JP2019531170A - 骨と軟組織を同調に再生する誘導剤、その調製方法、及びその使用 - Google Patents

Abstract

誘導剤は、再生医学分野のインサイチュ再生誘導に属する。誘導剤は、細胞外マトリックス及び／又は骨形成タンパク質を含み、欠損した残りの組織部位で骨と筋肉、血管、皮膚等の骨を包む軟組織との同調再生を誘導することができる。再生組織量は、移植される誘導剤の用量に関係がある。【選択図】 図５

Description

本発明は、再生医学分野のインサイチュ再生誘導に属する。本発明で誘導する再生は、
多組織の器官再生であり、骨組織の再生に加えて、筋肉、血管、皮膚等を含む骨周囲軟組
織の再生を含む。本発明は、完全に切断した損傷（生体を離れた元の組織を使用できない
場合を指す）、例えば、切断指／切断肢の再生、非完全切断した損傷、例えば、骨欠損／
骨不連の再生に適用できる。本発明は、再生を誘導する誘導剤、その組み合わせ、調製方
法及び使用に関する。

ミミズ、ヒル等の下等生物は、強大な再生能力を有する。トカゲ、イモリ及びカエルな
どの両生類動物の前後肢又は尾は切除されても完全に再生することができる。哺乳動物の
再生能力が弱いが、ロクジョウ等の少量の哺乳動物の器官は完全に再生することができ、
ヒト及びネズミ（げっ歯類）の指／趾末節部（Ｐｈａｌａｎｇｅ３、Ｐ３）は不完全な再
生能力を有する。例えば、遠位が切除された後再生できるが、近位が切除されたら再生す
ることができない。指／趾中節部（Ｐｈａｌａｎｇｅ２，Ｐ２）等の他の指／趾及び上下
肢が切除されたら再生することができない。本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及
び骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を用いて損傷組織の骨再生を誘導した結果、効果は顕著で
ある。

現在、切断指再生の研究は、マウス趾の完全離断傷をモデルとすることが多い。「軟組
織を残さない切断趾再生」を含み、このような再生は非常に困難である。軟組織は、骨創
傷の修復に対して重要な作用を有し、軟組織で包まられない骨傷は、癒合したとしても、
露出する骨組織が徐々に壊死することがある。そのため、截肢術／截指術では、骨が軟組
織で包まれるように、骨を短く（骨を軟組織よりも短く）切断する必要がある（曲智勇ら
、実用手外科術科学［Ｍ］、人民軍医出版社、２００３年。Ｋｅｖｉｎ ｃ ｃｈｕｎｇ
原著、手及び上肢の修復再建［Ｍ］、人民軍医出版、２０１３年）。生存率を向上させる
ために、切断指再植手術の０−３週後、再植される切断指を自体の軟組織に埋める必要が
ある（王斌ら、手部組織欠損の修復［Ｍ］、人民軍医出版社、２００８年）。

マウス趾の再生に用いられているインデューサは、生体組織（爪床／胚芽）、成長因子
（ＢＭＰｓ、ｂＦＧＦ）及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｍａｔｒｉｘ）を含む。誘導の作用方式は、それぞれ異なる。爪床／胚芽等の生体組織
は、そのまま創傷部位に移植される。成長因子は、ＢＭＰを含むゼラチン又はブルーガム
粒子を傷口の皮下に移植する。ＥＣＭは、液体ＥＣＭを傷口の近くに注射するか、又は特
殊な装置を介して傷口に直接接触させる。生体組織は、前腕部位では尺骨、橈骨、腕骨及
び趾骨等の複数の骨組織の再生を誘導することができる［Ｍｏｈａｍｍａｄ ＫＡ， Ｎ
ｅｕｆｅｌｄ ＤＡ． Ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎａｉ
ｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａｍｐｕｔａｔｅｄ ｐｒｏｘｉｍａｌ
ｐｈａｌａｎｇｅｓ． ［Ｊ］．Ｃａｌｃｉｆ Ｔｉｓｓ Ｉｎｔ ，１９９９，６５：
４０８〜４１０； Ｍａｓａｋｉ Ｈ， Ｉｄｅ Ｈ． Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｌｉｍｂｓ． ［Ｊ］．Ｄｅｖ． Ｇｒｏｗｔｈ
Ｄｉｆｆｅｒ．， ２００７， ４９：８９−９８］。ＢＭＰも顕著な骨再生作用を有す
る。趾末節部（Ｐ３）での近位切除（非再生可能切除）の場合、ＢＭＰ７／ＢＭＰ２は、
このＰ３骨を再生させることができる［Ｙｕ Ｌ， Ｈａｎ Ｍ，Ｙａｎ Ｍ． ｅｔ
ａｌ． ＢＭＰ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｄｉｇｉｔ ｒｅｇｅｎｅｒａ
ｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｏｎａｔａｌ ｍｉｃｅ． ［Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ．
２０１０，１３７， ５５１〜５５９］。趾中節部（Ｐ２）での切除の場合、ＢＭＰ２
は、Ｐ２骨の長さを延長できるが、関節を再生されることができない［Ｙｕ Ｌ， Ｈａ
ｎ Ｍ， Ｙａｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＢＭＰ２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｇｍｅｎｔ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｇｉ
ｔ ａｎｄ ｌｉｍｂ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ
ｎｅｗ ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ． ［
Ｊ］．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１２，３７２：２６３−２
７３］。新生マウスの骨を取り除き、皮膚等の軟組織を保留する場合、ＢＭＰ７を含むゼ
ラチンを用いて誘導することにより、異所性骨を生成することができる［Ｉｄｅ Ｈ．
Ｂｏｎｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｉｍｂｓ ａｆ
ｔｅｒ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｆｏｒｅａｒｍ ｌｅｖｅｌ． ［Ｊ］
．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２０１２，２４１：４３５−４４１
］。ＥＣＭの骨再生作用が最も低い。ＥＣＭ分解物は、複数種の前駆細胞／幹細胞をマウ
ス趾の傷口に集める作用を有する［Ｒｅｉｎｇ ＪＥ， Ｚｈａｎｇ Ｌ， Ｍｙｅｒｓ
Ｉｒｖｉｎ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ａｆｆｅｃｔ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ． ［Ｊ］．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒ
ｔ Ａ ２００９，１５：６０５〜６１４； Ａｇｒａｗａｌ Ｖ， Ｊｏｈｎｓｏｎ
ＳＡ， Ｒｅｉｎｇ Ｊ． Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｐ
ｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａ
ｍｍａｌｓ． ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２０１０，ＵＳＡ
１０７：３３５１〜３３５５］。ＥＣＭから抽出した未知のタンパク質は、少量のカルス
の生成を誘導することができる［Ａｇｒａｗａｌ Ｖ， Ｋｅｌｌｙ Ｊ， Ｔｏｔｔｅ
ｙ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｒｙｐｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌ
ｉｎｇ ｉｎ ａｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｄｉｇｉｔ
ａｍｐｕｔａｔｉｏｎ． ［Ｊ］．Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｐａｒｔ Ａ． ２０１１
Ｄｅｃ；１７（２３−２４）：３０３３−４４］。さらに、液体ＥＣＭと電気刺激の組
み合わせによりマウス趾の再生を誘導する方法［Ｈｅｃｈａｖａｒｒｉａ Ｄ， Ｄｅｗ
ｉｌｄｅ Ａ， Ｂｒａｕｎｈｕｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｄｏｍｅ ｒｅｇｅｎ
ｅｒａｔｉｖｅ ｓｌｅｅｖｅ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏ
ｎ． ［Ｊ］． Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ
２０１０， ３２（９）： １０６５−１０７３］、ＥＣＭ粉末と脂肪組織の組み合わせ
をヒトの切断指再生に用いる方法があるが、新骨生成についての記載がない［ Ｓｉｖａ
ｋ ＷＮ， Ｒｕａｎｅ ＥＪ， Ｈａｕｓｍａｎ ＳＪ， Ｒｕｂｉｎ ＪＰ， Ｓｐ
ｉｅｓｓ ＡＭ． Ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｓｕｐｐｌ
ｅｍｅｎｔａｌ Ｆａｔ Ｇｒａｆｔｉｎｇ Ｌｅａｄｓ ｔｏ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｔｒａｕｍａｔｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｔｉｐ Ａｍｐｕｔａｔ
ｉｏｎ． Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ Ｓｕｒｇ Ｇｌｏｂ Ｏｐｅｎ． ２０１６
Ｏｃｔ １２；４（１０）：ｅ１０９４］。ブタの膀胱ＥＣＭで切断指／切断肢の再生
を誘導する報告があるが、骨再生があるか否かは確認できない。ＥＣＭは、組織工学足場
材料として様々な軟組織の修復に用いられているが、ＥＣＭの骨組織再生における作用は
、いまだに強い証拠がない。以上のことから、従来技術におけるこれらのインデューサの
欠点は、生体組織インデューサの出所に制限がること、免疫拒絶等の問題、ＢＭＰが高価
であり再生した骨量が少ないこと、ＥＣＭ抽出物により誘導された再生組織量が少なすぎ
ることである。
現在、再生、特に骨再生を誘導する再生誘導剤を改良する必要がある。

本発明の解決しようとする課題は、再生能力のない切断指／切断肢の骨再生を誘導する
こと、指末節部の不完全再生を完全再生に変換すること、又は他の骨欠損／骨不連の再生
修復を実現することであり、特に軟組織を残さない骨（例えば、切断趾／指）の再生を誘
導することである。本発明は、新しい創傷及び古い創傷のいずれにも適用することができ
る。

本発明において、ＥＣＭは切断趾に対して明らかな骨再生作用を有することが初めて発
見された。ＥＣＭでマウス趾の再生を誘導することで得られた再生趾は、外観には対照趾
と明らかに異なっており、再生した骨量がＢｅａｄ＋高濃度ＢＭＰ（５００μｇ／ｍｌの
ＢＭＰ）で誘導することで再生した骨量に相当することが、本発明者らによって発見され
た。本発明者らは、対照と比較すると、ＥＣＭとＢＭＰの併用による再生骨量の増加は、
両者をそれぞれ単独で使用する場合の骨再生量の増加の和よりも顕著に高いこと、即ち、
顕著な相乗効果を有すること（実施例２、図４及び図５を参照）、及び骨再生量がＢＭＰ
濃度の増加につれて増加し、中／低濃度のＢＭＰ及びＥＣＭだけで元の骨量を超えた量の
骨の再生（過剰な骨再生）を誘導できることを驚くべきことに発見した。さらに、本発明
者らは、本誘導剤は、軟組織を残さない骨（例えば、切断趾）の再生に対して非常に顕著
な効果を有することも驚くべきことに発見した。また、ＥＣＭは、原料が入手されやすく
、使用が便利であり、臨床使用に適している。従って、本発明の再生誘導剤を用いること
により、骨の再生量及び品質を高めながら、コストを低減することができる。

本発明の一態様では、以下の実施形態を含む。

１．本誘導剤の主成分はＥＣＭであり、ＥＣＭは、動物組織や器官を原料として得られ
たものであり、限定されないが、小腸、気管、膀胱、骨の細胞外マトリックスに由来する
。

２．本誘導剤の主成分はＥＣＭである。ＥＣＭは、非動物組織や器官に由来する細胞外
マトリックスである。

３．本誘導剤の主成分はＥＣＭである。ＥＣＭは、実施形態１又は２のＥＣＭを物理的
または化学的方法で処理した生成物である。このような処理方法は、凍結乾燥、粉砕、分
解、架橋、ゲル化、３Ｄプリントなどの造形処理を含むが、これらに限定されない。

４．本誘導剤の主成分はＢＭＰである。ＢＭＰは、ＢＭＰスーパーファミリーの骨形成
タンパク質によって特徴付けられ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３Ｂ／ＧＤＦ−１
０、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７／ＯＰ−１、ＢＭＰ−８／ＯＰ−
２、ＢＭＰ−８Ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−
１３、ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ
−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−４、ＧＤＦ−５／ＣＤＭＰ−１／ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−６
／ＣＤＭＰ−２／ＢＭＰ−１３、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３／ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−８
、ＧＤＦ−９を含むが、これらに限定されない。

５．実施形態４に記載の誘導剤において、ＢＭＰは、ＢＭＰの抽出に用いられる原料、
例えば、骨基質ゼラチン、又は前記原料から得られたＢＭＰ含有抽出物によって提供され
る。

６．本誘導剤の主成分はＢＭＰである。ＢＭＰは、ＢＭＰによって骨生成作用を発揮す
る外因性添加物によって特徴付けられ、ＢＭＰ結合タンパク質、例えばｏｌｌｉｓｔａｔ
ｉｎ、ＢＭＰタンパク質を生成可能な活性物質を含むが、これらに限定されない。

７．本誘導剤の主成分はＢＭＰである。ＢＭＰは、実施形態４、５又は６におけるタン
パク質のコア配列を有するペプチド鎖によって特徴付けられる。

８．本誘導剤は、補助剤をさらに含む。前記補助剤は、純水又は中性緩衝液、カルシウ
ム、リン、マグネシウムなどのイオンを含有する無機塩を含むが、これらに限定されない
。

９．本誘導剤は外用薬であり、組織の損傷箇所に移植することにより作用を発揮し、再
生過程において完全に吸収される。

１０．本誘導剤の主成分はＥＣＭ及びＢＭＰである。ＥＣＭは、実施形態１、２、３の
何れかに記載のＥＣＭであり、ＢＭＰは、実施形態４、５、６、７の何れかに記載のＢＭ
Ｐである。

１１．ａ．細胞外マトリックス（ＥＣＭ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ
）、
ｂ．骨形成タンパク質（ＢＭＰ，ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）、及び
ｃ．骨形成タンパク質ＢＭＰの希釈液からなる誘導剤。

一方、本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ
）を含む再生誘導剤に関する。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、細胞外マトリックス及び／又は
骨形成タンパク質を主成分として含む。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、細胞外マトリックス及び／又は
骨形成タンパク質を主要な活性成分を含む。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、活性成分として細胞外マトリッ
クス及び骨形成タンパク質しか含まない。

いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスは、動物組織や器官から得られたも
のであり、限定されないが、小腸、気管、膀胱、骨の細胞外マトリックスに由来する。

いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスは、非動物組織や器官に由来する。

いくつかの実施形態において、細胞外マトリックスは、物理的または化学的方法で処理
されたものである。前記処理方法は、凍結乾燥、粉砕、分解、架橋、ゲル化、３Ｄプリン
ト等を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は、ＢＭＰスーパーファミリーの骨形
成タンパク質であり、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３Ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−
４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７／ＯＰ−１、ＢＭＰ−８／ＯＰ−２、ＢＭＰ−
８Ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ
−１４、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ
−３、ＧＤＦ−４、ＧＤＦ−５／ＣＤＭＰ−１／ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−
２／ＢＭＰ−１３、ＧＤＦ−７／ＣＤＭＰ−３／ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−８及び／又はＧ
ＤＦ−９を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰの抽出に用いられる原料、例えば骨基
質ゼラチン、又は前記原料から得られたＢＭＰ含有抽出物によって提供される。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤におけるＢＭＰは、ＢＭＰにより骨
生成作用を発揮する外因性添加物に置き換えられ、ＢＭＰ結合タンパク質、例えばＦｏｌ
ｌｉｓｔａｔｉｎ、ＢＭＰタンパク質を生成可能な活性物質、例えばＢＭＰタンパク質を
生成できる遺伝子組み換え製品を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、骨形成タンパク質は、前記ＢＭＰスーパーファミリーの
骨形成タンパク質及びＢＭＰ結合タンパク質のコア配列を有するペプチド鎖をさらに含む
。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、補助剤をさらに含む。補助剤は
、リン酸塩、酢酸塩、トレハロース、ハイドロキシアパタイト粉末、グルコース、ソルビ
トール、純水、エタノール、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液を含むが
、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、補助剤は希釈液である。希釈液には、無機塩又は他の骨
生成促進成分（カルシウム、リン、マグネシウム等のイオンを含有する無機塩を含むが、
これらに限定されない）を任意に添加することができる。希釈液は、純水、リン酸塩緩衝
液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液等を含むが、これらに限定されず、純水又は中性緩
衝液が好ましい。

いくつかの実施形態において、希釈液は、５％トレハロースを含むリン酸塩緩衝液であ
る。

いくつかの実施形態において、前記リン酸塩緩衝液はｐＨ＝７．２である。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、補助剤として添加されるハイド
ロキシアパタイトをさらに含む。

いくつかの実施形態において、ハイドロキシアパタイト粉末とＥＣＭとの乾燥重量比は
、１００：１〜１：１００００、例えば、１００：１〜１：１０００、１０：１〜１：２
００、５：１〜１：１００、２：１〜１：５０、１：１０〜１：５０である。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、細胞外マトリックス、骨形成タ
ンパク質及び補助剤からなる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、細胞外マトリックス、骨形成タ
ンパク質及び希釈液からなる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は外用薬であり、組織の損傷箇所に
移植することにより作用を発揮し、再生過程において部分的に又は完全に吸収される。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤におけるＢＭＰ：ＥＣＭの乾燥重量
比は、１００：１〜１：１００００００、例えば、１０：１〜１：１００００００、１：
１００〜１：１００００００、１：１００〜１：１０００００、１：１０００〜１：１０
０００００、１：１０００〜１：１０００００、１：２０００〜１：１０００００、１：
４０００〜１：７００００又は１：５０００〜１：５００００である。本発明の再生誘導
剤におけるＢＭＰ：ＥＣＭの乾燥重量比は、例えば、１：１０００、１：２０００、１：
３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７０００、１：８０００、
１：９０００、１：１００００、１：２００００、１：３００００、１：４００００、１
：５００００、１：６００００又は１：７００００等であってもよい。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、０．０００１−１００％重量の
ＢＭＰ及びＥＣＭを含み、例えば、０．０１％−９９ ％、０．１％−９５ ％、０．５
％−９０ ％、１％−８５ ％、２％−８０ ％、５％−７０ ％、１０％−９０ ％、
３０％−９０ ％、４０％−９０ ％、０．００１％−９０％、０．０１％−９０％，０
． １％−９０％，例えば、０．０００１％，０．００１％，０．０１％，０． １％，
０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％
、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％
又は１００％重量のＢＭＰ及びＥＣＭを含む。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の骨再生を誘導すること
に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の軟組織を残さない骨再
生を誘導することに用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の再生能力のない切断趾
、切断指又は切断肢の骨再生を誘導することに用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の指／趾末節部の不完全
再生を完全再生に変換することに用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の骨欠損／骨不連の再生
修復を実現することに用いられる。

いくつかの実施形態において、再生能力のない切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を
残した切断趾、切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、再生能力のない切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を
残さない切断趾、切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の指／趾末節部の遠位が
欠失した切断指／趾の骨再生に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の指／趾末節部の近位が
欠失した切断指／趾の骨再生に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の再生誘導剤は、被験体の指／趾中節部が欠失し
た切断指／趾の骨再生に用いられる。

他の態様によれば、本発明は、ＢＭＰとＥＣＭとの組み合わせ（以下、「本発明の組み
合わせ」とも呼ばれる）にも関する。

いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせにおけるＢＭＰ：ＥＣＭの乾燥重量
比は、１００：１〜１：１００００００、例えば、１０：１〜１：１００００００、１：
１００〜１：１００００００、１：１００〜１：１０００００、１：１０００〜１：１０
０００００、１：１０００〜１：１０００００、１：２０００〜１：１０００００、１：
４０００〜１：７００００又は１：５０００〜１：５００００である。本発明の組み合わ
せにおけるＢＭＰ：ＥＣＭの乾燥重量比は、例えば、１：１０００、１：２０００、１：
３０００、１：４０００、１：５０００、 １：６０００、１：７０００、１：８０００
、１：９０００、１：１００００、１：２００００、１：３００００、１：４００００、
１：５００００、１：６００００又は１：７００００等であってもよい。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の骨再生を誘導するＢＭＰとＥＣＭと
の組み合わせに関する。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の軟組織を残さない骨再生を誘導する
ＢＭＰとＥＣＭとの組み合わせに関する。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の再生能力のない切断趾、切断指又は
切断肢の骨再生を誘導するＢＭＰとＥＣＭとの組み合わせに関する。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の指／趾末節部の不完全再生を完全再
生に変換する

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の骨欠損／骨不連の再生修復を実現す
ることに用いられるＢＭＰとＥＣＭとの組み合わせに関する。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残した切断趾、
切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残さない切断趾
、切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせは、被験体の指／趾末節部の遠位が
欠失した切断指／趾の骨再生に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせは、被験体の指／趾末節部の近位が
欠失した切断指／趾の骨再生に用いられる。

いくつかの実施形態において、本発明の組み合わせは、被験体の指／趾中節部が欠失し
た切断指／趾の骨再生に用いられる。

他の態様によれば、本発明は、被験体の骨再生のための薬物の調製における再生誘導剤
又は本発明の組み合わせの使用に関する。

いくつかの実施形態において、本発明は、被験体の骨再生のための薬物の調製における
唯一の活性成分とする本発明の組み合わせの使用に関する。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、軟組織を残さない骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記被験体は、哺乳動物、鳥類、魚又は爬虫類動物であ
る。

いくつかの実施形態において、前記被験体は哺乳動物である。

いくつかの実施形態において、前記被験体は、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ
、ブタ、マウス、ラット及びモルモットから選択される。

いくつかの実施形態において、前記被験体はヒトである。

いくつかの実施形態において、骨再生は、再生能力のない切断趾、切断指又は切断肢の
骨再生である。

いくつかの実施形態において、骨再生は、指／趾末節部の不完全再生を完全再生に変換
することである。

いくつかの実施形態において、骨再生は、骨欠損／骨不連の再生修復である。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残した切断趾、
切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残さない切断趾
、切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾末節部の遠位が欠失した
切断指／趾の骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾末節部の近位が欠失した
切断指／趾の骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾の中節部が欠失した切断
指／趾の骨再生である。

他の態様によれば、本発明は、本発明の再生誘導剤又は組み合わせを被験体の欠損部位
に接触させることを含む被験体の欠損部位を骨再生させる方法に関する。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、軟組織を残さない骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記被験体は、哺乳動物、鳥類、魚又は爬虫類動物であ
る。

いくつかの実施形態において、前記被験体は、哺乳動物である。

いくつかの実施形態において、前記被験体は、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ
、ブタ、マウス、ラット及びモルモットから選択される。

いくつかの実施形態において、前記被験体はヒトである。

いくつかの実施形態において、前記欠損部位は、再生能力のない切断趾、切断指又は切
断肢である。

いくつかの実施形態において、骨再生は、指／趾末節部の不完全再生を完全再生に変換
することである。

いくつかの実施形態において、前記欠損部位は、骨欠損／骨不連の部位である。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残す切断趾、切
断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、切断趾、切断指又は切断肢は、軟組織を残さない切断趾
、切断指又は切断肢である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾末節部の遠位が欠失した
切断指／趾の骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾末節部の近位が欠失した
切断指／趾の骨再生である。

いくつかの実施形態において、前記骨再生は、被験体の指／趾中節部が欠失した切断指
／趾の骨再生である。

誘導剤の調製

他の態様によれば、本発明は、ＢＭＰとＥＣＭを混合するステップを含む本発明の再生
誘導剤の調製方法に関する。

いくつかの実施形態において、前記本発明の再生誘導剤の調製方法は、ＢＭＰとＥＣＭ
を混合する前に、ＢＭＰ又はＥＣＭを補助剤と混合するステップをさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記本発明の再生誘導剤の調製方法は、
希釈液でＢＭＰを希釈する希釈ステップ１と、
希釈されたＢＭＰ液とＥＣＭを混合する混合ステップ２と、を含む。

いくつかの実施形態において、前記方法のステップ１において、希釈液で希釈した後、
ＢＭＰの濃度は０．０１〜１００００μｇ／ｍｌ、例えば、０．０５〜５０００μｇ／ｍ
ｌ、０．１〜２０００μｇ／ｍｌ、１〜１０００μｇ／ｍｌ、０．０５〜５００μｇ／ｍ
ｌ、０．１〜５００μｇ／ｍｌ、０．５〜５００μｇ／ｍｌ、１〜５００μｇ／ｍｌ、３
０〜５００μｇ／ｍｌ、１００〜１０００μｇ／ｍｌ、２００〜８００μｇ／ｍｌ、２５
０〜７００μｇ／ｍｌ又は３００〜６００μｇ／ｍｌになる。

いくつかの実施形態において、前記方法のステップ２において、ＢＭＰとＥＣＭの乾燥
重量比は、１００：１〜１：１００００００、例えば、１０：１〜１：１００００００、
１：１００〜１：１００００００、１：１００〜１：１０００００、１：１０００〜１：
１００００００、１：１０００〜１：１０００００、１：２０００〜１：１０００００、
１：４０００〜１：７００００、又は１：５０００〜１：５００００であり、１：１００
０、１：２０００、１：３０００、１：４０００、１：５０００、１：６０００、１：７
０００、１：８０００、１：９０００、１：１００００、１：２００００、１：３０００
０、１：４００００、１：５００００、１：６００００、又は１：７００００であっても
よい。

いくつかの実施形態において、ステップ２の混合物において、ＢＭＰ液：ＥＣＭの重量
比は、１００：１〜１：１０００であり、例えば、１０：１〜１：１００、１：１０〜１
：１００、５：１〜１：５０、５：１〜１：１０、２：１〜１：５であり、例えば、２：
１、１：１、１：２、１：３等である。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ステップ２で得られた混合物を再生される
骨の形状に造形するステップ３をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記方法のステップ３では、直接使用可能なゲル／半ゲ
ル状の誘導剤を得る。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ステップ３で得られた誘導剤を乾燥させる
ステップ４をさらに含む。

いくつかの実施形態において、前記方法は、ＢＭＰとＥＣＭとを混合する前、混合した
後、又は混合すると同時に、必要に応じて他の補助剤を添加するステップをさらに含む。
前記補助剤は、無機塩、好ましくはハイドロキシアパタイト粉末を含むが、これらに限定
されない。

いくつかの実施形態において、希釈液は、純水、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエ
ン酸塩緩衝液等、好ましくは純水又は中性緩衝液を含むが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態において、希釈液は、５％トレハロースを含有するリン酸塩緩衝液
である。

いくつかの実施形態において、前記リン酸塩緩衝液は、ｐＨ＝７．２である。

いくつかの実施形態において、ハイドロキシアパタイト粉末とＥＣＭとの乾燥重量比は
、１００：１〜１：１００００であり、例えば、１０：１〜１：２００、５：１〜１：１
００、２：１〜１：５０、１：１０〜１：５０である。

いくつかの実施形態において、調製環境は、清潔で無菌であり、誘導剤の各成分は、調
製前に無菌化処理される必要がある。

一実施形態において、本発明は、誘導剤の調製方法に関する。前記誘導剤は、
ａ．細胞外マトリックス（ＥＣＭ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）、
ｂ．骨形成タンパク質（ＢＭＰ，ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）、及び
ｃ．骨形成タンパク質ＢＭＰの希釈液からなる。

前記方法は、
濃度が０．０１〜１０００μｇ／ｍｌになるようにｂをｃ液で希釈する希釈ステップ１
と、
ａ、希釈したｂ液、及び必要に応じて他の補助剤を、ｂ：ａ＝１：１〜１：１００００
０、例えば、１：１〜１：１０００の割合で混合する混合ステップ２と、
前記ステップ２で得られた混合物を再生される骨の形状に造形することにより誘導剤の
調製を完成させる造形ステップ３と、を含む。

調製環境は、清潔で無菌であり、誘導剤の各成分は、調製前に無菌化処理される必要が
ある。

本発明の誘導剤の効果は以下の通りである。

マウスＰ２（趾中節部）の切除実験から明らかであるように、本発明の誘導剤は、切除
された元の組織を使用することなく、切断趾の残端で骨と筋肉、皮膚等の軟組織との同調
再生を誘導することができる。これにより、残趾の長さを延長し、残趾の厚さを増加させ
ることができる。再生した骨組織は、細孔構造を有する骨であり、骨の表面が凹凸である
が、再生骨内の細孔構造が経時的に減少することで、骨の表面が滑らかになる傾向がある
。

理解できるように、本明細書で用いられる用語は、本発明の実施形態を説明するための
ものに過ぎず、制限的なものではない。

特に定義のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、いずれも
当業者に一般的に理解されている意味を有する。

定義

用語「ＢＭＰ」、「ＢＭＰタンパク質」及び「骨形成タンパク質」は、本明細書におい
て同じ意味で使用されており、ＢＭＰスーパーファミリーの骨形成タンパク質を指し、Ｂ
ＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３Ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ
−６、ＢＭＰ−７／ＯＰ−１、ＢＭＰ−８／ＯＰ−２、ＢＭＰ−８Ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭ
Ｐ−１０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１、
ＣＤＭＰ−２、ＣＤＭＰ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−４、ＧＤ
Ｆ−５／ＣＤＭＰ−１／ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２／ＢＭＰ−１３、ＧＤ
Ｆ−７／ＣＤＭＰ−３／ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−８及び／又はＧＤＦ−９を含むが、これ
らに限定されない。

ＢＭＰの由来源は制限されず、例えば、遺伝子工学の方法（例えば、ヒトＢＭＰの組み
換え）により得てもよく、ＢＭＰを含む原料、例えば、骨組織、脱灰骨、骨基質ゼラチン
等の材料として得てもよく、精製等の方法により純粋なＢＭＰ又はＢＭＰを含む抽出物等
として得てもよく、例えば、骨組織、脱灰骨、骨基質ゼラチン等の材料から抽出すること
により得てもよい。

用語「細胞外マトリックス」、「ＥＣＭ」及び類似する用語は、本明細書において同じ
意味で使用されており、狭義には、動物組織の細胞間に発見され、且つ組織内構造要素と
して用いられるコラーゲンリッチな物質を意味する。典型的には、細胞が分泌した多糖類
とタンパク質の複雑な混合物を含む。細胞外マトリックスは、分離されて様々な方法で処
理されてもよい。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、動物組織や器官から分離して得るこ
とができる。前記動物は、哺乳動物、例えば、家畜又は農場動物（例えば、ネコ、イヌ、
ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、霊長類動物）、鳥類、実験動物（例えば、マウス、ラ
ット及びモルモット）を含む。前記動物組織や器官は、小腸、気管、膀胱、骨、小腸粘膜
下層、胃粘膜下層、膀胱粘膜下層、組織粘膜、脳硬膜、肝臓基底膜、心膜又は他の組織を
含むが、これらに限定されない。分離して処理した後、通常、細胞外マトリックス又はＥ
ＣＭと呼ばれる。広い意味では、細胞外マトリックスは、非動物組織や器官由来の細胞外
マトリックス（例えば、人工細胞外マトリックス、インビトロ培養細胞由来の細胞外マト
リックス等）も含む。好ましくは、細胞外マトリックスは、Ａｇｒａｗａｌ Ｖ， Ｊｏ
ｈｎｓｏｎ ＳＡ， Ｒｅｉｎｇ Ｊ． Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉ
ｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｕ
ｌｔ ｍａｍｍａｌｓ． ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２０１０
，ＵＳＡ １０７：３３５１〜３３５５に記載の方法で調製することができる。

用語「被験体」は、哺乳動物、例えば、家畜又は農場動物（例えば、ネコ、イヌ、ヒツ
ジ、ヤギ、ウシ、ウマ及びブタ）、ヒト、霊長類動物；鳥類；実験動物（例えば、マウス
、ラット及びモルモット）；魚；爬虫類動物を含み、好ましくはヒトである。

用語「再生」とは、生体の全体、組織又は器官が創傷により部分的に欠失又は損傷した
場合、残りの部分の上で欠失又は損傷した部分と形態的及び機能的に同じであるか、又は
類似する構造を作り出すという修復過程をいう。

用語「骨再生」とは、骨組織の再生に関する再生をいう。通常、骨再生には、骨組織の
再生に加えて、筋肉、血管、皮膚等を含む骨周囲の軟組織の再生が含まれる。軟組織のみ
の修復は、骨再生とは言えない。本発明の骨再生は、軟組織を残さない骨再生、軟組織を
残した骨再生、切断趾、切断指又は切断肢（再生能力のある又はない；軟組織を残す又は
残さない）再生、指／趾末節部の不完全再生から完全再生への変換、骨欠損／骨不連の再
生修復を含むが、これらに限定されない。本発明の骨再生は、特にインサイチュ骨再生、
さらに軟組織を残さない骨再生を指す。

用語「軟組織を残さない骨再生」とは、切断指又は切断肢の再生の場合において、骨の
切断面を離れた組織が全て欠失したか、又は廃棄されたことをいい、他の骨欠損の場合に
おいて、離断骨を包む軟組織が全て欠失したか、又は廃棄されたことをいう。上記状況に
おける再生は、骨と軟組織の同調再生であり、再生する軟組織には皮膚が含まれる。

用語「誘導剤」及び「再生誘導剤」は、同じ意味で使用されており、被験体の組織及び
／又は器官の再生を誘導する組成物、特に骨再生を誘導する組成物である。

用語「再生能力のない」とは、外部誘導因子を移植しない状態で、生体の器官、組織等
が再生能力を持たないことを意味する。

用語「補助剤」とは、薬物製剤を調製又は製造する過程において添加する活性成分、例
えば、ＥＣＭ及び／又はＢＭＰ以外の物質を指す。補助剤は、液体、固体又は気体であっ
てもよく、単一の物質であってもよいか、又は複数種類の物質の混合物であってもよい。
補助剤は、フィラー、安定剤、抗生物質、抗酸化剤、防腐剤、希釈剤（希釈液を含む）等
を含む。本発明の補助剤は、当業者に知られている補助剤であり、ハイドロキシアパタイ
ト粉末、リン酸塩、酢酸塩、トレハロース、グルコース、ソルビトール、純水、エタノー
ル、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液等を含むが、これらに限定されな
い。他の補助剤について、この分野の参考書、例えば、《薬剤補助剤大全》（第２版、四
川科学技術出版社、主編：羅明生、高天惠）を参照されたい。

用語「希釈液」とは、ＢＭＰ及び／又はＥＣＭを希釈するための液体をいい、例えば、
水、エタノール又はその混合物などの有機又は無機溶媒である。希釈液には、無機塩又は
他の骨生成を促進する成分を任意に添加することができる。カルシウム、リン、マグネシ
ウム等のイオンを含有する無機塩を含むが、これらに限定されない。本発明の希釈液は、
純水、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液等を含むが、これらに限定され
ず、純水又は中性緩衝液、例えば、５％トレハロースを含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．
２）が好ましい。

用語「組み合わせ」とは、投薬単位の形態における固定の組み合わせ又は併用投与に用
いられるキットをいう。ＢＭＰ及びＥＣＭは、同一時点でそれぞれ独立して投与してもよ
いか、又は時間間隔（特に、この時間間隔が組み合わせによる相乗効果を許容する場合）
を置いて別々に投与してもよい。本明細書で用いられる用語「組み合わせ」は、「固定の
組み合わせ」を含み、つまり、ＢＭＰとＥＣＭを一体物として、又は同じ剤形で同時に被
験体に投与することをいい、ＢＭＰ、ＥＣＭ及び必要に応じて補助剤を混合又は合併して
得られた製品（組み合わせ製品とも呼ばれる）を含む。

投与

本発明の誘導剤は、如何なる適切な剤形に製剤化して、如何なる適切な経路で投与する
ことができる。本発明の誘導剤は、注射投与用の溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤等；
局所投与用のゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、坐剤、パッチ剤等；局所投与用のエアロゾル
剤、噴霧剤、粉末等に製剤化することができる。好ましい投与方式は、一般に骨再生を必
要とする部分に対する直接な局所投与である。より好ましくは、本発明の誘導剤は、組織
の損傷箇所に移植することで作用を発揮し、再生過程において完全に吸収される。

正常マウス趾の外観図（腹側、即ち、掌側の面）である。 中間趾（「中趾」）を切除せず、両側の趾（「示趾」和「環趾」）を切除する。切除位置は、両側の趾の２本目の趾紋線（矢印に示される）である。中間趾の３本目の趾紋線が両側の趾の２本目の趾紋線（矢印に示される）と揃っているため、中間趾の３本目の趾紋線は両側の趾の再生長さの基準座標とされ得る。同図には、（１）は切除位置、（２）は切除位置を示す。 マウス趾の中節部Ｐ２を切除した後の３５日目の外観及びその透明標本図である。図２−１は外観図である。図２−２は透明標本図である。 左側趾（「環趾」）に誘導剤が移植され、対照趾となる右側趾（「示趾」）に誘導剤が移植されていない。透明標本は、骨を観察するために用いられる。一方向矢印は切除位置、双方向矢印はＰ２趾骨の長さがを示す。誘導剤趾骨の長さは対照趾骨の長さがの約２倍である。図２−１、図２−２には、同一サンプルを示し、用いられる誘導剤はＥＣＭゲル単独である。図２−１における符号について、（１）は、誘導剤趾の切除位置を示し、（２）は、切除した後、誘導剤を使用した再生趾を示し、（３）は、未損傷の正常趾（「中趾」）を示し、（４）は、切除した後、誘導剤を使用していない対照趾を示し、（５）は、対照趾の切除位置を示す。図２−２における符号について、（１）は、誘導剤趾の切除位置を示し、（２）は、切除した後、誘導剤を使用した再生趾を示し、（３）は、再生したＰ２骨の長さを示し、（４）は、未損傷の正常趾（「中趾」）を示し、（５）は、切除した後、誘導剤を使用していない対照趾を示し、（６）は、対照趾の切除位置を示し、（７）は、対照趾Ｐ２骨の長さを示す。 過剰再生したＰ２マウス趾のｍｉｃｒｏ−ＣＴ図及び透明標本図（異なるサンプル）である。図３−１はｍｉｃｒｏ−ＣＴ図（切除後の５０日目）である。図３−２は透明標本図（切除後の３４日目）である。図３−３は透明標本図（切除後の３５日目）である。 再生したＰ２趾骨の長さは、正常中間趾のＰ２趾骨に相当し、再生趾の厚さは、正常中間趾以上である。マウスの正常中間趾は、ヒトの「中指」に相当し、そのＰ２趾骨が最も長い。再生したＰ２趾の骨量は、元のＰ２趾よりも多く、過剰なマウス趾再生に該当する。一方向矢印は、切除位置を示し、双方向矢印は、Ｐ２趾骨の長さを示す。図３−１の符号について、（１）は、誘導剤趾の切除位置を示し、（２）は、再生したＰ２趾を示し、（３）は、正常中間趾のＰ３骨を示し、（４）は、正常中間趾のＰ２骨を示す。図３−２の符号について、（１）は、正常中間趾のＰ２骨の長さを示し、（２）は、再生したＰ２骨の長さを示し、（３）は、誘導剤趾の切除位置を示す。図３−３の符号について、（１）は、誘導剤趾の切除位置を示し、（２）は、正常中間趾のＰ２骨の長さを示し、（３）は、再生したＰ２骨の長さを示す。 ブランク、ＥＣＭ単独、ＢＭＰ単独の再生効果の比較を示す。◆は、Ｔ検定のｐ＜０．０５（ＥＣＭ／ブランク群：ｐ＝０．０１１；ＢＭＰ（５００μｇ／ｍｌ）／ブランク群：ｐ＝０．０４１）であることを示し、◆◆は、Ｔ検定のｐ＞０．０５（ＥＣＭ／ＢＭＰ群：ｐ＝０．９０８）であることを示す 軟組織を残す切断趾及び軟組織を残さない切断趾に対するブランク、ＥＣＭ単独、ＥＣＭとＢＭＰの併用の再生効果の比較を示す。併用−３０は、ＥＣＭと濃度３０μｇ／ｍｌのＢＭＰとの併用を示し、他は同様である。 マウス脛骨を切除した後の再生効果図である。右図は、左図の一部拡大図である。図６の符号について、（１）は、マウス脛骨の切除位置（足首関節の近位）を示し、（２）は、ミリスケールを示し、（３）は、正常脛骨を示す。

以下の実施例は、本発明をより詳しく説明するものであり、本発明の特許請求の範囲を
制限するものではない。

実施例１

１．ＥＣＭ 新鮮なブタの膀胱を取り、文献に記載の方法に従ってＥＣＭ凍結乾燥粉末
を調製した。［Ａｇｒａｗａｌ Ｖ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＳＡ， Ｒｅｉｎｇ Ｊ． Ｅ
ｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｉｓｓｕ
ｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａｌｓ． ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２０１０，ＵＳＡ １０７：３３５１〜３３５５］。
ＥＣＭ凍結乾燥粉末を、吸湿してゲル状となるように濡れた環境（湿度が８５％を超え
）に分散させた。

２．組換えヒトタンパク質ＢＭＰ−２は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社（Ｃａｔａｌｏｇ＃１
２０−２）から購入したものである。希釈後のＢＭＰ−２の濃度は１００μｇ／ｍｌであ
り、ＢＭＰ−２の希釈液は、５％トレハロースを含むリン酸塩緩衝液（ＰＨ＝７．２）で
ある。

３．切断趾モデル及び誘導剤の使用方法
マウス後肢の両側趾を遠位の２本目の趾横紋で切除（Ｐ２骨中部）し、切除面を離れた
組織を全て分離して廃棄した。上記「誘導剤の調製」に記載の方法により誘導剤を調製し
、調製した誘導剤を傷口に移植して損傷した骨組織との接触状態を維持した。

４．方法及び結果
ＥＣＭゲルとＢＭＰ−２液（希釈液でＢＭＰ−２を希釈して得られた溶液）とを適切な
重量比で混合した。混合物を造形した後、Ｐ２部位で切除したマウス趾の残端に移植した
。本実施例におけるＥＣＭゲルの用量は０．２５mg／趾（乾燥重量）であり、ＢＭＰ液の
用量は０．２５μｌ／趾であり、ＢＭＰとＥＣＭとの乾燥重量比はＢＭＰ：ＥＣＭ＝１：
１００００である。３５日後、再生したＰ２趾の長さは元のＰ２趾を超え、厚さは元のＰ
２趾に相当し、再生趾の骨量は元の趾骨量を超え、過剰なマウス趾再生に該当する。結果
を図１〜図３に示す。

実施例２

２．１ 「骨率」で誘導剤の再生量を評価する。
マウスＰ２骨での切除実験から明らかであるように、切除された元の組織を使用しない
場合に、該誘導剤は、切断趾の残端で骨、筋肉／皮膚等の軟組織の同調再生を誘導するこ
とができる。これにより、残趾の長さを延長し、残趾の厚さを増加させることができる。
再生した骨組織は、細孔構造を有する骨であり、骨の表面が凹凸であるが、再生骨内の細
孔構造が経時的に減少することで、骨の表面が滑らかになる傾向がある。

骨再生は、切断趾が再生したか否かを判断する指標である。そこで、本明細書において
、再生効果は、Ｐ２骨の相対骨量（「骨比」（算式１．））で示され、算式の無損傷趾は
中間趾であり、ヒトの中指に相当し、再生趾は、中間趾に隣接する両側趾であり、それぞ
れヒトの示指、環指に相当する。マウス趾の切除位置は、いずれも両側趾（「示趾」及び
「環趾」）のＰ２骨の中部であり、対応する体表位置は両側趾の２本目の横紋であり、中
間趾の３本目の趾横紋に相当する（図１）。無損傷の場合、成体昆明マウスのＰ２骨比は
０．９２６（即ち、正常骨比＝０．９２６）である。以降、再生量は「骨率」で示される
。骨率は、骨比を０．９２６（正常骨比）で正規化した百分率である（算式２．）。例え
ば、無損傷の場合、正常骨率は１００％（＝正常骨比÷０．９２６×１００％）である。
算式１． 骨比＝再生趾のＰ２骨量÷無損傷趾のＰ２骨量
算式２． 骨率＝骨比÷０．９２６×１００％
（即ち、骨率＝再生趾のＰ２骨量÷無損傷趾のＰ２骨量÷０．９２６×１００％）

２．２軟組織を残さない切断趾再生

このモデルは、マウスの後肢の両側趾の骨及び軟組織をＰ２骨の中部で切除し、切除面
を離れた全ての組織を分離して廃棄した。切除の４日後、傷口が自然に癒合した後、誘導
剤を傷口に移植してＰ２骨の残断面との保持を維持した。処理せずにそのまま３５日保持
した後、マウスを安楽死させ、サンプリングして検出した。実験で用いられるマウスは、
全て成体昆明マウスであり、各群に３匹のマウスがあり、各匹のマウスに対して左右から
それぞれ２つの趾を切除し、各群は、合計１２個の趾を切除した。

ＥＣＭ及びＢＭＰの再生効果を比較するために、文献［Ｙｕ Ｌ， Ｈａｎ Ｍ， Ｙ
ａｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＢＭＰ２ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｅｇｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｄｉｇｉｔ ａｎｄ
ｌｉｍｂ ａｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｙ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ ｎｅｗ ｅ
ｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｅｎｔｅｒ． ［Ｊ］．Ｄｅｖ
ｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ． ２０１２，３７２：２６３−２７３］に従っ
て、ブルーガム粒子ｂｅａｄ群（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ Ｂｌｕｅ Ｇｅｌ ｂｅａｄｓ，Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ社から購入、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）、即ちＢＭＰ単独群を確立した。
ＢＭＰの濃度は５００μｇ／ｍｌ、選択されたｂｅａｄの直径は０．４ｍｍ、ＢＭＰ担持
可能量は１６．７ｎｇ（併用−１２５群のＢＭＰは１５．６ｎｇ／趾）である。ＥＣＭ単
独群は、ＢＭＰを添加しない群であり、ＥＣＭの用量が０．２５ｍｇ／趾（乾燥重量）で
ある。両側趾を切除した後、誘導剤を使用しない群をブランク対照群と呼ぶ。ブランク群
、ＥＣＭ単独群、ＢＭＰ単独群の平均骨率は、それぞれ５１．７％、６０．０％及び６２
．５％（図４）である。Ｔ検定により、ＥＣＭ単独群／ブランク群、ＢＭＰ単独群／ブラ
ンク群のｐ値は、いずれも０．０５未満であり、ＥＣＭ単独群／ＢＭＰ単独群のｐ値が０
．０５を超える。ブランク群に対して、ＥＣＭ単独群、ＢＭＰ単独群では、平均骨率はそ
れぞれ８．３％及び１０．８％増加した。これは、ＥＣＭ単独、ＢＭＰ単独は、顕著な切
断趾再生作用を有し、両者の作用効果には、大きな差異がないことを示している。

ＥＣＭとＢＭＰの混合誘導剤は、ＢＭＰの濃度によって３０、６０、１２５、２５０、
５００（μｇ／ｍｌ）に分けられた。ＥＣＭゲルの用量は０．２５mg／趾（乾燥重量）、
ＢＭＰ液の用量は０．１２５μｌ／趾である。ＢＭＰ濃度が１２５μｇ／ｍｌである場合
に、併用−１２５群と記する。他の命名は、同じようにする。併用−１２５群では、ＢＭ
ＰとＥＣＭとの乾燥重量比はＢＭＰ：ＥＣＭ＝３：５００００であり、併用−１２５群の
平均骨率は８３．０％であり、ブランク群に対して平均骨率は３１．３％増加した。これ
は、ＥＣＭ与ＢＭＰの併用が顕著な相乗効果を発揮することを示している。ＥＣＭとＢＭ
Ｐの混合誘導剤の再生骨量は、ＢＭＰ濃度の増加につれて増加し、２５０μｇ／ｍｌの骨
率は１１５．１％であり、過剰な骨再生であり、５００μｇ／ｍｌ群の骨率は１７７．３
％であり、ＥＣＭ群の約３倍（図５）である。

２．３ 軟組織を残した切断趾再生

このモデルは、Ｐ２骨を中部で切断し、切断面を離れたＰ２骨及び全てのＰ３骨を外し
、皮膚等軟組織を残し、誘導剤が残った軟組織中に包まれるように再生誘導剤を移植した
。処理せずにそのまま３４日保持した後、マウスを安楽死させ、サンプリングして検出し
た。群別、誘導剤の成分及び用量は、２．２軟組織を残さない切断趾再生と同じである。

併用−３０群の骨率は１０１．４％であり、過剰な骨再生である。軟組織を残した創傷
モデルの再生骨量もＢＭＰ濃度の増加につれて増加するが、軟組織を残さないモデルに対
して増加が顕著ではなく、隣接する濃度間は、併用−２５０と併用−５００の間のみに顕
著な差異がある（ｐ＝０．０２３）。各群の骨率は、いずれも軟組織を残さないモデルの
対応する群よりも高く、併用−５００のみが例外であり、ＥＣＭ単独の約１．５倍である
（図５）。これは、軟組織を残すことは、趾骨の再生に対して顕著な促進作用を有するこ
とを示している。異なる創傷モデルは、ＢＭＰ濃度の増加による再生量の増加が異なる。

実施例３

１．新鮮なブタの小腸を取り、粘膜下層を鈍的に機械的分離し、文献に記載の方法に従
ってＥＣＭ凍結乾燥粉末を調製した。 ［Ａｇｒａｗａｌ Ｖ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＳＡ
， Ｒｅｉｎｇ Ｊ． Ｅｐｉｍｏｒｐｈｉｃ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏ
ａｃｈ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｍａｍｍａ
ｌｓ． ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ２０１０，ＵＳＡ １０７
：３３５１〜３３５５］。

２．組換えヒトタンパク質ＢＭＰ−９はＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社（Ｃａｔａｌｏｇ＃１２
０−０７）から購入された。希釈後のＢＭＰ−９濃度は６０μｇ／ｍｌであり、ＢＭＰ−
９の希釈液は５％トレハロースを含むリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．２）である。ＢＭＰ−
９が完全に溶解した後、ハイドロキシアパタイト粉末をこの溶液に加えた。ハイドロキシ
アパタイト粉末は、蘇州鼎安科技有限公司の製品である。

３．切断肢モデル及び誘導剤の使用方法
マウスの後肢骨を足首関節の近位で切除し（図６）、切除面を離れた全ての骨組織を分
離して廃棄した。一部の軟組織を残し、軟組織の断面を骨断面の遠位から約３ｍｍの位置
に位置させた。自然止血後、誘導剤を残った軟組織に移植し、損傷した骨組織と接触した
ままで、処理せずに傷口を自然癒合させた。

４．方法及び結果
ＥＣＭ凍結乾燥粉末と希釈したＢＭＰ−９とを、適切な重量比で混合した。ＢＭＰとの
乾燥重量比はＢＭＰ：ＥＣＭ＝３：１０００００（３：十万）である。本実施例において
、ＥＣＭ凍結乾燥粉末の用量は４mg／肢、ＢＭＰ液の用量は２μl／肢、ハイドロキシア
パタイト粉末の用量は０．２mg／肢である。４５日後、サンプリングして検出した結果、
再生骨と元の骨との接合が緊密であり、再生骨のサイズは、３．９８×１．８６×３．０
４ｍｍである（図６）。

Claims (15)

1. 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び／又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）を含み、好まし
   くは、細胞外マトリックス及び／又は骨形成タンパク質を主要な活性成分として含み、例
   えば、前記再生誘導剤は、唯一の活性成分として細胞外マトリックス及び／又は骨形成タ
   ンパク質を含む、再生誘導剤。
2. 細胞外マトリックスは、動物組織や器官に由来し、前記動物組織や器官は、小腸、気管
   、膀胱、骨の細胞外マトリックスを含むが、これらに限定されず、或いは
   細胞外マトリックスは、非動物組織や器官に由来する、請求項１に記載の再生誘導剤。
3. 細胞外マトリックスは、物理的または化学的方法で処理して得られたものであり、前記
   処理方法は、凍結乾燥、粉砕、分解、架橋、ゲル化、３Ｄプリント造形を含むが、これら
   に限定されない請求項１又は２に記載の再生誘導剤。
4. 骨形成タンパク質は、ＢＭＰスーパーファミリーの骨形成タンパク質であり、ＢＭＰ−
   ２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−３Ｂ／ＧＤＦ−１０、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、
   ＢＭＰ−７／ＯＰ−１、ＢＭＰ−８／ＯＰ−２、ＢＭＰ−８Ｂ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１
   ０、ＢＭＰ−１１、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、ＢＭＰ−１４、ＣＤＭＰ−１、ＣＤＭ
   Ｐ−２、ＣＤＭＰ−３、ＧＤＦ−１、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−４、ＧＤＦ−５
   ／ＣＤＭＰ−１／ＢＭＰ−１４、ＧＤＦ−６／ＣＤＭＰ−２／ＢＭＰ−１３、ＧＤＦ−７
   ／ＣＤＭＰ−３／ＢＭＰ−１２、ＧＤＦ−８及び／又はＧＤＦ−９を含むが、これらに限
   定されない、請求項１〜３の何れか１項に記載の再生誘導剤。
5. ＢＭＰは、ＢＭＰの抽出に用いられる原料、例えば、骨基質ゼラチン、又は前記原料か
   ら得られたＢＭＰ含有抽出物によって提供される、請求項１〜４の何れか１項に記載の再
   生誘導剤。
6. 骨形成タンパク質は、ＢＭＰにより骨生成作用を発揮する外因性添加物に置き換えられ
   、フォリスタチンなどのＢＭＰ結合タンパク質、ＢＭＰタンパク質を生成可能な活性物質
   を含むが、これらに限定されない、請求項１〜５の何れか１項に記載の再生誘導剤。
7. 補助剤をさらに含み、前記補助剤は、ハイドロキシアパタイト粉末及び／又は無機塩を
   添加した希釈液である、請求項１〜７の何れか１項に記載の再生誘導剤。
8. 希釈液は、純水、リン酸塩緩衝液、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液等を含むが、これ
   らに限定されず、好ましくは、純水又は中性緩衝液であり、より好ましくは５％トレハロ
   ースを含有するリン酸塩緩衝液（好ましくはｐＨ＝７．２）である、請求項１〜７の何れ
   か１項に記載の再生誘導剤。
9. 軟組織を残さない骨再生を誘導する請求項１〜８の何れか１項に記載の再生誘導剤。
10. 外用薬であり、組織の損傷箇所に移植することで作用を発揮し、再生過程において部分
    的に又は完全に吸収される請求項１〜９の何れか１項に記載の再生誘導剤。
11. ＢＭＰとＥＣＭの乾燥重量比は、１００：１〜１：１００００００、１０：１〜１：１
    ００００００、１：１００〜１：１００００００、１：１００〜１：１０００００、１：
    １０００〜１：１００００００、１：１０００〜１：１０００００、１：２０００〜１：
    １０００００、１：４０００〜１：７００００又は１：５０００〜１：５００００である
    骨再生、好ましくは軟組織を残さない骨再生を誘導するＢＭＰとＥＣＭとの組み合わせ。
12. 被験体の骨再生のための薬物の調製における請求項１〜１０の何れか１項に記載の再生
    誘導剤又は請求項１１に記載の組み合わせの使用であって、
    前記骨再生は、軟組織を残さない骨再生である使用。
13. 請求項１〜１０の何れか１項に記載の再生誘導剤又は請求項１１に記載の組み合わせを
    被験体の欠損部位に接触することを含み、好ましくは、前記骨再生は、軟組織を残さない
    骨再生である、被験体の欠損部位の骨再生を実現する方法。
14. ＢＭＰとＥＣＭを混合するステップを含む請求項１〜１０の何れか１項に記載の前記再
    生誘導剤の調製方法。
15. 希釈液でＢＭＰを希釈するステップ（ｉ）と、
    希釈したＢＭＰ液とＥＣＭを混合するステップ（ｉｉ）と、
    ステップ（ｉｉ）で得られた混合物を再生される骨の形状に造形するステップ（ｉｉｉ
    ）と、
    ステップ（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）で得られた誘導剤を乾燥させるステップ（ｉｖ）と、
    を含む請求項１４に記載の方法。