JP2019534001A - 抗ｃｈｉｋｖ抗体およびその使用 - Google Patents

抗ｃｈｉｋｖ抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）に特異的に結合して中和する抗体および抗体の抗原結合フラグメントであって、ＣＨＩＫＶ疾患を処置するかまたはＣＨＩＫＶ感染を防止するための治療法を開発するために操作されている、上記抗体および抗体の抗原結合フラグメントに関する。本発明は、本発明の抗体を含む医薬組成物およびＣＨＩＫＶ疾患の防止および処置のための抗体の使用にも関する。

Description

本発明は、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）に特異的に結合して中和する抗体および抗体の抗原結合フラグメントに関し、それは、操作されてＣＨＩＫＶ疾患の防止および処置のための予防的および治療的解決をもたらす。本発明はＣＨＩＫＶを中和する抗体を含む医薬組成物およびＣＨＩＫＶ疾患の防止および処置のための抗体の使用にも関する。
ＣＨＩＫＶは、再興性の、蚊によって運ばれる病原体である。ＣＨＩＫＶは、アフリカ、インドおよび東南アジアにおける地方病であるが、これらの領域を越えても、高い攻撃率で予測不能の急激な大発生を起こして、幾百万もの人々に感染する（非特許文献１）。ＣＨＩＫＶのエンベロープ糖タンパク質１（Ｅ１）における突然変異が、ネッタイシマカに加えてヒトスジシマカによるウイルスの伝播を可能にして、２００５年にはレユニオン、インドおよびインドネシアに広がって深刻な流行を生じ、それに続いてイタリア、フランスおよび中国において旅行者で始まった急激な発生を生じた（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。ヒトスジシマカの広がった地理的範囲に基づいて、該ウイルスは新しい領域に広がると予想され、ヨーロッパおよび南北アメリカは今やＣＨＩＫＶの急激な発生のリスク下にある。
ＣＨＩＫＶは、トガウイルス科のアルファウイルス属のエンベロープ付きのプラス鎖ＲＮＡウイルスである。それは、セムリキ森林ウイルス複合体のメンバーであり、ロスリバーウイルスおよびオニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）と密接に関係しており；それは節足動物、すなわち蚊により伝播されるので、アルボウイルス（節足動物によって運ばれるウイルス）と称することもできる。
ＣＨＩＫＶは、受容体に媒介される内部移行、および初期のエンドソーム中における低ｐＨに引き起こされるタイプＩＩの膜融合事象により細胞に進入する。ＣＨＩＫＶ疾患は、急性、急性後および慢性の多発性関節炎／多発性関節痛期により特徴づけられ、後者は、通常対称性であり、しばしば無能力をもたらし、数か月または数年継続し得る。発熱、発疹、筋肉痛．および／または疲労のような他の症状も、急性期中に存在する。最近の流行は、共存症を有する非常に若い患者および高齢の患者に限定されるようであるＣＨＩＫＶ疾患の非定型および重症の臨床的形態および一部は死とも関連していた。
現在、ＣＨＩＫＶ疾患のための特定の予防的または治療的処置はない。ＣＨＩＫＶは、通常、ベッドで休養、輸液、および発熱および疼痛の症状を緩和するために簡単な鎮痛剤および／または非ステロイド抗炎症性薬剤（ＮＳＡＩＤ）のような医薬で症状に処置されている。ＣＨＩＫＶに対するワクチン候補が最初に４５年前に提案されたが、これまでに試験された多くのワクチン候補は、保護抗体を誘発すること、または有意の安全性の結果を示すことに成功しなかった。
Ｐｏｗｅｒｓ ＡＭ，Ｌｏｇｕｅ ＣＨ，２００７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８８：２３６３−２３７７ Ｔｓｅｔｓａｒｋｉｎ ＫＡら ２００７，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．３：ｅ２０１； Ｓｃｈｕｆｆｅｎｅｃｋｅｒ Ｉら ２００６，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ２６３； Ｗｕ Ｄ，Ｚｈａｎｇ Ｙら ２０１３，Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．１０：１７４； Ｒｅｚｚａ Ｇら ２００７，Ｌａｎｃｅｔ ３７０：１８４０−１８４６； Ｂｕｒｔ ＦＪ ２０１２，Ｌａｎｃｅｔ ３７９：６６２−６７１
ＣＨＩＫＶを標的とする特異的モノクローナル抗体の使用を含む、ＣＨＩＫＶに対する向上した治療効力を示す処置に対する必要性が未だ存在する。予防的および治療的使用のために適当なＣＨＩＫＶを中和する抗体の必要性が当技術分野に存在する。特に、そのような抗体は、異なる株のＣＨＩＫウイルスを高い標的結合親和性を以て適切に中和して、適当な薬物動態学的パラメーターを示し、投与されると適当な半減期を示し、大規模における効率的な製造を可能にしながら、エフェクター機能と関連するＦｃγＲＩＩＩａに対するそれらの結合を保持する必要がある。
本発明で開示したように、本出願の発明者らは、特異的なＣＨＩＫＶ中和抗体を選択および操作し、それらの曝露と関連する薬物動態を改善し、エフェクター機能に関連するＦｃγＲＩＩＩａに対するそれらの結合を維持して、それらを、ＣＨＩＫＶ疾患を防止および処置するための治療学の開発と適合性にして、ＣＨＩＫＶに対する効果的な療法のための技術分野における必要性に対処することができた。
本発明の抗体は、異なるＣＨＩＫＶ株に対する高い結合親和性（ナノモル濃度の範囲内）を有する。それ故、それらは、異なるＣＨＩＫＶ株に対して、広い、非常に強力な中和活性を示す。さらに、本発明の抗体は、ヒトＦｃＲｎ受容体に対する改善された結合を有し、同時にＦｃγＲＩＩＩａへの結合を保持してそれらを増大した半減期と適合性にして、同時にエフェクター機能と関連するＦｃγＲＩＩＩａに対するそれらの結合を維持する。
第１の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶに結合し、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む単離されたモノクローナル抗体であって：
ｉ． 前記ＣＤＲＨは配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬは配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬは配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、１つもしくは２つのアミノ酸置換によりｉ．もしくはｉｉ．の配列と異なるアミノ酸配列を有し；
および前記抗体は：
ｉｖ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｖ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｖｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｖｉｉ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖｉｉｉ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域をさらに含み；
ここで、前記アミノ酸の位置は、ＥＵインデックスにより与えられるモノクローナル抗体に関する。
一実施形態において、単離されたモノクローナル抗体は、ＣＨＩＫＶに結合し、および３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含み、ここで：
ｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは、配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは、配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、１つもしくは２つのアミノ酸置換によりｉ．もしくはｉｉ．の配列と異なるアミノ酸配列を有し；
および前記抗体は：
ｉｖ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｖ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｖｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｖｉｉ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖｉｉｉ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域をさらに含み；
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられ；
および抗体は以下の：
ｉｘ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的と約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
ｘ． ヒトＦｃＲｎと約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
ｘｉ． ヒトＦｃγＲＩＩＩと約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
性質の１つまたはそれ以上を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、前記抗体は、それぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は：
− 配列番号５の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号６の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号７の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号８の配列からなるＣＤＲＬ１；
− 配列ＧＮＴからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１０の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、前記抗体は、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、またはこれらの配列と１つもしくは２つにアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号１３の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− 配列ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は：
ｉ． 位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｉｉ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から選択される残基を含むＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体はＦｃ領域を含み、ここで、前記Ｆｃ領域は、位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含み、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、モノクローナル抗体はカッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号５９、６０、６１、６２および６３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖を有する。
第２の態様において、単離されたモノクローナル抗体は、ＣＨＩＫＶ、またはその抗原結合フラグメントに結合し、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、および前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
一実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは：
配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
配列番号３３の配列からなるＣＤＲＨ３；
配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２
配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含み；ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
別の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
別の実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、および前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
別の実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、および前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではなく、
ここで、抗体は以下の：
ｉｖ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
ｖ． ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
ｖｉ． ヒトのＦｃγＲＩＩＩに約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
性質の１つまたはそれ以上を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＱおよびＮからなる群から選択される、配列番号３３の位置８におけるアミノ酸を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３４の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、Ｑ、Ｅ、Ｓ、ＴおよびＤからなる群から選択される、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸を含む。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３５の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、Ａ、ＳおよびＴからなる群から選択される、配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸を含む。
さらなる実施形態において、モノクローナル抗体は：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３６の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号５７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号４７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖を有する。
この第２の態様の別の態様において、モノクローナル抗体は：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から選択される残基を含むＦｃ領域をさらに含み
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は：
ｉ． 位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｉｉ． 位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から選択される残基を含むＦｃ領域を有し、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を有し、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
本発明のこの態様の別の実施形態において、モノクローナル抗体は、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含む。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号５９、６０、６１、６２および６３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号５７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号５３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる重鎖を有する。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる軽鎖を有する。
第４の態様において、本発明は、医薬として使用するためのモノクローナル抗体に関する。
別の実施形態において、モノクローナルは、ＣＨＩＫＶと関連する関節痛の処置に使用するためのものである。
別の実施形態において、モノクローナル抗体は、ＣＨＩＫＶ感染の防止に使用するためのものである。
第５の態様において、本発明は、モノクローナル抗体および少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物に関する。
第６の態様において、本発明は、モノクローナル抗体を産生する細胞株に関する。
第７の態様において、モノクローナル抗体を産生する方法であり、前記方法は、（ｉ）第６の態様により細胞株を培養するステップ；（ｉｉ）産生されたモノクローナル抗体を精製するステップ；および場合により（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体を医薬組成物に剤形化するステップを含む。
第８の態様において、本発明は、本発明で特徴づけられる抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、それが配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を有することを特徴とする。
第９の態様において、本発明は、本発明で特徴づけられる少なくとも１種の抗体を含むキットに関する。一実施形態において、前記キット場合によりパッケージング材料を含む。
ヒトのＩｇＧ１の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域のアミノ酸配列；ヒンジおよびＣＨ２およびＣＨ３領域の部分がＦｃ領域を構成することを示す図である。アミノ酸残基の番号づけは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ，Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））で説明されているＥＵインデックスに従う。本発明で主に扱うＦｃ領域の置換された残基を四角で囲ってある。 ＩｇＧ１のＦｃ領域配列アラインメント：配列番号１７；配列番号５９；配列番号６０；配列番号６１；配列番号６２および配列番号６３を示す図である。 潜在的脱アミノ化および酸化モチーフを排除するために作製されたｍＡｂ２のＣＤＲＨ３内における突然変異のＥ２−Ｅ１標的への結合に対する効果を示す図である。結果の比較を各突然変異体について２連で示す。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のそれぞれのＦｃ領域における置換の、ＦｃＲｎへの結合に対する効果を示す図である。ｐＨ６．０における結果の比較を、ヒトのＦｃＲｎに対するｍＡｂ１（図４Ａ）およびｍＡｂ２（図４Ｃ）について、ならびにマウスのＦｃＲｎに対するｍＡｂ１（図４Ｂ）およびｍＡｂ２（図４Ｄ）について２連で示す。 図４−１の続き。 図４−２の続き。 図４−３の続き。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のそれぞれのＦｃ領域における突然変異のＥ２−Ｅ１標的への結合に対する効果を示す図である。結果を、株ＬＲ２００６（図５Ａ）およびＳＬ１５６４９（図５Ｂ）のそれぞれから誘導されたＥ１−Ｅ２抗原について２連で示す。 図５−１の続き。 ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のそれぞれのＦｃ領域における置換の、ＦｃγＲＩＩＩａの結合に対する効果を示す図である。結合結果を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ高親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８）に対するｍＡｂ１（図６Ａ）およびｍＡｂ２（図６Ｂ）について、ならびにヒトＦｃγＲＩＩＩａ低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）に対する、それぞれについて（ｍＡｂ１について図６ＣおよびｍＡｂ２について図６Ｄ）２連で示す。 図６−１の続き。 図６−２の続き。 図６−３の続き。 標準的プラーク減少アッセイを使用するｍＡｂ１およびｍＡｂ７の中和活性を示す図である。ｍＡｂ１およびｍＡｂ７は、３通り全ての遺伝子型すなわち、アジア型（図７Ａ）、東中部および南部アフリカ型（ＥＳＣＡ）（図７Ｂ）および西部アフリカ型（図７Ｃ）からのチクングニアウイルスを非常に強力な活性で阻害する。 図７−１の続き。 図７−２の続き。 マウスにおけるｍＡｂによる予防の研究。ＣＨＩＫＶ感染の前２、７または１４日に２５０μｇ／マウスで与えられたｍＡｂ１およびｍＡｂ７の、ＤＢＡ／１Ｊマウスの右後脚に接種後３日におけるウイルス力価に対する効果を示す図である。ウイルスの力価を組織の１グラム当たり５０％細胞培養感染性用量（ＣＣＩＤ５０）としてプロットしてある。 マウスにおけるｍＡｂ曝露後療法を示す図である。３ｄｐｉでｍＡｂ２、７、１１および１４の固定された２５０μｇ用量の単回の腹腔内投与後、右後脚に接種後５日（ｄｐｉ）におけるウイルス力価（図９Ａ）。３ｄｐｉで種々の用量の単回投与後（１０から２５０μｇ／マウス）（図９Ｂ）におけるｍＡｂ７およびｍＡｂ１４の５ｄｐｉの右後脚におけるウイルス力価に対する用量範囲の効果。ウイルスの力価を、組織の１グラム当たりの５０％細胞培養感染性用量（ＣＣＩＤ５０）としてプロットしてある。上側の横線は組織ホモジネートについての検出の平均限界である。 図９−１の続き。 非ヒト霊長類におけるｍＡｂの薬物動態を示す図である。静脈内（ＩＶ）ボーラスにより、２．５ｍｇ／ｋｇを雄カニクイザルサル（Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に投与されたｍＡｂ１およびｍＡｂ７についての薬物動態の比較。
定義
「抗体」は、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結されて、かつ各重鎖がジスルフィド結合で軽鎖に連結されている天然または通常の抗体である。哺乳動物では、抗体は、５種の主要なクラスまたはアイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに分類される。それらは、それらがそれぞれ含有する重鎖、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマまたはミューによって分類される。これらは、定常ドメインの配列および数、ヒンジ構造および抗体の価数が異なる。２つのタイプの軽鎖、ラムダ（ｌ）およびカッパ（ｋ）があり、２つのうちカッパ軽鎖がより一般的である。これらはタンパク質配列が比較的異なるが、それらは同様な構造および機能を共有する。
５種の主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が、抗体分子：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの機能の活性を決定する。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。ＩｇＧは正常ヒト血清中で最も豊富な抗体であり、全免疫グロブリンプールの７０−８５％を占める。それは分子量が約１５０ＫＤａのモノマーであり、第二次免疫応答の主要な抗体であり、５種の免疫グロブリンクラスのうち最長の半減期を有する。ＩｇＧは各々異なる重鎖を含有する４種のヒトサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）からなる。それらは、高度に相同性であり、主としてヒンジ領域およびそれらが宿主の免疫システムを活性化する程度において異なる。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４は、ヒンジ領域中に２個の鎖間のジスルフィド結合を含有し、ＩｇＧ２は４個を有し、ＩｇＧ３は１１個を有する。
軽鎖は、２つのドメインまたは領域、すなわち、１つの可変ドメイン（ＶＬ）および１つの定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、総称的にＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、胎盤を越える移動性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合のような重要な生物学的性質を付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体の結合部位と抗原性決定基との間の構造相補性に存する。抗体の結合部位は、主として超可変性または相補性決定領域（ＣＤＲ）による残基でできている。時たま、非超可変基またはフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が、ドメイン構造全体に、それ故、結合部位に影響する。「相補性決定領域またはＣＤＲ」とは、元来の免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽および重鎖は、各々、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−Ｌ（軽鎖の相補性決定領域について）またはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈ（重鎖の相補性決定領域について）またはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と呼ばれる３つのＣＤＲをそれぞれ有する。通常の抗体の抗原結合部位は、それ故、重および軽鎖のＶ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。
「フレームワーク領域」（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に差しはさまれたアミノ酸配列、すなわち、単一種における異なる免疫グロブリンの間で比較的保存されている、免疫グロブリンの軽および重鎖の可変領域のこれらの部分を指す。免疫グロブリンの軽および重鎖は、各々ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと、呼ばれるそれぞれ４つのＦＲを有する。
本明細書において使用する、「ヒトのフレームワーク領域」は、天然に生じるヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一の（約８５％またはそれ以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％または１００％）フレームワーク領域である。
一実施形態において、免疫グロブリン軽または重鎖におけるＣＤＲ／ＦＲの定義は、ＩＭＧＴ定義（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐら，２００３，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７；ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）に基づいて決定されるべきである。本発明で主に扱うＣＤＲ配列はＩＭＧＴの命名法に従って与えられる。
本明細書において使用する用語「抗体」は、通常のまたは全長の抗体（すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む抗体）、単一ドメインの抗体、および通常のおよび単一ドメインの抗体のフラグメントを指す。本明細書において使用する用語「抗体」は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒトの抗体、および多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体および三重特異性抗体など）を含むが、これらに限定されない。用語「抗体」は、シグナルペプチド（または、存在すればプロペプチド）を含む抗体、および鎖（単数または複数）の分泌およびタンパク質分解プロセシングで得られる成熟形態の両方を指す。
本明細書において使用する、抗体または免疫グロブリンは、比較的最近記載された「単一ドメイン抗体」も含み、それは、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの部分である抗体である。単一ドメイン抗体の例は、重鎖抗体、元来軽鎖が欠けている抗体、通常の４鎖抗体から誘導される単一ドメイン抗体、操作された単一ドメイン抗体を含む。単一ドメイン抗体は、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギおよびウシを含むが、これらに限定されない任意の種から誘導することもできる。単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られる天然に生じる単一ドメイン抗体であることもある。特に、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカおよびグアナコは、元来軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する。ラクダ科の動物の重鎖抗体は、ＣＨ１ドメインも欠く。
軽鎖を欠くこれらの単一ドメイン抗体の可変重鎖は、当技術分野で「ＶＨＨ」または「ナノボディ」として知られている。通常のＶＨドメインと同様に、ＶＨＨは、４つのＦＲおよび３つのＣＤＲを含有する。ナノボディは、通常の抗体に優る利点を有する：すなわち、それらはＩｇＧ分子より約１０倍小さく、その結果として、適当に折り畳まれた機能性ナノボディを、高収率を達成しながらインビトロにおける発現により産生することができる。さらに、ナノボディは非常に安定で、プロテアーゼの作用に対して抵抗性である。ナノボディの性質および産生は、ＨａｒｍｓｅｎおよびＤｅ Ｈａａｒｄ ＨＪにより総説されている（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７ Ｎｏｖ；７７（１）：１３−２２）。
本明細書において使用する、「単離された抗体」は、主として異なる抗原特異性を有する他の抗体を含まない抗体を指し；例えば、ＣＨＩＫＶに結合する単離された抗体、またはそれらのフラグメント、またはその抗原結合フラグメントは、主としてＣＨＩＫＶ以外の抗原に特異的に結合する抗体を含まない。
本明細書において使用する「遮断抗体」または「中和抗体」、または「ＣＨＩＫＶ活性を中和する抗体」、または「ＣＨＩＫＶに対して中和する活性を示す／発揮する抗体」、または「ＣＨＩＫＶを中和する抗体」または「抗ＣＨＩＫＶ抗体」は、そのＣＨＩＫＶに対する結合がＣＨＩＫＶの少なくとも１種の生物学的活性の阻害を生ずる抗体を指す。例えば、抗体は、細胞に対するＣＨＩＫＶの付着を遮断することによりＣＨＩＫＶ株を中和して、それによりＣＨＩＫＶによる前記細胞の感染を防止することができる。
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、特定の抗原に対する単一のアミノ酸組成物の抗体分子を指し、如何なる特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、Ｂ細胞またはハイブリドーマの単一クローンにより産生されるが、組換え、すなわち、タンパク質工学により産生されることも可能である。
用語「キメラ抗体」は、その最も広い意味で、１種の抗体からの１つまたはそれ以上の領域と１種またはそれ以上の他の抗体（単数または複数）からの１つまたはそれ以上の領域とを含有する操作され抗体を指す。特に、キメラ抗体は、別の抗体、特にヒトの抗体のＣＨドメインおよびＣＬドメインと結合した非ヒト動物に由来する抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む。非ヒト動物として、任意の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ等を使用することができる。キメラ抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対する特異性を有する多重特異性抗体を意味することもできる。一実施形態において、キメラ抗体は、マウス起源の可変ドメインとヒト起源の定常ドメインとを有する。
用語「ヒト化抗体」は、ヒトにおける免疫応答を回避または最小化するために、最初は全体的にまたは部分的に非ヒト起源のものであり、あるアミノ酸、特に重鎖および軽鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸を置き換えることにより改変された抗体を指す。ヒト化抗体の定常ドメインは、ほとんどの場合、ヒトのＣＨおよびＣＬドメインである。一実施形態において、ヒト化抗体はヒト起源の定常ドメインを有する。
（通常の）抗体の「フラグメント」は、完全抗体の部分、特に完全抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、抗体フラグメントから形成された二重特異性抗体および多重特異性抗体を含む。通常の抗体のフラグメントは、重鎖抗体またはＶＨＨのような単一ドメイン抗体であることもできる。
用語「Ｆａｂ」は、ＩｇＧをパパインというプロテアーゼで処理することにより得られるフラグメントの中で、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分および全Ｌ鎖がジスルフィド結合を通して結合されて一緒になった、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味する。
用語「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＩｇＧをペプシンというプロテアーゼで処理することにより得られるフラグメントの中で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を通して結合したＦａｂより僅かに長い、約１００，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを意味する。
用語「Ｆａｂ’」は、Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することにより得られる、約５０，０００の分子量および抗原結合活性を有する抗体フラグメントを指す。
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、抗体の重鎖のカルボキシル末端部と定義されて、全ての免疫グロブリンに共通のタンパク質配列ならびに免疫グロブリンの個々の異なるクラスに固有の決定基を含有する。例として、ヒトＩｇＧ１の重鎖は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含み；ヒンジおよびＣＨ２およびＣＨ３領域の部分がＦｃ領域を構成する。図１に示したように、本発明の目的のためのＦｃ領域のアミノ酸残基の番号づけは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））で説明されているＥＵインデックスに従う。その結果、「該／前記アミノ酸の位置がＥＵインデックスにより与えられている」という表現は、上のＫａｂａｔら，１９９１で説明されている、図１に示したＦｃ領域のこの番号づけを指す。
このＦｃ領域のドメインは、免疫グロブリンの生物学的機能の決定における中心であり、これらの生物学的機能は「エフェクター機能」と称される。これらのＦｃドメインに媒介される活性は、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好塩基球、好中球およびマスト細胞、または種々の補体構成要素を含む免疫学的エフェクター細胞により媒介される。これらのエフェクター機能は、抗体のＦｃドメインの前記受容体（または「Ｆｃ受容体」）または補体構成要素（単数または複数）への結合による前記エフェクター細胞の表面にある受容体の活性化を含む。抗体依存性の細胞の細胞障害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性の細胞の食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性の細胞障害性（ＣＤＣ）活性は、これらのエフェクター機能に属して、エフェクター細胞のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩのようなＦｃ受容体またはＣ１ｑのような補体構成要素に対するＦｃドメインの結合を含む。種々のヒト免疫グロブリンクラスの中で、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３媒介のＡＤＣＣは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも効果的である。用語「Ｆｃ受容体」は、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲＩまたはＣＤ８９）およびＦｃε受容体（ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）を含むが、これらに限定されない。数通りのアミノ酸置換が、文献で、異なるヒトＩｇＧアイソタイプにおけるエフェクター機能の低下に結びつくと報告されている（Ｓｔｒｏｈｌ ２００９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：６８５−６９１中の表２を参照されたい）。
単一鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）のポリペプチドは、共有結合で連結されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーであり、それは、ペプチドをコードするリンカーにより連結された、ＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から通常発現される。ヒトｓｃＦｖフラグメントは、特に遺伝子組換え技法を使用することにより、適当な構造に保たれるＣＤＲを含むことができる。２価および多価抗体のフラグメントは、１価のｓｃＦｖｓの会合により自発的に形成されるか、または２価ｓｃ（Ｆｖ）２のようなペプチドリンカーにより１価のｓｃＦｖをカップリングさせることにより生成されるかのいずれかが可能である。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロダイマーである。「（ｄｓＦｖ）２」は、ペプチドリンカーによりカップルされた２つのｄｓＦｖを表す。
用語「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」は、単一分子内に２種の抗体の抗原結合部位を組み合わせた抗体を表す。したがって、ＢｓＡｂは、２種の異なる抗原と同時に結合することができる。遺伝子操作は、増大した頻度で、例えばＥＰ２０５０７６４Ａ１に記載された結合の性質およびエフェクター機能の所望のセットを用いて、抗体または抗体誘導体を設計、改変、および産生するために使用される。
用語「多重特異性抗体」は、単一分子内の２種またはそれ以上の抗体の抗原結合部位を組み合わせた抗体を表す。
用語「ダイアボディ」は、２種の抗原が結合している部位を有する小さい抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同じポリペプチド鎖で軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ−ＶＬ）を含む。２つのドメイン間を同じ鎖で対にすることを可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、これらのドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対を形成することを強制されて２種の抗原結合部位を生じる。
用語「ハイブリドーマ」は、非ヒト哺乳類を抗原で免疫することにより製造されたＢ細胞を、マウス等に由来する骨髄腫細胞と細胞融合させることにより得られる細胞を表し、それは抗原特異性を有する所望のモノクローナル抗体を産生する。
本明細書において使用する、「特異的に結合する」または「と特異的に結合する」または「と結合する」等は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、生理学的条件下で比較的安定な抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも、約１×１０−８Ｍまたはそれ以下の平衡解離定数（ＫＤ）により特徴づけることができる（例えば、より小さいＫＤはより緊密な結合を表す）。２種の分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴等を含む。本明細書で記載されているように、抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を使用して、ＣＨＩＫＶおよび／またはＣＨＩＫＶ抗原に対するそれらの特異的結合により特徴づけられてきた。
本明細書において使用する「ＣＨＩＫＶ抗原」は、本明細書に記載されている抗体の特異的天然抗原、すなわち、ＣＨＩＫＶのタンパク質Ｅ２を意味する。それは、例えば、本明細書の材料および方法で記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体の結合親和性をインビトロで測定するための表面プラズモン共鳴結合実験で使用され、「ｐＥ２−Ｅ１タンパク質」または「ｐＥ２−Ｅ１標的」または「ｐ６２−Ｅ１」または「ｈｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２」または「ＣＨＩＫＶ標的ｐＥ２−Ｅ１」または「ＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１抗原」と呼ばれるＣＨＩＫＶのエンベロープタンパク質Ｅ１およびＣＨＩＫＶの特異的抗原Ｅ２を含む組換えタンパク質も包含する。
本明細書において使用する「酸性環境」とは、ｐＨ７未満の環境を意味して；それは、例えばｐＨ６で行われる結合実験は、酸性環境における結合データをもたらすと理解される。
「参照配列と少なくとも８０％同一の」配列は、その全長で、参照配列の全長と８０％以上、特に８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列である。
「配列同一性」のパーセンテージは、比較枠にわたって最適に整列された２つの配列を比較することにより決定することができて、その際、２つの配列の最適の整列について、比較枠中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、参照配列（それは付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で出現する位置の数を決定することにより計算されて一致した位置の数を得、比較枠中における一致した位置の数を位置の全数により除して、結果を１００倍することにより配列同一性のパーセンテージを得る。比較のための配列の最適の整列は、全体的なペアごとの整列により、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のアルゴリズムを使用して実施される。配列同一性のパーセンテージは、例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅを、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、および以下のパラメーター、ギャップ−オープン＝１０、ギャップ−エクステンド＝０．５で使用して、容易に決定することができる。
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学性質（例えば、電荷または疎水性）が同様な側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基により置換された置換である。一般的に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。化学性質が同様な側鎖を有するアミノ酸の群の例は、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族のヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；および７）イオウ含有側鎖：システインおよびメチオニンを含む。保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン−トリプトファン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタメート−アスパルテート、およびアスパラギングルタミンである。
抗体の「抗原結合部分」、抗体等の「抗原結合フラグメント」という本明細書において使用する用語は、抗原と特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に生じる、酵素的に得ることができる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の「抗原結合部分」、または「抗体フラグメント」という本明細書において使用する用語は、ＣＨＩＫＶおよび／またはＣＨＩＫＶ抗原と結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。そのような抗原結合部分は、典型的には抗体のＣＤＲを含む。
「抗体依存性の細胞媒介細胞障害性」または「ＡＤＣＣ」は、分泌されて、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した抗体が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が、抗原を担持する標的細胞に特異的に結合して、その後標的細胞を殺滅することを可能にする細胞障害性の形態を指す。換言すれば、ＡＤＣＣは、免疫システムのエフェクター細胞、主としてナチュラルキラー細胞が、特異的抗体が結合した標的細胞を能動的に溶解する細胞媒介免疫の機構である。ＡＤＣＣは、抗体が、液性免疫応答の部分として、感染を制限して封じ込めることができる機構の１つである。関心がある分子のＡＤＣＣ活性を推定するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたようなインビトロのＡＤＣＣアッセイも考慮した。
「１つまたは２つのアミノ酸置換（単数または複数）によりＸまたはＹの配列と異なるアミノ酸配列（単数または複数）」という表現は、前記配列が、最大で２つのアミノ酸置換により配列ＸまたはＹと異なる、すなわち、１つまたは２つにすぎないアミノ酸置換によって異なることを意味する。
例えば、「アミノ酸置換Ｚおよび場合により１つまたは２つの追加のアミノ酸置換（単数または複数）により、配列Ｙと異なる配列Ｘ」という表現は、前記配列Ｘが：
− アミノ酸置換Ｚのみ、または
− アミノ酸置換Ｚおよびアミノ酸置換Ｚと異なる１つまたは２つのアミノ酸置換
によって、配列Ｙと異なることを意味する。
「位置Ｙで１つのアミノ酸が置換された配列番号Ｘ」という表現は、配列番号Ｘの位置Ｙにおける１つのアミノ酸置換により配列番号Ｘと異なる配列を意味する。
本明細書において使用する「ＣＨＩＫＶ」は、上の導入部で記載されたトガウイルス科のアルファウイルス属のエンベロープ付きのプラス鎖ＲＮＡウイルスであるチクングニアウイルスを意味する。ＣＨＩＫＶの中に、東部／中部／南部アフリカ（ＥＣＳＡ）遺伝子型、例として、２００６年１０月２４日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＤＱ４４３５４４．２で示された配列を有するＬＲ２００６ＯＰＹ１［ＬＲ］株など；西部アフリカ遺伝子型、別の例として、２０１０年１２月２８日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＨＭ０４５７８６．１で示された配列を有するＮＩ６４ＩｂＨ３５株など、およびアジア型遺伝子型、別の例として、２０１０年１２月２８日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＨＭ０４５７９７．１で示された配列を有するＲＳＵ１株など、および例えば、２０１４年９月１１日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＫＪ４５１６２４で示された配列を有する９９６５９［２０１４カリブ型］株を含むが、これらに限定されない異なった代表的感染性株（「ＣＨＩＫＶ株」）も包含される。異なる遺伝子型に属する他の株も同定されており、例えば、Ｓ２７株は、別の例として、２０１４年１月１４日付けのＮＣＢＩ受入番号ＡＦ３６９０２４．２、および２０１５年９月１６日付けのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅでＱ８ＪＵＸ５で示された配列を有し：ならびに別の例としてＳＬ１５６４９は、２０１１年１２月１４日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＧＵ１８９０６１で示された配列を有する。参照されたＣＨＩＫＶ株の他の例は、ウイルス病原体データベース内で、それらのゲノムに関しては：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ｄｏＱｕｉｃｋＴｅｘｔＳｅａｒｃｈ＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａ＆ｐａｇｅＴｏ＝１＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎＣｏｎｔｅｘｔ＝１４７６３６２３２２４４８で、または関連するタンパク質に関しては：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ｄｏＱｕｉｃｋＴｅｘｔＳｅａｒｃｈ＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａ＆ｐａｇｅＴｏ＝１＆ｓｅｌｅｃｔｉｏｎＣｏｎｔｅｘｔ＝１４７６３６２６６９７６３
で利用可能である。
他のアルファウイルスのゲノムと同様に、ＣＨＩＫＶゲノムは、２つのエンベロープ糖タンパク質、Ｅ２およびＥ１をコードして、それらは、より大きいポリタンパク質前駆体（カプシド／Ｅ３／Ｅ２／６Ｋ／Ｅ１；２０１２年６月２７日付けのＮＣＢＩ受入番号：ＮＣ＿００４１６２．２で示される）から誘導されて、ウイルスの膜に埋め込まれる。成熟ビリオンは、３種の主要な構造タンパク質：ヌクレオカプシドタンパク質および２種の糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２を含み、ここで、Ｅ２は細胞への付着において機能し、およびＥ１はウイルス融合に関係する。第３の糖タンパク質、Ｅ３は、幾種類かのアルファウイルスにおける成熟ビリオンに会合しているが、他のビリオンに会合しておらず、Ｅ２およびＥ１を放出するポリタンパク質前駆体の切断により生じる膜結合ペプチドである６Ｋタンパク質が、粒子中に低レベルで組み込まれる。粒子中におけるアルファウイルスの表面糖タンパク質の組織化は、冷凍電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ−ＥＭ）を使用して明確化されたが、ＣＨＩＫＶの糖タンパク質の原子構造は、最近Ｘ線結晶学により、成熟粒子および未成熟前駆体ポリタンパク質の両方について解明された。３種の糖タンパク質（Ｅ３／Ｅ２／Ｅ１）の各々の２４０コピーが、成熟ウイルス上で一緒になって８０個のスパイクを形成し、それがウイルスの膜の周囲に二十面体のタンパク質シェルを構成する（Ｖｏｓｓ ＪＥら ２０１０， Ｎａｔｕｒｅ ４６８：７０９−７１２）。これらの糖タンパク質の折り畳み、表面への輸送および機能は、それらの相互の適当な相互作用に依存する。Ｅ１は、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩと称される３つのｂ−シートドメインからなり；Ｅ２は、３つの免疫グロブリン様ドメインを含有する（Ａ、ＢおよびＣ、ＡがＮ末端にある）。複合体中で、ドメインＢは、膜の遠方端部にあってＥ３に接し、ドメインＣは、ウイルス膜に最も近く、およびドメインＡは、中心にある（Ｆｏｘ ＪＭら ２０１５，Ｃｅｌｌ １６３：１０９５−１１０７およびＷＯ２０１５０１０１２５）。ＣＨＩＫＶのＥ１、Ｅ２およびＥ３タンパク質についての配列および情報は、ＰＤＢエントリーＮｏ．２ｘＦＢおよび２ｘＦＣ（２０１０年１１月２４日に最新のアップデート）、ＰＤＢエントリーＮｏ．３Ｎ４０、３Ｎ４１、３Ｎ４２、３Ｎ４３および３Ｎ４４（最新のアップデート、２０１０年１２月１日）で、それぞれ、限定するものではない例として提供される。
本発明で主に扱う抗体
治療目的のために、特に、それらが標的とする抗原（単数または複数）に対するそれらの結合、それらの安定性、薬物動態および薬力学ならびにそれらの機能を改善することにより、それらに求められる薬学的性質に、より適したｍＡｂを生成させることが望ましい。
第１の目的として、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、完全にヒトの親抗体、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のそれぞれに基づいて、それは異なるＣＨＩＫＶ株に対して、特にそれらのそれぞれのタンパク質Ｅ２に高い結合親和性を有する（ナノモル濃度の範囲内）。それ故、それらは、種々のＣＨＩＫＶ株に対して広い、非常に強力な中和活性を発揮する。
ｍＡｂ１は：
− 配列：
Figure 2019534001
 からなる重鎖の可変ドメイン（フレームワーク領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含む）；
− 配列：
Figure 2019534001
 からなる軽鎖の可変ドメイン（フレームワーク領域はＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む）
を含み、
ｍＡｂ２は：
− 配列：
Figure 2019534001
 からなる重鎖の可変ドメインを含み、フレームワーク領域はＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３を含み；
− 配列：
Figure 2019534001
 からなる軽鎖の可変ドメインを含み、フレームワーク領域は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３を含む。
第１の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶに結合するｍＡｂ１およびｍＡｂ２の変形抗体を提供し、それらは、それらのＦｃドメインにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を含むので、酸性環境でＦｃＲｎ受容体に対する改善された結合を有する。そのような突然変異は、患者に投与されたときに、そのような変形抗体の血清半減期における増大をもたらす。そのような置換の例は、位置２５０（例えば、ＥまたはＱ）；２５０および４２８（例えば、ＬまたはＦ）；２５２（例えば、Ｌ／Ｙ／Ｆ／ＷまたはＴ）、２５４（例えば、ＳまたはＴ）および２５６（例えば、Ｓ／Ｒ／Ｑ／Ｅ／ＤまたはＴ）における改変；または位置４２８および／または４３３（例えば、Ｈ／Ｌ／Ｒ／Ｓ／Ｐ／ＱまたはＫ）および／または４３４（例えば、Ａ、Ｗ、Ｈ、ＦまたはＹ）における改変；または位置２５０および／または４２８における改変；または位置３０７または３０８（例えば、３０８Ｆ、Ｖ３０８Ｆ）および４３４における改変を含むが、これらに限定されず、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスの番号づけを使用して与えられる（図１）。
本発明者らは、図４および実施例２で示したように、ヒトおよびマウスＦｃＲｎ受容体に対するｐＨ６における結合は、下の群から選択された置換がｍＡｂ１またはｍＡｂ２抗体のＦｃ領域内に導入された場合に強化されることを確認した：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． 位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸。
さらに、本発明者らは、実施例３および図５で記載されたように、それらのＣＨＩＫＶ標的ｐＥ２−Ｅ１に対するｍＡｂ１およびｍＡｂ２の結合は、それらのＦｃ領域に導入された場合に、上記の置換に影響されず、ヒトおよびマウスのＦｃＲｎに対する結合を強化することを示した。実施例２および図４に示したように、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２のＦｃ領域の置換は、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、またはそれぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンのいずれかが、それらのそれぞれのＦｃ領域に導入された場合に、最も強いヒトおよびマウスのＦｃＲｎへの結合を示す。
当技術分野で知られているように、Ｆｃ領域は、「エフェクター機能」と呼ばれる免疫グロブリンの生物学的機能の決定に必須である。ＡＤＣＣは、免疫システムのエフェクター細胞（主としてナチュラルキラー細胞）が特異的抗体が結合した標的細胞を溶解する細胞媒介免疫の部分、機構の１つである。それ故、ＡＤＣＣは、感染を制限して封じ込める機構の１つである。細胞に媒介される活性は、エフェクター細胞のＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩのようなＦｃ受容体に対するＦｃドメインの結合を含む。
モノクローナル抗体がＣＨＩＫＶ株に高度に特異的であり、治療目的の処置に供される本発明で主に扱うように、それらのＡＤＣＣを活性化する能力は、ＡＤＣＣは感染の制御における抗ＣＨＩＫＶ抗体の活性に関係するように思われるので、測定すべき重要なパラメーターである。実施例４および図６で示したように、本発明者らは、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、下の群から選択される置換がそれらのそれぞれのＦｃ領域に導入された場合に、保持されることを示した：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン。
対照的に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が位置２５２でチロシン、位置２５４でトレオニンおよび位置２５６でグルタミン酸によりそれぞれ置換された場合に、低下した。
それ故、本発明者らは、ヒトのＦｃＲｎ受容体に対する改善された結合を有する抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を保持しながら、本発明の抗体を、それらのエフェクター機能を維持しながら増大した半減期と適合性にすることを確認した。
それ故、第１の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶと結合し、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む単離されたモノクローナル抗体に関し、ここで：
ｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、ｉ．またはｉｉ．の配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有し；
前記抗体は：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域をさらに含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
そのような置換を含むＦｃ領域を図１および２に示した（配列番号１７；配列番号５９から６３）。
一実施形態において、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、少なくとも、位置４３４にアラニンを含むＦｃ領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、位置３０７、３８０および４３４にアラニンを含むＦｃ領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシンを含むＦｃ領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンを含むＦｃ領域を含む。別の実施形態において、抗ＣＨＩＫＶ抗体は、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸を含むＦｃ領域を含む。
本発明で主に扱う抗体は、ｍＡｂ１またはｍＡｂ２から誘導され、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含み、それらは：
ｉ． それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列、および配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列、または
ｉｉ． それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列、および配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、または
ｉｉｉ． ｉ．もしくはｉｉ．の配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列
をそれぞれ有する。
さらなる実施形態において、抗体は、配列番号５、６および７の配列、ならびに配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列とそれぞれ１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列、または配列番号１１、１２および１３の配列、ならびに配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６と、それぞれ１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
本発明によるアミノ酸置換は、保存的であってもよく、または非保存的であってもよいアミノ酸置換である。保存的置換の例を下の表１に示す。
Figure 2019534001
別の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびに前記抗体は、それぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）および：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、抗体は、ｍＡｂ２から誘導され、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびに前記抗体は、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含み
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、抗体は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
さらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ３）は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、位置４３４にアラニンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＥＵインデックスに従って与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ４）は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、およびそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置３０７、３８０および４３４にアラニンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ５）は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８にロイシンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ７）は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ６）は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸を含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、変形抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
さらなる実施形態において、変形抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含み、ならびに位置４３４に少なくともアラニンを含むＦｃ領域を含み、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスに従って与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置３０７、３８０および４３４にアラニンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ８）は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別のさらなる実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ９）は、それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸を含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
本発明者らは、実施例３および図５に記載されたように、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のそれらのＣＨＩＫＶ標的ｐＥ２−Ｅ１に対する結合は、上記のように少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含む場合に、影響されないことを示した。本発明者らは、上記のように少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域を含むこれらの抗体は、全て、ヒトおよびマウスのＦｃＲｎに対して強化された結合を示し（実施例２および図４）、それは、それらのそれぞれの半減期に対して好ましい影響を有して、その結果として抗ＣＨＩＫＶ療法のために有益であり；それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、またはそれぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンのいずれかが、それらのそれぞれのＦｃ領域に導入された場合に、ヒトおよびマウスにおける最高のＦｃＲｎへの結合が示されることも示した。
それ故、典型的実施形態では、変形抗体は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域、または少なくとも、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸を含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
さらに、実施例４および図６で示されたように、本発明者らは、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のＦｃγＲＩＩＩａに対する結合は、下の群：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン
から選択される置換が、それらのそれぞれのＦｃ領域に導入された場合に保持されることを示した。
対照的に、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合は、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２が、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸で置換された場合に低下した。
それ故、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を保持しながら、その標的に対する結合は影響されず、およびヒトＦｃＲｎ受容体に対する結合が改善されており、一方それらのエフェクター機能を維持しており、そのため、その増大した半減期に関して、それを、ＣＨＩＫＶ疾患を防止および処置するための治療学の開発と適合性である、少なくとも１種の抗体を同定した。
典型的な実施形態において、変形抗体は、それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）、およびそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）、ならびに少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
換言すれば、本発明で主に扱う抗体は、ＣＨＩＫＶに結合し、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む単離されたモノクローナル抗体として記載することができ、ここで：
ｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは、配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有し、および前記ＣＤＲＬは、配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
ｉｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、ｉ．またはｉｉ．の配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有し；
および前記抗体は：
ｉｖ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｖ． 位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｖｉ． 位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｖｉｉ． 位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖｉｉｉ． 位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域をさらに含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられ；
および抗体は、以下の：
ｉ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
ｉｉ． ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
ｉｉｉ． ヒトのＦｃγＲＩＩＩに約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
性質の１つまたはそれ以上を有する。
一実施形態において、本発明による抗体は、ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ、３、２、１ｎＭ未満、約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５，０．４、０．３ｎＭ未満または約０．２５ｎＭ、０．２０ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する。
別の実施形態において、本発明による抗体は、ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ、４５、４０、３５、３０ｎＭ未満または約２５ｎＭ、２０、１５または１０ＮＭ未満のＫＤで結合する。
別の実施形態において、本発明による抗体は、ヒトのＦｃγＲＩＩＩに、約６００ｎＭ未満、約５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ、１５０、１００または５０ｎＭ未満のＫＤで結合する。
ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＦｃγＲＩＩＩに対する結合は、例えば、表面プラズモン共鳴アッセイにより、例えば、３７℃で測定することができる。このアッセイは、例えば、実施例１から４に記載されているように実施することができる。
本発明による「Ｆｃ領域」は、抗体の機能的活性を決定する４つのヒトサブクラスのＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）の重鎖の１つに属することができる。一実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１サブタイプの重鎖に属する。別の実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ２サブタイプの重鎖に属する。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ３サブタイプの重鎖に属する。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４サブタイプの重鎖に属する。別の実施形態において、Ｆｃ領域は、本明細書に記載された突然変異を除いて、ＩｇＧ１のＦＣ領域の配列（配列番号１７）を含むかまたはそれらからなる（図１および２）。
一実施形態において、抗体は、配列番号１７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号１７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号１７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１７と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。
一実施形態において、抗体は、上で記載されたおよび実施例内の１つまたは数個の置換を含むＦｃ領域を有する。別の実施形態において、抗体は、配列番号５９、６０、６１、６２および６３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する。
あるいはまたはそれに加えて、システイン残基（単数または複数）を、Ｆｃ領域に導入することができて、それによりこの領域において鎖間のジスルフィド結合形成を可能にする。このようにして生成されたホモダイマーの抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体に媒介される細胞殺滅および／または抗体依存性の細胞の細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有することができる（Ｃａｒｏｎ、Ｐ．Ｃ．ら，１９９２、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１７６（４）：１１９１−１１９５およびＳｈｏｐｅｓ Ｂ．，１９９２，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（９）：２９１８−２９２２）。
別の実施形態において、抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号１と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号２と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号１９と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号１９と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号１９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号１９と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号２０と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号２０と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号２０と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２３と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２５と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２５と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２５と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２７と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２９と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２９と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号２９と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３１と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３１と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗体は、重鎖と軽鎖との、または下の表２に記載された配列のヌクレオチド配列によりコードされた重鎖と軽鎖との組み合わせである。
Figure 2019534001
別の実施形態において、抗体は、配列番号３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号３と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号４と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号４と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号４と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその軽鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号３７と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号３８と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号３８と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号３８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の軽鎖は、配列番号３８と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４１と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４１と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４３と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗体は、重鎖と軽鎖との、または下の表３に記載された配列のヌクレオチド配列によりコードされた重鎖と軽鎖との組み合わせである。
Figure 2019534001
すでに言及したように、治療目的のためには、それらの特定の標的に対するそれらの結合親和性を保持しながら、安定性、薬物動態および薬力学ならびにそれらの機能の関係で頼みにできるｍＡｂを生成させることが非常に望ましい。
第２の態様において、本発明者らは、均質性を向上させて、化学的性質、産生および制御（ＣＭＣ）の不利点を軽減するために使用することができるホットスポットを同定した。そのような分析は、分解生成物または抗体製剤の不均一性を潜在的に生ずることが、インシリコまたは実験的のいずれかで確認される酸化、脱アミノ化、異性化、酸性切断、グリコシル化ならびに追加の遊離システイン残基のような、溶媒に曝露された望ましくないモチーフに焦点を合わせた。例として、アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミノ化は、ｐＨおよび表面曝露のような要因に依存して起こり得る。アスパラギン残基は、主としてＡｓｎ−Ｇｌｙという配列で存在する場合に、脱アミノ化を特に起こしやすく、Ａｓｎ−Ａｌａのような他のジペプチド配列ではそれほどでもない。それ故、そのような脱アミノ化部位、特にＡｓｎ−Ｇｌｙが、本明細書に記載された抗体またはポリペプチド中に存在する場合、典型的には関与する残基の１つを除去する保存的置換によりその部位を除去することが望ましい。
実施例１および図３で示したように、本発明者らは、治療目的で使用される場合、それ自体有害な結果を有し得るか、またはそれらは以前の基準に基づいて不利なモチーフを生じるという理由で、ｍＡｂ２（配列番号１３）のＣＤＲＨ３内の少なくとも３種のアミノ酸を同定した。図３に示したように、本発明者らは、望ましくないアミノ酸またはモチーフを抑制するために、配列番号１３のそれぞれ位置８、１２および１３における単一置換により、ＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１抗原に対するそれらの結合親和性を維持する、ｍＡｂ２の少なくとも３種の変形抗体を生成させる。それ故、本発明者らは、バイオリアクターで産生される場合、それらの標的親和性を保ちながら、生成物に関係する不純物を少なくして、ＣＭＣ基準に対して、より高い安定性、均質性を有するｍＡｂ２の変形体を生成させた。
それ故、第２の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶに結合する抗原結合フラグメントであって、およびそれぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有する、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含むｍＡｂ２変形抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
一実施形態において、変形抗体は、配列番号１１、１２および３３の配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲＨを含み、かつ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６の配列と、それぞれ１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲＬを含む。「１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列」により、本発明で主に扱う、配列番号３３に関して、配列番号３３の位置８、１２および１３で構想される置換と比較して追加のアミノ酸置換が意味される。
アミノ酸置換は、保存的または非保存的アミノ酸置換であることができる。保存的置換の例は、上の表１に示す。
別の実施形態において、変形抗体は、配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む。別の実施形態において、前記変形抗体は、配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭであり、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む。他の実施形態において、前記変形抗体は、それぞれ：配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮであり、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３；配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧである配列番号３３のＣＤＲＨ３；配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭであり、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮであり、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３；配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭであり、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧである配列番号３３のＣＤＲＨ３；配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮであり、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧである配列番号３３のＣＤＲＨ３；配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮであり、および配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む。言い換えれば、配列番号３３は、配列番号１３と同一ではあり得ない。
「位置Ｘにおけるアミノ酸はＭではない」という表現により、前記位置Ｘにおけるアミノ酸は、Ｍ以外のどのアミノ酸であってもよいことが意味される。同様に、「位置Ｘにおけるアミノ酸はＮではなく」という表現により、前記位置Ｘにおけるアミノ酸は、Ｎ以外のどのアミノ酸であってもよいことが意味される。同様に、「位置Ｘにおけるアミノ酸はＧではない」という表現により、前記位置Ｘにおけるアミノ酸は、Ｇ以外のどのアミノ酸であってもよいことが意味される。限定するものではない例として、配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む変形抗体は、前記位置８において、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択される任意のアミノ酸を含むことができる。別の限定するものではない例として、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む変形抗体は、前記位置１２において、Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択される任意のアミノ酸を含むことができる。別の限定するものではない例として、配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない配列番号３３のＣＤＲＨ３を含む変形抗体は、前記位置１３において、Ａ、Ｎ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ｑ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲおよびＨからなる群から選択される任意のアミノ酸を含むことができる。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３３の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有する、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、およびそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない。
換言すれば、実施例１および図３で示したように、本発明者らは、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有するか、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではなく、
抗体は、以下の：
ｉ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
ｉｉ． ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
ｉｉｉ． ヒトのＦｃγＲＩＩＩに約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
性質の１つまたはそれ以上を有する抗体またはその抗原結合フラグメントを同定した。
一実施形態において抗体は、ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ、３、２、１ｎＭ未満、約０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３ｎＭ未満または約０．２５ｎＭ、０．２０ｎＭ、０．１５ｎＭ、０．１ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する。
別の実施形態において、抗体は、ヒトのＦｃＲｎに、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約５０ｎＭ、４５、４０、３５、３０ｎＭ未満または約２５ｎＭ、２０、１５または１０ＮＭ未満のＫＤで結合する。
別の実施形態において、本発明による抗体は、ヒトのＦｃγＲＩＩＩに、約６００ｎＭ未満、約５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ未満、約２００ｎＭ、１５０、１００または５０ｎＭ未満のＫＤで結合する。
ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に結合して、ヒトＦｃＲｎおよびヒトＦｃγＲＩＩＩは、例えば表面プラズモン共鳴アッセイにより、例えば３７℃で測定することができる。このアッセイは、例えば、実施例１から４に記載されているように実施することができる。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み、配列番号３３の位置８におけるアミノ酸は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、ＱおよびＮからなる群から選択される。
別の実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ１０）またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３４の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み、配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸は、Ｑ、Ｅ、Ｓ、ＴおよびＤからなる群から選択される。
別の実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ１１）またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３５の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、変形抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３３のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含み、配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸は、Ａ、ＳおよびＴからなる群から選択される。
別の実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ１２）またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３６の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号５６と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５６と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５６と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５６と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号５７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５７と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体は、配列番号５８と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５８と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５８と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。別の実施形態において、抗体は、配列番号５８と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるその重鎖の可変領域を含む。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４５と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４５と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４５と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４７と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４７と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４７と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４７と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４９と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかもしくはそれからなるか、または配列番号５０と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる配列を含むかもしくはそれからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４９と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４９と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号４９と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、抗体は、重鎖と軽鎖または下の表４に記載された配列のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖と軽鎖の組み合わせである。
Figure 2019534001
第３の態様において、本発明者らは、上の有益な態様を組み合わせた。本発明者らは、一方で、化学的性質、製造および制御の（ＣＭＣ）不利点の基準に基づいて有利ではないアミノ酸またはモチーフを抑制するようにＣＤＲＨ３内で置換されて、他方で、それらはそれらのＦｃドメインに少なくとも１つのアミノ酸置換を含むという理由で、エフェクター機能と関連するＦｃγＲＩＩＩａへの結合を保持しながら、酸性環境におけるＦｃＲｎ受容体に対する改善された結合を有するｍＡｂ２の変形体を生成させた。
実施例２および図４Ｃおよび４Ｄに記載されたように、本発明者らは、ＣＤＲＨ３内の置換が導入されたｍＡｂ２の変形体は、下の群：
ｉ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｉｉ． 位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
から選択される置換が、そのＦｃ領域内に導入されたときに、ｐＨ６におけるヒトおよびマウスのＦｃＲｎ受容体に対する強化された結合を示すことを示した。
さらに、本発明者らは、実施例３および図５に記載したように、上で記載されたそれらのＣＤＲＨ３およびそれらのＦｃ領域内における置換を積み重ねる抗体について、それらのＣＨＩＫＶ標的ｐＥ２−Ｅ１に対する結合は影響されないことを確認した。
実施例４および図６Ｂおよび６Ｄで示したように、本発明者らは、そのような抗体について、少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンが、それらのＦｃ領域に導入されたときに、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合は、保持されることも確認した。対照的に、ＦｃγＲＩＩＩａ結合は、そのような抗体が、位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸でそれぞれ置換された場合に弱まった。
それ故、本発明者らは、化学的性質、製造および制御（ＣＭＣ）の不利点の基準に基づいて有利ではないアミノ酸またはモチーフを抑制する、ＣＤＲＨ３内で置換された本発明による抗体について、それらのそれぞれのＦｃ領域内に導入された置換の有益な効果を確認した。
それ故、この第３の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶに結合する抗原結合フラグメントであって、それぞれ配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有する、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含むｍＡｂ２の変形抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、それぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）をさらに含み、ここで：
ｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
ｉｉ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
ｉｉｉ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではなく；
前記抗体は、少なくとも：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． 位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から、それぞれ選択される突然変異を含むＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
第３の態様において、第２の態様の、すなわち、配列番号３３のＣＤＲＨを含む任意の抗体は、第１の態様で記載されたＦｃ領域中で任意の突然変異を含むことができて、前記抗体は：
ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸
からなる群から選択される少なくとも１つの残基を有するＦｃ領域を含み、
ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられることが理解される。
別の実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ１３）またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３５の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３；
ならびに少なくとも、それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸を含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、変形抗体（ｍＡｂ１４）またはその抗原結合フラグメントは：
− 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
− 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
− 配列番号３５の配列からなるＣＤＲＨ３；
− 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
− ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
− 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３；
ならびに少なくとも、それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を含み、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５１少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５１と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５１と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５３と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５３と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。別の実施形態において、抗体の重鎖は、配列番号５３と９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる。
一実施形態において、この特定の態様による抗体は、重鎖と軽鎖または下の表５に記載された配列のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖と軽鎖の組み合わせである。
Figure 2019534001
核酸、ベクターおよび組換え宿主細胞
本発明で主に扱うさらなる目的は、本発明で定義された抗体、または本明細書に記載された抗体を含むかまたはそれらからなるポリペプチド、重鎖、軽鎖またはそれらのフラグメントをコードする配列を含むかまたはそれらからなる核酸配列に関する。
典型的には、前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり、それらは、任意の適当なベクター、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスのベクターなどに含まれ得る。
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）が、それにより宿主細胞に導入され、宿主を形質転換させて、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを意味する。
したがって、本発明で主に扱うさらなる目的は、本明細書に記載された核酸を含むベクターに関する。
そのようなベクターは、調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等を含み、対象に投与されると、前記ポリペプチドの発現を惹起または指示することができる。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例は、ヒトサイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモーター（Ｎｅｌｓｏｎ、Ｊ．、１９９６ Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：３２０７３９８６）、ＳＶ４０の初期プロモーターおよびエンハンサー（Ｍｉｚｕｋａｍｉ、Ｔ．およびＩｔｏｈ、Ｓ．ら、１９８７、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１（５）：１３０７−１３１０）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー（Ｋｕｗａｎａ Ｙ．ら、１９８７、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．１４９：９６０−９６８）、プロモーター（Ｍａｓｏｎ、Ｊ．Ｏ．ら、１９８５、Ｃｅｌｌ ４１：４７９−４８７）および免疫グロブリンのＨ鎖のエンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ、Ｓ．Ｄ．ら、１９８３、Ｃｅｌｌ ３３：７１７−７２８）等を含む。
ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を挿入および発現することができる限り、動物細胞のための任意の発現ベクターを使用することができる。適当なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ，Ｈ．ら，１９９０，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３（２）：１３３−１４０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ、Ｔ．ａｎｄ Ｉｔｏｈ，Ｓ．ら，１９８７，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１（５）：１３０７−１３１０）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ，Ｇ．ら，１９８４，Ｇｅｎｅ ２７（２）：２２３−２３２）、ｐＫＣｒ（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｋ．ら，１９８１，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７８（３）：１５２７−１５３１）、ｐＳＧ１ｂｅｔａ ｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ，Ｈ．ら，１９９０，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１７３−１８０）等を含む。
プラスミドの他の例には、複製ｐＣＥＰ５の起源を含む複製プラスミド、または統合的なプラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲ等が含まれる。
ウイルスのベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスおよびＡＡＶのベクターを含む。そのような組換えウイルスは、当技術分野で知られている技法により、例えば、パッケージング細胞にトランスフェクトすることによりまたはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いる一過性トランスフェクションにより産生することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞、その他を含む。そのような複製欠陥がある組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８に見出すことができる。
一実施形態において、本発明は、配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４からなる群から選択される配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４からなる群から選択される配列の１つと少なくとも８５％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４からなる群から選択される配列の１つと少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、本発明は、配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４からなる群から選択される配列の１つと少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、本発明は、本発明に記載された抗体、すなわち、ｍＡｂ３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の重鎖の１つまたは軽鎖の１つまたは重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドに関する。別の実施形態において、本発明は、本発明で主に扱う抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする配列を含むポリヌクレオチドに関する。
本発明で主に扱うさらなる目的は、本明細書に記載された核酸および／またはベクターをトランスフェクト、感染または形質転換された細胞に関する。
したがって、本発明は、本明細書に記載された抗体の１種を産生する細胞株に関する。
用語「形質転換」は、宿主細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には、導入された遺伝子または配列によりコードされるタンパク質または酵素を産生することになる、「外来」（すなわち、外部からの）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味する。受けたおよび導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを発現する宿主細胞は、「形質転換」されている。
本発明で主に扱う核酸は、適当な発現システムから組換え抗ＣＨＩＫＶ抗体を産生させるために使用することができる。用語「発現システム」は、例えば、ベクターにより運ばれて宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するために適当な条件下にある宿主細胞および適合性ベクターを意味する。
一般的な発現システムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞およびプラスミドベクター、昆虫宿主細胞およびバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳動物の宿主細胞およびベクターを含む。宿主細胞の他の例は、原核細胞（細菌など）および真核生物細胞（酵母細胞、哺乳動物の細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含むが、これらに限定されない。特定の例は、大腸菌、クルイウェロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）またはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母、哺乳動物の細胞株（例えば、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞その他）ならびに第一次のまたは確立された哺乳動物の細胞培養（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞、その他から産生される）を含む。例には、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子（この後「ＤＨＦＲ遺伝子」と称する）に欠陥があるＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ、Ｇ．ら，；１９８０、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．７７（７）：４２１６−４２２０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６６２、この後「ＹＢ２／０細胞」と称する）等も含まれる。ＹＢ２／０細胞は、キメラまたはヒト化抗体のＡＤＣＣ活性が、この細胞で発現されたときに、増強されているので、興味深い。
特に、ヒト化抗体の発現について、発現ベクターは、抗体の重鎖をコードする遺伝子および抗体の軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクターに存在するタイプかまたは両方の遺伝子が同じベクターに存在するタイプ（タンデムタイプ）のいずれかである。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、および動物細胞中における抗体のＨおよびＬ鎖の発現レベルの間のバランスに関して、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが、一般的に使用される（Ｓｈｉｔａｒａ、Ｋ．ら，１９９４，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｊａｎ．３：１６７（１−２）：２７１−８）。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８等を含む。
本発明は、本発明による抗体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法にも関し、前記方法は：（ｉ）インビトロまたはエクスビボで、上で記載された組換え核酸またはベクターをコンピテントな宿主細胞中に導入すること、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロまたはエクスビボで培養すること、および（ｉｉｉ）、場合により、前記抗体を発現および／または分泌する細胞を選択することからなるステップを含む。
そのような組換え宿主細胞は、本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体の産生のために使用することができる。
したがって、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体を産生する方法に関し、前記方法は、（ｉ）上で記載された細胞株を培養するステップ；（ｉｉ）産生モノクローナル抗体を精製するステップ；および場合により（ｉｉｉ）前記モノクローナル抗体を医薬組成物に剤形化するステップを含む。
抗ＣＨＩＫＶ抗体を産生する方法
本発明で主に扱う抗ＣＨＩＫＶ抗体は、当技術分野で知られている任意の技法、例えば、限定されないが、任意の化学、生物学的、遺伝的または酵素的技法の、単独または組み合わせのいずれかにより産生される。
所望の配列のアミノ酸配列を知れば、当業者は、前記抗体または免疫グロブリン鎖を、ポリペプチドを産生するための標準的技法によって容易に産生することができる。例えば、それらは、周知の固相法を使用して、特に市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州により作製されたものなど）を使用して、メーカーの使用説明書に従って合成することができる。あるいは、抗体および免疫グロブリン鎖は、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法によって合成することができる。例えば、これらのフラグメントは、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現ベクターへの組み込み、およびそのようなベクターの所望のポリペプチドを発現する適当な真核生物または原核宿主への導入後のＤＮＡ発現生成物として得ることができて、その後それから、フラグメントを周知の技法を使用して単離することができる。
特に、本発明は、（ｉ）本発明により形質転換された宿主細胞を培養すること；（ｉｉ）前記抗体またはポリペプチドを発現させること；および（ｉｉｉ）発現された抗体またはポリペプチドを回収することからなるステップを含む、抗体を産生する方法にさらに関する。
換言すれば、本発明は：
（ｉ） 抗ＣＨＩＫＶ抗体を発現する細胞を提供するステップ；
（ｉｉ） 前記細胞を培養するステップ；
（ｉｉｉ） 前記抗体を精製するステップ；および
（ｉｖ） 場合により、前記抗体を医薬組成物に剤形化するステップ
を含む、抗体を産生する方法に関する。
ヒト化またはキメラ抗体を産生する方法は、当技術分野で周知の通常の組換えＤＮＡおよび遺伝子トランスフェクション技法を包含する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．およびＯｉ，Ｖ．Ｔ．、，１９８４，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２３９−２５６および特許文献ＵＳ５，２０２，２３８；およびＵＳ５，２０４，２４４を参照されたい）。
特定の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、前に記載されたように、マウスのＶＬおよびＶＨドメインをコードする核酸配列を得て、キメラ抗体発現ベクターを構築し、それらを、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞のための発現ベクター中に挿入して、発現ベクターを動物細胞に導入することによりそのコード配列を発現させることによって産生することができる。
本発明で主に扱う抗体は、通常の免疫グロブリン精製手順、例えばタンパク質Ａの親和性クロマトグラフィー、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、混合様式のクロマトグラフィー、サイズ−排除クロマトグラフィーなどにより培養媒体から適当に分離される。
Ｆａｂは、ＣＨＩＫＶと特異的に反応する抗体をパパインのようなプロテアーゼで処理することにより得ることができる。Ｆａｂは、抗体のＦａｂの両方の鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核生物で発現、または真核生物で発現させるためのベクター中に挿入して、そのベクターを原核細胞または真核生物細胞（適当な）中に導入してＦａｂを発現させることによって産生することもできる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＣＨＩＫＶと特異的に反応する抗体を、プロテアーゼ、ペプシンで処理して得ることができる。Ｆ（ａｂ’）２は、下で記載されるようにＦａｂ’を、チオエーテル結合またはジスルフィド結合を通して結合することにより産生することもできる。
Ｆａｂ’は、ＣＨＩＫＶと特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、ジチオスレイトールのような還元剤で処理することにより、得ることができる。Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’鎖をコードするＤＮＡ配列を、原核生物で発現のためのベクター、または真核生物で発現のためのベクター中に挿入して、そのベクターを原核または真核生物細胞（適当な）中に導入して、その発現を実施することにより産生することもできる。
ｓｃＦｖは、前に記載されたように、ＣＤＲまたはＶＨおよびＶＬドメインの配列を使用して、ｓｃＦｖフラグメントをコードするＤＮＡを構築し、そのＤＮＡを原核または真核生物の発現ベクター中に挿入し、次にその発現ベクターを原核または真核生物細胞（適当な）中に導入して、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成させるためには、本発明により相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択して、それらを、知られた３次元の構造のヒトｓｃＦｖフラグメントのフレームワークにグラフトすることを含む、ＣＤＲグラフトと呼ばれる周知の技術を使用することができる（例えば、Ｗ０９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照されたい）。
ＣＨＩＫＶに対する単一鎖の抗体またはＶＨＨは、例えば、（ａ）ＣＨＩＫＶに対する抗体（および特に重鎖抗体）を誘発するために、ラクダ科に属する哺乳類をＣＨＩＫＶまたはそれらのフラグメントで免疫するステップ；（ｂ）このように免疫されたラクダ科からのＣＨＩＫＶに対する重鎖抗体配列および／またはＶＨＨ配列を含む生物学的試料を得るステップ；および（ｃ）前記生物学的試料から、ＣＨＩＫＶに対する重鎖抗体配列および／またはＶＨＨ配列を回収する（例えば単離する）ステップを含む方法により得ることができる。適当な単一鎖抗体またはＶＨＨは、限定するものではない例として、重鎖抗体配列および／または重鎖抗体配列のＶＨＨ配列および／またはＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１との結合について競合するＶＨＨ配列を含むライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる。
本発明の抗ＣＨＩＫＶ抗体の改変
本発明のさらなる目的は、本明細書に記載された抗体の機能保存的変形体を包含する。
例えば、あるアミノ酸は、タンパク質構造中で他のアミノ酸により、活性の認識され得る損失なしに置換され得る。タンパク質の相互作用する能力および性質がその生物学的機能性活性を定めるので、あるアミノ酸置換は、タンパク質配列中で、また言うまでもなくその配列をコードするＤＮＡ（ｉｔｓ ＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中で行い、それにも拘わらず類似の性質を有するタンパク質を得ることができる。したがって、抗体配列、または前記抗体をコードする対応するＤＮＡ配列に種々の変化を、それらの結合活性の認識され得る損失なしに、行うことができると考えられる。
あるアミノ酸は、同様な疎水性指数（hydropathic index）またはスコアを有する他のアミノ酸により置換されて、それでも同様な生物学的活性を有するタンパク質を生ずる、すなわち、なおも生物学的機能的に等価のタンパク質を得ることができることが、当技術分野で知られている。抗体中において、抗原に対する結合の有意の損失なしに置換することができる全てのアミノ酸を同定するために、アラニンスキャニング手法のような十分に確立された技術を使用することも可能である。そのような残基は、抗原結合にまたは抗体の構造の維持に関与しないので、中性と定性することができる。１つまたはそれ以上のこれらの中性の位置は、抗体の主要な特性を変化させずに、アラニンによりまたは別のアミノ酸により置換することができる。
それ故、上で概説したように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸の側鎖置換基の相対類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。数種類の前述の特性を考慮に入れた典型的置換は、当業者に周知であり：アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリン、ロイシンとイソロイシンを含む。
別のタイプの抗体のアミノ酸改変は、抗体中に見出される１つまたはそれ以上の炭水化物部分を欠失させ、および／または抗体中に存在しない１つまたはそれ以上グリコシル化部位を付加することにより、すなわち、抗体の元々のグリコシル化パターンを変更するために有用であり得る。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギンＸ−セリン、およびアスパラギンＸ−トレオニンのいずれかの存在は、潜在的グリコシル化部位を生じる。抗体へのグリコシル化部位の添加または欠失は、１つまたはそれ以上の上記のトリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することにより、通常達成される（Ｎ−連結されたグリコシル化部位について）。
別のタイプの共有結合改変は、グリコシドを、抗体に化学的にまたは酵素的にカップリングすることを包含する。これらの手順は、それらが、Ｎ−またはＯ−連結されたグリコシル化のために、グリコシル化の能力を有する宿主細胞における抗体の産生を必要としないという点で有利である。使用されるカップリング様式に依存して、糖（単数または複数）は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインの遊離基のような遊離のスルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離基のような遊離のヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、またはチロシンの残基のような芳香族残基、（ｆ）グルタミンのアミド基に取り付けることができる。例えば、そのような方法は、ＷＯ８７／０５３３０に記載されている。
抗体に存在する任意の炭水化物部分の除去は、化学的にまたは酵素的に達成することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価の化合物に対する抗体の曝露を必要とする。この処理は、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く大部分のまたは全ての糖類で切断を生じさせるが、抗体は完全なまま残る。化学的脱グリコシル化は、Ｓｏｊａｈｒ、Ｈ．ら（１９８７，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９（１）：５２−５７）により、およびＥｄｇｅ，Ａ．Ｓ．ら（１９８１，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８（１）：１３１−１３７）により記載されている。抗体における炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ，ＮＲら（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １３８：３５０−３５９）により記載された種々のエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。
別のタイプの抗体の共有結合改変は、抗体を、種々の非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンの１種に、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号または４，１７９，３３７号で説明されている様式で連結することを含む。
医薬組成物
本発明で主に扱う抗ＣＨＩＫＶ抗体は、薬学的に許容される賦形剤と、場合により生分解性ポリマーのような徐放性マトリックスと組み合わされて、治療用組成物を形成することもできる。
したがって、本発明は、本発明の抗ＣＨＩＫＶ抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関する。
本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体にも関する。
「薬学的に」または「薬学的に許容される」とは、哺乳類、特にヒトに、適宜投与されたときに、有害なアレルギー性または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容される担体または賦形剤は、無毒性固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または任意のタイプの剤形化助剤を指す。
医薬組成物の形態、投与の経路、投薬量および投与計画は、処置される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、および性別等に当然依存する。
医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉、皮下または眼内投与等のために剤形化することができる。
特に、医薬組成物は、注射することができる剤形のために薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に等張、滅菌、食塩水溶液（リン酸一ナトリウムまたは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウム等またはそのような塩の混合物）、または乾燥、特に場合に応じて、滅菌水または生理食塩水が添加されると、注射用溶液の構成を可能にする凍結乾燥された組成物であることもできる。
投与のために使用される用量は、種々のパラメーターの関数として、特に、使用される投与様式、関係する病理、またはあるいは処置の所望の持続時間の関数として、適合させることができる。
医薬組成物を製造するために、薬学的に許容される担体または水性媒体中に、有効量の抗体を溶解または分散することができる。
一実施形態において、本発明は、予防または治療有効量の、本明細書に記載されたＣＨＩＫＶに結合する抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
注射用の使用に適当な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散液；および滅菌注射用溶液または分散液の即時製造のための滅菌散剤を含む。全ての場合に、形態は、滅菌でなければならずかつ容易に注射できる程度に流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、かつ細菌およびカビのような微生物の汚染作用を防ぐように貯蔵されなければならない。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、適当なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒体であることができる。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、および界面活性剤、安定剤、凍結保護材または抗酸化剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、抗菌剤および抗真菌剤により成し遂げることができる。多くの場合に、等張化剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。
滅菌注射用溶液は、有効化合物を必要とされる量で適当な溶媒中に、必要とされる数種類の上で列挙した他の成分と共に組み込み、続いて濾過滅菌することにより製造される。一般的に、分散液は、種々の滅菌された有効成分を基本の分散媒体および上で記載されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことにより製造される。滅菌注射用溶液を製造するための滅菌散剤の場合、一般的な製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥技法を含み、有効成分に加え、予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生ずる。
剤形化されると、溶液は、投薬剤形と適合性の様式で、および治療有効であるような量で投与されるであろう。製剤は、種々の投与形態で、例えば、上で記載された注射用溶液のタイプなどで容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。
水溶液で非経口投与するためには、例えば、溶液は、必要であれば適当に緩衝されているべきであり、希釈液は、第１に十分な食塩水またはグルコースで等張にされているべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適当である。この関係で、当業者は、本開示に照らして、使用することができる滅菌水性媒体を知るであろう。例えば、１回の投薬量は、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解されて、１０００ｍＬの大量皮下注射流体に加えられるかまたは点滴が提案された部位に注入されるかのいずれかが可能である、（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版，１０３５−１０３８頁、１５７０−１５８０頁を参照されたい）。投薬量における若干の変動は、処置される対象の状態に依存して必然的に生ずるであろう。投与に責任がある人物は、任意の事象において、個体対象のために適当な用量を決定するであろう。
抗体は、治療用混合物内に剤形化されて、１用量当たり約０．０１から１００ミリグラム、またはその付近を含むことができる。
ある実施形態により、単回または複数の用量の本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体は、規定された時間経過にわたって対象に投与することができる。
この態様による方法は、対象に複数の用量のＣＨＩＫＶに対する抗体を順次投与することを含む。本明細書において使用する、「順次投与する」は、各用量のＣＨＩＫＶに対する抗体が、異なる時点で、例えば、異なる日に所定の間隔（例えば、時間、日、週または月）により分けられて、対象に投与されることを意味する。本発明は、患者に、１回の初期用量のＣＨＩＫＶに対する抗体、続いて１回またはそれ以上の第二次用量のＣＨＩＫＶに対する抗体、および場合により続いて１回またはそれ以上の第三次用量のＣＨＩＫＶに対する抗体を順次投与することを含む方法を含む。
用語「初期用量」、「第二次用量」および「第三次用量」は、時間の経過順のＣＨＩＫＶに対する抗体の投与の配列を指す。したがって、「初期用量」は、処置の投与計画の開始時に投与される用量であり（「ベースライン用量」とも称される）；「第二次用量」は、初期用量の後に投与される用量であり；および「第三次用量」は、第二次用量の後に投与される用量である。初期、第二次、および第三次用量は、全てＣＨＩＫＶに対する抗体の同じ量を含有することもあるが、一般的には、投与の頻度に関して互いに異なることもある。しかしながら、ある実施形態では、初期、第二次および／または第三次用量に含有されるＣＨＩＫＶに対する抗体の量は、処置の経過中に互いに変わる（例えば、適宜、上下に調節される）。ある実施形態では、２用量以上の（例えば、２、３、４、または５）用量が、処置の投与計画の開始時に、「装薬用量」として投与され、その後、頻度を減らした基準で投与される用量が続く（例えば、「維持用量」）。
治療的方法および使用
別の態様で、本発明は、それらを必要とする患者におけるＣＨＩＫＶによる感染を防止するため、またはＣＨＩＫＶによる感染を患う患者を処置するため、またはＣＨＩＫＶ感染と関連する少なくとも１種の症状または合併症を軽減するための方法を提供し、該方法は、ＣＨＩＫＶ感染が防止され、または感染と関連する少なくとも１つの症状もしくは合併症の重症度および／もしくは持続時間が軽減され、緩和され、もしくは減少されるように、本明細書に記載された１種もしくはそれ以上の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または本明細書に記載された、本発明で主に扱う１種もしくはそれ以上の抗ＣＨＩＫＶ抗体もしくはそれらのフラグメントを含む医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
幾つかの実施形態において、該方法は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する病状を軽快させる。
幾つかの実施形態において、該方法は、急性、急性後または慢性の多発性関節炎／多発性関節痛と関連する症状／ＣＨＩＫＶと関連する関節痛、発熱、発疹、筋肉痛および／または疲労を軽減する。一実施形態において、該方法は、対象におけるＣＨＩＫＶ感染と関連する疼痛を軽快させる。一実施形態において、抗体は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する症状を処置する／軽快させるために使用され、他のアルファウイルス感染と関連する症状と交差反応し、これを処置することができる。一実施形態において、抗体は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する急性、急性後および慢性の多発性関節炎／多発性関節痛期を処置する／軽快させるために使用される。
そのような他のアルファウイルスの例には、オニョンニョン（ＯＮＮＶ）、ロスリバー（ＲＲＶ）、バーマーフォレスト（ＢＦＶ）、西部ウマ脳炎（ＷＥＥＶ）、セムリキフォレスト（ＳＦＶ）、シンドビス（ＳＩＮＶ）、東部ウマ脳炎（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥＶ）が含まれるが、これらに限定されない。処置されるかまたは軽快される症状は、疼痛、発熱等を含むことができるが、これらに限定されない。
別の実施形態において、表２から５で、それぞれリストに挙げられた抗体のＣＤＲ配列を含む、本発明によるＣＨＩＫＶに結合する抗体、または抗原結合フラグメントを、前記対象に送達することを含む、チクングニアウイルスに感染した対象を処置する、またはチクングニアウイルスに罹るリスクがある対象の感染の尤度を低下させる方法が提供される。
別の実施形態において、表２から５のリストに挙げたＣＨＩＫＶに結合する抗体を、それぞれ前記対象に送達することを含む、チクングニアウイルスに感染した対象を処置するか、またはチクングニアウイルスに罹るリスクがある対象の感染の尤度を低下させる方法が提供される。別の実施形態において、表２から５のリストに挙げられたものの中の１、２または数種の抗体を組み合わせることができる。別の実施形態において、抗体は、表２から５のリストに挙げられた抗体の１種の可変配列と７０％、８０％、９０％または９５％の同一性を有する可変配列を有する重および軽鎖を含む変形抗体をコードしていることもある。抗体フラグメントは、組換えＳｃＦｖ（単一鎖の可変フラグメント）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、またはＦｖフラグメントであってもよい。抗体は、ＩｇＧ、および／またはキメラ抗体であってもよい。抗体または抗体フラグメントは、感染に先立って、または感染の後で投与することもできる。送達は、抗体または抗体フラグメントの投与、またはＲＮＡもしくはＤＮＡ配列または抗体もしくは抗体フラグメントをコードするベクターを用いる遺伝的送達を含むことができる。
上で言及したように、本発明の方法は、ＣＨＩＫＶによる感染／症状を防止または処置するために、それを必要とする対象に、本明細書に記載された、表２、３、４および５のリストに挙げられたｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４からなる群から選択される１種の抗体を投与することを含む。
上で言及したように、本発明の方法は、ＣＨＩＫＶによる感染／症状を防止または処置するために、本明細書に記載された、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４からなる群から選択される１種の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の実施形態において、本発明の方法は、ＣＨＩＫＶによる感染／症状を防止または処置するために、ｍＡｂ７およびｍＡｂ１４からなる群から選択される、本発明で主に扱う１種の抗体を、それを必要とする対象に投与することを含む。
別の態様において、本発明は、医薬として使用するための本明細書に記載されたモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＨＩＫＶ感染の処置で使用するための本明細書に記載されたモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＨＩＫＶと関連する関節痛の処置で使用するためのモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する急性、急性後および慢性の多発性関節炎／多発性関節痛期の処置で使用するためのモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、本発明は、急性、急性後または慢性多発性関節炎／多発性関節痛／ＣＨＩＫＶと関連する関節痛、発熱、発疹、筋肉痛．および／または疲労の処置で使用するためのモノクローナル抗体に関する。一実施形態において、本発明は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する対象における疼痛を軽快させるために使用するためのモノクローナル抗体に関する。別の態様において、本発明は、ＣＨＩＫＶ感染の防止に使用するためのモノクローナル抗体に関する。別の実施形態において、本発明は、上の表２、３、４および５のリストに挙げた、感染および症状の処置で使用するためのｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１２、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４からなる群から選択されるモノクローナル抗体に関する。別の実施形態において、本発明は、上のリストに挙げた感染および症状の処置で使用するための、表２、３および５のリストに挙げたｍＡｂ６、ｍＡｂ７、ｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４からなる群から選択されるモノクローナル抗体に関する。別の実施形態において、本発明は、上のリストに挙げた感染および症状の処置で使用するための、表２および５のリストに挙げたｍＡｂ７およびｍＡｂ１４から選択されるモノクローナル抗体に関する。
別の態様において、本発明のモノクローナル抗ＣＨＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＨＩＫＶ感染または関連する症状を防止または処置するために、１種またはそれ以上の追加の治療剤との組み合わせで使用することもできる。本明細書において使用する「との組み合わせで」という表現は、追加の治療剤が、本発明で主に扱う抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の前、後または同時に投与されることを意味する。用語「との組み合わせで」は、抗ＣＨＩＫＶ抗体および第２の治療剤の順次または同時の投与も含む。
例えば、抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の「前に」投与される場合、追加の治療剤は、抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の投与の約７２時間、約６０時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約８時間、約６時間、約４時間、約２時間、約１時間、約３０分、約１５分または約１０分前に投与することができる。抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の「後」で投与される場合、追加の治療剤は、抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の投与の約１０分、約１５分、約３０分、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約６０時間または約７２時間後に投与することができる。抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物と「同時に」またはそれと共に投与することは、追加の治療剤が、別の投与形態で、抗ＣＨＩＫＶ抗体を含む医薬組成物の投与の５分未満以内に（前、後、または同時に）対象に投与されるか、または追加の治療剤および抗ＣＨＩＫＶ抗体を両方共含む単一の組み合わせ投薬剤形として対象に投与されることを意味する。
組み合わせ療法は、本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体、および上記抗体と、または上記抗体の生物学的に活性なフラグメントと組み合わされることが有利であり得る任意の追加の治療剤を含むことができる。
例えば、第２のまたは第３の治療剤は、急性、急性後または慢性の多発性関節炎、多発性関節痛／ＣＨＩＫＶと関連する関節痛、発熱、発疹、筋肉痛．および／または疲労を含むが、これらに限定されないＣＨＩＫＶ感染と関連する症状の軽快を助けるために使用することができる。例えば、第２のまたは第３の治療剤は、ＣＨＩＫＶ感染と関連する疼痛の軽快を助けるために使用することができる。
診断のための使用
別の態様において、本発明で主に扱うモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、試料中におけるＣＨＩＫＶ抗原の存在または不在を検出するために使用される。一実施形態において、本明細書に記載された抗体は、試料を本明細書に記載された抗体または抗原結合フラグメントと接触させるステップ、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントのＣＨＩＫＶ抗原に対する結合を検出するステップを含むアッセイの構成要素として使用され、ここで、結合の検出はＣＨＩＫＶ抗原の存在を示し、またはＣＨＩＫＶ抗原に対する結合の検出の不在は、ＣＨＩＫＶ抗原の不在を示す。
特に、本明細書に記載されたモノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、治療剤の構成要素および診断アッセイの構成要素の両方として使用される。
一実施形態において、抗体は、インビトロまたはエクスビボにおける使用が意図される。例えば、ＣＨＩＫＶは、対象から得られた生物学的試料中で、本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体を使用して、インビトロまたはエクスビボで検出することができる。
本発明は：
ｉ． 対象の生物学的試料を抗ＣＨＩＫＶ抗体と、特に抗体が前記生物学的試料と複合体を形成するために十分な条件下で接触させること、
ｉｉ． 前記生物学的試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
ｉｉｉ． 結合した抗体の測定されたレベルを対照と比較することによりＣＨＩＫＶ感染の存在を検出すること、対照と比較して結合した抗体の増大したレベルがＣＨＩＫＶ感染を示す、こと、
からなるステップを含む、対象におけるＣＨＩＫＶ感染の存在を検出するインビトロまたはエクスビボにおける方法にさらに関する。
本発明は、ＣＨＩＫＶを標的とする治療剤、特に本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントに対する、ＣＨＩＫＶに感染した患者の感受性を決定するインビトロまたはエクスビボにおける方法にも関し、該方法は：
ｉ． ＣＨＩＫＶに感染した患者の生物学的試料を、抗ＣＨＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメントと、特に抗体が前記生物学的試料と複合体を形成するために十分な条件下で接触させること、
ｉｉ． 前記生物学的試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
ｉｉｉ． 前記生物学的試料に結合した抗体の測定されたレベルを、対照に結合した抗体のレベルと比較すること
からなるステップを含み、
ここで、対照と比較した前記生物学的試料に結合した抗体の増大したレベルが、ＣＨＩＫＶを標的とする治療剤に感受性の患者を示す。
上の方法において、前記対照は、正常で、感染していない同じタイプの生物学的試料、または同じタイプの正常な生物学的試料における抗体結合レベルの代表的な値と決定される参照値であり得る。
本発明は：
ｉ． ＣＨＩＫＶ感染の治療を受けている対象の生物学的試料を、本明細書に記載された抗体またはその抗原結合フラグメント、特に、抗体が前記生物学的試料と複合体を形成するために十分な条件下で接触させること、
ｉｉ． 前記生物学的試料に結合した抗体のレベルを測定すること、
ｉｉｉ． 結合した抗体の測定されたレベルを対照に結合した抗体のレベルと比較すること
からなるステップを含む、ＣＨＩＫＶ感染の治療の効果をモニターする、インビトロまたはエクスビボにおける方法にさらに関し、ここで、
前記生物学的試料に結合した抗体の、対照と比較して低下したレベルが、前記ＣＨＩＫＶ感染の治療の効果を示す。
前記方法において、前記生物学的試料に結合した抗体の、対照と比較して増大したレベルは、前記ＣＨＩＫＶ感染の治療の無効性を示す。
前記対照は、特に、分析にかける生物学的試料と同じタイプの生物学的試料であるが、時間的にＣＨＩＫＶ感染の治療の経過の前に対象から得られたものである。
一実施形態において、本明細書に記載された抗ＣＨＩＫＶ抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｅ２結合フラグメント）は、検出可能な分子または物質、例えば、蛍光性分子、放射性分子または（直接または間接的のいずれかで）シグナルを提供する当技術分野で知られている任意の他の標識で標識することもできる。
本発明による抗体に関して、本明細書において使用する、用語「標識され」は、検出可能な物質、例えば、放射性試剤または蛍光団（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリスリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））などをポリペプチドにカップリング（すなわち、物理的に連結）することによる抗体の直接標識、ならびにポリペプチドの検出が可能な物質を用いる反応性による間接標識を包含することが意図される。
本発明によるＣＨＩＫＶの診断アッセイで使用することができる「試料」または「生物学的試料」は、正常または病理学的状態の患者から得ることができる任意の組織または体液の試料を含む。
生物学的試料は、生物学的起源の血液および他の液体試料、生検検体または組織培養またはそれに由来する細胞、およびそれらの子孫のような固体組織試料を含むが、これらに限定されない。それ故、生物学的試料は、臨床的試料、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織試料を包含する。
キット
本発明は、少なくとも１種の抗ＣＨＩＫＶ抗体または抗原結合フラグメントを含むキットも提供する。抗体または抗原結合フラグメントを含有するキットは、ＣＨＩＫＶの検出、または治療的または診断アッセイにおいて用途を見出す。キットは、固体支持体、例えば、組織培養プレートまたはビーズ（例えば、セファロースビーズ）にカップリングされたポリペプチドまたは抗体を含有することができる。インビトロでＣＨＩＫＶを、例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットで検出および定量するための抗体を含有するキットを提供することができる。検出のために有用なそのような抗体は、蛍光性または放射性標識などで標識して提供することができる。
一実施形態において、本発明は、本発明で主に扱う少なくとも１種の抗体を含むキット、および場合によりパッケージング材料、および場合により本発明で主に扱う前記抗体が、ＣＨＩＫＶ感染またはＣＨＩＫＶ感染に関係する症状を防止／処置するために効果的であることを示す、前記パッケージング材料内に含有される標識またはパッケージング挿入物に関する。
配列の簡単な説明
配列番号１は、「ｍＡｂ１」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号２は、「ｍＡｂ１」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号３は、「ｍＡｂ２」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号４は、「ｍＡｂ２」抗体のＶＬ配列を示す。
配列番号５〜７は、「ｍＡｂ１」抗体のＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、ＣＤＲ３Ｈの配列を示す。
配列番号８は、「ｍＡｂ１」抗体のＣＤＲ１Ｌの配列を示す。
配列番号９は、組換えｐＥ２−Ｅ１の組換え標的「Ｈｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＬＲ２００６」の配列を示す。
配列番号１０は、「ｍＡｂ１」抗体のＣＤＲ３Ｌの配列を示す。
配列番号１１−１３は、「ｍＡｂ２」抗体のＣＤＲ１Ｈ、ＣＤＲ２Ｈ、ＣＤＲ３Ｈの配列を示す。
配列番号１４は、「ｍＡｂ２」抗体のＣＤＲ１Ｌの配列を示す。
配列番号１５は、組換えｐＥ２−Ｅ１組換え標的「Ｈｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＳＬ１５６４９」の配列を示す。
配列番号１６は、「ｍＡｂ２」抗体のＣＤＲ３Ｌの配列を示す。
配列番号１７は、本発明で主に扱われ、図１で示された置換のないＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
配列番号１８は、ＩｇＧ１のＦｃ領域の核酸配列を示す。
配列番号１９は、「ｍＡｂ１」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号２０は、「ｍＡｂ１」抗体のＬＣの配列を示す。
配列番号２１は、「ｍＡｂ１」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号２２は、「ｍＡｂ１」抗体のＬＣの核酸配列を示す。
配列番号２３は、「ｍＡｂ３」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号２４は、「ｍＡｂ３」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号２５は、「ｍＡｂ４」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号２６は、「ｍＡｂ４」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号２７は、「ｍＡｂ５」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号２８は、「ｍＡｂ５」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号２９は、「ｍＡｂ６」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号３０は、「ｍＡｂ６」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号３１は、「ｍＡｂ７」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号３２は、「ｍＡｂ７」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号３３は、「ｍＡｂ２」抗体のＣＤＲＨ３のコンセンサス配列を示す。
配列番号３４は、「ｍＡｂ１０」抗体のＣＤＲＨ３の配列を示す。
配列番号３５は、「ｍＡｂ１１」抗体のＣＤＲＨ３の配列を示す。
配列番号３６は、「ｍＡｂ１２」抗体のＣＤＲＨ３の配列を示す。
配列番号３７は、「ｍＡｂ２」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号３８は、「ｍＡｂ２」抗体のＬＣの配列を示す。
配列番号３９は、「ｍＡｂ２」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号４０は、「ｍＡｂ２」抗体のＬＣの核酸配列を示す。
配列番号４１は、「ｍＡｂ８」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号４２は、「ｍＡｂ８」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号４３は、「ｍＡｂ９」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号４４は、「ｍＡｂ９」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号４５は、「ｍＡｂ１０」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号４６は、「ｍＡｂ１０」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号４７は、「ｍＡｂ１１」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号４８は、「ｍＡｂ１１」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号４９は、「ｍＡｂ１２」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号５０は、「ｍＡｂ１２」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号５１は、「ｍＡｂ１３」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号５２は、「ｍＡｂ１３」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号５３は、「ｍＡｂ１４」抗体のＨＣの配列を示す。
配列番号５４は、「ｍＡｂ１４」抗体のＨＣの核酸配列を示す。
配列番号５５は、図１に示したＩｇＧ１定常領域の配列を示す。
配列番号５６は、「ｍＡｂ１０」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号５７は、「ｍＡｂ１１」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号５８は、「ｍＡｂ１２」抗体のＶＨ配列を示す。
配列番号５９は、図２に示した本発明による、位置４３４にアラニンを有するＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
配列番号６０は、図２に示した本発明による、それぞれ位置３０７、３８０および４３４にアラニンを有するＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
配列番号６１は、図２に示した本発明による、位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシンを、それぞれ有するＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
配列番号６２は、図２に示した本発明による、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニン、および位置２５６にグルタミン酸を、それぞれ有するＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
配列番号６３は、図２に示した本発明による、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンを、それぞれ有するＩｇＧ１のＦｃ領域の配列を示す。
材料および方法
モノクローナル抗体の分析および操作：
抗ＣＨＩＫＶ抗体のアミノ酸配列を、３Ｄモデル／構造分析ツール（Ｂｉｏｖｉａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｓｕｉｔｅ）とカップリングした抗体インスペクター（社内で開発された抗体配列分析のためのツール）を使用して分析し、開発にとっての潜在的な問題点および不利点をスクリーニングした。不利点分析は、酸化、脱アミノ化、異性化、酸性切断、グリコシル化、および追加の遊離Ｃｙｓのような溶媒に曝露が望ましくないモチーフに焦点を合わせる。溶媒曝露の全ての不利点は、それらの位置（ＣＤＲ、可変ドメインのフレームワーク、定常ドメイン）に基づいて優先順位付けされる。突然変異が、配列に見出される不利点を最小化することが示唆された。
最適化された抗体の生成：
コドンが最適化された遺伝子のフラグメントを合成して、哺乳動物の発現ベクター中でクローニングした。トランスフェクションは、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してメーカーのプロトコルに従って実施した。収穫された状態調節された媒体中の試料を、タンパク質Ａカラムに通して精製して、溶離した分画の緩衝液を交換してｐＨ７．４のＧｉｂｃｏ ＰＢＳにした。
結合分析：抗原結合、ヒトおよびマウスへのＦｃＲｎ結合、ＦｃγＩＩＩａ結合
組換えＣＨＩＫＶ Ｅ２抗原の結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を使用して表面プラズモン共鳴により測定した。ＣＭ５シリーズＳセンサーチップに、抗テトラＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）を、飽和レベルで、Ｂｉａｃｏｒｅにより提供された標準的アミンカップリング手順により固定化した。組換えＣＨＩＫＶ Ｅ２抗原、すなわち、Ｈｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＬＲ２００６（配列番号９）およびＨｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＳＬ１５６４９（配列番号１５）組換えタンパク質の構築物は、Ｖｏｓｓら、２０１０（Ｖｏｓｓ ＪＥら ２０１０，Ｎａｔｕｒｅ ４６８：７０９−７１２）に基づくものであり、ＨＥＫ２９３細胞により一過性で発現されて精製された（Ｐａｌら，２０１３，ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ９，ｅ１００３３１２；Ｓｍｉｔｈら，２０１５，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ ＆ Ｍｉｃｒｏｂｅ １８：８６−９５）。基本的に、これらの構築物は、シグナルペプチド−Ｅ３＿Ｅ２−（Ｇ４Ｓ）４−Ｅ１−Ｈｉｓ８として設計されるが、成熟形態で、シグナルペプチドおよびＥ３は切断により除去される。Ｈｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＬＲ２００６およびＨｉｓタグ付きＣＨＩＫＶ Ｅ２ ＳＬ１５６４９組換え抗原を、ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動緩衝液で希釈して、１０ないし３０ＲＵの間の捕捉レベルを達成するために３０秒間注入した。試験抗体は、３０ｎＭから１．１ｎＭに逐次３倍希釈した。低親和性の結合剤は、９００ｎＭから逐次希釈した。各抗体を、捕捉された抗原および対照表面に３分間２連で、６５μＬ／分の流速で注入し、５または１５分間解離させた。表面をｐＨ１．５のグリシンで再生させた。反応速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアで、１：１結合モデルを使用して計算した。
ＦｃＲｎへの結合を測定するために、ＣＭ５シリーズＳセンサーのチップに組換えヒトＦｃＲｎまたはマウスＦｃＲｎをアミン化学反応を使用して直接固定化し、それぞれ１７００ＲＵおよび８００ＲＵの表面密度を達成した。試験抗体を、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４の５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０中で、２００および５０ｎＭに希釈した。希釈された試料を３分注入し、続いて、２連で緩衝液中１０μＬ／分で５分間解離させた。表面をｐＨ８．５のホウ酸塩緩衝液で再生させた。
ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００装置を用いて測定した。ＣＭ５チップに、アミンカップリングにより抗ＨＰＣ４抗体を飽和レベルで固定化した。組換えヒトＦｃγＲＩＩＩａの２つの多形を分析で比較した（Ｖａｌ１５８およびＰｈｅ１５８）。組換えヒトＨＰＣ４タグ付きＦｃγＲＩＩＩａ−Ｖ１５８およびＦｃγＲＩＩＩ−Ｆ１５８を、２ｍＭのＣａＣｌ２を含有するＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液で希釈し、Ｆｃ２またはＦｃ４に、それぞれ、３０秒間１０μＬ／分で注入して、１０〜４０ＲＵの捕捉レベルを達成した。試料を、９００、３００、および１００ｎＭに希釈して２分間注入し、続いて緩衝液中３０μＬ／分で３分、２連で解離させた。表面を、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて２０μＬ／分で３分間再生させた。
結果
ＣＤＲＨ３中に置換を有するｍＡｂ２の抗原結合
結果を図３に示す。潜在的脱アミノ化および酸化モチーフを排除するために導入された、ｍＡｂ２のＣＤＲＨ３内の突然変異の効果を、ＣＨＩＫＶのＬＲ２００６株に由来するＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１抗原に対する結合で測定した。結合は：
− ｍＡｂ２、およびそのＣＤＲＨ３の位置８にイソロイシン、そのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、およびそのＣＤＲＨ３の位置１３にアラニンをそれぞれ含むその誘導された変形体ｍＡｂ１０、ｍＡｂ１１およびｍＡｂ１２について、ならびにそのＣＤＲＨ３の位置８にアラニンを含む変形体、および上のリストに挙げたこれらの中における２つの置換の異なる組み合わせを含む変形体についてそれぞれ測定した。
潜在的脱アミノ化および酸化モチーフを排除して作製した７種の突然変異体の中で、そのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミンを含むｍＡｂ１１（ｍＡｂ２ Ｎ１０８Ｑ）のみが、親のｍＡｂと等価の標的結合親和性を保持していた。注意すると、そのＣＤＲＨ３の位置８にイソロイシンを含むｍＡｂ１０（ｍＡｂ２ Ｍ１０４Ｉ）および、そのＣＤＲＨ３の位置１３にアラニンを含むｍＡｂ１２（ｍＡｂ２ Ｇ１０９Ａ）は、中間的プロファイルを示し；二重突然変異体はそれらの標的結合親和性を失い、ならびにそのＣＤＲＨ３の位置８にアラニンを含む変形体（ｍＡｂ２ Ｍ１０４Ａ）も同様であった。
ＦｃＲｎの結合
結果を図４に示す。ヒトＦｃＲｎに対する結合（図４Ａおよび４Ｃ）およびマウスに対する結合（図４Ｂおよび４Ｄ）を：
− それらのＦｃ領域において、位置４３４にアラニン、位置３０７、３８０および４３４のそれぞれにアラニン、位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４のそれぞれにセリン、ならびに位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸をそれぞれ含むｍＡｂ１およびｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６およびｍＡｂ７
− それらのＦｃ領域において、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンをそれぞれ、そのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸ならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミンをそれぞれ含むｍＡｂ２およびｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４
について、ｐＨ６．０で測定した。
全ての突然変異体は、増大した半減期を生ずると予想されるＦｃＲｎ結合親和性の増大、それ故、抗ＣＨＩＫＶ療法におけるそれらの有用性に対する好ましい影響を示した。位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンをそれぞれ、および位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸をそれぞれ含む突然変異体は、他の突然変異体と比較した場合、最も強い結合を示した。
ｍＡｂ１およびｍＡｂ２の標的結合に対するＦｃ領域における置換の効果
結果を図５に示す。Ｆｃ領域における置換の効果を、ｍＡｂ１およびｍＡｂ２について、ＣＨＩＫＶ株ＬＲ２００６（図５Ａ）およびＳＬ１５６４９（図５Ｂ）に由来するＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１抗原に対する結合で、それぞれ測定した。結合は：
− 位置４３４にアラニン、位置３０７、３８０および４３４にそれぞれアラニン、位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンをそれぞれ、ならびに位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸をそれぞれ含むｍＡｂ１およびｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６およびｍＡｂ７；
− 位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンをそれぞれ、そのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸、ならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリン、ならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミンをそれぞれ含むｍＡｂ２およびｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４。
についてそれぞれ測定した。
ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のＦｃＲｎへの結合を増強したＦｃ領域における置換は、標的とされるＣＨＩＫＶのｐＥ２−Ｅ１抗原に対する結合に影響しなかった。
ＦｃγＲＩＩＩａの結合
結果を図６に示す。ｍＡｂ１およびｍＡｂ２のＦｃ領域における置換の効果を、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合でそれぞれ測定した。ＦＣγＲＩＩａ（ＣＤ１６ａ）は、ＮＫおよびマクロファージにより発現されて、抗体依存性の細胞媒介される細胞障害性（ＡＤＣＣ）およびマクロファージによるサイトカイン放出を誘発することができる。
結合の結果を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの高親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＩａＶ１５８）におけるｍＡｂ１（図６Ａ）およびｍＡｂ２（図６Ｂ）について、ならびにヒトＦｃγＲＩＩＩａの低親和性受容体（ＦｃγＲＩＩＩａＦ１５８）におけるｍＡｂ１（図６Ｃ）およびｍＡｂ２について（図６Ｄ）それぞれ示す。
結合を：
− 位置４３４にアラニン、位置３０７、３８０および４３４にそれぞれアラニン、位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンをそれぞれ、ならびに位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸をそれぞれ含む、ｍＡｂ１およびｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、ｍＡｂ６およびｍＡｂ７；
− 位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンをそれぞれ、そのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸、ならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミン、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンならびにそのＣＤＲＨ３の位置１２にグルタミンを含む、ｍＡｂ２およびｍＡｂ８、ｍＡｂ９、ｍＡｂ１１、ｍＡｂ１３およびｍＡｂ１４
についてそれぞれ測定した。
ＦｃＲｎへの結合を増強したｍＡｂ１およびｍＡｂ２のＦｃ領域における置換の中で、位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸は、低下したＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性を導き、Ｆｃ領域が置換されていないｍＡｂ１またはｍＡｂ２と比較して、細胞に媒介されるエフェクター機能および抗ＣＨＩＫＶ療法に対して負の影響を有し得た。それぞれ、位置４３４におけるアラニン、位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、それぞれ、位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンのような他の突然変異は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合親和性を保持した。
位置４３４にアラニン、位置３０７、３８０および４３４にそれぞれアラニン、または位置２５０にグルタミンおよび位置４２８にロイシン、または位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンを、それぞれ含むが、位置２５２にチロシン、位置２５４にトレオニンおよび位置２５６にグルタミン酸を含まないｍＡｂ１およびｍＡｂ２は、エフェクター機能と連結されるＦｃγＲＩＩＩａ結合を保持した。
それ故、位置４２８にロイシンおよび位置４３４にセリンを含むｍＡｂ１またはｍＡｂ２は、最良のＦｃＲｎ結合を呈し、同時にエフェクター機能と連結されるＦｃγＲＩＩＩａの結合も保持する。
Figure 2019534001
Figure 2019534001
標準的プラーク縮小アッセイを使用するｍＡｂの中和活性
ｍＡｂ１、ｍＡｂ７およびｍＡｂ ＣＴＲ（抗リゾチームｒｈｌｇＧ１対照抗体）を、３種のＣＨＩＫＶ系統（アジア、東中部および南部アフリカ（ＥＳＣＡ）および西部アフリカ系統）を代表するＣＨＩＫＶの３種の異なる原型株（カリブ株、レユニオン（ＬＲ）および３７９９７株）に対してインビトロで試験した。
所定量のウイルスを、等体積のＰＢＳまたは希釈剤で希釈された抗体と混合した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。次に混合物を６ウェルのプレート中のコンフルエントな単層のベロ細胞に加えた。２時間のインキュベーションの後、プレートにＤＭＥＭ中５％のＣＭＣを重層した。注入後４８時間において、プレートをホルマリンで固定して、次にメチレンブルー色素で染色した。プラークを数えて、ＥＣ５０を決定するために、Ｐｒｉｓｍ−Ｇｒａｐｈ Ｐａｄでデータを分析した。
結果を、下の表８ならびに図７Ａから７Ｃに示す。ｍＡｂ１およびｍＡｂ７は、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃに、それぞれ示したように、アジア、東中部および南部アフリカ（ＥＳＣＡ）および西部アフリカのＣＨＩＫＶ系統の３種全ての遺伝子型のウイルスを、非常に強力な活性（ｍＡｂ１についてＥＣ５０値＜１０ｎｇ／ｍＬ、およびｍＡｂ７について＜１ｎｇ／ｍＬ）で阻害した。抗リゾチーム抗体（ｍＡｂのＣＴＲ）を非特異的な陰性対照として使用した。
Figure 2019534001
マウスにおけるインビボの保護の研究
ＤＢＡ１／Ｊマウスモデルを用いるインビボの研究を、Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈにおける勧告に厳密に従って実施した。プロトコルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ （ＮＩＡＩＤ）により承認された。感染実験は、ＮＩＡＩＤ Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの承認を得て、Ａ−ＢＳＬ３施設で実施した。
７〜８週齢のＤＢＡ／１Ｊマウスに、ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６の０．０５ｍｌを、足首に向かって右後足の蹠の皮下に接種した。治療的研究のためには、１０５．５ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６を、足の蹠に皮下接種を使用してＣＨＩＫＶ感染の３日後に、単回用量の組換えヒトＩｇＧの抗ＣＨＩＫＶｍＡｂを、個々の特化された用量で、腹腔内経路により投与した。注射の部位におけるウイルス力価を感染の５日後にモニターした。予防研究のためには、１０５．５ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６を用いる足の蹠の皮下感染の２日前、７日前または１４日前のいずれかに、組換えヒトＩｇＧの抗ＣＨＩＫＶｍＡｂを腹腔内注射により投与した。注射の部位におけるウイルス力価を、感染の３日後にモニターした。
インビボにおけるｍＡｂによる予防
ＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６を皮下注射する前２、７または１４日のいずれかに、マウスを、単回で２５０μｇ用量（約１２．５ｍｇ／ｋｇ）の組換えｈＩｇＧ抗ＣＨＩＫＶ ｍＡｂ（ｍＡｂ１、ｍＡｂ７）または対照の抗アイソタイプリゾチームｍＡｂ（ｍＡｂＣＴＲ）で予め処置した。アイソタイプの対照ｍＡｂで処置された全てのマウスは、右後脚に接種（ＣＣＩＤ５０／ｇ組織）の３日後に高いウイルス力価を示した（図８）。感染前の異なるときにおける（−２から−１４日）、ｍＡｂ７およびｍＡｂ１の両方による前処理は、それらのそれぞれの右後脚におけるウイルスレベルが、ＳＨＡＭ−ＰＢＳ群からの非感染マウスとほぼ同等であったので、ＤＢＡ１／Ｊ−マウスを、注射の部位に負荷されたウイルスから完全に保護した。
曝露後のインビボにおけるｍＡｂ療法
７〜８週齢のＤＢＡ／１Ｊマウスに、足首に向かって右後足の蹠の皮下に、０．０５ｍｌの１０５．５ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＣＨＩＫＶ−ＬＲを接種した。単回で２５０μｇ用量の個々のｍＡｂ（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ７、ｍＡｂ１１またはｍＡｂ１４）を、ＣＨＩＫＶ感染の３日後に腹腔内経路により投与した。注射の部位におけるウイルス力価を、感染の５日後にモニターした。全ての試験されたｍＡｂは、ＣＨＩＫＶ感染のマウスモデルにおける組織のウイルスの負荷を中和する同じ力価を示した（図９Ａ）。ｍＡｂ７およびｍＡｂ１４を、用量滴定研究でさらにキャラクタライズした。その目的で、ＤＢＡ１／Ｊマウスに、足首に向かって右後足の蹠の皮下に、０．０５ｍｌの１０５．５ＣＣＩＤ５０／０．１ｍｌのＣＨＩＫＶ−ＬＲ２００６を接種した。ｍＡｂ７またはｍＡｂ１４を、３ｄｐｉに単回の腹腔内注射により１０、２５、５０、１００および２５０μｇ用量（約０．５、１、２．５、５、１２．５ｍｇ／ｋｇ）で与えた。第一次の結果は、後肢におけるウイルスチャレンジの部位における５ｄｐｉのウイルス力価であった。ｍＡｂ７は、ＣＨＩＫＶに感染したＤＢＡ／１Ｊマウスにおける関節のウイルスの力価を用量依存性の様式で低下させた（図９Ｂ）。有意の低下が、５０から２５０μｇ用量で観察され、最高の効果は最高の用量で達成された。ｍＡｂ１４は、用量がどうであれ、ウイルスの力価を有意に低下させたが、用量効果は試験条件では観察されなかった。
非ヒト霊長類におけるｍＡｂの薬物動態
ｍＡｂ１およびｍＡｂ７を２．５ｍｇ／ｋｇ、静脈内（ＩＶ）ボーラスにより、雄カニクイザルサル（Ｍａｃａｃａ Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に投与した。ｍＡｂ１およびｍＡｂ７を受けた動物は異なる（２つの別の研究）。血漿の試料を、ヒトＩｇＧ１に対する抗体を使用して、外挿Ｅｌｉｓａバイオ分析法によりアッセイして、それによりウサギの免疫により発現されたｍＡｂ１およびｍＡｂ７を認識した。薬物動態の比較は、ｍＡｂ７で最終半減期（すなわち、ｔ１／２、身体中における薬物の濃度または量が厳密に半分まで減少するのに要する時間）の増大を示し、ｍＡｂ１およびｍＡｂ７についてそれぞれ２２．７および２５．５日であった（図１０）。

Claims (31)

  1. ＣＨＩＫＶに結合し、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む単離されたモノクローナル抗体であって：
    ｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号５、６および７のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬは、配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列を有するか、または
    ｉｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬは、配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
    ｉｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、ｉ．またはｉｉ．の配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有し；
    前記抗体は：
    ｉｖ． 位置４３４におけるアラニン、または
    ｖ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
    ｖｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
    ｖｉｉ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
    ｖｉｉｉ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
    からなる群から選択される少なくとも１つの残基を含むＦｃ領域をさらに含み、
    ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる前記モノクローナル抗体。
  2. 以下の：
    ｉ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
    ｉｉ． ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
    ｉｉｉ． ヒトのＦｃγＲＩＩＩに約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
    性質の１つまたはそれ以上を有する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体。
  3. それぞれ配列番号５、６および７のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびにそれぞれ配列番号８、ＧＮＴおよび配列番号１０のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
  4. それぞれ配列番号１１、１２および１３のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）を含み、ならびにそれぞれ配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列、またはこれらの配列と１つもしくは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有する３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む、請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体。
  5. − 配列番号５の配列からなるＣＤＲＨ１；
    − 配列番号６の配列からなるＣＤＲＨ２；
    − 配列番号７の配列からなるＣＤＲＨ３；
    − 配列番号８の配列からなるＣＤＲＬ１；
    − 配列ＧＮＴからなるＣＤＲＬ２；
    − 配列番号１０の配列からなるＣＤＲＬ３
    を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  6. − 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
    − 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
    − 配列番号１３の配列からなるＣＤＲＨ３；
    − 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
    − ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
    − 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
    を含む、請求項１、２および４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  7. 前記Ｆｃ領域が：
    ｉ． 位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
    ｉｉ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
    からなる群から選択される残基を含み、
    ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  8. 前記Ｆｃ領域は、位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含み、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  9. 前記Ｆｃ領域は、配列番号５９、６０、６１、６２および６３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  10. 重鎖の可変領域は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１から３、５、７〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  11. 軽鎖の可変領域は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１から３、５、７〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  12. その重鎖は、配列番号３１と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１から３、５、７〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  13. その軽鎖は、配列番号２０と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなる、請求項１から３、５、７〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  14. ＣＨＩＫＶに結合し、ならびに配列番号３１の重鎖および配列番号２０の軽鎖を含むかまたはそれらからなる単離されたモノクローナル抗体。
  15. ＣＨＩＫＶに結合し、ならびに３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）および３つの軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）を含む単離されたモノクローナル抗体であって：
    ｉ． 前記ＣＤＲＨは、配列番号１１、１２および３３のアミノ酸配列を有し、前記ＣＤＲＬは配列番号１４、ＧＴＳおよび配列番号１６のアミノ酸配列を有するか、または
    ｉｉ． 前記ＣＤＲＨおよびＣＤＲＬＨは、ｉ．の配列と１つまたは２つのアミノ酸置換により異なるアミノ酸配列を有し；および：
    ｉｉｉ． 配列番号３３の位置８におけるアミノ酸はＭではなく、および／または
    ｉｖ． 配列番号３３の位置１２におけるアミノ酸はＮではなく；および／または
    ｖ． 配列番号３３の位置１３におけるアミノ酸はＧではない
    前記モノクローナル抗体。
  16. 以下の：
    ｉ． ＣＨＩＫＶ ｐＥ２−Ｅ１標的に、約１０ｎＭ未満の結合解離平衡定数（ＫＤ）で結合する；
    ｉｉ． ヒトのＦｃＲｎに約２００ｎＭ未満のＫＤで結合する；
    ｉｉｉ． ヒトのＦｃγＲＩＩＩに約６００ｎＭ未満のＫＤで結合する
    性質の１つまたはそれ以上を有する、請求項１５に記載のモノクローナル抗体。
  17. − 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
    − 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
    − 配列番号３４の配列からなるＣＤＲＨ３；
    − 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
    − ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
    − 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
    を含む、請求項１５または請求項１６に記載のモノクローナル抗体。
  18. − 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
    − 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
    − 配列番号３５の配列からなるＣＤＲＨ３；
    − 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
    − ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
    − 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
    を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  19. − 配列番号１１の配列からなるＣＤＲＨ１；
    − 配列番号１２の配列からなるＣＤＲＨ２；
    − 配列番号３６の配列からなるＣＤＲＨ３；
    − 配列番号１４の配列からなるＣＤＲＬ１；
    − ＧＴＳからなるＣＤＲＬ２；
    − 配列番号１６の配列からなるＣＤＲＬ３
    を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  20. ｉ． 位置４３４におけるアラニン、または
    ｉｉ． それぞれ位置３０７、３８０および４３４におけるアラニン、または
    ｉｉｉ． それぞれ位置２５０におけるグルタミンおよび位置４２８におけるロイシン、または
    ｉｖ． それぞれ位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリン、または
    ｖ． それぞれ位置２５２におけるチロシン、位置２５４におけるトレオニンおよび位置２５６におけるグルタミン酸、
    からなる群から選択される残基を含むＦｃ領域をさらに含み、
    ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  21. 位置４２８におけるロイシンおよび位置４３４におけるセリンを含むＦｃ領域を有し、ここで、前記アミノ酸の位置はＥＵインデックスにより与えられる、請求項２０に記載のモノクローナル抗体。
  22. 配列番号５９、６０、６１、６２および６３と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含むかまたはそれらからなるＦｃ領域を有する、請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  23. 医薬として使用するための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
  24. ＣＨＩＫＶと関連する関節痛の処置に使用するための、請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
  25. ＣＨＩＫＶ感染の防止に使用するための、請求項２３に記載のモノクローナル抗体。
  26. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体および少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物。
  27. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する細胞株。
  28. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生する方法であって：
    ｉ． 前記モノクローナル抗体を産生する細胞株を培養するステップ；
    ｉｉ． 該産生されたモノクローナル抗体を精製するステップ；および場合により
    ｉｉｉ． 前記モノクローナル抗体を医薬組成物に剤形化するステップ
    を含む前記方法。
  29. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド。
  30. 配列番号１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３９、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４の配列の１つと少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードする請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の１種の抗体および場合によりパッケージング材料を含むキット。
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