JP2020092635A - 培養装置および培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】培養をスケールアップするためには、金属製の圧力容器の一種である培養槽が用いられる。しかし、機械通気により雑菌汚染される危険性が高まる、若しくは規模を変更して運転する場合は、各々の規模に合わせて装置を変えなければならないなどといった課題があった。【解決手段】水が貯留される水槽と、前記水槽中に微細気泡を発生させる微細気泡発生装置と、ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部を有し、被培養生物および培地が収納され、前記フィルム部が前記水槽の水に接するように入れられる培養容器を有することを特徴とする培養装置は、簡便な上に、通気はフィルム部を通じて行うため、通気に伴う雑菌汚染の危険がない。【選択図】図１

Description

本発明は、培養装置および培養方法に関するものであり、特にガス透過性を有し疎水性の高い樹脂製フィルムで作製した密閉容器を、槽内に満たした水中に全部または一部分を沈め、かつ槽内に満たした水中に充満させた微細気泡に接触させることで、容器内への酸素供給を格段に高めることのできる培養装置および培養方法に関する。

培養をする際に微細気泡を利用する方法は、従来から提案されていた。例えば、特許文献１では、発酵槽において液体培地で微生物（但し、偏性嫌気性微生物を除く）を培養する際に、培養中は発酵槽中の培養液をダイヤフラムポンプにより循環させ、その循環中にマイクロバブル発生装置により通気することで、高い生存率及び活性を保持した微生物（例えば酵母、乳酸菌など）を簡便且つ効率的に培養する（増殖させる）ことができる方法が開示されている。

また、植物などを栽培する場合に微細気泡を利用する方法としては、特許文献２において、加圧液体と気体との導入部と円筒状の気泡発生空間を有し、前記導入部内に、前記気泡発生空間に開口する加圧液体導入孔と気体導入孔を形成し、前記加圧液体導入孔を前記導入部の端面に開口し、前記気体導入孔を前記導入部の側面に開口したマイクロバブル発生ノズルと、栽培作物を植え付けた定植パネルを備えた栽培ベッドと、この栽培ベッドに養液を供給するパイプと、このパイプの途中または先端に取り付けた前記マイクロバブル発生ノズルに養液を圧送するポンプとを備えた水耕栽培酸素供給システムが開示されている。

特開２０１５−１９８５９８号公報 特開２００２−１４２５８２号公報

培養をスケールアップするためには、特許文献１に記載しているように、一般に金属製の圧力容器の一種である培養槽が用いられる。これを液体培地で満たして機械通気する方法が最も一般的に採用される。

しかし、それには、下記に代表される種々の問題がある。
１）培養装置が複雑で高価である。
２）操作が複雑で運転に技術を要する。
３）規模を変更して運転する場合は、各々の規模に合わせて装置を変えなければならない。
４）機械通気により雑菌汚染される危険性が高まる。
５）光を必要とする場合、特殊な構造と装置が必要となる。
６）機械通気にともなって生じる物理的ストレスに対して敏感な生物は培養できない。

本発明は上記問題点に鑑みて想到されたものである。具体的に本発明に係る培養装置は、
水が貯留される水槽と、
前記水槽中に微細気泡を発生させる微細気泡発生装置と、
ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部を有し、
被培養生物および培地が収納され、
前記フィルム部が前記水槽の水に接するように入れられる培養容器を
有することを特徴とする。

また本発明に係る培養方法は、
ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部を有する培養容器に被培養生物および培地を収納する工程と、
前記フィルム部に微細気泡を接触させる工程を有することを特徴とする。

本発明によって、上述した問題点（１〜６）は全て解決される。具体的には、以下のとおりである。

１）本発明に係る培養装置では、培養容器は、ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルムで作った袋だけでもよく、単純で安価である。
２）本発明に係る培養装置では、圧力容器は不要であるので、操作は簡単で無菌的に移植操作ができれば誰でも培養できる。
３）本発明に係る培養装置では、培養容器（フィルム製の袋）の数や大きさによって規模の変更が可能なので非常に容易である。
４）本発明に係る培養装置では、培養容器を入れる水槽には微細気泡を発生させるものの、培養容器内には、機械通気しないので、大規模な雑菌汚染の危険性はない。
５）また、被培養生物は培養容器内で培養され、直接通気を受けないので、被培養生物の通気に伴う物理的ストレスは完全に解消できる。
６）本発明に係る培養装置においては、光を必要とする場合は、水槽の周囲の適当な方向から光を照射すればよく、特別な採光の手立てを用意する必要がない。
７）培養容器（フィルム製の袋）の形状、内部に入れる培地量等は、自由に設定でき、それによって、培養途中で培地を追加したり、培養完了まで放置しておく等、いずれの方法も実施できる。

本発明に係る培養装置の構成を示す図である。 培養容器の構成例を示す図である。 保持手段の例を示す図である。 微細気泡を用いた際のフィルムＦの酸素透過速度を測定したグラフである。 イチゴを６週間栽培した結果を示す図である。

以下に本発明に係る培養装置および培養方法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

図１に本発明に係る培養装置の概要を示す。培養装置１には、水槽１０、微細気泡発生装置１２、照明装置１４、培養容器２０、培養容器２０の保持手段１６を有する。水槽１０は、水Ｗを貯留できるものであれば特に限定されるものではない。光を必要とする生物を対象とする場合は、側面１０ｓや底面１０ｂの少なくとも一方が透明部分を有していれば好ましい。

照明装置１４は、光合成が必要な被培養生物ＢＢを培養する際に用いる。光合成が必要な波長および照度があればよい。照明装置１４は水槽１０の透明部分を通じて培養容器２０に光を与える。

微細気泡発生装置１２は、水槽１０内の水Ｗを吸い、微細気泡ＢＬを含んだ水ＷＢ（「微細気泡水ＷＢ」とも呼ぶ。）を水槽１０に返す。微細気泡発生装置１２は、マイクロバブルが発生できるものが望ましい。微細気泡発生装置１２はさらに、ナノバブルも発生していてよい。微細気泡発生装置１２は、水槽１０中に配置してもよいし、水槽１０の外に配置されていてもよい。

水槽１０の底部分には、微細気泡発生装置１２が発生する微細気泡水ＷＢを放出する放出管１２ａが配置されていてもよい。水槽１０に貯留された水に微細気泡ＢＬを充満させるためである。水槽１０中の水Ｗは、微細気泡ＢＬが充満すると微細気泡水ＷＢとなる。

図２（ａ）に培養容器２０の一例を示す。培養容器２０は本体２０ｄに蓋２０ｆで密閉できる構造となっている。本体２０ｄには、ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部２０ａを有していることが必要である。フィルム部２０ａを通して微細気泡ＢＬから酸素を培養容器２０内に取り込むからである。また、本体２０ｄには光を取り込める採光部２０ｂが設けられていてもよい。被培養生物ＢＢには、光合成を行わせる場合もあるからである。

採光部２０ｂには、透明なフィルムや樹脂若しくはガラスなどで、培養容器２０内部に光を取り込めるようにする。なお、培養容器２０は、採光部２０ｂが必ず水面に対して上側を向き、フィルム部２０ａが水面に対して下側を向くような構造であれば好ましい。

フィルム部２０ａを構成するガス透過性を有しかつ疎水性のフィルムＦ（単に「フィルムＦ」とも呼ぶ。）としては、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂（ＰＦＡ）、四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）あるいはエチレン・四フッ化エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）の少なくとも一種の樹脂フィルムを好適に利用することができる。なお、フィルム部２０ａを構成するフィルムＦは複数種類で構成されていてもよい。

培養容器２０内に収納される被培養生物ＢＢには、特に制限はない。しかし、本発明に係る培養装置１では、培養容器２０内への酸素の供給速度が高くなる。したがって、酸素を必要とする生物であるのが望ましい。具体的には、微生物、菌類、植物、細胞といった生物を好適に培養することができる。培養容器２０内には、被培養生物ＢＢと共に、生物毎に好適な培地を入れることができる。ここでは、被培養生物ＢＢには、培地も含まれるものとして説明を続ける。

培養容器２０内には、被培養生物ＢＢ以外に空気が溜まるスペースＳがあってもよい。スペースＳには、被培養生物ＢＢの好みに応じて空気や空気以外の物（気体、液体、固体のいずれでもよい）が含まれていてもよい。

培養容器２０の非常に単純な構成の一例としては、フィルムＦを袋状にし、被培養生物ＢＢを入れ、クリップ２１で開口部を気密に閉じる形態である（図２（ｂ）参照）。この場合フィルムＦが透明であれば、フィルムＦ自体がフィルム部２０ａであり、また採光部２０ｂを構成する。

図１を再度参照して、保持手段１６は、培養容器２０を水槽１０の水中に沈め、その状態を保持するための手段である。培養容器２０は水槽１０に貯留された水に全部沈めるのが望ましい。しかし、培養容器２０のフィルム部２０ａが水槽１０の微細気泡ＢＬを含んだ水に接するように保持できればよい。

図３に保持手段１６の例を示す。なお、図３では、水槽１０と培養容器２０と保持手段１６だけを示し、その他の部材については、記載を省略している。図３（ａ）を参照すると、水槽１０の上部から培養容器２０を水中に押し込むタイプが挙げられる。

保持手段１６−１は、水槽１０の上部に固定された枠１６−１ａから押さえ具１６−１ｂが突設された構造になっている。押さえ具１６−１ｂの形状は特に限定されるものではない。このような保持手段１６−１は、培養容器２０が浮力を有している場合に有効である。

図３（ｂ）を参照すると、培養容器２０が浮き上がらないよう、若しくは沈んで底に沈降してしまわないように、水槽１０の内部に設けたアーム１６−２ｂのようなタイプが挙げられる。水槽１０の上部に固定された枠１６−２ａから水槽１０内に延設されたアーム１６−２ｂには、連結紐１６−２ｃが備えられている。この連結紐１６−２ｃに培養容器２０を連結しておくことで、培養容器２０は、連結紐１６−２ｃの長さ以上には水面へも底面へも行かず保持することができる。

図３（ｃ）を参照すると、培養容器２０をザル１６−３に入れ、ザル１６−３毎水槽１０に沈めるタイプが挙げられる。もちろん、これ以外の方法で培養容器２０を水中に保持する方法も保持手段１６に含まれる。

なお、培養容器２０のフィルム部２０ａが水面に接するのであれば、培養容器２０をそのまま水槽１０に投入しただけであってもよい（図３（ｄ））。フィルム部２０ａが微細気泡水ＷＢに接しているからである。この場合は、保持手段１６は使用しなくてもよい。例えば、図２（ｂ）で示した培養容器２０が袋状のフィルムの開口をクリップ止めしただけの構成の場合である。培養容器２０は、このような非常に簡便な構成で実施することができる。

次に本発明に係る培養装置１の使用方法について説明する。まず水槽１０に水Ｗを入れ、微細気泡発生装置１２を動作させる。これによって、水槽１０内に微細気泡水ＷＢが発生する。次に培養容器２０に被培養生物ＢＢを適当な培地とともに、封入する。そして、水槽１０中に培養容器２０を入れる。この際に、培養容器２０を完全に水Ｗに埋没させてしまうのが、好ましい。しかし、培養容器２０のフィルム部２０ａが微細気泡水ＷＢに接するのであれば、水槽１０の水面に浮かせておくだけであってもよい。この状態で一定期間放置することで培養が進む。

なお、途中で培養容器２０中の培地を交換してもよい。また、定期的若しくは定常的に照明装置１４によって培養容器２０内の被培養生物ＢＢに光を照射してもよい。

また、本発明に係る培養装置１においては、単に被培養生物ＢＢを培地で培養するだけでなく、培地として原料を入れ、被培養生物ＢＢとして酵母や菌類を入れることで、原料を被培養生物の力で加工するバイオリアクターとして利用することもできる。つまり培養容器２０自体がリアクター容器とみなせる。

次に本発明に係る培養装置１および培養方法の作用について説明する。ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルムＦは、表面が高い疎水性となっているため、微細気泡ＢＬ（マイクロバブルを含む）は、フィルムＦの表面に付着しやすい。そして、微細気泡ＢＬは消失する際に高い圧力を生じる。したがって、微細気泡ＢＬが高密度で付着したフィルムＦの表面では、酸素分子がより激しくフィルムＦに衝突する。その結果、フィルムを通過する酸素移動速度が大きくなる。

すなわち、本発明の培養装置１で、被培養生物ＢＢを培養すると、酸素を素早く供給されるため、培養効果が高くなる。次に実施例を用いてさらに具体的に説明を行う。

＜実施例１：微細気泡水ＷＢからの酸素移動＞
ＦＥＰフィルム製の筒（フィルム厚さ５０μｍ、直径５５ｍｍ）の一端をクリップで封じ、中に水２００ｍＬを入れ、窒素ガスを吹き込むことによって、溶存酸素濃度を十分に低下させた。もう一端からは溶存酸素濃度測定用の電極を差し込んでからきつく閉じた。なお、ＦＥＰフィルムはガス透過性を有しかつ疎水性のフィルムＦである。

（ａ）無通気の水槽、（ｂ）観賞魚水槽用（バブリングした水槽）、（ｃ）微細気泡を継続して発生させている水槽、（ｄ）空気中、という４条件において、ＦＥＰフィルム製袋内の溶存酸素濃度の変換を測定した。水温は２１℃であった。測定中は、容器内の水面の高さが水槽の水面より高くならないように保った。

微細気泡生成には、Ｐａｏ６０Ｓ（森鉄工株式会社製）を用いた。微細気泡は、肉眼ではほとんど気泡が観察できない程度まで通気量を絞り込んだ（１００ｍＬ／ｍｉｎ以下）。また（ｂ）では気泡が直接に袋に衝突するようにした。

結果を図４（ａ）〜図４（ｄ）に示した。各グラフとも、横軸は時間（分）であり、縦軸は溶存酸素濃度（ｍｇ／Ｌ）である。グラフの縦軸のスケールは図４（ａ）〜図４（ｄ）まで同じである。グラフの傾きが酸素移動の速さを表している。図４（ａ）〜図４（ｄ）の横軸の太線を１目盛りとすると、図４（ａ）では１分から９分間の間に縦軸が約１．７目盛り上昇した。同様に、図４（ｂ）では約２．０目盛り、図４（ｃ）では約４．０目盛り、そして図４（ｄ）では約２．８目盛り上昇した。図４（ａ）の無通気の場合と図４（ｂ）のバブリングした水槽の場合とでは差が顕著でなく、次いで、図４（ｄ）の空気中、図４（ｃ）の微細気泡水中に入れた場合の順に傾きが明らかに大きかった。この結果から、微細気泡水ＷＢ中ではＦＥＰフィルムを通過する酸素分子が多くなると推定された。

＜実施例２：酵母の増殖＞
ＦＥＰフィルム製バッグ（フィルム厚さ５０μｍ、１Ｌ容量、アズワン１−６３３４−０１）にＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養液２００μＬおよびＢＭ液体培地４５．１ｍＬを、５０ｍＬシリンジを用いて注入した。

注入後可能な限りバッグ内の空気を抜いて封じた。このバッグを、微細気泡を発生させた水槽中に完全に沈めた。水槽は、透明のアクリル製の水槽（５０ｃｍ、５０ｃｍ、５０ｃｍ）に深さ約３０ｃｍまで水を満たしたものとした。

微細気泡生成には、Ｐａｏ６０Ｓ（森鉄工株式会社製）を用いた。通気量は約０．１Ｌ／ｍｉｎとした。この場合の微細気泡は、肉眼でわずかに気泡が継続して観察できる程度であった。水槽は２４℃の恒温室に設置し、水温は投げ込み式ヒーターによって２８℃に調節した。

対照区は、同様に酵母と培地を入れて封じたＦＥＰフィルム製バッグを２８℃に調節した水槽中に完全に沈め、エアーポンプ（１００Ｖ、２Ｗ、約１Ｌ／ｍｉｎ）により観賞用の水槽に用いるスパージャーを通して通気することにより気泡を継続して送り込んだ場合とした。この際、ＦＥＰフィルム製バッグに気泡が直接あたるようにした。なお、この場合の気泡は微細気泡ではない。

２日間培養後、懸濁（ＯＤ_６００値）を測定した。明らかに微細気泡水中で培養した場合の培地が強く濁っており、そのＯＤ_６００値は、換算値で微細気泡水中の方が約２．５倍大きかった。

＜実施例３：イチゴの増殖＞
透明アクリル製の水槽（５０ｃｍ、５０ｃｍ、５０ｃｍ）に深さ約３０ｃｍまで水を満たした。微細気泡生成のためＰａｏ６０Ｃ（森鉄工株式会社製）を入れ、通気量を約０．１Ｌ／ｍｉｎとし、室温が２４℃に保たれた室内に設置した。この場合の、微細気泡は肉眼でわずかに気泡が継続して観察できる程度であった。

ＦＥＰフィルムで作った筒状のフィルム（フィルム厚２０μｍ、直径５５ｍｍ、長さ１０ｃｍ）に、スクロース３０ｇ／Ｌを含む液体ムラシゲ・スクーグ培地とイチゴ無菌培養苗１株（約１ｇ）を移植した。フィルムの両端はストッパーで封じた。これを微細気泡水中に完全に沈め、ＣＣＦＬ照明ユニット（日本医科器・ＣＣＦＬ−１−８）を用いて側面から連続照明した。

６週間後に取り出した状態を図５（ａ）に示した。重さ７．８ｇの植物が得られ、かつ、その葉柄は太く良好な品質の苗であった。対照として恒温室内の空気中に置くこと以外は同様として同期間培養したところ、その重さは最大で６．１ｇであった（図５（ｂ）参照）。以上のように、ＦＥＰフィルム内に入れた植物を微細気泡水で満たした水槽中に没しさせて培養すると、空気中で培養した以上にイチゴを増殖させることができた。

＜実験結果について＞
以上の通り、ＦＥＰフィルムからなる袋に液体を封じ、微細気泡水を満たした水槽に没しさせると、気相中よりも高い効率で袋内に酸素が移動することを見出した。袋内への酸素移動速度は、空気をバブリングした場合や空気中に置いた場合よりも高かった（図４）。その理由はすでに説明したが、以下のように説明できる。

ＦＥＰフィルムには高い疎水性があるため、マイクロバブルはフィルム表面に付着しやすい。そして、マイクロバブルは消失する際に高い圧力を生じる。したがって、マイクロバブルが高密度で付着したフィルム表面では、酸素分子がより激しくフィルムに衝突する。その結果、フィルムを通過する酸素移動速度が大きくなった。

本発明に係る培養装置および培養方法は、微生物、植物だけでなく、菌類や細胞の培養などにも好適に利用することができる。

１ 培養装置
１０ 水槽
１０ｓ 側面
１０ｂ 底面
１２ 微細気泡発生装置
１２ａ 放出管
１４ 照明装置
１６ 保持手段
１６−１ａ 枠
１６−１ｂ 押さえ具
１６−２ａ 枠
１６−２ｂ アーム
１６−２ｃ 連結紐
１６−３ ザル
２０ 培養容器
２０ａ フィルム部
２０ｂ 採光部
２０ｄ 本体
２０ｆ 蓋
２１ クリップ
ＢＢ 被培養生物
Ｗ 水
ＢＬ 微細気泡
ＷＢ 微細気泡水
Ｆ フィルム
Ｓ スペース

Claims (8)

1. 水が貯留される水槽と、
   前記水槽中に微細気泡を発生させる微細気泡発生装置と、
   ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部を有し、
   被培養生物および培地が収納され、
   前記フィルム部が前記水槽の水に接するように入れられる培養容器を
   有することを特徴とする培養装置。
2. 前記培養容器の前記フィルム部は袋状であることを特徴とする請求項１に記載された培養装置。
3. 前記培養容器を前記水槽中に保持する保持手段を有することを特徴とする請求項１または２の何れかに記載された培養装置。
4. 前記水槽および前記培養容器は透明部分を有し、前記培養容器内に光線を照射する光源をさらに備えたことを特徴とする請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載された培養装置。
5. 前記フィルム部は、ペルフルオロアルコキシフッ素樹脂（ＰＦＡ）、四フッ化エチレン・六フッ化プロピレン共重合体（ＦＥＰ）あるいはエチレン・四フッ化エチレン共重合体（ＥＴＦＥ）の少なくとも一種の樹脂で構成された請求項１乃至４の何れか一の請求項に記載された培養装置。
6. 請求項１から５の何れか一の請求項に記載された培養装置を有するバイオリアクター。
7. ガス透過性を有しかつ疎水性のフィルム部を有する培養容器に被培養生物および培地を収納する工程と、
   前記フィルム部に微細気泡を接触させる工程を有することを特徴とする培養方法。
8. 前記培養容器に培地を追加する工程をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載された培養方法。