TW201827461A - 抗chikv抗體及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及抗體和抗體的抗原結合片段，所述抗體和抗體的抗原結合片段特異性結合並中和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)並經工程化以開發療法進而治療CHIKV疾病或預防CHIKV感染。本發明還涉及包含本發明的抗體的藥物組合物和所述抗體用於預防和治療CHIKV疾病的用途。
Description
本發明涉及抗體和抗體的抗原結合片段，所述抗體和抗體的抗原結合片段特異性結合並中和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)並經工程化以開發預防和治療方案用於預防和治療CHIKV疾病。本發明還涉及包含CHIKV中和抗體的藥物組合物和該抗體用於預防和治療CHIKV疾病的用途。
CHIKV是一種重新出現的蚊媒病原體。CHIKV在非洲、印度和東南亞流行，但在這些地區外也以高發病率發生在不可預知和大型的暴發中，感染數百萬人(Powers AM,Logue CH,2007,J.Gen.Virol.88：2363-2377)。CHIKV包膜糖蛋白1(E1)中的突變使病毒通過白紋伊蚊(Aedes albopictus mosquitoe)以及埃及伊蚊(Aedes aegypti mosquitoe)傳播並在2005年于留尼汪島、印度和印度尼西亞導致廣泛而嚴重的流行病，隨後在意大利、法國和中國發生從旅行者開始的爆發(Tsetsarkin KA et al 2007,PLoS Pathog.3：e201；Schuffenecker I et al 2006,PLoS Med.3：e263；Wu D,Zhang Y et al 2013,Virol.J.10：174；Rezza G et al 2007,Lancet 370：1840-1846；Burt FJ 2012,Lancet 379：662-671)。由於白紋伊蚊地理範圍的擴大，預計 該病毒會傳播到新的地區且歐洲和美洲現在面臨CHIKV暴發的風險。
CHIKV是披膜病毒科(Togaviridae)α病毒屬的包膜正鏈RNA病毒。它是塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)複合體的成員且與羅斯河病毒(Ross River virus)和O’nyong’nyong病毒(ONNV)密切相關；由於其通過節肢動物，即蚊子傳播，還可將其稱作蟲媒病毒(節肢動物傳播病毒)。
CHIKV經由受體介導的內化和在早期內體中低pH觸發的II型膜融合事件進入細胞。CHIKV疾病的特徵在於急性、急性期後和慢性多關節炎/多關節痛階段，後者通常是對稱的，並且經常造成失能並且可以持續數月或數年。其他症狀，如發熱、皮疹、肌痛和/或疲勞也在急性期出現。近期流行的還與CHIKV疾病的非典型和嚴重臨床形式和一些死亡相關，這似乎僅限於非常年輕和年長的具有合併症的患者。
目前沒有針對CHIKV疾病的具體預防或治療性處理。CHIKV有對症治療，通常是臥床休息、補液和減輕發燒和疼痛的症狀的藥物如簡單鎮痛藥和/或非甾體抗炎藥物(NSAID)。雖然45年前首次提出針對CHIKV的疫苗候選，但迄今為止測試的許多疫苗候選都未能誘導保護性抗體，或顯示出顯著的安全性問題。
仍然需要顯示針對CHIKV增加的治療功效的治療，包括使用靶向CHIKV的特異性單克隆抗體。
本領域需要適用於預防和治療用途的CHIKV中和抗體。具體而言，這樣的抗體需要以高靶結合親和力適當地中和CHIK病毒的不同毒株，以展現適當的藥代動力學參數，在施用時顯示合適的半衰期，並且允許大規模有效製造，同時保持其與跟效應功能相關的Fc RIIIa的結合。
如本發明中所公開的，本申請的發明人能夠選擇和工程化特異性CHIKV中和抗體，所述抗體在其暴露相關藥代動力學和維持其與效應功能相關的Fc RIIIa的結合中有所改進，使其與預防和治療CHIKV疾病的治療劑的開發兼容並解決了本領域對抗CHIKV的有效療法的需要。
本發明的抗體對不同的CHIKV毒株具有高結合親和力(在納摩爾範圍內)。因此，它們展示針對不同CHIKV毒株的廣泛和超強效的中和活性。此外，本發明的抗體具有改進的與人FcRn受體的結合，同時保留Fc RIIIa結合，使得其與增加的半衰期兼容，同時保持其與效應功能相關的與Fc RIIIa的結合。
第一方面，本發明涉及與CHIKV結合的分離的單克隆抗體，其包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或iii.所述CDRH和CDRLH具有與i.或ii.因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中所述抗體進一步包含含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：iv.在位置434的丙氨酸，或v.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或vi.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或vii.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或viii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置 256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在一個實施方案中，所述分離的單克隆抗體與CHIKV結合並包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或iii.所述CDRH和CDRLH具有與i.或ii.因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中所述抗體進一步包含含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：iv.在位置434的丙氨酸，或v.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或vi.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或vii.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或viii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出；且其中所述抗體具有一個或多個下述特徵：i.以小於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1靶標；ii.以小於約200nM的KD結合人FcRn；iii.以小於約600nM的KD結合人Fc RIII。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，或因一 個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列，且其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含：- 由SEQ ID NO：5的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：6的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：7的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：8的序列組成的CDRL1；- 由GNT序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：10的序列組成的CDR L3。
在進一步的實施方案中，所述單克隆抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列，且所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的輕鏈互補決定區(CDRL)，或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：13的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含含有選自下組的殘基的Fc區： i.在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或ii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
在進一步的實施方案中，所述單克隆抗體包含Fc區，其中所述Fc區包含在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含κ輕鏈或λ輕鏈。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與SEQ ID NO：59、60、61、62和63具有至少80%同一性的序列或由其組成的Fc區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：1具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：2具有至少80%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：31具有至少80%同一性的序列或由其組成的重鏈。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：20具有至少80%同一性的序列或由其組成的輕鏈。
第二方面，與CHIKV結合的分離的單克隆抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中： i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
在一個實施方案中，單克隆抗體或其抗原結合片段包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：34的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
在另一個實施方案中，單克隆抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
在另一個實施方案中，分離的單克隆抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)且所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有 SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
在另一個實施方案中，單克隆抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G，且其中所述抗體具有一個或多個下述特徵：iv.以小於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1靶標；v.以小於約200nM的KD結合人FcRn；vi.以小於約600nM的KD結合人Fc RIII。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含在SEQ ID NO：33的位置8具有選自I、L、V、Q和N的氨基酸。
在另一個實施方案中，單克隆抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：34的序列組成的CDRH3； - 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體包含在SEQ ID NO：33的位置12具有選自Q、E、S、T和D的氨基酸。
在進一步的實施方案中，單克隆抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：35的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，單克隆抗體包含在SEQ ID NO：33的位置13具有選自A、S和T的氨基酸。
在進一步的實施方案中，單克隆抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：36的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：57具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：4具有至少80%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO： 47具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：38具有至少80%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。
第二方面的另一方面，所述單克隆抗體進一步包含含有選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有含有選自下組的殘基的Fc區：i.在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或ii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有含有在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
在本發明該方面的另一實施方案中，所述單克隆抗體包含κ輕鏈或λ輕鏈。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與SEQ ID NO：59、60、61、62和63具有至少80%同一性的序列或由其組成的Fc區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與SEQ ID NO：57具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與SEQ ID NO：4具有至少80%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：53具有至少80%同一性的序列或由其組成的重鏈。
在另一個實施方案中，所述單克隆抗體具有包含與序列ID NO：38具有至少80%同一性的序列或由其組成的輕鏈。
第四方面，本發明涉及用作藥物用途的單克隆抗體。
在另一個實施方案中，單克隆抗體用於在治療CHIKV相關關節痛中使用。
在另一個實施方案中，單克隆抗體用於在預防CHIKV感染中使用。
第五方面，本發明涉及藥物組合物，其包含單克隆抗體和至少一種賦形劑。
第六方面，本發明涉及產生單克隆抗體的細胞系。
第七方面，是產生單克隆抗體的方法，其中所述方法包括步驟：(i)培養根據第六方面產生所述單克隆抗體的細胞系；(ii)純化所產生的單克隆抗體；和任選地(iii)將所述單克隆抗體配製成藥物組合物。
第八方面，本發明涉及包含編碼本發明所述的抗體或其抗原結合片段的序列的多核苷酸。在一個實施方案中，多核苷酸編碼與序列SEQ ID NO：18、21、22、24、26、28、30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54之一具有至少80%同一性的多肽。
第九方面，本發明涉及包含至少一種本文所述的抗體的試劑盒。在一個實施方案中，所述試劑盒任選包含包裝材料。
“抗體”可以是天然的或常規的抗體，其中兩條重鏈通過二硫鍵彼此連接，並且每條重鏈通過二硫鍵連接到輕鏈。在哺乳動物中，抗體分為五大類或同種型，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。根據其分別包含α、δ、ε、或μ的重鏈對其分類。其不同在於恒定域的序列和數目、鉸鏈結構和抗體的價。有兩種類型的輕鏈，λ(l)和κ(k)，其中κ輕鏈是兩者中較常見的。雖然這些在蛋白質序列方面相對不相似，但它們具有相似的結構和功能。
五種主要的重鏈種類(或同型)決定抗體分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每種鏈包含不同的序列域。IgG是正常人血清中最豐富的抗體，占免疫球蛋白總量的70-85%。它是分子量約 150kDa的單體，是二次免疫應答的主要抗體且具有五種免疫球蛋白種類中最長的半衰期。IgG由四個人亞類(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)組成，每個亞類包含不同的重鏈。它們高度同源，主要在鉸鏈區和其激活宿主免疫系統的程度上有所不同。IgG1和IgG4在鉸鏈區含有兩個鏈間二硫鍵，IgG2有4個，IgG3有11個。
輕鏈包括兩個結構域或區，即可變結構域(VL)和恒定結構域(CL)。重鏈包括四個結構域，可變結構域(VH)和三個恒定結構域(CH1,CH2和CH3，統稱為CH)。輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區確定對抗原的結合識別和特異性。輕鏈(CL)和重鏈(CH)的恒定區賦予重要的生物學特性，例如抗體鏈結合、分泌、經胎盤流動性、補體結合和與Fc受體(FcR)的結合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N末端部分且由一個輕鏈和一個重鏈的可變部分組成。抗體的特異性在於抗體結合位點和抗原決定簇之間的結構互補性。抗體結合位點由主要來自高變或互補決定區(CDR)的殘基組成。偶爾，來自非超變或框架區(FR)的殘基影響整個結構域的結構且因此影響結合位點。
“互補決定區或CDR”指一起定義天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親和力和特異性的氨基酸序列。免疫球蛋白輕鏈和重鏈各具有三個CDR，分別稱為CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L(對於輕鏈互補決定區)或CDRL1、CDRL2、CDRL3和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H(對於重鏈互補決定區)或CDRH1、CDRH2、CDRH3。因此，常規抗體抗原結合位點包括六個CDR，其包含來自重鏈和輕鏈V區中的每一個的CDR組。
“框架區”(FR)指介於CDR間的氨基酸序列，即指那些在單個物種中不同免疫球蛋白間相對保守的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區的部分。免疫球蛋白的輕鏈和重鏈各具有四個FR，分別稱為FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。
如本文使用的"人框架區"是與天然存在的人抗體的框架區基本上相同(約85%或更多，特別是90%、95%、97%、99%或100%)的框架區。
在一個實施方案中，免疫球蛋白輕鏈或重鏈中CDR/FR的界定基於IMGT定義(Lefranc,M.P.et al.,2003,Dev Comp Immunol.27(1)：55-77；www.imgt.org)確定。本發明中特徵性CDR序列根據IMGT的命名法給出。
如本文使用的術語“抗體”指常規或全長的抗體(即包含兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體)、單域抗體，還指常規和單域抗體的片段。如本文使用的術語“抗體”包括但不限於嵌合抗體、人源化抗體、人抗體和多重特異性抗體(如例如雙特異性和三特異性抗體)。術語“抗體”指包含單肽(或前肽，如果有的話)的抗體以及基於鏈的分泌和蛋白水解加工獲得的成熟形式。
如本文使用的抗體或免疫球蛋白還包括“單域抗體”，近來已對其進行了描述且其為互補決定區為單域多肽的部分的抗體。單域抗體的實例包括重鏈抗體、天然缺乏輕鏈的抗體、源自常規四鏈抗體的單域抗體、工程化的單域抗體。單域抗體可源自任何物種，包括但不限於小鼠、人、駱駝、美洲駝、山羊、兔和牛。單域抗體可以是已知為缺乏輕鏈的重鏈抗體的天然存在的單域抗體。具體而言，駱駝科物種例如駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝和原駝產生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。駝科重鏈抗體還缺乏CH1域。
這些缺乏輕鏈的單域抗體的可變重鏈在本領域中已知為“VHH”或“納米抗體”。與常規VH域相似的是，VHH包含四個FR和三個CDR。納米抗體具有超越常規抗體的優勢：其比IgG分子小約10倍，且結果是適當折疊的功能性納米抗體可由體外表達產生同時實現高產量。此外，納米抗體非常穩定，且對蛋白酶的作用具有抗性。納米抗體的性 質和產生已由Harmsen and De Haard HJ(Appl.Microbiol.Biotechnol.2007 Nov；77(1)：13-22)綜述。
如本文使用的“分離的抗體”指主要不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體；例如，主要無特異性結合非CHIKV的抗原的抗體的與CHIKV結合的分離的抗體或其片段，或其抗原結合片段。
如本文使用的“阻斷抗體”，或“中和抗體”，或“中和CHIKV活性的抗體”、或“呈現/展示針對CHIKV的中和活性的抗體”，或“CHIKV中和抗體”，或“抗CHIKV抗體”指其與CHIKV的結合導致CHIKV的至少一種生物活性的抑制的抗體。例如，抗體可通過阻斷CHIKV與細胞的附著中和CHIKV毒株並由此預防所述細胞由CHIKV感染。
如本文使用的術語“單克隆抗體”或“mAb”指針對特異性抗原的單一氨基酸組成的抗體分子，且不應理解為需要通過任何特定方法產生抗體。單克隆抗體可通過B細胞的單克隆或雜交瘤產生，但還可以是重組的，即由蛋白工程化產生。
術語"嵌合抗體"指以其最廣義包含來自一種抗體的一個或多個區和來自一種或多種其他抗體的一個或多個區的工程化的抗體。具體而言，嵌合抗體包含源自非人動物的抗體的VH域和VL域，其與另一抗體特別是人抗體的CH域和CL域結合。作為非人動物，可使用任何動物如小鼠、大鼠、倉鼠、兔等。嵌合抗體還可指針對至少兩種不同的抗原具有特異性的多重特異性抗體。在一個實施方案中，嵌合抗體具有小鼠來源的可變域和人來源的恒定域。
術語"人源化抗體"指初始完全或部分為非人來源且隨後經修飾以替換一些氨基酸(特別是在重鏈和輕鏈的框架區中)進而避免或最小化人中的免疫應答的抗體。人源化抗體的恒定區大多為人CH和CL域。在一個實施方案中，人源化的抗體具有人來源的恒定區。
(常規)抗體的“片段”包含完整抗體的一部分，特別是完整抗體的 抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、雙抗體、雙特異性和多特異性抗體，其由抗體片段形成。常規抗體的片段還可以是單域抗體如重鏈抗體或VHH。
術語“Fab”指具有約50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中在通過以蛋白酶木瓜蛋白酶處理IgG獲得的片段中H鏈的約一半N末端和完整的L鏈通過二硫鍵結合在一起。
術語“F(ab')2”指具有約100,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，在通過蛋白酶胃蛋白酶處理獲得的片段中，其略大於經由鉸鏈區的二硫鍵結合的Fab。
術語“Fab'“指具有約50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其通過切割F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵獲得。
“Fc區”或“Fc域”定義為抗體重鏈的羧基末端且包含對全部免疫球蛋白通用的蛋白序列以及對個別不同類別的免疫球蛋白獨特的決定簇的蛋白序列。例如，人IgG1重鏈包含CH1、鉸鏈、CH2和CH3區；鉸鏈、CH2和CH3區的部分組成Fc區。如圖1所示，就本發明而言Fc區氨基酸殘基根據如Kabat所述的EU指數編號(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th,Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。因此，表述“其中該/所述氨基酸位置根據EU指數給出”指該Fc區的編號如上文Kabat et al,1991中所述且如圖1所示。
該Fc區的結構域在確定免疫球蛋白的生物功能方面是重要的，這些生物學功能被稱為“效應功能”。這些Fc域介導的活性經由免疫效應細胞介導，包括B淋巴細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜中性粒細胞和肥大細胞或多種補體成分。這些效應功能涉及通過抗體Fc域與所述受體(或“Fc受體”)或與補體成分的結合，對所述 效應細胞表面上受體進行活化。抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)和補體依賴的細胞毒性(CDC)活性屬□這些效應功能且涉及Fc域與Fc受體如效應細胞的Fc RI(CD64)、Fc RII、Fc RIII或補體成分如C1q的結合。對於多種人免疫球蛋白的種類，人IgG1和IgG3比IgG2和IgG4更有效地介導ADCC。術語“Fc受體”包括但不限於Fc RI(CD64)、Fc RIIA和Fc RIIB(CD32)、Fc RIIIA(CD16a)和Fc RIIIB(CD16b)、Fc受體(Fc RI或CD89)和Fc受體(Fc RI和Fc RII(CD23)。文獻中已經報道了數種氨基酸取代導致不同人IgG同型中效應功能的降低(參見Strohl 2009,Current Opinion in Biotechnology 20：685-691中的表2)。
單鏈Fv("scFv")多肽是共價連接的VH：：VL異二聚體，其經常表達自包括通過編碼的肽接頭連接的VH和VL編碼基因的基因融合物。人scFv片段可包括以適當構象保持的CDR，特別是通過使用基因重組技術。二價和多價抗體片段可通過單價scFv的結合自發形成或可通過由肽接頭偶聯單價scFv生成，如二價sc(Fv)2。“dsFv”是通過二硫鍵穩定化的VH：：VL異二聚體。“(dsFv)2”指通過肽接頭偶聯的兩個dsFv。
術語“雙特異性抗體”或“BsAb”指在單分子內組合兩種抗體的抗原結合位點的抗體。因此，BsAb能夠同時結合兩種不同的抗原。以增加的頻率使用基因工程以設計、修飾和產生具有理想的結合特徵和效應功能組合的抗體或抗體衍生物，如EP 2050764 A1中所述。
術語“多重特異性抗體”指在單分子內組合兩種或多種抗體的抗原結合位點的抗體。
術語"雙抗體"指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含在相同的肽鏈中與輕鏈可變域(VL)連接的重鏈可變域(VH)(VH-VL)。通過使用過短的接頭而不允許在相同鏈上兩個域間的配對，所 述域被迫與另一條鏈的互補域配對並生成兩個抗原結合位點。
術語“雜交瘤”指通過將使用抗原免疫非人哺乳動物製備的B細胞與源自產生具有抗原特異性的、期望的單克隆抗體的小鼠等的骨髓瘤細胞進行細胞融合。
如本文使用的“特異性結合”或“特異性結合至”或“結合至”等意為抗體或其抗原結合片段與相對穩定的抗原在生理條件下形成複合物。特異性結合可通過至少約1x10-8M或更少的平衡解離常數(KD)(例如較小的KD指更緊密的結合)表徵。用於確定兩分子是否特異性結合的方法為本領域已知且包括例如平衡透析、表面等離子體共振等。如本文所述，已表徵抗體，例如通過其與CHIKV和/或CHIKV抗原的特異性結合使用表面等離子體共振例如BIACORETM。
如本文使用“CHIKV抗原”指本文所述的抗體的特異性天然抗原，即CHIKV的蛋白E2。其還涵蓋包含CHIKV包膜蛋白E1和CHIKV的特異性抗原E2的重組蛋白，例如在表面等離子體共振結合實驗中使用以在體外測量抗CHIKV抗體的結合親和力，如本文在材料和方法中描述並稱為“pE2-E1蛋白”或“pE2-E1靶標”或“p62-E1”或“his-標簽CHIKV E2”或“CHIKV靶pE2-E1”或“CHIKV pE2-E1抗原”者。
如本文使用的“酸性環境”意為小於pH 7的環境；應該理解在例如pH 6完成的結合實驗產生在酸性環境中的結合數據。
“與參照序列至少80%相同的”序列是在其全長上與參照序列的全長具有80%或更具體地85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列。
“序列同一性”的百分比可通過在比較窗口上以最佳方式對齊來比較兩序列確定，其中比較窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分與參照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即缺口)用於兩個序列的最佳比對。通過確定在兩個序列中出現相同核酸堿基或氨基 酸殘基的位置數來計算百分比以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗口中位置的總數目並將結果乘以100得到序列同一性的百分比。用於比較的序列的最佳比對通過全域成對比較來進行，例如，使用N Needleman and Wunsch J.Mol.Biol.48：443(1970)的算法。序列同一性的百分比可容易地確定，例如使用程序Needle，使用BLOSUM62矩陣，和如下參數缺口-開放=10，缺口-延伸=0.5。
"保守的氨基酸取代"是其中氨基酸殘基由另一個具有化學性質(例如電荷或疏水性)類似的側鏈R基團的氨基酸殘基取代的一種。一般而言，保守的氨基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能特性。擁有具有類似化學性質的側鏈的氨基酸基團實例包括1)脂肪族側鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側鏈：絲氨酸和蘇氨酸；3)含醯胺側鏈：天冬醯胺和榖氨醯胺；4)芳香族側鏈：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)鹼性側鏈：賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側鏈：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫側鏈：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬醯胺-榖氨醯胺。
如本文使用的術語抗體的“抗原結合部分”、抗體的“抗原結和片段”等包括任何天然存在、酶促獲得的、合成的或基因工程化的多肽或特異性結合抗原以形成複合物的糖蛋白。如本文使用的術語抗體的“抗原結合部分”、“抗體片段”指保留與CHIKV和/或CHIKV抗原結合能力的抗體的一個或多個片段。這樣的抗原結合部分通常包含抗體的CDR。
"抗體依賴性細胞介導的細胞毒性"或"ADCC"指其中分泌的抗體結合到存在於某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞，嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上的Fc受體(FcR)上以允許這些細胞毒性效應細胞特 異性結合攜帶抗原的靶細胞並隨後殺傷該靶細胞的細胞毒性形式。換句話說，ADCC是細胞介導的免疫機制，其中免疫系統的效應細胞(主要是自然殺傷細胞)主動裂解已經由特異性抗體結合的靶細胞。ADCC是抗體作為體液免疫應答的一部分的機制之一，可以限制和包含感染。為評估感興趣分子的ADCC活性，還可以考慮體外ADCC測定，如US專利號5,500,362或5,821,337中所述。
表述“與X或Y的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列”意為所述序列與序列X或Y因至多兩個氨基酸殘基取代而不同，即僅因一個或兩個氨基酸取代而不同。
例如，表述“與序列Y因氨基酸取代Z和任選一個或兩個其他氨基酸取代而不同的序列X”意為所述序列X與序列Y因下述而不同： - 僅氨基酸取代Z，或 - 氨基酸取代Z和不同於氨基酸取代Z的一個或兩個氨基酸取代。
表述“在位置Y具有一個氨基酸取代的SEQ ID NO：X”意為序列與SEQ ID NO：X因在SEQ ID NO：X的位置Y的一個氨基酸取代而不同。
如本文使用，“CHIKV”意為基孔肯雅病毒，如在上文介紹部分所述，其為披膜病毒科(Togaviridae)α病毒屬的包膜正鏈RNA病毒。 CHIKV內也包含不同的代表性感染毒株(“CHIKV毒株”)，舉例來說，包括但不限於東/中/南非(ECSA)基因型如LR2006 OPY1[LR]毒株，其具有在NCBI登錄號DQ443544.2，日期2006年10月24日下所示的序列；西非基因型如NI 64 IbH35毒株是另一個實例，其具有在NCBI登錄號HM045786.1，日期2010年12月28日下所示的序列；且亞洲基因型如RSU1毒株為另一實例，其具有在NCBI登錄號HM045797.1，日期2010年12月28日下所示的序列，和例如99659[2014加勒比地區]毒株，其具有在NCBI登錄號KJ451624，日期2014年9月11日下所 示的序列。已鑒定屬□不同基因型的其他毒株如S27毒株為另一實例，其具有在NCBI登錄號AF369024.2，日期2014年1月14日和UniProtKB/Swiss-Prot參考號Q8JUX5，日期2015年9月16日下所示的序列以及SL15649作為另一實例，其具有在NCBI登錄號GU189061，日期2011年12月14日下所示的序列。參照CHIKV毒株的其他實例可在病毒病原體數據庫內獲得，關於其基因組可在如下處獲得：https：//www.viprbrc.org/brc/vipr_genome_search.spg？method=doQuickTextSearch&decorator=toga&pageTo=1&selectionContext=1476362322448，或關於相關蛋白可在如下處獲得：https：//www.viprbrc.org/brc/vipr_protein_search.spg？method=doQuickTextSearch&decorator=toga&pageTo=1&selectionContext=1476362669763。
類似于其他α病毒的基因組，CHIKV基因組編碼兩種包膜糖蛋白，E2和E1，其衍生自較大的多聚蛋白前體(衣殼/E3/E2/6K/E1；如在NCBI登錄號：NC_004162.2，日期2012年6月27日所示)且嵌入病毒膜。成熟病毒粒子由三種主要結構蛋白組成：一種核衣殼蛋白和兩種糖蛋白E1和E2，其中E2與細胞附著且E1參與病毒融合。第三種糖蛋白E3與在一些α病毒的成熟病毒粒子而非其他相關，而通過裂解多聚蛋白前體釋放E2和E1而產生的膜相關肽6K蛋白以低水平摻入到顆粒中。已經使用低溫電子顯微鏡(Cryo-EM)定義了顆粒中α病毒表面糖蛋白的組成，而CHIKV糖蛋白的原子結構最近通過X射線晶體學解決，包括成熟顆粒和未成熟前體多聚蛋白二者。三種糖蛋白(E3/E2/E1)每種的240個拷貝一起在成熟病毒上形成80個尖峰，組成圍繞病毒膜的二十面體蛋白質殼。(Voss JE et al 2010,Nature 468：709-712)。這些糖蛋白的折疊、運輸到表面和功能依賴於它們彼 此的正確相互作用。E1由三個b片層組成，稱為I、II和III；E2含有三個免疫球蛋白樣結構域(A、B和C，其中A在N末端)。在複合物中，結構域B位於膜的遠端並且接觸E3；結構域C與病毒膜最接近且結構域A在中心(Fox JM et al 2015,Cell 163：1095-1107and WO 2015010125)。作為分限制性實例，CHIKV E1、E2和E3蛋白的序列和信息分別在PDB入口No.2xFB和2xFC(最近更新：2010年11月24日)、PDB條目No.3N40、3N41、3N42、3N43和3N44(最近更新：2010年12月01日)中提供。
本發明所述的抗體
就治療目的，理想的是通過改進，具體而言，其與其靶向的抗原的結合、其穩定性、藥代動力學和藥效學以及其功能生成更適於其所需的藥物特性的mAb。
作為第一個目的，抗CHIKV抗體基於完整的人親本抗體，分別是mAb1和mAb2，其對於不同的CHIKV毒株具有高結合親和力(在納摩爾範圍內)，特別是對其各自的蛋白質E2。因此，它們顯示出針對多種CHIKV毒株廣泛且超強的中和活性。
MAb1包含：- 重鏈的可變域由下述序列組成：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISTYKGYTQYAQNFQGRVTITTDTPATTVYMELRSLRSDDTAVYYCARVLSETGYFYYYYYGMDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：1)，其中CDR分別以加粗字體顯示，CDRH1(GYSFTSYG,SEQ ID NO：5),CDRH2(ISTYKGYT,SEQ ID NO：6)和CDRH3(ARVLSETGYFYYYYYGMDV,SEQ ID NO：7)。框架區涵蓋CDRH1、CDRH2和CDRH3； - 輕鏈的可變域由下述序列組成：QAVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGADYNVHWYQLLPGTAPKLLIYGNTNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSASVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：2)，其中CDR分別以加粗字體顯示，CDRL1(SSNIGADYN,SEQ ID NO：8)、CDRL2(GNT)和CDRL3(QSYDSSLSASV,SEQ ID NO：10)。框架區涵蓋CDRL1、CDRL2和CDRL3；Mab2包含：- 重鏈的可變域由下述序列組成：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYILSKLSVHWVRQAPGKGLEWMGGSEREDGETVYAQKFQGRISLTEDTSIETAYMELSSLSSEDTAVYYCATGGFWSMIGGNGVDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：3)，其中CDR分別以加粗字體顯示，CDRH1(GYILSKLS,SEQ ID NO：11),CDRH2(SEREDGET,SEQ ID NO：12)和CDRH3(ATGGFWSMIGGNGVDY,SEQ ID NO：13)。框架區涵蓋CDRH1、CDRH2和CDRH3；- 輕鏈的可變域由下述序列組成：QAVVTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQDIRNNLGWYQQKPGKAPERLIYGTSNLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPPTFGRGTKVEIK(SEQ ID NO：4)，其中CDR分別以加粗字體顯示，CDRL1(QDIRNN,SEQ ID NO：14)、CDRL2(GTS)和CDRL3(LQHNSYPPT,SEQ ID NO：16)。框架區涵蓋CDRL1、CDRL2和CDRL3。
在第一方面，本發明提供了與CHIKV結合並且因為其在其Fc域中包含至少一個氨基酸取代而在酸性環境中與FcRn受體具有改進的 結合的mAb1和mAb2的變體抗體。當施用至患者時，這種突變導致這種變體抗體的血清半衰期增加。這種取代的非限制性實例包括在位置250(例如E或Q)；250和428(例如L或F)；252(例如L/Y/F/W或T),254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修飾；或在位置428和/或433(例如H/L/R/S/P/Q或K)和/或434(例如A,W,H,F或Y)的修飾；或在位置250和/或428的修飾；或在位置307或308(例如308F,V308F)和434的修飾，其中所述氨基酸位置使用EU指數編號給出(圖1)。
如圖4和實施例2所示，發明人鑒定了當將選自下組的取代引入mAb1或mAb2抗體Fc區內時，其與人和小鼠FcRn受體在pH6的結合增加：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸。
此外，如實施例3和圖5中所述，發明人顯示當引入其Fc區時，mAb1和mAb2與其CHIKV靶標pE2-E1的結合為受如上文所述的取代影響，且其增加了與任何小鼠FcRn的結合。如實施例2和圖4所示，當分別將位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和位置256的谷氨酸，或位置428的亮氨酸和位置434的絲氨酸引入其各自的Fc區時，mAb1或mAb2 Fc區的取代顯示最強的人和小鼠FcRn結合。
如本領域已知，Fc區在確定稱為“效應功能”的免疫球蛋白的生物學功能中是必需的。ADCC是其中一種機制，是細胞介導的免疫的一 部分，通過其免疫系統的效應細胞(主要是天然殺傷細胞)裂解已由特異性抗體結合的靶細胞。因此，ADCC是可以限制和包含感染的機制之一。細胞介導的活性涉及Fc域與效應細胞的Fc-受體如Fc RI(CD64)、Fc RII、Fc RIII的結合。
如本文所述，其中單克隆抗體對CHIKV毒株是高度特異性的並且專用於處理治療目的，其活化ADCC的潛力是測量的重要參數，因為ADCC似乎參與感染控制中的抗CHIKV抗體的活性。如實施例4和圖6所示，發明人已經顯示，當將選自下組的取代引入到其各自的Fc區中時，mAb1和mAb2與Fc RIIIa的結合被保留：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸。
反之，當分別以位置252的酪氨酸、位置254的蘇氨酸和位置256的谷氨酸取代mAb1和mAb2時，Fc RIIIa結合減少。
因此，本發明人鑒定了具有改善的與人FcRn受體結合同時保留了Fc RIIIa結合的抗體，使得本發明的抗體兼容增加的半衰期的同時保持其效應功能。
因此，第一方面，本發明涉及與CHIKV結合的分離的單克隆抗體，其包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或iii.所述CDRH和CDRLH具有與來自i.或ii.的序列因一個或兩個 氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中所述抗體進一步包含含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
包括這些取代的Fc區示於圖1和2(SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：59至63)。
在一個實施方案中，抗CHIKV抗體包含至少在位置434含有丙氨酸的Fc區。在另一個實施方案中，抗CHIKV抗體包含在位置307、380和434含有丙氨酸的Fc區。在另一個實施方案中，抗CHIKV抗體包含在位置250含有榖氨醯胺且在位置428含有亮氨酸的Fc區。在另一個實施方案中，抗CHIKV抗體包含在位置428含有亮氨酸且在位置434含有絲氨酸的Fc區。在另一個實施方案中，抗CHIKV抗體包含在位置252含有酪氨酸、在位置254含有蘇氨酸且在位置256含有谷氨酸的Fc區。
本發明中的特徵抗體源自mAb1或mAb2且分別包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其分別具有：i. SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列和SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii. SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列和SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或 iii.與i.或ii.的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；在進一步的實施方案中，抗體包含CDR，所述CDR具有分別與SEQ ID NO：5、6和7的序列和SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列，或與SEQ ID NO：11、12和13的序列和SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列。
根據本發明的氨基酸取代可以是保守的或非保守的氨基酸取代。保守取代的實例示於下表1中。
在另一個實施方案中，抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和含有至少一個選自下組的殘基的Fc區： i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，抗體源自mAb2且包含分別具有SEQ ID NO：11,12和13的氨基酸序列或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)且其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，和含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或 iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在進一步的實施方案中，變體抗體(mAb3)包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少在位置434含有丙氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb4)包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8,GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，和至少分別在位置307、380和434含有丙氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb5)包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置250含有榖氨醯胺且在位置428含有亮氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb7)包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置428含有亮氨酸且在位置434含有絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb6)包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置252含有酪氨酸、在位置254含有蘇氨酸且在位置256含有谷氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在進一步的實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少在位置434含有丙氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置307、380和434含有丙氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置250含有榖氨醯胺且在位置428含有亮氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb8)包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置428含有亮氨酸且在位置434含有絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一實施方案中，變體抗體(mAb9)包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置252含有酪氨酸、在位置254含有蘇氨酸且在位置256含有谷氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
如實施例和圖5中所述，發明人顯示當包含含有至少一個如上文所述的殘基的Fc區時，mAb1和mAb2與其CHIKV靶標pE2-E1的結合未受影響。發明人還顯示這些包含含有至少一個如上文所述的殘基的Fc區的抗體全部展示與人和小鼠FcRn增加的結合(實施例2和圖4)，這對其各自的半衰期具有積極影響且因此對抗CHIKV療法有益；當分別將在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸或分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸引入其各自的Fc區時在人和在小鼠中顯示最高的FcRn結合。
因此，在示例性的實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具 有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置428含有亮氨酸且在位置434含有絲氨酸的Fc區，或至少分別在位置252含有酪氨酸、在位置254含有蘇氨酸且在位置256含有谷氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
此外，如實施例4和圖6所示，發明人已顯示當將選自下組的取代引入其各自的Fc區時，mAb1和mAb2與Fc RIIIa的結合被保留：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸。
相反，當分別以在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸取代時，Fc RIIIa結合減少。
因此，本發明人鑒定了與其靶標具有不受影響的結合和與人FcRn受體具有改進的結合同時保留Fc RIIIa結合的至少一種抗體，使其就其增加的半衰期同時保留其效應功能而言與治療劑的開發兼容以預防並治療CHIKV疾病。
在典型的實施方案中，變體抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)和分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)和至少分別在位置428含有亮氨酸且在位置434含有絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
換而言之，本文的特徵抗體可描述為與CHIKV結合的分離的單克隆抗體，其包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，且所述 CDRL具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或iii.所述CDRH和CDRLH具有與i.或ii.的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中所述抗體進一步包含含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出；且其中所述抗體具有一個或多個下述特徵：i.以小於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1靶標；ii.以小於約200nM的KD結合人FcRn；iii.以小於約600nM的KD結合人Fc RIII；在一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約5nM、小於約4nM、3、2、1nM、小於約0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3nM或小於約0.25nM、0.20nM、0.15nM、0.1nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1靶標。
在另一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約200nM、小於約100nM、小於約50nM、45、40、35、30nM或小於約25nM、20、15或10nM的KD結合人FcRn。
在另一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約600nM、小於約500nM、400nM、300nM、小於約200nM、150、100或50nM的KD結合人Fc RIII。
與CHIKV pE2-E1靶標結合，人FcRn和人Fc RIII可舉例來說通過表面等離子體共振測定例如在37℃測量。該測定可以舉例來說如實施例1至4中所述進行。
根據本發明的“Fc區”可以屬□確定抗體的功能活性的四個人亞類IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)重鏈之一。在一個實施方案中，Fc區屬□IgG1亞型重鏈。在另一個實施方案中，Fc區屬□IgG2亞型重鏈。在另一個實施方案中，Fc區屬□IgG3亞型重鏈。在另一個實施方案中，Fc區屬□IgG4亞型重鏈。在另一個實施方案中，除了本文所述的突變(圖1和2)外，Fc區包含IgG1 FC區的序列(SEQ ID NO：17)或由其組成。
在一個實施方案中，抗體具有包含與SEQ ID NO：17具有至少80%同源性的序列或由其組成的Fc區。在另一個實施方案中，抗體具有包含與SEQ ID NO：17具有至少85%同源性的序列或由其組成的Fc區。在另一個實施方案中，抗體具有包含與SEQ ID NO：17具有至少90%同源性的序列或由其組成的Fc區。在進一步的實施方案中，抗體具有包含與SEQ ID NO：17具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同源性的序列或由其組成的Fc區。
在一個實施方案中，抗體具有包含一個或多個如上所述和在實施例中的取代的Fc區。在另一個實施方案中，抗體具有包含與SEQ ID NO：59、60、61、62和63具有至少80%同一性的序列或由其組成的Fc區。
可替換地或此外，可將半胱氨酸殘基引入Fc區中，從而允許在該區中形成鏈間二硫鍵。由此產生的同二聚體抗體可具有改進的內化 能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)(Caron,P.C.et al.,1992,J Exp Med.176(4)：1191-1195and Shopes B.,1992,J Immunol.148(9)：2918-2922)。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：1具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：1具有至少85%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：1具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：1具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：2具有至少80%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：2具有至少85%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：2具有至少90%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：2具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其輕鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：19具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：19具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：19具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：19具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：20具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：20具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：20具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：20具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：23具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：23具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：23具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：23具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：25具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：25具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：25具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：25具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：27具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：27具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：27具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與 SEQ ID NO：27具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：29具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：29具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：29具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：29具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：31具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：31具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：31具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：31具有具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在一個實施方案中，抗體是如下表2中所述的序列的重鏈和輕鏈之間或由如下表2中所述的序列的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈之間的組合。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：3具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：3具有至少85%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：3具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：3具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：4具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：4具有至少85%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：4具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：4具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈 可變區。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：37具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：37具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：37具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：37具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：38具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：38具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：38具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的輕鏈包含與SEQ ID NO：38具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：41具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：41具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：41具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：41具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：43具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：43具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：43具有至少90%同 一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：43具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在一個實施方案中，抗體是如下表3中所述的序列的重鏈和輕鏈之間或由如下表3中所述的序列的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈之間的組合。
如已經提到的，為了治療目的，非常需要生成就穩定性、藥代動力學和藥效學及其功能方面同時保留它們與其特定靶標的結合親和力而言我們可以依賴的mAb。
第二方面，發明人鑒定了可用于增加均一性的熱點並減輕了化學、製造和控制(CMC)約束(liability)。這樣的分析聚焦在溶劑暴露的不想要的基序如氧化、脫醯胺、異構化、酸性裂解、糖基化以及另外的游離半胱氨酸殘基，其在計算機上或實驗上可能鑒定為潛在導致降解產物或抗體製劑的異質性。作為實例，取決於因素如pH和表面暴露，可能發生天冬醯胺和榖氨醯胺殘基的脫醯胺。天冬醯胺殘基特別容易脫醯胺化，主要當存在于序列Asn-Gly時，且在其他二肽序列如 Asn-Ala中較少。當此類脫醯胺位點，特別是Asn-Gly存在于本文所述的抗體或多肽中時，因此可能需要除去該位點，通常通過保守取代以去除所涉及的殘基之一。
如實施例1和圖3所示，發明人鑒定了mAb2(SEQ ID NO：13)的CDRH3內的至少三個氨基酸，其本身可能具有有害的後果，或因為在用於治療目的時基於先前的標準產生不利的基序。如圖3上所示，發明人在SEQ ID NO：13的位置8、12和13上分別生成至少三個mAb2的變體抗體進而抑制不需要的氨基酸或基序，所述抗體保持對其CHIKV pE2-E1抗原的結合親和力。因此，發明人生成了針對CMC標準的mAb2的變體，其在具有較少產物相關雜質的生物反應器中生產時具有較高的穩定性、較高的均一性，同時保持其靶向親和力。
因此，第二方面，本發明涉及與CHIKV結合的mAb2變體抗體及其抗原結合片段，且其可包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N，和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
在一個實施方案中，變體抗體分別包含具有與SEQ ID NO：11、12和33的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列的CDRH，且包含具有與SEQ ID NO：14、GTS和16的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列的CDRL。
對於SEQ IDNO：33,“因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸 序列”意為相比在如本發明所述的SEQ ID NO：33的位置8、12和13所設想的取代額外的氨基酸取代。
氨基酸取代可以是保守的或非保守的氨基酸取代。上表1中顯示了保守取代的實例。
在另一個實施方案中，變體抗體包含SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。在另一個實施方案中，所述變體抗體包含SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。在其他實施方案中，所述變體抗體分別包含：SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G；SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸是G；SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G；SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸是G；SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸是G；SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，且在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸是N，且在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。換言之，SEQ ID NO：33不能與SEQ ID NO：13相同。
表述“在位置X的氨基酸不是M”意為在位置X的所述氨基酸可以是每一種氨基酸但非M。相似地，表述“在位置X的氨基酸不是N”意為在位置X的所述氨基酸可以是每一種氨基酸但非N。相似地，表述“在位置X的氨基酸不是G”意為在位置X的所述氨基酸可以是每一種氨基酸但非G。作為非限制性實例，變體抗體其中所述變體包含SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，在所述位置8可包含選自下組的任何氨基酸：A、G、V、L、I、F、W、Y、S、T、N、Q、C、D、E、K、R和H。作為另一非限制性實例，變體抗體其中所述變體包含SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，在所述位置12可包含選自下組的任何氨基酸：A、G、V、L、I、F、W、Y、S、T、M、Q、C、D、E、K、R和H。作為另一非限制性實例，變體抗體其中所述變體包含SEQ ID NO：33的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G，在所述位置13可包含選自下組的任何氨基酸：A、N、V、L、I、F、W、Y、S、T、M、Q、C、D、E、K、R和H。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：33組成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2,-由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3，且其中：i.在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，或ii.在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，或iii.在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含分別具 有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i.在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，或ii.在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，或iii.在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i.在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，或ii.在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，或iii.在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G。
換而言之且如實施例1和圖3所示，發明人鑒定了抗體或其抗原結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，且進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i.在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸不是M，和/或ii.在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸不是N，和/或iii.在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸不是G，且其中所述抗體具有一種或多種下述特性：i.以小於約10nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1 靶標；ii.以小於約200nM的KD結合人FcRn；iii.以小於約600nM的KD結合人Fc RIII。
在一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約5nM、小於約4nM、3、2、1nM、小於約0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3nM或小於約0.25nM、0.20nM、0.15nM、0.1nM的結合解離平衡常數(KD)結合CHIKV pE2-E1靶標。
在另一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約200nM、小於約100nM、小於約50nM、45、40、35、30nM或小於約25nM、20、15或10nM的KD結合人FcRn。
在另一個實施方案中，根據本發明的抗體以小於約600nM、小於約500nM、400nM、300nM、小於約200nM、150、100或50nM的KD結合人Fc RIII。
與CHIKV pE2-E1靶標結合，人FcRn和人Fc RIII可舉例來說通過表面等離子體共振測定例如在37℃測量。該測定可以舉例來說如實施例1至4中所述進行。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置8的氨基酸選自下組：I、L、V、Q和N。
在另一個實施方案中，變體抗體(mAb10)或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：34組成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2, -由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置12的氨基酸選自Q、E、S、T和D。
在另一個實施方案中，變體抗體(mAb11)或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：35組成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2,-由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，變體抗體或其抗原結合片段包含具有SEQ ID NO：33的氨基酸序列的CDRH3，其中在SEQ ID NO：33位置13的氨基酸選自A、S和T。
在另一個實施方案中，變體抗體(mAb12)或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：36組成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2,-由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：56具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：56具有至少85%同一性的序列或由 其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：56具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：56具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：57具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：57具有至少85%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：57具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：57具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：58具有至少80%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：58具有至少85%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：58具有至少90%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體包含含有與SEQ ID NO：58具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成的其重鏈可變區。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：45具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：45具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：45具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與 SEQ ID NO：45具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：47具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：47具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：49具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：49具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：49具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：49具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在一個實施方案中，抗體是下表4中所述的序列的重鏈和輕鏈之間的組合，或由下表4中所述的序列的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈之間的組合。
在第三方面，發明人組合了上述的有益方面。發明人生成了mAb2的變體，其一方面在CDRH3內取代以抑制基於化學、製造和控制(CMC)約束標準不利的氨基酸或基序，另一方面改善了酸性環境中與FcRn受體的結合，同時保留與效應功能相關的Fc RIIIa結合，因為它們在其Fc區中包含至少一個氨基酸取代。
如實施例2和圖4C和4D中所述，發明人顯示其中引入其CDRH3內的取代的mAb2的變體，在pH6時當將選自下組的取代引入其Fc區時顯示與人和小鼠FcRn受體的結合增加：i.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或ii.在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸。
此外，如實施例3和圖5所述，本發明人證實，對於如上所述在其CDRH3及其Fc區內的累積了取代的抗體，與其CHIKV靶標pE2-E1的結合沒有受到影響。
如實施例4和圖6B和6D所示，發明人還證實，對於這樣的抗體，至少當位置428的亮氨酸和位置434的絲氨酸分別引入其Fc區中時，與Fc RIIIa的結合得到保留。相反，當這些抗體在位置252以酪氨酸、在位置254以蘇氨酸且在位置256以谷氨酸分別取代時Fc RIIIa 結合減少。
因此，本發明人證實了基於化學、製造和控制(CMC)約束標準在CDRH3內進行取代以抑制不利的氨基酸或基序的根據本發明的抗體在其各自的Fc區內引入的取代的有益效果。
因此，第三方面，本發明涉及與CHIKV結合的mAb2變體抗體或其抗原結合片段，其包含分別具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)且其中所述抗體或其抗原結合片段進一步包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列或具有因一個或兩個氨基酸取代而不同於那些序列的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，且其中：i. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或ii. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N，和/或iii. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G；且其中所述抗體包含含有至少一個選自下組的突變的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
第三方面，可以理解的是第二方面的任何抗體，即含有SEQ ID NO：33的CDRH的抗體可在Fc區中包含任何第一方面所述的突變，所述抗體包含具有一個選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或 ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，變體抗體(mAb13)或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：35成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2,-由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3。
和至少分別包含在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，變體抗體(mAb14)或其抗原結合片段包含：- 由序列SEQ ID NO：11組成的CDRH1,-由序列SEQ ID NO：12組成的CDRH2,-由序列SEQ ID NO：35成的CDRH3,-由序列SEQ ID NO：14組成的CDRL1,-由GTS組成的CDRL2,-由序列SEQ ID NO：16組成的CDRL3，和至少分別包含在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：51具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：51具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：51具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：51具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：53具有至少80%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：53具有至少85%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：53具有至少90%同一性的序列或由其組成。在另一個實施方案中，抗體的重鏈包含與SEQ ID NO：53具有91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的序列或由其組成。
在一個實施方案中，根據這個特定方面的抗體是下表5中所述的序列的重鏈和輕鏈之間或由下表5中所述的序列的核苷酸序列編碼的重鏈和輕鏈之間的組合。
核酸、載體和宿主細胞
本發明的另一個目的涉及核酸序列，其包含編碼本文定義的抗體、或多肽、重鏈、輕鏈或含有如本文所述的抗體或其片段(或由其組成)的片段的序列或由其組成。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含在任何合適的載體中，如質粒、粘粒、附加體、人工染色體、噬菌體或病毒載體。
術語“載體”、“克隆載體”和“表達載體”意為將DNA或RNA序列(例如外源基因)通過其導入宿主細胞中以轉化宿主並促進引入的序列表達(例如轉錄和翻譯)的運載體(vehicle)。
所以，本發明的另一個目的涉及包含如本文所述的核酸的載體。
這樣的載體可以包含調節元件，如啟動子、增強子、終止子等，以在施用於受試者時引起或直接表達所述多肽。用於動物細胞的表達載體中的啟動子和增強子的實例包括人巨細胞病毒的增強子和啟動子(Nelson,J.,1996 J.Virology 70：3207-3986)、SV40的早期啟動子和增強子(Mizukami,T.and Itoh,S.et al.,1987,J Biochem.101(5)：1307-1310)、Moloney小鼠白血病病毒的LTR啟動子和增強子(Kuwana Y.et al.,1987,Biochem Biophys Res Commun.149：960-968)、免疫球蛋白H鏈的啟動子(Mason,J.O.et al.,1985,Cell 41：479-487)和增強子(Gillies,S.D.et al.,1983,Cell 33：717-728)等。
可以使用任何用於動物細胞的表達載體，只要編碼人抗體C區的基因可被插入並表達。適當的載體的實例包括pAGE107(Miyaji,H.et al.,1990,Cytotechnology 3(2)：133-140)、pAGE103(Mizukami,T.and Itoh,S.et al.,1987,J Biochem.101(5)：1307-1310)、pHSG274(Brady,G.et al.,1984,Gene 27(2)：223-232)、pKCR(O'Hare,K.et al.,1981,Proc Natl Acad Sci USA.78(3)：1527-1531)、pSG1β d2-4-(Miyaji,H.et al.,1990,Cytotechnology 4：173-180)等。
質粒的其他實例包括包含複製起點pCEP5的複製質粒，或整合質粒，例如pUC、pcDNA、pBR等。
病毒載體的其他實例包括腺病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒和AAV載體。這樣的重組病毒可以通過本領域已知的技術產生，例如通過轉染包裝細胞或通過用輔助質粒或病毒瞬時轉染。病毒包裝細胞的典型實例包括PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞，293細胞等。用於產生這種複製缺陷型重組病毒的詳細方案可發現於例如WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中。
在一個實施方案中，本發明涉及與選自下組的序列之一具有至少80%同一性的多核苷酸：SEQ ID NO：18、21、22、24、26、28、30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54。在另一個實施方案中，本發明涉及與選自下組的序列之一具有至少85%同一性的多核苷酸：SEQ ID NO：18、21、22、24、26、28、30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54。在另一個實施方案中，本發明涉及與選自下組的序列之一具有至少90%同一性的多核苷酸：SEQ ID NO：18、21、22、24、26、28、30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54。在另一個實施方案中，本發明涉及與選自下組的序列之一具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99%同一性的多核苷酸：SEQ ID NO：18、21、22、24、26、28、 30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54。在另一個實施方案中，本發明涉及編碼如本文所述的抗體(即mAb3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)的重鏈之一或輕鏈之一或重鏈和輕鏈二者的多核苷酸。在另一個實施方案中，本發明涉及包含編碼本文所述的抗體或其抗原結合片段的序列的多核苷酸。
本發明的另一個目的涉及已經由本文所述的核酸和/或載體轉染、感染或轉化的細胞。
因此，本發明涉及產生如本文所述的抗體之一的細胞系。
術語“轉化”意為向宿主細胞引入“外源”(即外在的)基因、DNA或RNA序列，從而宿主細胞將表達引入的基因或序列以產生預期的物質，通常是由引入的基因或序列編碼的蛋白質或酶。接受和表達引入的DNA或RNA的宿主細胞已被“轉化”。
本文所述的核酸可用於從合適的表達系統產生重組抗CHIKV抗體。術語“表達系統”意為在合適的條件下的宿主細胞和相容性載體，例如用於表達由載體攜帶並導入宿主細胞的外源DNA編碼的蛋白質。
常見的表達系統包括大腸桿菌宿主細胞和質粒載體、昆蟲宿主細胞和杆狀病毒載體，以及哺乳動物宿主細胞和載體。宿主細胞的其他實例包括但不限於原核細胞(例如細菌)和真核細胞(例如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等)。具體實例包括大腸桿菌、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)或釀酒酵母屬(Saccharomyces)酵母、哺乳動物細胞系(例如Vero細胞、CHO細胞、3T3細胞、COS細胞、HEK293細胞等)以及原代或已建立的哺乳動物細胞培養物(例如由成淋巴細胞、成纖維細胞、胚胎細胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等產生)。實例包括小鼠SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、其中二氫葉酸還原酶基因(以下稱為“DHFR基因”)缺陷(Urlaub,G.et al.；1980,Proc Natl Acad Sci USA.77(7)：4216-4220)的CHO細胞、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662，以下稱為"YB2/0細胞")等。YB2/0細胞是感興趣的，因為在該細胞中表達時嵌合或人源化抗體的ADCC活性增強。
具體而言，對於人源化抗體的表達，表達載體可以是其中編碼抗體重鏈的基因和編碼抗體輕鏈的基因存在於分開的載體上的類型或兩種基因存在於同一載體上的類型(串聯型)。鑒於人源化抗體表達載體的構建簡單，易於導入動物細胞，並且動物細胞中抗體H和L鏈的表達水平平衡，通常使用串聯型人源化抗體表達載體(Shitara,K.et al.,1994,J Immunol Methods.Jan.3：167(1-2)：271-8)。串聯型人源化抗體表達載體的實例包括pKANTEX93(WO 97/10354),pEE18等。
本發明還涉及生產表達根據本發明的抗體的重組宿主細胞的方法，所述方法包括以下步驟：(i)將如上所述的重組核酸或載體體外或離體引入到感受態宿主細胞中，(ii)在體外或離體培養獲得的重組宿主細胞和(iii)，任選地，選擇表達和/或分泌所述抗體的細胞。
這種重組宿主細胞可以用於生產本文所述的抗CHIKV抗體。
因此，本發明涉及產生根據本發明的單克隆抗體的方法，其中所述方法包括以下步驟：(i)如上所述培養細胞系；(ii)純化產生的單克隆抗體；並且可選地(iii)將所述的單克隆抗體配製成藥物組合物。
產生抗CHIKV抗體的方法
本發明所述的抗CHIKV抗體可以通過本領域已知的任何技術單獨或組合來產生，如但不限於任何化學、生物、遺傳或酶技術。
瞭解所需序列的氨基酸序列，本領域技術人員可以通過生產多 肽的標準技術容易地生產所述抗體或免疫球蛋白鏈。例如，其可以使用熟知的固相方法合成，特別是使用市售的肽合成裝置(例如由Applied Biosystems,Foster City,California製造的)並按照製造商的說明合成。可替換地，抗體和免疫球蛋白鏈可以通過本領域熟知的重組DNA技術來合成。例如，這些片段可以在將編碼所需(多)肽的DNA序列併入表達載體並將該載體導入合適的真核或原核宿主中之後作為DNA表達產物獲得，所述真核或原核宿主將表達預期的多肽，隨後使用熟知的技術可將其從中分離。
具體而言，本發明進一步涉及生產抗體的方法，該方法包括以下步驟：(i)培養根據本發明的轉化的宿主細胞；(ii)表達所述抗體或多肽；和(iii)回收表達的抗體或多肽。
換而言之，本發明涉及生產抗體的方法，其包括以下步驟：(i)提供表達抗CHIKV抗體的細胞；(ii)培養所述細胞；(iii)純化所述抗體；和(iv)任選地，將所述抗體配製成藥物組合物。
產生人源化或嵌合抗體的方法涉及常規重組DNA，並且基因轉染技術在本領域中是公知的(參見Morrison,S.L.and Oi,V.T.,1984,Annu Rev Immunol 2：239-256和專利文件US 5,202,238；和US 5,204,244)。
在一個具體的實施方案中，本發明的嵌合抗體可以通過如先前所述獲得編碼鼠類VL和VH域的核酸序列來產生，通過將其插入用於具有編碼人抗體CH和人抗體CL的基因的動物細胞的表達載體構建嵌合抗體表達載體，並通過將表達載體引入動物細胞表達編碼序列。
通過常規的免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質A親和層析，陶瓷羥基磷灰石層析、混合模式層析、尺寸排阻層析等適當地將本文所述 的抗體與培養基分離。
Fab可以通過用蛋白酶如木瓜蛋白酶處理與CHIKV特異性反應的抗體來獲得。而且，Fab可以通過將編碼抗體的Fab的兩條鏈的DNA序列插入用於原核表達或用於真核表達的載體，並且將該載體引入原核或真核細胞(視情況而定)以表達Fab來產生。
F(ab')2可以通過用蛋白酶胃蛋白酶處理與CHIKV特異性反應的抗體來獲得。而且，F(ab')2可以通過經由硫醚鍵或二硫鍵結合下述Fab'產生。
Fab'可以通過用還原劑如二硫蘇糖醇處理與CHIKV特異性反應的F(ab')2來獲得。而且，Fab'可以通過將編碼抗體的Fab'鏈的DNA序列插入用於原核表達的載體或用於真核表達的載體中，並將該載體引入原核或真核細胞(視情況而定)以進行其表達產生。
scFv可以通過採取如前所述獲得CDR或VH和VL域的序列，構建編碼scFv片段的DNA，將DNA插入原核或真核表達載體，然後將表達載體引入原核或真核細胞(視情況而定)以表達scFv產生。為了生成人源化的scFv片段，可以使用稱為CDR移植的公知技術，其涉及根據本發明選擇互補決定區(CDR)，並將其移植到已知三維結構的人scFv片段框架上(參見例如WO98/45322；WO 87/02671；US5,859,205；US5,585,089；US4,816,567；EP0173494)。
針對CHIKV的單鏈抗體或VHH可以例如通過包括以下步驟的方法獲得：(a)用CHIKV或其片段免疫屬□駱駝科的哺乳動物以引發針對CHIKV的抗體(並且特別是重鏈抗體)；(b)從所述免疫的駱駝科動物獲得生物樣品，所述樣品包含針對CHIKV的重鏈抗體序列和/或VHH序列；和(c)從所述生物樣品中回收(例如分離)針對CHIKV的重鏈抗體序列和/或VHH序列。作為非限制性實例，合適的單鏈抗體或VHH也可以通過在包含重鏈抗體序列和/或VHH序列的文庫中篩選競爭與 CHIKV的pE2-E1的結合的重鏈抗體序列和/或VHH序列的文庫來獲得。
本發明抗CHIKV抗體的修飾
本發明的另一個目的涵蓋本文所述抗體的功能保守性變體。
例如，蛋白質結構中某些氨基酸可能由其他氨基酸取代而沒有明顯的活性損失。由於蛋白質的相互作用能力和性質決定了其生物學功能活性，因此可以在蛋白質序列中生成某些氨基酸取代，當然也可以在其編碼序列的DNA中製備，而獲得具有相似性質的蛋白質。因此預期可以對抗體序列或相應的編碼所述抗體的DNA序列做出改變而使其生物活性沒有明顯損失。
本領域已知，某些氨基酸可由具有相似親水指數或得分的其它氨基酸取代，並仍然產生具有相似生物活性的蛋白質，即仍獲得生物功能等價蛋白質。也可以使用成熟的技術，例如丙氨酸掃描方法，在抗體中鑒定可被取代而不顯著喪失與抗原的結合的所有氨基酸。這樣的殘基可以定性為中性的，因為它們不參與抗原結合或維持抗體的結構。這些中性位置中的一個或多個可由丙氨酸或另一個氨基酸取代，而不改變抗體的主要特徵。
如上所述，氨基酸取代通常因此基於氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。考慮幾個前述特徵的示例性取代是本領域技術人員熟知的且包括：精氨酸和賴氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；榖氨醯胺和天冬醯胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
抗體的另一類氨基酸修飾可用於改變抗體的原始糖基化模式，即通過缺失抗體中發現的一個或多個碳水化合物部分和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位點。三肽序列天冬醯胺-X-絲氨酸和 天冬醯胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)的存在產生潛在的糖基化位點。通過改變氨基酸序列使其含有一個或多個上述三肽序列(用於N-連接的糖基化位點)，可方便地實現向抗體添加或缺失糖基化位點。
另一種類型的共價修飾包括將糖苷化學或酶促偶聯到抗體上。這些方法是有利的，因為它們不需要在具有針對N-或O-聯糖基化的糖基化能力的宿主細胞中產生抗體。根據所使用的偶聯模式，糖可附著至(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離羧基，(c)游離巰基如半胱氨酸的那些，(d)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸那些，(e)芳香族殘基如苯丙氨酸或酪氨酸那些，(f)榖氨醯胺的醯胺基團。例如，這些方法描述於WO87/05330。
存在於抗體上的任何碳水化合物部分的去除可以通過化學或酶的方式來完成。化學去糖基化需要將抗體暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。該處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的大部分或全部糖的切割，同時使抗體保持完整。化學去糖基化由Sojahr,H.et al.和Edge,A.S.et al.(1981,Anal Biochem.118(1)：131-137)描述(1987,Arch Biochem Biophys.259(1)：52-57)。抗體上碳水化合物部分的酶促切割可以通過使用多種內切糖苷酶和外切糖苷酶實現如Thotakura,NR.et al.所述(1987,Methods Enzymol 138：350-359)。
抗體的另一種類型的共價修飾包括以美國專利號4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述的方式將抗體與多種非蛋白質聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)中的一種連接。
藥物組合物
本發明所述的抗CHIKV抗體可與藥物上可接受的賦形劑和任選緩釋基質如生物可降解的聚合物組合以形成治療組合物。
因此，本發明還涉及包含本發明的抗CHIKV抗體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。
本發明還涉及用作藥物的根據本發明的抗體。
“藥物上”或“藥物上可接受的”指適當時當對哺乳動物尤其是人施用時不產生不利的、過敏的或其他不良反應的分子實體和組合物。藥學上可接受的載體或賦形劑是指任何類型的無毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、封裝材料或製劑助劑。
藥物組合物的形式、施用途徑、劑量和方案自然取決於待治療的病症、疾病的嚴重程度、患者的年齡、體重和性別等。
可以配製藥物組合物用於局部、口服、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌內、皮下或眼內施用等。
具體而言，藥物組合物含有對於能夠被注射的製劑而言藥學上可接受的載體。這些具體可以是等滲、無菌、鹽水溶液(磷酸一鈉或磷酸氫二鈉，鈉、鉀、鈣或鎂氯化物等或這些鹽的混合物)，或幹的特別是冷凍乾燥的組合物，取決於情況，添加無菌水或生理鹽水時允許組成可注射的溶液。
用於施用的劑量可以作為多種參數的函數進行調整，特別是作為根據所使用的施用方式、相關病理或者可替換的所需的治療持續時間的函數。
為了製備藥物組合物，可以將有效量的抗體溶解或分散在藥學上可接受的載劑或水性介質中。
在一個實施方案中，本發明涉及藥物組合物，其包含預防或治療上有效的量的如本文所述的與CHIKV結合的抗體或其抗原結合片段，和藥學上可接受的載劑。
適於可注射使用的藥物形式包括無菌水溶液或分散液；和用於無菌注射溶液或分散液臨場製備的無菌粉末。在所有情況下，形式必須是無菌的，並且必須以存在易注射性的程度流動。在生產和儲存條件下必須穩定，並且必須防止微生物如細菌和真菌等的污染進行保存。
載體可以是溶劑或分散介質包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物。適當的流動性可例如通過使用包衣如卵磷脂，在分散液的情況中通過保持所需粒徑和通過使用表面活性劑、穩定劑、冷凍保護劑或抗氧化劑來保持。可以通過抗菌劑和抗真菌劑帶來預防微生物的作用。在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。
通過將所需量的活性化合物與上面列舉的幾種其它成分(如果需要)一起摻入合適的溶劑中，然後過濾滅菌來製備無菌可注射溶液。通常，通過將多種無菌的活性成分摻入含有基本分散介質和來自上面列舉的所需其它成分的無菌載體中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情況下，常用的製備方法包括真空乾燥和冷凍乾燥技術，其從其先前無菌過濾的溶液產生活性成分加任何額外的所需成分的粉末。
在配製時，溶液將以與劑量配方相容的方式並以該治療有效的量施用。該製劑容易以多種劑型施用，例如上述可注射溶液的類型，但也可以採用藥物釋放膠囊等。
對於在水性溶液中的腸胃外施用，例如，如果需要，溶液應適當地緩衝，並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定的水性溶液特別適用於靜脈內、肌肉內、皮下和腹膜內施用。就此而言，根據本公開內容，可以採用的無菌水性介質將是本領域技術人員已知的。例如，一個劑量可以溶解在1mL的等滲NaCl溶液中，並 且加入到1000mL的皮下注射液中，或在建議的注入部位注射，(參見例如，"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition,pages 1035-1038 and 1570-1580)。劑量的一些變化將根據所治療的受試者的病況而必然發生。無論如何，負責施用的人員將確定個體受試者的適當劑量。
可以將抗體配製在治療混合物中以每劑量包含約0.01至100毫克等。
根據某些實施方案，本文所述的單次或多次劑量的抗CHIKV抗體可以在限定的時間過程中施用至受試者。
根據該方面的方法包括向受試者依次施用多劑量的抗CHIKV抗體。如本文使用的“順序施用”指每個劑量的CHIKV抗體在不同的時間點例如在通過預先確定的時間間隔(例如、小時、天、周或月)分隔的不同日施用至受試者。本發明包括方法，其包括向受試者施用單個初始劑量的CHIKV抗體，隨後一個或多個次級劑量的CHIKV抗體和隨後任選的一個或多個三級劑量的CHIKV抗體。
術語“初始劑量”、“次級劑量”和“三級劑量”指CHIKV抗體的施用時間序列。因此，“初始劑量”是在治療方案開始時施用的劑量(也稱為“基線劑量”)；“次級劑量”是在初始劑量之後施用的劑量；而“三級劑量”是在二級劑量之後施用的劑量。初始，二級和三級劑量都可以含有相同量的CHIKV抗體，但通常就施用頻率而言可能彼此不同。然而，在一些實施方案中，在治療過程中，在初始、二級和/或三級劑量中含有的CHIKV抗體彼此不同(例如酌情上調或下調)。在一些實施方案中，在治療方案開始時作為"加載劑量"施用兩個或多個(例如2、3、4或5)劑量，隨後以較少的頻率基礎施用後續的劑量(例如"維持劑量")。
治療方法和用途
另一方面，本發明提供方法，其用於在有需要的患者中預防中CHIKV感染，或用於治療罹患CHIKV感染的患者，或用於改善與CHIKV感染相關的至少一種症狀或併發症，所述方法包括對有需要的患者施用如本文所述的一種或多種抗體或其抗原結合片段，或含有本文所述的一種或多種抗CHIKV抗體或其片段的藥物組合物，進而預防CHIKV感染或改善、減輕或減少嚴重性和/或持續時間中與CHIKV感染相關的至少一種症狀或併發症。
在一些實施方案中，該方法減少與CHIKV感染相關的病理學。
在一些實施方案中，所述方法減輕與急性、急性後或慢性多關節炎/多關節痛/CHIKV相關的關節痛、發熱、皮疹、肌痛和/或疲勞相關的症狀。在一個實施方案中，該方法減少與CHIKV感染相關的受試者的疼痛。在一個實施方案中，該抗體用於治療/減少與CHIKV感染相關的症狀，其可交叉反應並治療與其他α病毒感染相關的症狀。在一個實施方案中，該抗體用於治療/減少與CHIKV感染相關的急性、急性後和慢性多關節炎/多關節痛階段。
這些其他α病毒的實例包括但不限於O’nyong Nyong(ONNV)、羅斯河(Ross River,RRV)、巴馬森林(Barmah Forest,BFV)、西部馬腦炎(Western Equine Encephalitis,WEEV)、塞姆利基森林(Semliki Forest,SFV)、辛德畢斯(Sindbis,SINV)、東部馬腦炎(Eastern Equine Encephalitis,EEEV)、委內瑞拉馬腦炎(Venezuelan Equine Encephalitis,VEEV)。治療或減少的症狀可包括但不限於疼痛、發熱等。
在另一個實施方案中，提供治療具有基孔肯雅病毒感染的受試者或減少處於接觸基孔肯雅病毒風險的受試者感染的可能性的方法，包括向所述受試者遞送根據本發明的與CHIKV結合的抗體或抗原結合 片段，所述抗體或抗原結合片段包含分別來自表2至5所列抗體的CDR序列。
在另一個實施方案中，提供治療具有基孔肯雅病毒感染的受試者或減少處於接觸基孔肯雅病毒風險的受試者感染的可能性的方法，包括向所述受試者遞送分別列於表2至5的與CHIKV結合的抗體。在另一個實施方案中，表2至5列出的抗體中的一種、兩種或幾種抗體可以組合。在另一個實施方案中，抗體可以編碼變體抗體，其包含具有可變序列的重鏈和輕鏈，所述可變序列與表2至5列出的抗體之一的可變序列具有70%、80%、90%或95%同一性。抗體片段可以是重組的ScFv(單鏈片段可變)抗體、Fab片段、F(ab')2片段或Fv片段。抗體可以是IgG和/或嵌合抗體。抗體或抗體片段可在感染前或感染後施用。遞送可包括抗體或抗體片段施用或以編碼抗體或抗體片段的RNA或DNA序列或載體基因遞送。
如上文所述，本發明的方法包括對需要預防或治療CHIKV感染/症狀的受試者施用一種如上文所述的選自下組的列於表2、3、4和5抗體：mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13和mAb14。
如上文所述，本發明的方法包括對需要預防或治療CHIKV感染/症狀的受試者施用一種如本文所述的選自下組的抗體：mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb13和mAb14。在另一個實施方案中，本發明的方法包括對需要預防或治療CHIKV感染/症狀的受試者施用一種如本文所述的選自下組的抗體：mAb7和mAb14。
另一方面，本發明涉及如本文所述的用作藥物用途的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉及用於治療CHIKV感染用途的如本文所述的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉及用於治療CHIKV相關關節痛用途的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉 及用於治療與CHIKV感染相關的急性、急性後和慢性多關節炎/多關節痛階段用途的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉及用於治療與急性、急性後或慢性多關節炎/多關節痛/CHIKV相關的關節痛、發熱、皮疹、肌痛和/或疲勞有關的症狀用途的單克隆抗體。在一個實施方案中，本發明涉及用於減少與CHIKV感染相關的受試者的疼痛的用途的單克隆抗體。另一方面，本發明涉及用於預防CHIKV感染用途的單克隆抗體。在另一個實施方案中，本發明涉及選自如表2、3、4和5中所列的mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb10、mAb11、mAb12、mAb13和mAb14的單克隆抗體用於治療如上文所列的感染和症狀的用途。在另一個實施方案中，本發明涉及選自如表2、3和5中所列的mAb6、mAb7、mAb8、mAb9、mAb13和mAb14的單克隆抗體用於治療如上文所列的感染和症狀的用途。在另一個實施方案中，本發明涉及選自如表2和5中所列的mAb7和mAb14的單克隆抗體用於治療如上文所列的感染和症狀的用途。
另一方面，本發明的單克隆抗CHIKV抗體或其抗原結合片段與一種或多種額外的治療劑組合可用於預防或治療CHIKV感染或相關症狀。如本文所用的表述“與...組合”意為額外的治療劑在包含本發明所述的抗CHIKV抗體的藥物組合物之前、之後或同時施用。術語“與...組合”還包括抗CHIKV抗體和第二治療劑的順序或同時施用。
例如，當在包含抗CHIKV抗體的藥物組合物“之前”施用時，額外的治療劑可以在施用包含抗CHIKV抗體的藥物組合物之前約72小時、約60小時、約48小時、約36小時、約24小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約2小時、約1小時、約30分鐘、約15分鐘或者大約10分鐘之前施用。當在包含抗CHIKV抗體的藥物組合物“之後”施用時，額外的治療劑可以在施用包含抗CHIKV抗體的 藥物組合物之後約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或約72小時後施用。“同時”施用或與包含抗CHIKV抗體的藥物組合物一起意為在施用包含抗CHIKV抗體的藥物組合物不到5分鐘內(在施用之前、之後或同時)以另外的劑型向受試者施用額外的治療劑，或作為包含額外的治療劑和抗CHIKV抗體的單一組合劑量製劑施用至受試者。
組合療法可包括本文所述的抗CHIKV抗體和可有利地與抗體或與抗體的生物學活性片段組合的任何額外的治療劑。
例如，可以採用第二或第三治療劑來幫助減輕與CHIKV感染相關的症狀，所述症狀包括但不限於急性、急性後或慢性多發性關節炎多關節痛/CHIKV相關的關節痛、發熱、皮疹、肌痛和/或疲勞。例如，可採用第二或第三治療劑來幫助減輕與CHIKV感染相關的疼痛。
診斷用途
另一方面，本發明所述的單克隆抗體或抗原結合片段用於檢測樣品中CHIKV抗原的存在或不存在。在一個實施方案中，將本文所述的抗體用作測定的組分，所述測定包括使樣品與如本文所述的抗體或抗原結合片段接觸的步驟，檢測單克隆抗體或抗原結合片段與CHIKV抗原結合的步驟，其中結合的檢測指示CHIKV抗原的存在或不存在CHIKV抗原結合的檢測指示CHIKV抗原的缺失。
具體而言，本文所述的單克隆抗體或抗原結合片段既用作治療劑的組分，也用作診斷測定的組分。
在一個實施方案中，該抗體旨在用於體外或離體使用。例如，使用本文所述的抗CHIKV抗體，CHIKV可以在從受試者獲得的生物樣品中在體外或離體檢測。
本發明進一步涉及檢測受試者中CHIKV感染的存在的體外或離體方法，包括以下步驟：i.使受試者的生物樣品與抗CHIKV抗體接觸，特別是在足以使抗體與所述生物樣品形成複合物的條件下，ii.測量與所述生物樣品結合的抗體水平，iii.通過將測量的結合抗體水平與對照進行比較來檢測CHIKV感染的存在，與對照相比增加的結合抗體水平指示CHIKV感染。
本發明還涉及確定由CHIKV感染的患者對靶向CHIKV的治療劑特別是如本文所述的抗CHIKV抗體或其抗原結合片段的易感性的體外或離體方法，該方法包括步驟：i.使CHIKV感染的患者的生物樣品與抗CHIKV抗體或其抗原結合片段接觸，特別是在足以使抗體與所述生物樣品形成複合物的條件下，ii.測量與所述生物樣品結合的抗體水平，iii.將測量的與所述生物樣品結合的抗體水平與結合對照的抗體水平進行比較，其中與對照相比與所述生物樣品結合的抗體水平增加表明患者對靶向CHIKV的治療劑敏感。
在上述方法中，所述對照可以是相同類型的正常的、未感染的生物樣品，或者被確定為代表相同類型的正常生物樣品中的抗體結合水平的參考值。
本發明進一步涉及監測CHIKV感染療法的有效性的體外或離體方法，其包括以下步驟：i.使經歷CHIKV感染療法的受試者的生物樣品與如本文所述的抗體或其抗原結合片段接觸，特別是在足以使所述抗體與所述生物樣品形成複合物的條件下， ii.測量與所述生物樣品結合的抗體水平，iii.將測量的結合抗體水平與結合於對照的抗體水平進行比較，其中與對照相比與所述生物樣品結合的抗體水平下降表明所述CHIKV感染治療的有效性。
在所述方法中，與對照相比與所述生物樣品結合的抗體水平增加表明所述CHIKV感染治療的無效性。
所述對照具體是與在CHIKV感染療法過程中提交分析的生物樣品相同類型的生物樣品，但其在時間上是在之前從受試者獲得的。
在一個實施方案中，可以使用可檢測的分子或物質如熒光分子、放射性分子或本領域已知的任何其他(直接或間接地)提供信號的標記物標記如本文所述的抗CHIKV抗體或其抗原結合片段(例如E2結合片段)。
如本文使用的關於根據本發明的抗體的術語“標記的”旨在涵蓋通過偶聯(即物理連接)可檢測物質如放射性試劑或熒光團(例如異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))直接標記抗體，以及通過與可檢測物質的反應性間接標記多肽。
可以在根據本發明的CHIKV診斷測定中使用的“樣品”或“生物樣品”包括在正常或病理條件下可從患者獲得的任何組織或液體樣品。
生物樣品包括但不限於生物來源的血液和其他液體樣品、實體組織樣品如活檢標本或組織培養物或由其衍生的細胞及其後代。因此，生物樣品涵蓋臨床樣品、培養細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物液體和組織樣品。
試劑盒
本發明還提供了包含至少一種抗CHIKV抗體或抗原結合片段的試劑盒。含有抗體或抗原結合片段的試劑盒可用於檢測CHIKV，或用於治療或診斷測定中。試劑盒可含有與固體支持物偶聯的多肽或抗體， 例如組織培養板或珠(例如瓊脂糖珠)。可以提供含有用於在體外檢測和定量CHIKV的抗體的試劑盒，例如在ELISA或Western印跡中。這種用於檢測的抗體可以配備標記物如熒光標記或放射性標記物。
在一個實施方案中，本發明涉及試劑盒，其包含至少一種如本文所述的抗體和任選的包裝材料和任選包含在所述包裝材料內的標簽或包裝插頁，其表明本文所述的所述抗體對於預防/治療CHIKV感染或CHIKV感染相關症狀有效。
序列簡述
SEQ ID NO：1顯示“mAb1”抗體的VH序列。
SEQ ID NO：2顯示“mAb1”抗體的VL序列。
SEQ ID NO：3顯示“mAb2”抗體的VH序列。
SEQ ID NO：4顯示“mAb2”抗體的VL序列。
SEQ ID NO：5-7顯示“mAb1”抗體的CDR1H、CDR2H、CDR3H的序列。
SEQ ID NO：8顯示“mAb1”抗體的CDR1L的序列。
SEQ ID NO：9顯示重組pE2-E1重組靶標“His-標簽CHIKV E2 LR2006”的序列。
SEQ ID NO：10顯示“mAb1”抗體的CDR3L的序列。
SEQ ID NO：11-13顯示“mAb2”抗體的CDR1H、CDR2H、CDR3H的序列。
SEQ ID NO：14顯示“mAb2”抗體的CDR1L的序列。
SEQ ID NO：15顯示重組pE2-E1重組靶標“His-標簽CHIKV E2 SL15649”的序列。
SEQ ID NO：16顯示“mAb2”抗體的CDR3L的序列。
SEQ ID NO：17顯示無本發明所述取代的IgG1 Fc區的序列且示 於圖1中。
SEQ ID NO：18顯示IgG1 Fc區的核酸序列。
SEQ ID NO：19顯示“mAb1”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：20顯示“mAb1”抗體的LC序列。
SEQ ID NO：21顯示“mAb1”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：22顯示“mAb1”抗體的LC核酸序列。
SEQ ID NO：23顯示“mAb3”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：24顯示“mAb3”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：25顯示“mAb4”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：26顯示“mAb4”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：27顯示“mAb5”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：28顯示“mAb5”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：29顯示“mAb6”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：30顯示“mAb6”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：31顯示“mAb7”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：32顯示“mAb7”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：33顯示“mAb2”抗體的CDRH3的共有序列。
SEQ ID NO：34顯示“mAb10”抗體的CDRH3的序列。
SEQ ID NO：35顯示“mAb11”抗體的CDRH3的序列。
SEQ ID NO：36顯示“mAb12”抗體的CDRH3的序列。
SEQ ID NO：37顯示“mAb2”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：38顯示“mAb2”抗體的LC序列。
SEQ ID NO：39顯示“mAb2”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：40顯示“mAb2”抗體的LC核酸序列。
SEQ ID NO：41顯示“mAb8”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：42顯示“mAb8”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：43顯示“mAb9”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：44顯示“mAb9”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：45顯示“mAb10”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：46顯示“mAb10”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：47顯示“mAb11”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：48顯示“mAb11”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：49顯示“mAb12”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：50顯示的HC核酸序列。
SEQ ID NO：51顯示“mAb13”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：52顯示“mAb13”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：53顯示“mAb14”抗體的HC序列。
SEQ ID NO：54顯示“mAb14”抗體的HC核酸序列。
SEQ ID NO：55顯示如圖1所示的IgG1恒定區的序列。
SEQ ID NO：56顯示“mAb10”抗體的VH序列。
SEQ ID NO：57顯示“mAb11”抗體的VH序列。
SEQ ID NO：58顯示“mAb12”抗體的VH序列。
SEQ ID NO：59顯示如圖2所示根據本發明在位置434具有丙氨酸的IgG1 Fc區的序列。
SEQ ID NO：60顯示如圖2所示根據本發明在位置307、380和434分別具有丙氨酸的IgG1 Fc區的序列。
SEQ ID NO：61顯示如圖2所示根據本發明分別在位置250具有榖氨醯胺且在位置428具有亮氨酸的IgG1 Fc區的序列。
SEQ ID NO：62顯示如圖2所示根據本發明分別在位置252具有酪氨酸、在位置254具有算算且在位置256具有谷氨酸的IgG1 Fc區的序列。
SEQ ID NO：63顯示如圖2所示根據本發明分別在位置428具有亮 氨酸且在位置434具有絲氨酸的IgG1 Fc區的序列。
圖1：CH1、鉸鏈、CH2和CH3區的人IgG1重鏈氨基酸序列；鉸鏈和CH2和CH3區的部分組成Fc區。氨基酸殘基根據如Kabat中所述的EU指數編號(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th,Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)。本發明所述Fc區的取代殘基在方框中。
圖2：IgG1 Fc區序列比對：SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：59；SEQ ID NO：60；SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63。
圖3：mAb2的CDRH3內的突變對E2-E1靶向結合的作用，產生所述突變以消除潛在的脫氨基和氧化基序。每個突變體的比較結果一式二份顯示。
圖4：mAb1和mAb2的Fc區中的取代分別對FcRn結合的作用。在pH6.0,mAb1(圖4A)和mAb2(圖4C)對人FcRn以及mAb1(圖4B)和mAb2(圖4D)對小鼠FcRn的比較性結果一式二份顯示。
圖5：mAb1和mAb2的Fc區中的突變對E2-E1靶向結合的作用。一式二份分別顯示了源自毒株LR2006(圖5A)和SL15649(圖5B)的E1-E2抗原的結果。
圖6：mAb1和mAb2的Fc區中的取代分別對Fc RIIIa結合的作用。一式二份分別顯示了mAb1(圖6A)和mAb2(圖6B)對人Fc RIIIa高親和力受體(Fc RIIIaV158)以及對人Fc RIIIa低親和力受體(Fc RIIIaF158)的結合結果(mAb1為圖6C且mAb2為圖6D)。
圖7：使用標準空斑減少測定的mAb1和mAb7中和活性。MAb1和mAb7以超效活性在全部三種基因型(即亞裔(圖7A)、中非東非和南非裔(圖7B)和西非裔(圖7C))中抑制基孔肯雅病毒。
圖8：小鼠中的單克隆抗體預防研究。以250μg/小鼠在CHIKV感染前2、7或14天給予的mAb1和mAb7對DBA/1J小鼠右後腿中接種後第3天病毒滴度的影響。將病毒滴度繪製為50%細胞培養感染劑量(CCID50)/g組織。
圖9：小鼠中的單克隆抗體暴露後療法。在接種後3天(3dpi)單次腹膜內施用固定250μg劑量的mAb2、7、11和14後在接種後5天(5dpi)右後腿中的病毒滴度(圖9A)。在3dpi單次施用多個劑量(10至250μg/小鼠)後在5dpi mAb7和mAb14劑量範圍對右後腿中病毒滴度的影響(圖9B)。病毒滴度繪製為50%細胞培養感染劑量(CCID50)/g組織。上面的虛線是組織勻漿物的平均檢測極限。
圖10：單克隆抗體在非人靈長類動物體內的藥代動力學。通過靜脈內(IV)推注將2.5mg/kg mAb1和mAb7施用入雄性食蟹猴(Macaca Fascicularis)的藥代動力學的比較。
抗CHIKV抗體的氨基酸序列使用Antibody Inspector(內部開發的用於抗體序列分析的工具)與3D模型/結構分析工具(Biovia Discovery Studio Suite)結合來分析，以篩選針對開發的潛在的問題和約束。約束分析集中在溶劑暴露的不需要的基序如氧化、脫醯胺、異構化、酸性切割、糖基化和額外的游離Cys。所有暴露於溶劑中的約束的優先級都是根據他們的位置來決定的(CDR、可變域框架、恒定域)。建議了最小化序列中發現的約束的突變。
合成密碼子優化的基因片段並克隆到哺乳動物表達載體中。根據製造商的方案使用Expi293F表達系統(Thermo Fisher Scientific)進行轉染。收集的條件培養基樣品通過蛋白A柱純化，洗脫級分緩衝交換到pH7.4的Gibco PBS中。
結合分析：抗原結合、FcRn與人和小鼠的結合、Fc RIIia結合：使用Biacore T200儀器通過表面等離子體共振測量重組CHIKV E2抗原結合。CM5系列S傳感器芯片經由Biacore提供的標準胺偶聯程序使用飽和水平的抗四His抗體(Qiagen)固定。重組的CHIKV E2抗原即His-標簽CHIKV E2 LR2006(SEQ ID NO：9)和His-標簽CHIKV E2 SL15649(SEQ ID NO：15)重組蛋白構建體基於Voss et al.,2010(Voss JE et al 2010,Nature 468：709-712)，由HEK293細胞瞬時表達並從其純化(Pal et al,2013,PLoS Pathog9,e1003312；Smith et al,2015,Cell Host & Microbe 18：86-95)。基本上，將這些構建體設計為信號肽-E3_E2-(G4S)4-E1-His8，但在成熟形式中，信號肽和E3被切割掉。His-標簽CHIKV E2 LR2006和His-標簽CHIKV E2 SL15649重組抗原在HBS-EP+運行緩衝液中稀釋並注射30秒進而實現10-30RU的捕獲水平。將測試抗體從30nM至1.1nM進行3倍系列稀釋。低親和力結合物從900nM系列稀釋。將每種抗體以65μL/分鐘的流速使用5或15分鐘解離注射到捕獲的抗原和對照表面3min，一式兩份。使用甘氨酸pH 1.5再生表面。用Biacore T200評估軟件使用1：1結合模型計算動力學常數。
為了測量FcRn結合，使用胺化學將CM5系列S傳感器芯片直接以重組人FcRn或小鼠FcRn固定，從而分別實現1700RU和800RU的表面密度。將測試抗體在50mM磷酸鈉、150mM NaCl、0.05%表面活性劑P20,pH6.0或pH7.4中稀釋至200和50nM。注射稀釋的樣品3分鐘，然後以10μL/分鐘在緩衝液中解離5分鐘，一式兩份。用硼酸鹽pH 8.5緩衝液再生表面。
使用Biacore 3000儀器測量Fc RIIIa結合。CM5芯片經由胺偶聯以飽和水平的抗HPC4抗體固定。在分析中比較了重組人Fc RIIIa的兩種多態性(Val158和Phe158)。將重組人HPC4-標簽Fc RIIIa-V158和Fc RIII-F15稀釋至包含2mM CaCl2的HBS-P+緩衝液中並以10μL/分鐘分別注射至Fc2或Fc4達30秒以實現10-40RU的捕獲水平。將樣品稀釋至900、300和100nM並注射2分鐘，然後以30μL/分鐘在緩衝液中解離3分鐘，一式兩份。以20mM/分鐘在HBS-EP+緩衝液中使用10mM EDTA再生表面3分鐘。
結果
實施例1：在CDRH3中具有取代的mAb2的抗原結合
結果在圖3中給出。在與源自CHIKV毒株LR2006的CHIKV pE2-E1抗原的結合上測量了引入以消除潛在脫醯胺基和氧化基序的mAb2的CDRH3內突變的影響。分別測量下述結合：- mAb2及分別在其CDRH3的位置8包含異亮氨酸、在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺和CDRH3的位置13包含丙氨酸的其衍生的變體mAb10、mAb11和mAb12，以及在其CDRH3的位置8包含丙氨酸的變體和包含上文所列那些中兩種取代的不同組合的變體。
為了消除潛在的脫氨基和氧化基序而生成的七個突變體中，僅在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺的mAb11(mAb2 N108Q)保留與親本mAb等同的靶標結合親和力。值得注意的是，在其CDRH3的位置8包含異亮氨酸的mAb10(mAb2M104I)和在其CDRH3的位置13包含丙氨酸的mAb12(mAb2G109A)呈現中間概況；雙突變體以及在其CDRH3的位置8包含丙氨酸的變體(mAb2 M104A)喪失了其靶標結合親和力。
實施例2：FcRn結合
結果在圖4中給出。在pH6.0測量了下述與人FcRn(圖4A和4C)和與小鼠(圖4B和4D)的結合：- mAb1和分別在其Fc區中在位置434包含丙氨酸、在位置307、380和434分別包含丙氨酸、在位置250包含榖氨醯胺且在位置428包含亮氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸和在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸的mAb3、mAb4、mAb5、mAb6和mAb7。
-mAb2和分別在其Fc區中在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸，在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置 252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺的mAb8、mAb9、mAb11、mAb13和mAb14。
全部突變體顯示增加的FcRn結合親和力，這預期導致增加的半衰期並因此導致在抗CHIKV療法中對其有效性的積極影響。當與其他突變體比較時，分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸和分別在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸和在位置256包含谷氨酸的突變體顯示最強的結合。
實施例3：Fc區取代對mAb1和mAb2靶標結合的影響
結果在圖5給出。測量了Fc區中取代對mAb1和mAb2分別源自CHIKV毒株LR2006(圖5A)和SL15649(圖5B)的CHIKV pE2-E1抗原結合的影響。分別測量了下述結合：- mAb1和分別在其Fc區中在位置434包含丙氨酸、在位置307、380和434分別包含丙氨酸、在位置250包含榖氨醯胺且在位置428包含亮氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸和在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸的mAb3、mAb4、mAb5、mAb6和mAb7。
- mAb2和分別在其Fc區中在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸，在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺的mAb8、mAb9、mAb11、mAb13和mAb14。
Fc區中增強了mAb1和mAb2的FcRn結合的取代中沒有一個影響與CHIKV靶向的pE2-E1抗原的結合。
實施例4：Fc RIIIa結合
結果在圖6中給出。分別測定mAb1和mAb2的Fc區中的取代對Fc RIIIa的結合的影響。FC RIIa(CD16a)由NK和巨噬細胞表達，能夠誘導巨噬細胞的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和細胞因子釋放。
結合結果顯示的是mAb1(圖6A)和mAb2(圖6B)對人Fc RIIIa高親和力受體(Fc RIIIaV158)和mAb1(圖6C)和mAb2(圖6D)分別對人Fc RIIIa低親和力受體(Fc RIIIaF158)。
分別測量了下述的結合：- mAb1和分別在其Fc區中在位置434包含丙氨酸、在位置307、380和434分別包含丙氨酸、在位置250包含榖氨醯胺且在位置428包含亮氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸和在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸的mAb3、mAb4、mAb5、mAb6和mAb7。
- mAb2和分別在其Fc區中在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸、分別在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸，在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置252包含酪氨酸、在位置254包含蘇氨酸且在位置256包含谷氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺、在位置428包含亮氨酸且在位置434包含絲氨酸以及在其CDRH3的位置12包含榖氨醯胺的mAb8、mAb9、mAb11、mAb13和mAb14。
在增強FcRn結合的mAb1和mAb2的Fc區中的取代中，在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸導致 Fc RIIIa結合親和力降低，與具有未取代的Fc區的mAb1或mAb2相比，這對細胞介導的效應功能和抗CHIKV療法具有負面影響。其他突變如在位置434的丙氨酸，分別在位置307、380和434的丙氨酸，在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸保持對Fc RIIIa的結合親和力。
分別包含在位置434的丙氨酸、在位置307、380和434的丙氨酸、或在位置250的榖氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸保留與效應功能相關的Fc RIIIa結合，但在位置252的酪氨酸，在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸並沒有。
因此，包含在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸的mAb1或mAb2給出最好的FcRn結合，同時保留與效應功能相關的Fc RIIIa結合。
實施例5：使用標準空斑減少測定的mAb中和活性
體外測試了MAb1、mAb7和mAb CTR(抗溶酶體rhIgG對照抗體)針對代表三個CHIKV譜系(亞洲、中非東非和南非(ESCA)和西非譜系)的三種不同的CHIKV的原型毒株(加勒比地區、留尼汪島(LR)和37997毒株)。
將設定量的病毒與等體積的在PBS或稀釋劑中稀釋的抗體混合。將混合物在37℃溫育2小時。然後將混合物添加到6孔平板中的融合單層vero細胞中。溫育2小時後，在DMEM-5%中將平板與CMC重 疊。注射福爾馬林48小時後將板固定，然後用亞甲藍染料染色。對斑塊進行計數，並在Prism-Graph Pad中進行數據分析以測定EC50。
結果在下表8以及圖7A至7C給出。MAb1和mAb7以超強效活性抑制來自全部三個基因型的病毒(mAb1的EC50值<10ng/mL且mAb7<1ng/mL)，如分別在圖7A、7B和7C中所示的亞洲、中非東非和南非(ESCA)和西非CHIKV譜系。將抗溶酶體抗體(mAb CTR)用作非特異性陰性對照。
實施例6：小鼠中的體內保護研究
嚴格按照美國國立衛生研究院的實驗動物護理和使用指南中的建議進行DBA1/J小鼠模型的體內研究。該方案得到了美國國立過敏和感染研究所(NIAID)的動物管理和使用委員會的批准。在NIAID動物研究委員會的批准下，在A-BSL3設施中進行感染實驗。
使用CHIKV-LR2006，朝腳踝右後足墊中對7-8周齡的DBA/1J小鼠皮下接種0.05ml。對於治療性研究，將單劑量的重組人IgG抗 CHIKV單獨的mAb以所述劑量通過腹膜內途徑在CHIKV感染後3天使用105.5 CCID50/0.1ml的CHIKV-LR2006在腳墊中皮下接種施用。在感染後5天監測感染部位的病毒滴度。對於預防性研究，將重組人IgG抗CHIKV mAb通過腹膜內注射在以105.5 CCID50/0.1ml的CHIKV-LR2006在足墊中皮下感染前2、7或14天施用。在感染後3天監測感染部位的病毒滴度。
MAb的體內預防
以單次250μg劑量(~12.5mg/kg)的重組hIgG抗CHIKV mAb(mAb1、mAb7)或抗溶酶體同型對照mAb(mAbCTR)在以CHIKV-LR2006皮下感染前2、7或14天預處理小鼠。在接種後3天在右後腿中全部以同型對照mAb處理的小鼠呈現高病毒滴度(CCID50/g組織)(圖8)。在感染前不同的時間(-2至-14天)使用mAb7和mAb1預處理完全在注射部位保護了DBA1/J-小鼠免於病毒負擔，因為右後腿中各自的病毒水平與來自SHAM-PBS組的未感染小鼠相當。
體內的MAb暴露後療法
朝腳踝右後足墊中通過0.05ml皮下接種具有105.5 CCID50/0.1ml的CHIKV-LR的7-8周大的DBA/1J小鼠。在CHIKV感染後3天，通過腹膜內途徑施用單次250μg劑量的單獨的mAb(mAb1、mAb2、mAb7、mAb11或mAb14)。在感染後5天監測注射部位的病毒滴度。在CHIKV感染的小鼠模型中，所有測試的mAb展現出相同的效力以中和組織中的病毒負荷(圖9A)。在劑量滴定研究中進一步表徵MAb7和mAb14。為該目的，使用105.5 CCID50/0.1ml的CHIKV-LR2006朝腳踝右後足墊中通過0.05ml皮下接種DBA1/J小鼠。以10、25、50、100和250μg的劑量(~0.5、1、2.5、5、12.5mg/kg)通過單次腹膜內 注射在3dpi給予MAb7或mAb14。主要結果是5dpi病毒攻擊部位的後肢中的病毒滴度。在CHIKV-感染的DBA/1J小鼠中mAb7以劑量依賴的方式減少關節病毒滴度(圖9B)。從50至250μg劑量觀察到顯著減少，其中在最高劑量達到最大效果。無論劑量如何，mAb14均顯著降低病毒滴度，但在測試條件下未觀察到劑量效應。
實施例7：非人靈長類中Mab的藥代動力學
MAb1和mAb7通過靜脈內(IV)推注2.5mg/kg施用至雄性食蟹猴(Macaca Fascicularis)。接受mab1和mab7的動物是不同的(兩個獨立的研究)。使用針對人IgG1的抗體的探索性Elisa生物分析方法分析血漿樣品，從而識別由兔免疫建立的mAb1和mAb7。藥代動力學比較顯示使用mAb7增加終末半衰期(即t1/2，藥物在體內的濃度或數量減少到正好一半所需的時間)，其中mAb1和mAb7分別為22.7和25.5天(圖10)。
<110> 賽諾菲
<120> 抗CHIKV抗體及其用途
<130> FR2016/026
<160> 63
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb1
<400> 1
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<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL mAb1
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<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL mAb2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 8
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<220>
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<220>
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<220>
<223> CDRH3 mAb2
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<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL1 mAb2
<400> 14
<210> 15
<211> 863
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> His-標簽CHIKVE2 SL15649
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDRL3 mAb2
<400> 16
<210> 17
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 無取代的IgG1 Fc區
<400> 17
<210> 18
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 無取代的IgG1 Fc區核酸序列
<220>
<221> 外顯子
<222> (1)..(663)
<400> 18
<210> 19
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb1
<400> 19
<210> 20
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC mAb1
<400> 20
<210> 21
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb1核酸序列
<400> 21
<210> 22
<211> 654
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC mAb1核酸序列
<400> 22
<210> 23
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb3
<400> 23
<210> 24
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb3核酸序列
<400> 24
<210> 25
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb4
<400> 25
<210> 26
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb4核酸序列
<400> 26
<210> 27
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb5
<400> 27
<210> 28
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb5核酸序列
<400> 28
<210> 29
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb6
<400> 29
<210> 30
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb6核酸序列
<400> 30
<210> 31
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb7
<400> 31
<210> 32
<211> 1368
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb7核酸序列
<400> 32
<210> 33
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb2 CDRH3
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> X=除M的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> X=除N的任何氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (13)..(13)
<223> X=除G的任何氨基酸
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb10 CDRH3
<400> 34
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb11 CDRH3
<400> 35
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mAb12 CDRH3
<400> 36
<210> 37
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb2
<400> 37
<210> 38
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LC mAb2
<400> 38
<210> 39
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb2核酸
<400> 39
<210> 40
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LC mAb2核酸序列
<400> 40
<210> 41
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb8
<400> 41
<210> 42
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb8核酸序列
<400> 42
<210> 43
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb9
<400> 43
<210> 44
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb9核酸序列
<400> 44
<210> 45
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb10
<400> 45
<210> 46
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb10核酸序列
<400> 46
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<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb11
<400> 47
<210> 48
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb11核酸序列
<400> 48
<210> 49
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb12
<400> 49
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<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb12核酸序列
<400> 50
<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb13
<400> 51
<210> 52
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb13核酸序列
<400> 52
<210> 53
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb14
<400> 53
<210> 54
<211> 1359
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HC mAb14核酸序列
<400> 54
<210> 55
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1恒定區
<400> 55
<210> 56
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb10
<400> 56
<210> 57
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb11
<400> 57
<210> 58
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH mAb12
<400> 58
<210> 59
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 FC區A
<400> 59
<210> 60
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 FC區AAA
<400> 60
<210> 61
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 FC區QL
<400> 61
<210> 62
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 FC區YTE
<400> 62
<210> 63
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 FC區LS
<400> 63
Claims (31)
- 一種與CHIKV結合的分離的單克隆抗體，其包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列，或ii.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或iii.所述CDRH和CDRLH具有與i.或ii.因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中所述抗體進一步包含含有至少一個選自下組的殘基的Fc區：iv.在位置434的丙氨酸，或v.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或vi.分別在位置250的穀氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或vii.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或viii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
- 根據請求項1的分離的單克隆抗體，其中所述抗體具有一個或多個下述特徵：i.以小於約10nM的結合解離平衡常數(K D)結合CHIKV pE2-E1靶標；ii.以小於約200nM的K D結合人FcRn；iii.以小於約600nM的K D結合人Fc□RIII。
- 根據請求項1或請求項2的單克隆抗體，其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：5、6和7的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，或因一個或兩個氨基酸取代不同於那些序列的氨基酸序列，且其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：8、GNT和10的氨基酸序列的三個輕鏈互補決定區(CDRL)，或因個或兩個氨基酸取代不同於那些序列的氨基酸序列。
- 根據請求項1或請求項2的單克隆抗體，其中所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：11、12和13的氨基酸序列的三個重鏈互補決定區(CDRH)，或因一個或兩個氨基酸取代不同於那些序列的氨基酸序列，且所述抗體包含分別具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列的輕鏈互補決定區(CDRL)，或因一個或兩個氨基酸取代不同於那些序列的氨基酸序列。
- 根據請求項1-3任一項的單克隆抗體，其中所述抗體包含：- 由SEQ ID NO：5的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：6的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：7的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：8的序列組成的CDRL1；- 由GNT序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：10的序列組成的CDR L3。
- 根據請求項1、2和4任一項的單克隆抗體，其中所述抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：13的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
- 根據請求項1-6任一項的單克隆抗體，其中所述Fc區包含選自下組的殘基：i.在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或ii.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸， 其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
- 根據請求項1-7任一項的單克隆抗體，其中所述Fc區包含在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，其中所述氨基酸的位置根據EU指數給出。
- 根據請求項1-6任一項的單克隆抗體，其中所述Fc區包含與SEQ ID NO：59、60、61、62和63具有至少80%同一性的序列或由其組成。
- 根據請求項1-3、5、7-9任一項的單克隆抗體，其中其重鏈的可變區包含與序列ID NO：1具有至少80%同一性的序列或由其組成。
- 根據請求項1-3、5、7-10任一項的單克隆抗體，其中其輕鏈的可變區包含與序列ID NO：2具有至少80%同一性的序列或由其組成。
- 根據請求項1-3、5、7-11任一項的單克隆抗體，其中其重鏈包含與序列ID NO：31具有至少80%同一性的序列或由其組成。
- 根據請求項1-3、5、7-12任一項的單克隆抗體，其中其輕鏈包含與序列ID NO：20具有至少80%同一性的序列或由其組成。
- 一種分離的單克隆抗體，其結合CHIKV且包含SEQ ID NO：31的重鏈和SEQ ID NO：20的輕鏈或由其組成。
- 一種分離的單克隆抗體，其結合CHIKV且包含三個重鏈互補決定區(CDRH)和三個輕鏈互補決定區(CDRL)，其中：i.所述CDRH具有SEQ ID NO：11、12和33的氨基酸序列，且所述CDRL具有SEQ ID NO：14、GTS和16的氨基酸序列，或ii.所述CDRH和CDRLH具有與i.的序列因一個或兩個氨基酸取代而不同的氨基酸序列；且其中iii. SEQ ID NO：33在位置8的氨基酸不是M，和/或iv. SEQ ID NO：33在位置12的氨基酸不是N；和/或v. SEQ ID NO：33在位置13的氨基酸不是G。
- 根據請求項15的單克隆抗體，其中所述抗體具有一個或多個下述特 徵：i.以小於約10nM的結合解離平衡常數(K D)結合CHIKV pE2-E1靶標；ii.以小於約200nM的K D結合人FcRn；iii.以小於約600nM的K D結合人Fc□RIII。
- 根據請求項15或請求項16的單克隆抗體，其中所述抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：34的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
- 根據請求項15-17任一項的單克隆抗體，其中所述抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：35的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
- 根據請求項15-18任一項的單克隆抗體，其中所述抗體包含：- 由SEQ ID NO：11的序列組成的CDRH1；- 由SEQ ID NO：12的序列組成的CDRH2；- 由SEQ ID NO：36的序列組成的CDRH3；- 由SEQ ID NO：14的序列組成的CDRL1；- 由GTS序列組成的CDRL2；- 由SEQ ID NO：16的序列組成的CDRL3。
- 根據請求項15-19任一項的單克隆抗體，其中所述抗體進一步包含含 有選自下組的殘基的Fc區：i.在位置434的丙氨酸，或ii.分別在位置307、380和434的丙氨酸，或iii.分別在位置250的穀氨醯胺和在位置428的亮氨酸，或iv.分別在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸，或v.分別在位置252的酪氨酸、在位置254的蘇氨酸和在位置256的谷氨酸，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
- 根據請求項20的單克隆抗體，其中所述抗體具有包含在位置428的亮氨酸和在位置434的絲氨酸的Fc區，其中所述氨基酸位置根據EU指數給出。
- 根據請求項15-21任一項的單克隆抗體，其中所述抗體具有包含與SEQ ID NO：59、60、61、62和63具有至少80%同一性的序列或由其組成的Fc區。
- 根據請求項1-22任一項的單克隆抗體，其用作藥物。
- 根據請求項23的單克隆抗體，其用於在治療CHIKV相關的關節痛中使用。
- 根據請求項23的單克隆抗體，其用於在預防CHIKV感染中使用。
- 一種藥物組合物，其包含根據請求項1-22任一項的單克隆抗體和至少一種賦形劑。
- 一種細胞系，其產生根據請求項1-22任一項的單克隆抗體。
- 一種產生根據請求項1-22任一項的單克隆抗體的方法，其中所述方法包括步驟：i.培養產生所述單克隆抗體的細胞系；ii.純化所產生的單克隆抗體；和任選地iii.將所述單克隆抗體配製成藥物組合物。
- 一種多核苷酸，其包含編碼根據請求項1-22任一項的單克隆抗體的序列。
- 請求項29的多核苷酸，其編碼與SEQ ID NO：18、21、22、24、26、 28、30、32、39、40、42、44、46、48、50、52和54的序列之一具有至少80%同一性的多肽。
- 一種試劑盒，其包含根據請求項1-22任一項的一種抗體和任選的包裝材料。
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