JP2020000149A - 細胞生産物の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程、および核酸を除去する工程を含む、細胞生産物の製造方法に関する。
本発明で製造する細胞生産物は、培養により生産される有用物質であれば特に限定されず、例えばタンパク質、アミノ酸、ビタミン、糖、脂質、色素、有機酸、テルペン等が挙げられる。タンパク質としては酵素、抗体、ペプチド、サイトカイン等が挙げられる。ペプチドとして、例えば2〜20個のアミノ酸からなるオリゴペプチドが挙げられる。ビタミンとしてはコエンザイムQ10、ビタミンK2、ビタミンC等が挙げられる。糖としてはグルコサミン、ヒアルロン酸、グルクロン酸等が挙げられる。細胞生産物は、培養中に細胞内に蓄積されてもよいし、細胞外に排出されてもよい。細胞生産物が細胞内に蓄積される場合、後述のように培養終了後に細胞を溶菌または破砕して生産物を漏出させることができる。
細胞は、細胞生産物を発現できる細胞であれば特に限定されないが、例えば微生物細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられる。微生物細胞としては、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌;ロドコッカス(Rhodococcus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌;サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母;ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。より具体的には、Escherichia coli、Streptomyces violaceoruberなどが挙げられる。細胞にタンパク質を発現させる場合、細胞はそのタンパク質を本来発現する細胞であってもよく、タンパク質をコードするDNAを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。
本発明の細胞生産物の製造方法では、核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する。
キトサンはD−グルコサミンを主要な構成成分として含有する多糖であり、生物由来であってもよく、化学合成物であってもよいが、生物由来であることが好ましい。生物由来の場合には、微生物由来、植物由来、動物由来のキトサンが挙げられる。微生物由来の場合、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、コウジカビ(Aspergillus oryzae)、マッシュルーム(Agaricus bisporus)、アスペルギルス・ビスポラス(Aspergillus bisporus)、エノキタケ(Flammulina velutipes)、シイタケ(Lentinus edodes)、マイタケ(Grifola frondosa)、アブシディア(Absidia)属、ムコール(Mucor)属、リゾパス(Rhizopus)属、シルシネラ(Circinella)属、ザイグランカス(Zygrhynchus)属等に由来するキトサンが挙げられ、この中でもコウジカビ(Aspergillus oryzae)由来のキトサンが最も好ましい。動物由来の場合、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類や昆虫等に由来するキトサンが挙げられる。このうち、人体にアレルギーを生じさせるリスクが少ない点でコウジカビ(Aspergillus oryzae)に由来するキトサンが好ましい。キトサンは、前記生物に由来するキチンをアルカリ処理してN−アセチル−D−グルコサミン単位中のアセチル基を除くことにより得られるものであってもよい。
水不溶性物質は、培養物に含まれる核酸とキトサンの複合物と相互作用することで、培養物に含まれる核酸を不溶化させる。
負電荷を帯びている核酸に、正電荷を帯びるキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を添加し、これらを混合することにより、核酸が水に不溶化され、除去が可能になる。本発明により除去される核酸としてはDNA、RNAが挙げられ、その配列は特に限定されない。DNAとしては、染色体DNA、プラスミドDNAが挙げられる。核酸は一本鎖核酸、二本鎖核酸、多重鎖核酸のいずれであってもよい。除去される核酸の長さは特に限定されないが、例えば数十bp以上の塩基長の範囲の核酸を除去可能である。除去される核酸としては、細胞培養中に細胞から排出される核酸、細胞内に存在する核酸、細胞培養後に細胞を溶菌して漏出する核酸が挙げられる。培養物中の核酸の濃度は特に限定されないが、例えば1,000ppb以下である。
核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程において不溶化された核酸は、遠心分離、フィルタープレス、濾紙・濾布濾過、MF膜(Microfiltration Membrane)等の固液分離方法により培養物から除去できる。培養物から核酸が除去されていることは、PCR、RT−PCR等により残存核酸を増幅し、電気泳動法により可視化することにより確認できる。本発明の方法で核酸を除去すると培養物の粘度上昇を抑制して操作性を改善し、細胞生産物の生産性を向上できる。また、本発明の方法で製造された細胞生産物からは人体への悪影響が懸念される核酸が除去されているため、特に医薬品、食品、化粧品等の用途に好適に使用できる。
本発明の細胞生産物は、上記の製造方法により製造される。細胞生産物は、医薬用組成物、食品用組成物、化粧用組成物、健康食品用組成物、飼料用組成物、動物用医薬組成物、医療機器用組成物、工業用組成物、化学用組成物等の原材料として使用できる。食経験のあるキトサンと負電荷の水不溶性物質を用いる場合には、人体への安全性も保証されるため、医薬用組成物、食品用組成物、化粧用組成物等の人体に直接適用する用途に特に適している。
(1−1)細胞
・Escherichia coli JM109(プラスミドベクター:pTONA4、約9000bp)
・Streptomyces violaceoruber(プラスミドベクター:pIJ702、5685bp)
(1−2)キトサン
・コウジカビ由来キトサン:KiOnutrime−CsG(KITOZYME社製)
(1−3)負電荷の水不溶性物質
・トプコパーライト#54(東興パーライト工業株式会社製)
・セルパウダーP100(木粉パルプ、内外製粉株式会社)
・KCフロック W−100(粉末セルロース、日本製紙株式会社)
・セリッシュ濾過名人(粉末セルロース、ダイセルファインケム株式会社)
・濾過一番6号(焼成珪藻土、土田食品工業株式会社)
・ラジオライト#900(融剤焼成珪藻土、白山工業株式会社)
・セルピュアS65(高純度珪藻土、Imerys Filtration Minerals, Inc)
・ベントナイト(ベントナイト、和光純薬工業株式会社)
コウジカビ由来キトサンをそれぞれ37℃の温水に4重量%となる量で添加し、キトサンと同重量%の酢酸原液を添加後、1時間撹拌を行った。この溶液に20%水酸化ナトリウムを添加し、撹拌を行った後にpH5.4に調整し、終濃度が3重量%のコウジカビ由来キトサン溶液を得た。
各水不溶性物質を最終濃度0.001重量%となるようにpH3.0〜10.0のBritton−Robinson緩衝液に加えて、水不溶性物質の分散液を得た。この分散液を用いてZetasizer Nano−ZS(Malvern Panalytical社製)により、pH3.0〜pH10.0の範囲でゼータ電位を測定した。測定は温度:25℃、粘度:0.8872、誘電率:78.5、分散媒のRefractive Index:1.330の条件で行った。
3Lフラスコ中で、500mLの培地(Bacto Trypton1.00%、Bacto Yeast Extract 1.00%、塩化ナトリウム0.50%、アンピシリンナトリウム0.10%。121℃で30分間の蒸気滅菌済み)に、プラスミドベクターpTONA4を導入した大腸菌(Escherichia coli JM109)を植菌し、37℃、160rpmの条件で24時間培養した。
実施例1〜4と同じ方法により大腸菌の培養を行った。培養終了後の培養液に、2%リゾチーム溶液(Lysozyme Base Powder、天野エンザイム社)を1.25ml添加し、25℃、160rpmの条件で18時間振蕩して大腸菌を溶菌した。溶菌終了後、15000rpmで15分間遠心分離し、溶菌上清液を得た。
2Lファーメンタージャー中で、1.2Lの培地(グルコース2%、K2HPO4 0.8%、ポリペプトン(日本製薬製)0.5%、イーストエキストラクト(Difco製)、pH7.0、121℃で20分間の蒸気滅菌済み)に、プラスミドベクターpIJ702を導入したStreptomyces violaceoruberを植菌し、28℃、700rpmの条件で72時間培養した。
実施例20と同じ方法によりStreptomyces violaceoruberの培養を行った。培養液100mlに、表5の配合量となるようにコウジカビ由来キトサンおよびセルパウダーP100を入れ、ボルテックスにより混合した。混合物を濾紙(ADVANTECφ185mm No.2)により濾過した。
実施例20と同じ方法によりStreptomyces violaceoruberの培養を行った。培養終了後の培養液を遠心分離器(株式会社トミー精工)で15,000×gの条件にて15分間遠心し、上清を回収した。この上清に40%硫酸アンモニウムを添加して塩析を行った。塩析物を遠心分離により回収し、得られた塩析物12gに対し水道水60ml、およびトプコパーライト#54を2g添加して分散させた。通常、塩析物では核酸が検出されないことから、プラスミドベクターpIJ702を添加し、分散液が100ppbのプラスミドを含むように調整した。
Claims (5)
- 核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程、および
核酸を除去する工程
を含む、細胞生産物の製造方法。 - 水不溶性物質のゼータ電位が0mV未満である、
請求項1に記載の細胞生産物の製造方法。 - 水不溶性物質が珪藻土、細胞、細胞壁、木粉、木粉パルプ、パーライト、粉末セルロース、シリカ、活性炭、ベントナイト、タルク、およびカオリンからなる群から選択される少なくとも1つである、
請求項1または2に記載の細胞生産物の製造方法。 - 細胞生産物がタンパク質である、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞生産物の製造方法。 - 請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法により生産された細胞生産物。
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