が、例えば単一細胞TCRシーケンシングなどの1つまたは複数の追加の単一細胞特性と組み合わせて決定される、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 所定のTCRの親和性および結合モチーフが決定される、請求項14〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 例えば洗浄および/または回転などによって増幅の前に前記多量体MHCと接触した前記試料中の未結合のMHC多量体を除去する、1つまたは複数のステップをさらに含む、請求項14〜22のいずれか1項に記載の方法。
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