JP7132771B2

JP7132771B2 - 細胞生産物の製造方法

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Publication number: JP7132771B2
Application number: JP2018124519A
Authority: JP
Inventors: 学飯島
Original assignee: Nagase Chemtex Corp
Current assignee: Nagase Chemtex Corp
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2022-09-07
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: JP2020000149A

Description

本発明は、細胞生産物の製造方法に関する。

微生物培養や細胞培養により酵素や抗体、サイトカイン等の有用物質の生産を行う際、目的の有用物質を含む培養液、精製物、製品中には、細胞や核酸、培養培地等の夾雑物も多く含まれている。特に、培養液中に含まれる核酸は培養物の粘度を上昇させ、有用物質の分離・濾過効率を低下させる原因となる。

特許文献１は、タンパク質溶液から核酸またはエンドトキシンを除去するために低分子キトサンを用いている。しかし、キトサン溶液の粘度低下や核酸除去効果を十分に得るために、キトサンを低分子化する工程が必要であるため、作業が煩雑となる。

特許文献２は、タンパク質溶液から核酸またはエンドトキシンを除去するためにＮ－アルキル化したキトサンからなる二分子膜を固定化した担体を用いている。しかし、キトサンをアルキル化する工程やＮ－アルキルキトサンと不溶性単体を反応させる工程が必要であり、縮合剤等の物質が製品に残存する等の課題がある。

特許文献３は、キトサンおよびポリアクリル酸を併用することで酵母エキスに含まれる水不溶性物質を除去している。しかし、除去対象は水溶性物質である核酸ではなく、核酸の除去効果は不明である。

特開昭６３－５６３００号公報特開平８－１１７５９５号公報特開平８－５６６１１号公報

本発明は、微生物培養や細胞培養により酵素や抗体、サイトカイン等の有用物質の生産を行う際に、核酸含有量を簡便に低減することができる、細胞生産物の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、当該製造方法により生産された細胞生産物を提供することを目的とする。

本発明者らは、培養物および精製中間品から核酸を除去する際の処理条件を検討した結果、キトサンおよび負電荷の水不溶性物質を培養物および精製中間品に混合し、核酸を水不溶性物質に吸着させることにより、効率的に核酸を除去できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程、および核酸を除去する工程を含む、細胞生産物の製造方法に関する。

水不溶性物質のゼータ電位が０ｍＶ未満であることが好ましい。

水不溶性物質が珪藻土、細胞、細胞壁、木粉、木粉パルプ、パーライト、粉末セルロース、シリカ、活性炭、ベントナイト、タルク、およびカオリンからなる群から選択される少なくとも１つであることが好ましい。

細胞生産物がタンパク質であることが好ましい。

また、本発明は、前記製造方法により生産された細胞生産物に関する。

本発明の細胞生産物の製造方法は、培養物に含まれる核酸を除去することができる。本発明の方法で製造された細胞生産物からは、人体への悪影響が懸念される核酸が除去されているため、医薬、食品、化粧品等の用途に好適に使用できる。

水不溶性物質のゼータ電位を示す。実施例１～４、比較例１の溶菌液における残存核酸の検出結果を示す。比較例２～１０の溶菌液における残存核酸の検出結果を示す。実施例５～１１、比較例１１の溶菌液における残存核酸の検出結果を示す。実施例１２～１９、比較例１２の溶菌液における残存核酸の検出結果を示す。実施例２０～２４、比較例１３～１６における残存核酸の検出結果を示す。実施例２５～２９、比較例１７～１８における残存核酸の検出結果を示す。実施例３０～３４、比較例１９の塩析後の濾過液における残存核酸の検出結果を示す。実施例３０～３４、比較例１９の凍結乾燥物における残存核酸の検出結果を示す。

＜＜細胞生産物の製造方法＞＞
本発明は、核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程、および核酸を除去する工程を含む、細胞生産物の製造方法に関する。

＜細胞生産物＞
本発明で製造する細胞生産物は、培養により生産される有用物質であれば特に限定されず、例えばタンパク質、アミノ酸、ビタミン、糖、脂質、色素、有機酸、テルペン等が挙げられる。タンパク質としては酵素、抗体、ペプチド、サイトカイン等が挙げられる。ペプチドとして、例えば２～２０個のアミノ酸からなるオリゴペプチドが挙げられる。ビタミンとしてはコエンザイムＱ１０、ビタミンＫ２、ビタミンＣ等が挙げられる。糖としてはグルコサミン、ヒアルロン酸、グルクロン酸等が挙げられる。細胞生産物は、培養中に細胞内に蓄積されてもよいし、細胞外に排出されてもよい。細胞生産物が細胞内に蓄積される場合、後述のように培養終了後に細胞を溶菌または破砕して生産物を漏出させることができる。

＜細胞＞
細胞は、細胞生産物を発現できる細胞であれば特に限定されないが、例えば微生物細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられる。微生物細胞としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属など宿主ベクター系の開発されている細菌；ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母；ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属などの宿主ベクター系の開発されているカビなどが挙げられる。より具体的には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒなどが挙げられる。細胞にタンパク質を発現させる場合、細胞はそのタンパク質を本来発現する細胞であってもよく、タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。

動物細胞としてはヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、チャイニーズハムスター、ショウジョウバエ、ヨトウガ、イラクサギンウワバ等に由来する細胞が挙げられる。植物細胞としてはタバコ、トウモロコシ、イネ等に由来する細胞が挙げられる。これらの細胞にタンパク質を発現させる場合も、微生物細胞の場合と同様に、細胞はそのタンパク質を本来発現する細胞であってもよく、タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターを含む形質転換体であってもよい。

培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程の前に、細胞を培養する工程を含むことが好ましい。細胞培養のための培地は、細胞が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、キシロース、スクロース、ラフィノース、デンプン、グリセリン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を添加、混合してもよい。

細胞の培養条件は、培地の種類、培養方法などにより適宜選択すればよく、細胞が増殖し、細胞生産物を産生できる条件であれば特に制限はない。具体的な培養条件としては、例えば液体培地中で振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下で、２５～５０℃、好ましくは２７℃～３７℃で１０～１６８時間培養する条件が挙げられる。ｐＨは特に限定されないが、例えば３．０～１１．０に調節される。ｐＨの調整は、無機酸または有機酸、アルカリ溶液などを用いて行うことができる。

＜キトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程＞
本発明の細胞生産物の製造方法では、核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する。

細胞生産物が細胞内に蓄積する場合には、培養終了後、遠心分離やろ過によって細胞を回収し、得られた細胞を超音波処理、界面活性剤、凍結融解、酵素処理、フレンチプレス、ホモジナイザー、ガラスビーズ等によって溶菌した後、遠心分離やろ過によって得られる無細胞抽出液を培養物として用いることができる。また、培養終了後の遠心分離やろ過、ＭＦ膜（ＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＭｅｍｂｒａｎｅ）により固液分離を行った清澄液、また清澄液を、塩析法や、ＵＦ膜（ＵｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＭｅｍｂｒａｎｅ）濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーなどの一般的な方法により精製した生成物を培養物として用いることもできる。細胞生産物が細胞外に分泌される場合には、培養上清から同様に精製したものを培養物として用いることができる。これらの中でも、培養物は、培養終了後の液体培地から固液分離、限外濾過、および／または塩析、有機溶媒沈殿により濃縮した処理物、或いは培養終了直後の液体培地が好ましい。

培養物は水溶液であることが好ましく、その溶媒としては、水、細胞の培養に用いた培地、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液等の緩衝液が挙げられる。キトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する際の培養物のｐＨは特に限定されず、当該ｐＨにおいて水不溶性物質が負電荷を帯びていればよい。培養物のｐＨとしては例えばｐＨ３．０～８．０が挙げられる。

本発明では、前記培養物中にキトサンを添加し、負電荷の水不溶性物質と混合することにより、培養物中の核酸を不溶化させる。このとき、培養物中にキトサンと負電荷の水不溶性物質が共存していればよく、キトサンと負電荷の水不溶性物質の添加時期は特に限定されない。キトサンと負電荷の水不溶性物質は、細胞培養中に添加してもよく、細胞培養後の培養物の作製途中に添加してもよい。キトサンと負電荷の水不溶性物質の添加時期は同一であっても異なっていてもよい。後述するように、負電荷の水不溶性物質として細胞を用いることができ、このときは培養終了時に培養物中に存在する細胞を、引き続き負電荷の水不溶性物質として使用することが可能である。また、負電荷の水不溶性物質として、別途、細胞を添加することも可能である。別途、細胞を添加する場合に、その細胞の種類は特に限定されず、前述した微生物細胞、動物細胞、植物細胞が挙げられる。

＜キトサン＞
キトサンはＤ－グルコサミンを主要な構成成分として含有する多糖であり、生物由来であってもよく、化学合成物であってもよいが、生物由来であることが好ましい。生物由来の場合には、微生物由来、植物由来、動物由来のキトサンが挙げられる。微生物由来の場合、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）、マッシュルーム（Ａｇａｒｉｃｕｓｂｉｓｐｏｒｕｓ）、アスペルギルス・ビスポラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｂｉｓｐｏｒｕｓ）、エノキタケ（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）、シイタケ（Ｌｅｎｔｉｎｕｓｅｄｏｄｅｓ）、マイタケ（Ｇｒｉｆｏｌａｆｒｏｎｄｏｓａ）、アブシディア（Ａｂｓｉｄｉａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、リゾパス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、シルシネラ（Ｃｉｒｃｉｎｅｌｌａ）属、ザイグランカス（Ｚｙｇｒｈｙｎｃｈｕｓ）属等に由来するキトサンが挙げられ、この中でもコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来のキトサンが最も好ましい。動物由来の場合、カニ、エビ、オキアミなどの甲殻類や昆虫等に由来するキトサンが挙げられる。このうち、人体にアレルギーを生じさせるリスクが少ない点でコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）に由来するキトサンが好ましい。キトサンは、前記生物に由来するキチンをアルカリ処理してＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン単位中のアセチル基を除くことにより得られるものであってもよい。

キトサンは、重量平均分子量（Ｍｗ）が１０^３～１０^６であることが好ましい。この分子量とするために、キトサンをあらかじめ酸処理により低分子化してから用いてもよい。酸処理は例えばキトサンをｐＨ２．０～６．０の条件で部分的に分解することにより行われる。酸処理により低分子化されたキトサンは、ｐＨ５．０～７．０に調整してから培養物に添加される。

培養物中のキトサンの濃度は特に限定されないが０．００１～１０重量％が好ましく、０．０１～５重量％がより好ましく、０．０４～１重量％がさらに好ましく、０．０５～０．５重量％がさらにより好ましく、０．０６～０．１８重量％が特に好ましい。

キトサンの形状は粉末、酸に溶解させた液状の形状が挙げられ、この中でも、核酸と高効率で結合する点で、酸に溶解させた形状が好ましい。キトサンを溶解させる酸としては、例えばｐＨ２．０～６．０の酢酸やクエン酸、乳酸等の酸が挙げられる。酸に溶解したキトサンはｐＨ５．０～７．０に調整した後、培養物に添加することが好ましい。キトサンはシリカやアルミナ、珪藻土等の担体に固定化されていてもよいが、固定化にかかる工程が煩雑であること、固定化に使用する架橋物質の残存等の懸念があるため、固定化されていないことが好ましい。

＜負電荷の水不溶性物質＞
水不溶性物質は、培養物に含まれる核酸とキトサンの複合物と相互作用することで、培養物に含まれる核酸を不溶化させる。

負電荷の水不溶性物質は、ゼータ電位が０ｍＶ未満であることが好ましく、このゼータ電位はｐＨ３．０～１０．０での測定値であることがより好ましい。本発明では、負電荷を帯びた核酸と、正電荷を帯びたキトサンが結合するが、キトサン分子上に正電荷が打ち消されていない箇所が残ることがある。このような場合でも、ゼータ電位が０ｍＶ未満である水不溶性物質は当該キトサン分子に結合でき、核酸－キトサン－水不溶性物質の複合体が形成され、この複合体の除去により核酸を除去することが可能となる。水不溶性物質のゼータ電位は、水不溶性物質の分散液をＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ－ＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）等の機器により測定して得ることができる。

負電荷の水不溶性物質の形態は、特に限定されないが、粉末、顆粒等が挙げられる。水不溶性物質の平均粒子径は０．０１μｍ～５ｍｍが好ましい。

培養物中の負電荷の水不溶性物質の濃度は特に限定されないが、０．００１～１０重量％が好ましく、０．０１～５重量％がより好ましく、０．１～３重量％がさらに好ましく、１～３重量％がさらにより好ましい。培養物中の負電荷の水不溶性物質の濃度は、培養に用いた培地や、水、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液等の緩衝液によって調整することが可能である。

負電荷の水不溶性物質の具体例としては、珪藻土、細胞、細胞壁、木粉、木粉パルプ、パーライト、粉末セルロース、シリカ、活性炭、ベントナイト、タルク、カオリンなどが挙げられ、これらの中でも珪藻土、細胞、木粉パルプ、パーライト、粉末セルロース、ベントナイトが好ましい。これらは組み合わせて用いることもでき、組み合わせの具体例としては、例えば細胞と木粉、珪藻土と木粉等が挙げられる。

培養物中におけるキトサンおよび負電荷の水不溶性物質の混合方法は特に限定されず、振とう、プロペラ撹拌、インラインでの混合等の方法を用いることができる。

＜核酸＞
負電荷を帯びている核酸に、正電荷を帯びるキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を添加し、これらを混合することにより、核酸が水に不溶化され、除去が可能になる。本発明により除去される核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられ、その配列は特に限定されない。ＤＮＡとしては、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡが挙げられる。核酸は一本鎖核酸、二本鎖核酸、多重鎖核酸のいずれであってもよい。除去される核酸の長さは特に限定されないが、例えば数十ｂｐ以上の塩基長の範囲の核酸を除去可能である。除去される核酸としては、細胞培養中に細胞から排出される核酸、細胞内に存在する核酸、細胞培養後に細胞を溶菌して漏出する核酸が挙げられる。培養物中の核酸の濃度は特に限定されないが、例えば１，０００ｐｐｂ以下である。

＜核酸の除去＞
核酸および細胞生産物を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程において不溶化された核酸は、遠心分離、フィルタープレス、濾紙・濾布濾過、ＭＦ膜（ＭｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎＭｅｍｂｒａｎｅ）等の固液分離方法により培養物から除去できる。培養物から核酸が除去されていることは、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ等により残存核酸を増幅し、電気泳動法により可視化することにより確認できる。本発明の方法で核酸を除去すると培養物の粘度上昇を抑制して操作性を改善し、細胞生産物の生産性を向上できる。また、本発明の方法で製造された細胞生産物からは人体への悪影響が懸念される核酸が除去されているため、特に医薬品、食品、化粧品等の用途に好適に使用できる。

＜＜細胞生産物＞＞
本発明の細胞生産物は、上記の製造方法により製造される。細胞生産物は、医薬用組成物、食品用組成物、化粧用組成物、健康食品用組成物、飼料用組成物、動物用医薬組成物、医療機器用組成物、工業用組成物、化学用組成物等の原材料として使用できる。食経験のあるキトサンと負電荷の水不溶性物質を用いる場合には、人体への安全性も保証されるため、医薬用組成物、食品用組成物、化粧用組成物等の人体に直接適用する用途に特に適している。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されない。以下、「％」は特記しない限り「重量％」を意味する。

（１）使用材料
（１－１）細胞
・ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９（プラスミドベクター：ｐＴＯＮＡ４、約９０００ｂｐ）
・Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ（プラスミドベクター：ｐＩＪ７０２、５６８５ｂｐ）
（１－２）キトサン
・コウジカビ由来キトサン：ＫｉＯｎｕｔｒｉｍｅ－ＣｓＧ（ＫＩＴＯＺＹＭＥ社製）
（１－３）負電荷の水不溶性物質
・トプコパーライト＃５４（東興パーライト工業株式会社製）
・セルパウダーＰ１００（木粉パルプ、内外製粉株式会社）
・ＫＣフロックＷ－１００（粉末セルロース、日本製紙株式会社）
・セリッシュ濾過名人（粉末セルロース、ダイセルファインケム株式会社）
・濾過一番６号（焼成珪藻土、土田食品工業株式会社）
・ラジオライト＃９００（融剤焼成珪藻土、白山工業株式会社）
・セルピュアＳ６５（高純度珪藻土、ＩｍｅｒｙｓＦｉｌｔｒａｔｉｏｎＭｉｎｅｒａｌｓ，Ｉｎｃ）
・ベントナイト（ベントナイト、和光純薬工業株式会社）

（１－４）キトサンの調製
コウジカビ由来キトサンをそれぞれ３７℃の温水に４重量％となる量で添加し、キトサンと同重量％の酢酸原液を添加後、１時間撹拌を行った。この溶液に２０％水酸化ナトリウムを添加し、撹拌を行った後にｐＨ５．４に調整し、終濃度が３重量％のコウジカビ由来キトサン溶液を得た。

（２）測定例（水不溶性物質のゼータ電位測定）
各水不溶性物質を最終濃度０．００１重量％となるようにｐＨ３．０～１０．０のＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に加えて、水不溶性物質の分散液を得た。この分散液を用いてＺｅｔａｓｉｚｅｒＮａｎｏ－ＺＳ（ＭａｌｖｅｒｎＰａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製）により、ｐＨ３．０～ｐＨ１０．０の範囲でゼータ電位を測定した。測定は温度：２５℃、粘度：０．８８７２、誘電率：７８．５、分散媒のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ：１．３３０の条件で行った。

ｐＨ３．０～１０．０における各水不溶性物質のゼータ電位を表１および図１に示す。どの水不溶性物質も、ｐＨ３．０～１０．０の間で０ｍＶ未満のゼータ電位を有していた。セルロース系の水不溶性物質（セルパウダーＰ１００、ＫＣフロックＷ－１００、セリッシュ濾過名人）は、珪藻土、パーライト、ベントナイトと比較して高いゼータ電位を有する傾向がみられた。

（３）実施例１～４、比較例１（キトサンと珪藻土による核酸除去）
３Ｌフラスコ中で、５００ｍＬの培地（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ１．００％、ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１．００％、塩化ナトリウム０．５０％、アンピシリンナトリウム０．１０％。１２１℃で３０分間の蒸気滅菌済み）に、プラスミドベクターｐＴＯＮＡ４を導入した大腸菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９）を植菌し、３７℃、１６０ｒｐｍの条件で２４時間培養した。

培養終了後の培養液に、２％リゾチーム溶液（ＬｙｓｏｚｙｍｅＢａｓｅＰｏｗｄｅｒ、天野エンザイム社）を１．２５ｍｌ添加し、２５℃、１６０ｒｐｍの条件で１６時間振盪して大腸菌を溶菌した。溶菌終了後、１５０ｍｌの溶菌液に１５０ｍｌの水道水を添加して混合して溶菌希釈液を得た。試験管に、表２の配合量となるようにラジオライト＃９００を入れ、１０ｍｌの溶菌希釈液を添加してボルテックスにより混合した。その後、コウジカビ由来キトサンを表２に記載の最終濃度となるように添加してボルテックスにより混合した。混合物を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣφ９０ｍｍＮｏ．１３１）により濾過した。

濾過後の清澄液に残存する核酸を、ＰＣＲを用いて検出した。ＰＣＲは、清澄液１μｌから、ＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑおよび２×ＧＣｂｕｆｆｅｒ（Ｉ）を用いたＰＣＲ反応液１０μｌにより行った。ＰＣＲプライマーとしては、フォワードプライマーは５’－ＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＧＴＧＣＡＧＴＴＧＣＴＴＣＣＴＣ－３’、リバースプライマーは５’－ＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣ－３’の塩基配列を有するものを用いた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃ ５分、（９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ２分）×３０サイクル、７２℃ ５分とした。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、色素（ＭｉｄｏｒｉＧｒｅｅｎＤｉｒｅｃｔ）により可視化した。その結果を図２に示す。図２において、Ｍは分子量マーカー（ＯｎｅＳＴＥＰＭａｒｋｅｒ６）を示す。

図２に示すように、キトサンのみを使用した比較例１にはプラスミドＤＮＡが残存していた。キトサンと負電荷の水不溶性物質であるラジオライト＃９００を併用した実施例１～４では、いずれのキトサン濃度においても残存するプラスミドＤＮＡ量をＰＣＲの検出限界以下に低減できていた。また、実施例１～４により、キトサンおよび負電荷の水不溶性物質を使用することにより大腸菌の培養物から核酸を除去できることが確かめられた。

（４）実施例５～１９、比較例２～１２（キトサンと負電荷の水不溶性物質による核酸除去）
実施例１～４と同じ方法により大腸菌の培養を行った。培養終了後の培養液に、２％リゾチーム溶液（ＬｙｓｏｚｙｍｅＢａｓｅＰｏｗｄｅｒ、天野エンザイム社）を１．２５ｍｌ添加し、２５℃、１６０ｒｐｍの条件で１８時間振蕩して大腸菌を溶菌した。溶菌終了後、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、溶菌上清液を得た。

試験管に、表３の配合量となるように負電荷の水不溶性物質を入れ、１０ｍｌの溶菌上清液を添加してボルテックスにより混合した。その後、コウジカビ由来キトサンを表３に記載の最終濃度となるように添加してボルテックスにより混合した。混合物を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣφ９０ｍｍＮｏ．１３１）により濾過した。

実施例１～４と同じ方法で、濾過後の清澄液１μｌに残存する核酸をＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ反応産物を可視化した。その結果を図３Ａ～Ｃに示す。

図３Ａ～Ｃに示すように、キトサンまたは負電荷の水不溶性物質を使用しなかった比較例２～１２ではプラスミドＤＮＡが残存していた。キトサンと負電荷の水不溶性物質を併用した実施例５～１９ではプラスミドＤＮＡ量を低減できていた。

（５）実施例２０～２４および比較例１３～１６（キトサンと珪藻土による核酸除去）
２Ｌファーメンタージャー中で、１．２Ｌの培地（グルコース２％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．８％、ポリペプトン（日本製薬製）０．５％、イーストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ製）、ｐＨ７．０、１２１℃で２０分間の蒸気滅菌済み）に、プラスミドベクターｐＩＪ７０２を導入したＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒを植菌し、２８℃、７００ｒｐｍの条件で７２時間培養した。

培養終了後の培養液を遠心分離器（株式会社トミー精工）で１５，０００×ｇの条件にて１５分間遠心し、上清を回収した。試験管に、表４の配合量となるようにパーライト＃５４、または濾過一番６号を入れ、１０ｍｌの遠心上清を添加してボルテックスにより混合した。その後、コウジカビ由来キトサンを表４に記載の最終濃度となるように添加してボルテックスにより混合した。混合物を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣφ９０ｍｍＮｏ．１３１）により濾過した。

濾過後の清澄液に残存する核酸を、ＰＣＲを用いて検出した。ＰＣＲは、清澄液１μｌから、ＴＡＫＡＲＡＬＡＴａｑおよび２×ＧＣｂｕｆｆｅｒ（Ｉ）を用いたＰＣＲ反応液１０μｌにより行った。ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマーは５’－ＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＣＡＡ－３’、リバースプライマーは５’－ＴＴＡＴＣＧＧＴＴＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧ－３’の塩基配列とした。これらのプライマーを用いたＰＣＲにより８１０塩基長の増幅産物が得られる。ＰＣＲの反応条件は、９４℃ ５分、（９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ２分）×３０サイクル、７２℃ ５分とした。ＰＣＲ反応産物を１％アガロースゲルで電気泳動し、色素（ＭｉｄｏｒｉＧｒｅｅｎＤｉｒｅｃｔ）により可視化した。その結果を図４に示す。図４において、ｐｃはＰＣＲのポジティブコントロール（プラスミドベクターｐＩＪ７０２１μｌ（１ｎｇ）をＰＣＲの鋳型として使用）を表し、Ｍは分子量マーカー（ＯｎｅＳＴＥＰＭａｒｋｅｒ６）を示す。

図４に示すように、遠心上清である比較例１３にはプラスミドＤＮＡが残存しており、キトサンのみを使用した比較例１４でも完全には除去できていなかった。負電荷の水不溶性物質のみを使用した比較例１５～１６ではプラスミドＤＮＡを除去できなかった。キトサンと負電荷の水不溶性物質を併用した実施例２０～２４では残存するプラスミドＤＮＡ量を、ＰＣＲの検出限界以下に低減できていた。キトサンと負電荷を帯びたＤＮＡが相互作用し、さらにそのキトサンと負電荷の水不溶性物質であるパーライトおよび珪藻土が相互作用して、ＤＮＡを不溶化したと考えられる。なお、実施例２０～２４では残余ＤＮＡ量が少ないためＰＣＲ反応が起こらず、ＰＣＲ産物より下の位置に未反応のプライマーに起因する電気泳動バンドが観察された。

（６）実施例２５～２９、比較例１７～１８（キトサンと細胞による核酸除去）
実施例２０と同じ方法によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒの培養を行った。培養液１００ｍｌに、表５の配合量となるようにコウジカビ由来キトサンおよびセルパウダーＰ１００を入れ、ボルテックスにより混合した。混合物を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣφ１８５ｍｍＮｏ．２）により濾過した。

濾過後の清澄液に残存する核酸を、上記（５）と同じ方法でＰＣＲを用いて検出し、ＰＣＲ産物を可視化した。その結果を図５に示す。図５において、ｐｃはＰＣＲのポジティブコントロール（プラスミドベクターｐＩＪ７０２１μｌをＰＣＲの鋳型として使用）を表し、Ｍは分子量マーカー（ＯｎｅＳＴＥＰＭａｒｋｅｒ６）を示す。なお、比較例１７はＰＣＲのポジティブコントロールのためにコウジカビ由来キトサンおよびセルパウダーＰ１００のいずれも添加せず、培養液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して得られた上清をＰＣＲ反応の鋳型として用いた。

図５に示すように、遠心上清である比較例１７にはプラスミドＤＮＡが残存しており、パルプ（木粉）であるセルパウダーＰ１００のみを使用した比較例１８ではプラスミドＤＮＡを全く除去できなかった。

キトサンを添加した実施例２５～２９では残存するプラスミドＤＮＡ量を、ＰＣＲの検出限界以下に低減できた。培養終了後の培養液を遠心分離せず、キトサンを添加したため、培養液に含まれる細胞が負電荷の水不溶性物質として核酸の不溶化に貢献した。また、セルパウダーＰ１００はろ過助剤であるが、負電荷の水不溶性物質として核酸の不溶化に貢献した。キトサン、培養液に含まれる細胞、ＤＮＡ、およびセルパウダーＰ１００が相互作用して核酸を不溶化したと考えられる。

（７）実施例３０～３４、比較例１９（キトサンと細胞による核酸除去）
実施例２０と同じ方法によりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒの培養を行った。培養終了後の培養液を遠心分離器（株式会社トミー精工）で１５，０００×ｇの条件にて１５分間遠心し、上清を回収した。この上清に４０％硫酸アンモニウムを添加して塩析を行った。塩析物を遠心分離により回収し、得られた塩析物１２ｇに対し水道水６０ｍｌ、およびトプコパーライト＃５４を２ｇ添加して分散させた。通常、塩析物では核酸が検出されないことから、プラスミドベクターｐＩＪ７０２を添加し、分散液が１００ｐｐｂのプラスミドを含むように調整した。

プラスミドベクターを添加した上記分散液１０ｍｌを試験管に移し、表６の濃度となるようにコウジカビ由来キトサンを入れ、ボルテックスにより混合した。なお、表６において、パーライト＃５４の濃度は分散液中の濃度を示す。混合物約１０ｍｌ全量を濾紙（ＡＤＶＡＮＴＥＣφ９０ｍｍＮｏ．１３１）により濾過した。

濾過で得られた濾過液を蒸留水で１００倍に希釈し、希釈液１μｌをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。塩析後の濾過液に残存する核酸を、上記（６）と同じ方法でＰＣＲを用いて検出し、ＰＣＲ産物を可視化した。その結果を図６に示す。

また、塩析後の濾過液の凍結乾燥物にも核酸が含まれないことを確認するために、前記濾過で得られた濾過液を室温、－０．９気圧、４２時間の条件で凍結乾燥した。この凍結乾燥物を１～０．１重量％の濃度となるように水に懸濁し、その懸濁液１μｌをＰＣＲ反応の鋳型として用いた。凍結乾燥物に残存する核酸を、上記（６）と同じ方法でＰＣＲを用いて検出し、ＰＣＲ産物を可視化した。その結果を図７に示す。

図６～７において、ｐｃはＰＣＲのポジティブコントロール（プラスミドベクターｐＩＪ７０２、１ｎｇ／μｌ、１μｌをＰＣＲの鋳型として使用）を表し、Ｍは分子量マーカー（ＯｎｅＳＴＥＰＭａｒｋｅｒ６）を示す。

図６～７に示すように、比較例１９には、塩析物分散後の濾過液、および凍結乾燥物のいずれにおいてもプラスミドＤＮＡが残存していた。キトサンと負電荷の水不溶性物質を併用した実施例３０～３４では残存するプラスミドＤＮＡ量をＰＣＲの検出限界以下に低減できていた。

Claims

核酸およびタンパク質を含む培養物中でキトサンおよび負電荷の水不溶性物質を混合する工程、および
核酸を除去する工程
を含み、
前記水不溶性物質が珪藻土、木粉、木粉パルプ、パーライト、粉末セルロース、シリカ、活性炭、ベントナイト、タルク、およびカオリンからなる群から選択される少なくとも１つであり、かつゼータ電位が０ｍＶ未満である、
タンパク質の製造方法。
キトサンが微生物由来のキトサンである、請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
混合工程におけるキトサンの濃度が０．００１～１０重量％である、請求項１または２に記載のタンパク質の製造方法。