JP2019536436A - アプタマーを用いた抗酸化物質の酸化防止方法、物質、及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗酸化物質の酸化速度を減少させるアプタマーを提供する。
本発明は、前記本発明のアプタマーと抗酸化物質との複合体、またはアプタマーを単独で有効成分として含む栄養補助剤組成物を提供する。
本発明は、ビタミンCと同様に、ビタミンA(Retinol)、ビタミンE、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムQ10、ペプチド、オイルなどの、酸化に非常に不安定な抗酸化物質をアプタマーと結合して栄養補助剤として製造して使用することができる。これを通じて物質の酸化(腐敗)を防止することによって、それらの物質が求める効果を奏するようにすることによって、その効果を最大限増加させることができる。
本発明は、前記本発明のアプタマーと抗酸化物質との複合体を有効成分として含むか、または飲料にアプタマーを単独で含む飲料組成物を提供する。
Ascorbic Acid SELEX:
アスコルビン酸(Ascorbic acid)に対する9ラウンドのSELEXを、〜1015の独特なオリゴヌクレオチドで構成されたDNAライブラリー(BasePair Biotechnologies)を使用して行った。使用したバッファーの組成は、次の通りである:50mM酢酸ナトリウム(Sodium Acetate) pH5.5(Sigma)、1mM MgCl2(Sigma)、0.05%Tween20(Sigma)、1%BSA(Sigma)及び1mMグルタチオン(Sigma)。[The stringency of the SELEX]のストリンジェンシーを、ターゲットに対するアプタマーの結合時間を減少させ、バッファーの組成を変更し、自由分子溶出においてターゲットの濃度を減少させて変更した。DHAに対する陰性選択を、豊富な(enriched)ライブラリーから酸化形態のアスコルビン酸に結合するアプタマーを除去するために行った。
アスコルビン酸の酸化をVisliselなど(Vislisel,J.M.,Schafer,F.Q. and Buettner,G.R.(2007) Analytical biochemistry,365,31−39)に記載された方法を変形して、酸化物デヒドロアスコルビン酸(dehydroascorbic acid;DHA)を検出して逆に測定した。
最適のアプタマー(A)の有効濃度を決定するために、それをAA(10.3μM)に対して滴定した。AAに対するアプタマーの相対的な濃度は、10x、5x、2x、1x、0.5x、0.25x及び0.1x(103μMで1.03μMアプタマー)であった。全てのアプタマー/AA混合物を、10.3μMCuSO4の添加前に30分間常温で培養し、サンプルを954.6μM OPDAの添加前に10分間さらに常温で培養した。プレートをex:345nm;em:425nmで45分間読み取り、60s毎にデータを集めた。各サンプルを3回繰り返して行った。
アスコルビン酸及びデヒドロアスコルビン酸のような物質は、Sigma−Aldrich(St.Louis,MO)から購入した。AA及びDHAに対するアプタマーの親和度の測定は、MST(microscale−thermophoresis)を使用して行った(Jerabek−willemsen M et al.Assay and drug development technologies.2011;9(4):342−53)。要約すると、Cy5−共役アプタマー(5nM)を、50uMから1.53nMまでターゲット(AA又はDHA)の16回連続して希釈と培養を行った。スキャニング毛細管チューブ(4uL/チューブ)にローディングする前に15分間混合物を培養した。各サンプルの蛍光を、Monolith NT.115 MST装置(NanoTemper Technologies)を使用して熱勾配に露出させる間に測定して、結合曲線を作った。各分析は3回繰り返して行った。
サンプルの製造:
アプタマーA(50uM)をvitaminwaterR(kiwi−strawberry)(Glaceau,Coca−cola)中で培養した。サンプルを常温で培養し、10uLを0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h及び168hで収集した。アスコルビン酸(Cerilliant Cat# V−038)及びデヒドロアスコルビン酸(Sigma−Aldrich Cat#261556)対照群を、LC−MS/MS分析の間、AA及びDHAの安定性をモニタリングするために、各時点の前後に注射した。各サンプル及び対照群を、アスコルビン酸(Ascorbic acid)内部標準物質C13(Toronto Research Chemicals Cat#A786992)で200ng/mLの最終濃度でスパイクした。AAストック溶液(Cerilliant 1mg/mL in acetonitrile:H2O、50:50)を10ug/mL及びAA−C13で1000ng/mLに希釈した。10uLのAA(2ug/mL)を90uLのAA−C13で1000ng/mLに希釈して、それぞれ、AA及びAA−C13から最終濃度1000ng/ml及び900ng/mlを得た。DHA対照群を900ng/mlのAA−C13で1ug/mlの最終濃度で製造した。10uLの各時点のサンプルを、同じ内部標準物質溶液中で1:200に希釈して、LC−MS/MSで分析した。
認識(Acquisition)を、Eksigent μUHPLC(Eksigent,Redwood City,CA,USA)にカップリングされ、50μm iDキャピラリを有する電子噴霧インターフェースを備えたABSciex QTRAP 6500(ABSciex,Foster City,CA,USA)で行った。Analyst 1.6.3ソフトウェアを“Low mass hardware configuration”でその装置を調節し、データの加工及び認識のために使用した。最適化されたMRMパラメータを、アスコルビン酸、アスコルビン酸−C13及びDHAをモニタリングするために使用した。サンプルを、2μLループでループオーバーフィリングして注射し、LC−MS/MSで分析した。分離は、45℃に維持されたGemini C18 from Phenomenex 50mm×0.5mm上で行った。3.5min LC勾配の間、移動相は溶媒A(10mM TBA及び15mM acetic acid in water)及び溶媒B(10mM TBA及び15mM acetic acid in methanol)で構成され、流速は30μL/minであった。勾配は、100:0 A:Bから開始した。TBAをイオンペアリング試薬として使用し、各サンプルを3回繰り返して分析した。
SELEX方法によって生産された豊富なライブラリーのバイオ情報分析は、候補アプタマーを得、これらの上位20個から、酸化からAAを保護する能力をスクリーニングした。
アプタマー(aptamer)プールのスクリーニング
この分析において、DHAの蓄積/検出はAAの酸化を示す。したがって、もし、アプタマーが酸化からAAを保護する場合、生成された信号は陽性(no aptamer)対照群よりも低いはずである。AA及び酸化剤、陽性対照群(AA plus oxidizer)及び陰性対照群(AA minus oxidizer)に混合された各候補アプタマーのオーバーレイグラフを図2に示し、各タイルは、複数のアプタマー候補物質を示す。20個のアプタマーのうち、陽性対照群未満の明確な差を有することで、AAの保護効果が確実な3個をスクリーニングし(アプタマーA、B及びC)、これらは、それぞれ、22番、27番及び44番に対して30分間、AAの酸化が35±13%、43±9%及び25±8%減少した(n=3)。
スクリーニングから得た上位3個のアプタマー(A、B及びC)を、アプタマーが自ら検出分析を妨げるか否かを決定するために、酸化されたAA産物であるDHAに対して分析した。アプタマーAは、DHA対照群グラフから外れず、それは、検出方法を妨げないことを示唆する。しかし、アプタマーB及びCは、対照群グラフと僅かな差を示し、これは、これらのアプタマーに対するスクリーニングから生成されたデータが信頼できないことを示唆する(図2)。信頼できるデータを作るために、全ての追加実験は、アプタマーAのみを使用して行った。
アプタマーAの4種の酸化剤(CuSO4(10.3μM)、NaIO4(103.3μM)、H2O2(10.3μM)及びTEMPOL(103.3μM))に対するAAを保護する能力を評価した。各酸化剤の滴定を、陽性対照群と陰性対照群との間に適切なテストウィンドウを作る最低濃度を決定するために、AA(10.3μM)に対して行った(データは図示せず)。アプタマー22番は、NaIO4の存在において酸化に対する保護に失敗(図3、top right)したが、それぞれ19±6%及び51±7%のAAの相対的な酸化の減少をH2O2及びTEMPOLに対して示した(図4、bottom panels)。また、CuSO4に対する再分析(増加した装置セッティングを有する)は、初期のスクリーニングよりも19%以上である54±5%の酸化の減少を示した(図3、top left)(n=3)。
アプタマーAを、アスコルビン酸と10x、5x、2x、1x、0.5x、0.25x及び0.1xの相対的な濃度で培養した。滴定データは、陽性及び陰性対照群に対してオーバーレイで作図した(図4)。滴定は用量依存的に作用した。最も低い2つの濃度(0.1x及び0.25x)では酸化保護効果が観察されず、酸化保護効果は、AAに対するアプタマーの割合が増加するに伴い増加した。酸化保護の程度は、テストした範囲で安定状態を示さなかった。したがって、アプタマーAによるAAの最大保護効果は、AAの10x以上の濃度で起こった。
AA及びDHAに対するアプタマーAの結合親和度をMSTで測定した。検出されたKD値は、それぞれ、AA及びDHAに対して987.9nM及び189.7nMであった(n=3)。
データの統合と定量化は、曲線の下の面積(AUC)を使用してMultiQuant software(ABSciex)で行った。AAベースの定量化は、168hの経過に対して測定した(図5)。時間経過の終わりで、対照群及びアプタマーA処理されたサンプルにおいて、それぞれ、初期AAの21.9±6.6%及び47.5±0.5%が残った(n=3)。AAの半減期は、対照群及びアプタマーA処理されたサンプルにおいて、それぞれ84±10h及び141±14hであった。これは、アプタマーAの添加が、vitaminwaterRにおいてAAの半減期を168%増加させることを意味する。
SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)過程を通じて、1013個で構成されたDNAアプタマーライブラリーから還元状態のアスコルビン酸に対して選択的に結合するアプタマーを見つける実験を、次の条件で行った。アスコルビン酸の還元状態を維持した状態でSELEXを行うために、〜pH5.5程度に維持し、グルタチオン(glutathione)を投入した。
二次構造の種類によって20個の個別アプタマーを選択して、ビタミンCの酸化防止実験を行った。アニーリングバッファー(Annealing buffer)に溶かしたアプタマーを、95℃に加熱した後、徐々に温度を常温に低下させながらアプタマーの二次構造を作った後、還元されたL−アスコルビン酸と混合して、アプタマーがL−アスコルビン酸と結合できるように約30分間反応させた。その後、過酸化水素水を添加して酸化条件を作った後、L−アスコルビン酸の酸化を、蛍光染料であるOPDA(o−phenylenediamine)を添加して測定した。L−アスコルビン酸の酸化物であるDHAがOPDAと反応して生成されたDHA−OPDAからの蛍光量を測定して、DHAの生成の程度を定量分析することができる。前記の条件で、DHA−OPDAの蛍光量を34秒毎に25分間測定した。
解離定数は、MST(microscale thermophoresis)を使用して決定した。
本発明のアプタマーをヒドロゲルにトラップさせる方法は、まず、アプタマーに付着させておいたアミノ基にビオチン(Biotin)を付着させた後に、これと結合するストレプトアビジンを有しているパーティクルで機能化した後、ヒドロゲルを焼成するときに20%の割合で混合して、ヒドロゲルにアプタマーパーティクルをトラップさせる方法がある。この方法は、アプタマーとヒドロゲルとの間の化学的結合が起こらず、比較的簡単に具現できる方法であるといえる。
滅菌精製水1000gに、本発明のアプタマービタミンC複合体1g、オリゴ糖500g、グリシン2g、タウリン2g、クエン酸ナトリウム0.2gを添加して混合した後、精製水を再度添加して、総重量が2000gとなるようにした。
前記実施例10で製造した本発明のビタミン飲料及び比較例の飲料に対して、味、香り、全体的な嗜好度のような官能検査を行い、その結果を下記の表1に示す。
慢性疲労症状がある50人(男性20人、女性30人)に、前記実施例4で製造した本発明のビタミン飲料と比較例の飲料を、2週間、毎日150mlずつ摂取させた後、疲労改善効果に対する設問を行い、その結果を下記の表2に示す。
Claims (20)
- 抗酸化物質にアプタマーを処理して抗酸化物質の酸化を防止する方法。
- 前記抗酸化物質は、ビタミンC、ビタミンA、レチノール、ビタミンE、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムQ10、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記アプタマーは、配列番号1又は2に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記抗酸化物質がビタミンCである場合に、前記アプタマーは、ビタミンCのラクトン環の2番目及び3番目のOH基の酸化を抑制することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 抗酸化物質の酸化を防止するアプタマー。
- 前記抗酸化物質は、ビタミンC、ビタミンA、レチノール、ビタミンE、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムQ10、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項5に記載のアプタマー。
- 前記アプタマーは、配列番号1又は2に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項5に記載のアプタマー。
- a)請求項5乃至7のいずれかに記載のアプタマーにアミノ基を結合させるステップと、
b)ヒドロゲルモノマーのヒドロキシ基を、エポキシ基を有している3−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン(3−glycidoxypropyltrimethoxysilane、3−GPTMS)でシリル化(silanizing)した後、該エポキシ基に、前記アプタマーに結合しているアミノ基を結合させるステップと、
c)前記ヒドロゲルモノマーを重合させるステップと、を含む、アプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。 - 前記方法は、前記a)ステップのアプタマーに結合しているアミノ基にビオチンを結合させた後、ストレプトアビジンを有している粒子と反応させた後に、ヒドロゲル重合反応時に、前記アプタマーを有する粒子をヒドロゲルモノマーと混合させるステップを含むことを特徴とする、請求項8に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。
- 前記方法は、ヒドロゲルのヒドロキシ基に、化学的方法により、アプタマーに付着しているアミノ基又はカルボキシ基を結合させることを特徴とする、請求項8に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルの製造方法。
- 請求項8乃至10のいずれかに記載の方法によって製造されたアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
- 前記ヒドロゲルは、ヒドロゲルの表面にアプタマーが付着し、前記アプタマーの末端には特定の成分が付着していることを特徴とする、請求項11に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
- 前記特定の成分は、皮膚老化防止、しわ除去、美白、または保湿効果を有する成分であることを特徴とする、請求項12に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲル。
- 請求項11に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを含む化粧料組成物。
- 請求項11に記載のアプタマーがトラップされたヒドロゲルを皮膚に塗布して、前記ヒドロゲルから成分が結合したアプタマーが皮膚内に浸透するようにした後、前記成分が結合したアプタマーがターゲット物質と結合した後、成分を放出するステップを含む、皮膚から分泌されるターゲット物質の量に応じて皮膚活性物質の放出を調節する方法。
- 前記ターゲット物質はATPであることを特徴とする、請求項15に記載の皮膚から分泌されるターゲット物質の量に応じて皮膚活性物質の放出を調節する方法。
- 請求項5に記載の抗酸化物質の酸化を防止するアプタマーを有効成分として含む食品組成物。
- 前記抗酸化物質は、ビタミンC、ビタミンA、レチノール、ビタミンE、アスタキサンチン、レスベラトロール、ポリフェノール、コエンザイムQ10、ペプチド及びオイルからなる群から選択された物質であることを特徴とする、請求項17に記載の食品組成物。
- 前記アプタマーは、配列番号1又は2に記載された塩基配列からなることを特徴とする、請求項17に記載の食品組成物。
- 前記食品は、飲料、菓子類、キャンデー類、乳製品、ガム類、醤類、パン類、及びアイスクリームからなる群から選択された食品であることを特徴とする、請求項17に記載の食品組成物。
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