JP2019527674A - 諸疾患を予防または治療するための、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを含むCblファミリー阻害剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、自然免疫を調節することによる諸疾患の予防または治療に関する。本発明は、患者の諸疾患の予防または治療に使用するためのCblファミリー阻害剤(ここでCblファミリー阻害剤は、Sykの結合ペプチドと、細胞送達部分と、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドとを含み、ここでCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、Cblファミリータンパク質のTKBドメインに結合する)、キットおよびこれらの利用を提供する。
Description
本発明は、新規なCblファミリータンパク質阻害剤に関するとともに、Cblファミリーメンバーを抑制して免疫系の活性を調節し、特に真菌感染症(特にカンジダ症)またはがんを予防または治療することに関する。
E3ユビキチンリガーゼのCblファミリーは、メンバーとして3種類のタンパク質、すなわちCbl(c−Cblとしても知られる)、Cbl−b、Cbl−c(Cbl−3としても知られる)を含んでいる。Cbl−b(casitas b系列リンパ腫b)は、元々は適応免疫応答の負の調節因子として報告された。極めて重要なシグナル伝達分子がCbl−bを媒介としてユビキチン化されることにより、T細胞受容体(TCR)のシグナル伝達とB細胞受容体(BCR)のシグナル伝達の両方が変化する。その帰結として、Cbl−bは、いくつかの疾患(特にがん)の治療において免疫療法の標的となってきた(アメリカ合衆国特許出願公開第2010/0260808 A号)。アメリカ合衆国特許第8,168,176 B2号には、Cbl−bの投与によって内毒素を媒介とした病気(敗血症を含む)を治療する方法が記載されている。Cbl−bの別の役割は、NK細胞を媒介とした抗腫瘍免疫(アメリカ合衆国特許出願公開第2014/0010781 A号)、マスト細胞におけるFcεRシグナル伝達、インテグリンのシグナル伝達、DC機能におけるものであり、Cbl−bの機能が自然免疫系の細胞へと拡張される。Cbl−bが標的とするシグナル伝達分子は特定の経路に特異的ではないことがしばしばあるため、多数のシグナル伝達モジュールによって使用され得る。
Kawai(2015年)は、アテロコラーゲン(ATCOL)をベースとした送達方法を利用してペンタペプチドをCbl−b阻害剤として細胞に送達することによる骨格筋萎縮の予防に関する。
Kumar(2012年)は、Cbl(TKB)(c−Cblとしても知られる)阻害剤の同定に関する。
Ruzza(2009年)は、治療薬としてのSyk阻害剤の見通しに関する。Syk阻害剤は、Sykの効果を増進するCbl阻害剤とは反対の効果を有する。
真菌は、重病の患者における主要な病原体であるとますます認識されてきており(Enoch他、2006年)、真菌感染症は毎年150万人の生命を奪っていると推定されている。カンジダ種とクリプトコッカス種は、臨床において最も高頻度で単離される酵母である。カンジダ・アルビカンスは、先進国において重篤な真菌感染症を患っている患者から最も高頻度で単離される真菌病原体である(Kullberg他、2015年)。アスペルギルス種は、最も一般的に単離される侵襲性カビである(Denning、1998年)。抗悪性腫瘍剤と免疫抑制剤、広域抗生物質、人工装具とグラフト、より侵襲的な手術を利用することが理由で、侵襲性真菌感染症が増加している。火傷や膵炎の患者も真菌感染症になりやすい(Enoch他、2006年)。免疫状態が損なわれた患者は、HIV感染(Armstrong−James他、2014年;Brown他、2014年;Park他、2009年)や、免疫抑制(Ravikumar他、2015年)や、ある種の原発性免疫不全(Lanternier他、2013年;Lortholary他、1997年)で観察されるように、深刻な真菌感染症が進行する大きなリスクを抱えている。
酵母、カビ、二形性菌が、ヒトで疾患を引き起こすことが知られている3種類の真菌である(Jain他、2010年)。真菌感染症は3つのグループに分類される。すなわち1)皮膚、毛髪、爪に存在する表面的/皮膚感染症、2)皮膚の下の組織に存在する皮下感染症、3)全身性感染症である。
いくつかの抗真菌剤が異なる種類の真菌感染症の治療に用いられている。アムホテリシンBは、大半の酵母とカビに対して有効な非常に広域の活性を有するポリエンであり、抗真菌剤のクラスに属していて局所または全身に投与することができる。しかし副作用が50〜90%のケースで発生しており、それは通常は腎毒性または輸注関連である。発熱、寒気、吐き気、嘔吐、低血圧が、それ以外の副作用である。フルコナゾールはアゾール系抗真菌剤に属しており、経口投与または静脈内投与される。欠点には、いくつかのカンジダ株の抵抗性と、頭痛、吐き気、嘔吐、肝臓酵素の上昇といった副作用が含まれる。
さらに、Cblタンパク質にはさまざまな機能があること、そしてCblタンパク質が、がんの進行と、がんに対する免疫応答の調節の両方において役割を果たしていることから、多面的な治療機会が提供される。したがってCblタンパク質によって調節される経路を標的とすることで、がんを治療する魅力的な機会が提供される可能性がある。
まとめると、既知の抗真菌剤または抗がん剤の有効性および/または安全性は多くの場合にまだ不十分であるため、新しい抗真菌剤と抗がん剤が大いに必要とされている。真菌感染症および/またはがんを予防または治療するための新規な化合物と方法を提供することが、本発明の目的の1つである。
本発明により、casitas b系列リンパ腫ファミリー(Cblファミリー)活性を抑制する方法と手段が提供され、この方法と手段により、特に真菌感染症に感染したとき、またはがんに罹患したときに患者の健康を顕著に改善することができて、真菌感染症で罹患率(例えば図1a参照)と死亡率(図1b)を顕著に低下させることと、がんで腫瘍の成長を顕著に低下させること(図15a)が可能であることが非常に際立っている。したがって本発明により、患者で真菌感染症および/またはがんの予防または治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤が提供される。真菌感染症は酵母感染症であることが好ましく、日和見酵母感染症であることがより好ましい。より一層好ましいのは、真菌感染症がカンジダ症またはクリプトコッカス症であることである。一実施態様では、Cblファミリータンパク質阻害剤は、脾臓チロシンキナーゼ(Syk)の結合ペプチドを含んでいる。
本発明の別の1つの側面では、細胞送達部分とCblファミリータンパク質結合ペプチドを含んでいて、そのCblファミリータンパク質結合ペプチドがCblファミリーのメンバーのチロシンキナーゼ結合(TKB)ドメインに結合する融合ペプチドが提供される(したがってこのペプチドは、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドとも呼ばれる)。注目すべきことに、この融合ペプチドは、致死的真菌感染症(図12b)とがん(図15a)からの保護に非常に有効であることがわかったが、任意の用途または利用でCblファミリータンパク質阻害剤として使用することができ、その中には治療での利用が含まれる。
さらに本発明は、細胞送達部分とCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを含んでいて、そのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがイントラマーまたはアプタマーであってCblファミリーのタンパク質を抑制する融合ペプチドに関する。このCblファミリー結合ペプチドは、Cblファミリーのメンバー(Cbl−bが好ましい)のTKBドメインに結合することが好ましい。
本発明はさらに、患者でワクチンアジュバントとして用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤に関するものであり、そのCblファミリータンパク質阻害剤は、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである。Cblファミリー結合ペプチドは、Cblファミリータンパク質のTKBドメインに結合することが好ましい。特に好ましいのは、Sykのペプチド(断片)、またはSykに由来するペプチド(断片)である。
本発明は、上記の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物にも関する。
それに加えてさらに、本発明により、アジュバントとしてCblファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンが提供される。Cblファミリータンパク質阻害剤は、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、少なくとも1つの抗原であることが好ましい。
別の1つの側面では、本発明は、上記のペプチドと医薬として許容可能な賦形剤を含むキットにも関する。医薬として許容可能な賦形剤は、患者で細胞内投与するのに適していることが好ましい。
本発明は、自然免疫を調節する方法にも関係しており、この方法は、Cblファミリータンパク質を抑制することを含んでいる。上記の融合ペプチドまたはCblファミリータンパク質阻害剤を患者に投与することが好ましい。
さらに、別の1つの側面では、本発明は、インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法に関するものであり、この方法は、その細胞を上記の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと接触させること、またはその細胞を上記の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドで処理することを含んでいる。
本発明のすべての側面と実施態様は、Cblファミリータンパク質結合ペプチドを用いたCblファミリータンパク質の抑制に関する。明示的に述べられている場合は除き、本明細書に提示するより詳細なすべての一般的な記述と具体的な記述は、好ましい実施態様を含め、本発明のあらゆる側面と利用に同様に関係する。例えばペプチドまたはそのCblファミリーTKBドメイン結合部分の好ましい任意の定義を本発明のあらゆる側面または方法で用いることができる。
発明の詳細な説明
E3ユビキチンリガーゼのCblファミリーは、多彩な細胞系においてシグナル伝達の調節に重要な役割を果たしている(Sohn他、2003年)。Cblタンパク質のアミノ末端ドメインは、チロシンキナーゼ結合(TKB)ドメインとRINGフィンガードメインで構成されており、その両方が、シグナル伝達とタンパク質分解を調節している(Ohno他、2016年;Peschard他、2004年)。Cblファミリーのメンバー(例えばCbl−b)による基質の認識には主にそのTKBドメインが関与していて、TKBドメインが、標的分子(例えばZAP−70、Syk、Src)上のホスホチロシンと、RTK(例えばEGFR受容体、Met受容体、CSF−1受容体)内に位置する残基を認識する(Mancini他、2002年;Peschard他、2001年;Peschard他、2004年;Tsygankov他、2001年)。Cbl−bは、元々は適応免疫応答の負の調節因子として特徴づけられた(Bachmaier他、2000年;Chiang他、2000年)。極めて重要なシグナル伝達分子がCbl−bを媒介としてユビキチン化されることにより、T細胞受容体(TCR)のシグナル伝達とB細胞受容体(BCR)のシグナル伝達の両方が変化する(Loeser他、Cell cycle 2007年;Kitaura他、2007年)。例えばCbl−bの遺伝子除去(Bachmaier他、2000年;Chiang他、2000年)または触媒的に不活性なCbl−bC373A/C373Aバリアントのノックイン(Paolino他、2011年)が、特に抗原チャレンジの後に広い自己免疫症状を引き起こすことが報告されている。最近の観察から、Cbl−bの別の役割が、NK細胞を媒介とした抗腫瘍免疫(Paolino他、2014年)、マスト細胞におけるFcεRシグナル伝達(Gustin他、2006年;Qu他、2004年)、インテグリンのシグナル伝達(Han他、2010年)、DC機能(Wallner他、2013年)において発見されていて、Cbl−bの機能が自然免疫系の細胞へと拡張される。Cbl−bが標的とするシグナル伝達分子は特定の経路に特異的ではないことがしばしばあるため、多数のシグナル伝達モジュールが使用することができる。
E3ユビキチンリガーゼのCblファミリーは、多彩な細胞系においてシグナル伝達の調節に重要な役割を果たしている(Sohn他、2003年)。Cblタンパク質のアミノ末端ドメインは、チロシンキナーゼ結合(TKB)ドメインとRINGフィンガードメインで構成されており、その両方が、シグナル伝達とタンパク質分解を調節している(Ohno他、2016年;Peschard他、2004年)。Cblファミリーのメンバー(例えばCbl−b)による基質の認識には主にそのTKBドメインが関与していて、TKBドメインが、標的分子(例えばZAP−70、Syk、Src)上のホスホチロシンと、RTK(例えばEGFR受容体、Met受容体、CSF−1受容体)内に位置する残基を認識する(Mancini他、2002年;Peschard他、2001年;Peschard他、2004年;Tsygankov他、2001年)。Cbl−bは、元々は適応免疫応答の負の調節因子として特徴づけられた(Bachmaier他、2000年;Chiang他、2000年)。極めて重要なシグナル伝達分子がCbl−bを媒介としてユビキチン化されることにより、T細胞受容体(TCR)のシグナル伝達とB細胞受容体(BCR)のシグナル伝達の両方が変化する(Loeser他、Cell cycle 2007年;Kitaura他、2007年)。例えばCbl−bの遺伝子除去(Bachmaier他、2000年;Chiang他、2000年)または触媒的に不活性なCbl−bC373A/C373Aバリアントのノックイン(Paolino他、2011年)が、特に抗原チャレンジの後に広い自己免疫症状を引き起こすことが報告されている。最近の観察から、Cbl−bの別の役割が、NK細胞を媒介とした抗腫瘍免疫(Paolino他、2014年)、マスト細胞におけるFcεRシグナル伝達(Gustin他、2006年;Qu他、2004年)、インテグリンのシグナル伝達(Han他、2010年)、DC機能(Wallner他、2013年)において発見されていて、Cbl−bの機能が自然免疫系の細胞へと拡張される。Cbl−bが標的とするシグナル伝達分子は特定の経路に特異的ではないことがしばしばあるため、多数のシグナル伝達モジュールが使用することができる。
脾臓チロシンキナーゼ(Syk)は、Cblファミリーのタンパク質(特にCbl−b)が標的とするシグナル伝達タンパク質である。特にC型レクチン受容体(CLR)であるデクチン−1、デクチン−2、デクチン−3によって誘導される古典的シグナル伝達は、Sykの活性化に決定的に依存する(Gross他、2009年;Mocsai他、2010年)。Sykはデクチン−1、デクチン−2/3、Mincle受容体複合体にリクルートされた後、Srcファミリーのキナーゼを通じたリン酸化と自己リン酸化の両方によって活性化される(Deng他、2015年)。すると活性化されたSykは、インフラマソーム(Gross他、2009; Gringhuis他、2012年;Zwolanek他、2014年)、古典的NF−κBシグナル伝達(LeibundGut−Landmann他、2007年;Ruland、2008年)、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞(DC)における活性酸素種(ROS)の産生(Mocsai他、2010年)を開始させる。これらが合わさってCLRによりSykが活性化されて殺真菌経路がただちに活性化されるとともに、細胞の種類に特異的な転写の変化が局所的または全身性の真菌感染症の根絶に向けて誘導される。Sykシグナル伝達は、がんにおいてもある役割を果たしている。
本発明によれば、Cblファミリータンパク質阻害剤(特にCbl−b阻害剤)の投与により、最も優勢な酵母病原体であるカンジダ・アルビカンスの感染と、それに似た真菌病原体の感染によって誘発される罹患と死亡から保護されることが見いだされた。Cblファミリータンパク質阻害剤(特にCbl−b阻害剤)の投与により、腫瘍の成長が顕著に低下することも見いだされた。したがって第1の側面では、本発明により、患者で真菌感染症またはがんの予防または治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤(例えばCbl−b阻害剤)が提供される。ただしその真菌感染症は酵母感染症である。患者は、例えば疾患の症状を有するか予後不良であり、治療を必要としている可能性がある。
Cblファミリーの遺伝子とその遺伝子産物はこれまでに詳しく記述されている(例えばCbl−bに関しては、UniGene Id.Mm.328206とHs.430589も参照されたい)。Cblファミリーのタンパク質配列は、例えばCbl−bについてはGenBankデータベースに登録番号NP_001028410.1(マウス)とNP_733762.2(ホモサピエンス)で公開されている。Cblファミリータンパク質阻害剤は先行技術で知られている。Cblファミリータンパク質阻害剤として適した抗Cblファミリータンパク質抗体、siRNA、アンチセンス阻害剤が市販されている。具体的には、Cblファミリーのタンパク質の発現を低下させるか抑制し、したがってCblファミリーの機能を低下させるか抑制するのにも適したsiRNAが、例えばアメリカ合衆国特許出願公開第2007/0054355 A1号、第2010/0260808 A号、第2014/0010781 A号に開示されている(これらのすべてが、参照によって本明細書に組み込まれている)。Cblファミリーのメンバーを抑制するペプチドは、Kawai(2015年)、Kumar(2012年)、Bechara(2013年)に開示されている。
任意のCblファミリータンパク質阻害剤(例えばCbl−b阻害剤)を本発明で用いることができる。一実施態様では、Cblファミリータンパク質阻害剤は、Cblファミリーのタンパク質(例えばCbl−b)を標的とする核酸(例えばCblファミリーの遺伝子発現を抑制する核酸であるsiRNA、shRNA、miRNA)から選択される。
Cblファミリーは、c−Cbl(またはCbl)、Cbl−b、Cbl−c(またはCbl−3)というメンバーを含んでいる。Cbl−b、すなわちCblファミリー結合ペプチドの標的が抑制されることが好ましい。さらに別の実施態様では、c−CblとCbl−cのいずれか一方、すなわちCblファミリー結合ペプチドの標的が抑制される。Cblファミリーのメンバーを本明細書では「Cbl−ファミリー−リガーゼ」、「Cblファミリーリガーゼ」、「Cblタンパク質」、「Cbl−ファミリータンパク質」、「Cbl−ファミリーメンバー」と呼ぶ。いくつかの実施態様では、阻害剤は、ファミリーの2つ以上のメンバー(例えばc−CblとCbl−b)と結合すること、またはファミリーの2つ以上のメンバーを抑制することができる。Cbl−bが最も好ましい標的であるため、本発明の任意の側面と好ましい実施態様はCbl−bの抑制として読まれ、本発明のあらゆる側面と実施態様において、例えばCblファミリータンパク質阻害剤としてはCbl−b阻害剤が可能であり、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドとしては(Cbl−bのTKBドメインに結合する)Cbl−b結合ペプチドが可能である。
臨床的に重要なサッカロミケス科のいくつかの酵母の感染症(例えばカンジダ感染症)に対する免疫応答は、Cblファミリーのメンバーによって調節されることが示されている。したがって好ましい一実施態様では、酵母感染症は、サッカロミケス科の酵母の感染症であり、より好ましいのはそれがカンジダ症またはクリプトコッカス症であることである。さらに好ましいのは、真菌感染症が、カンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症、カンジダ・ドゥブリニエンシス感染症のいずれかであることである。
本発明は、患者でがんおよび/または真菌感染症の予防または治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤にも関するものであり、そのCblファミリータンパク質阻害剤は、SykのCblファミリータンパク質結合ペプチドであり、特に好ましいのはSykのCbl−b結合ペプチドである。Syk遺伝子とその遺伝子産物は先行技術において周知である(UniGene Id.Mm.375031、Rn.87407、Mmu.32294、Hs.371720)。Syk配列は例えばGenBankデータベースに登録番号NP_001185906.2(マウス)、NP_036890.1(ラット)、NM_001261035.1(アカゲザル)、NP_003168.2(ホモサピエンス)で公開されている。Cblファミリーのメンバーに結合する上で重要な配列を含有するSykの断片は、治療でCblファミリータンパク質を抑制するための特に有効な治療剤であることが示されている。特にCblファミリータンパク質結合ペプチドは、CblファミリーのメンバーのTKBドメインに結合する(TBK(ドメイン)結合ペプチド)。
好ましい一実施態様では、Cblファミリータンパク質結合ペプチドは、Sykのホスホチロシンと周囲の隣接領域を含んでいる(マウスSykペプチドを示す図11eの右側部分)。本発明の一実施態様では、TKBドメイン結合ペプチドは、以下のコンセンサス配列:SFNPYEPX1X2X3(配列番号1)を有する。ただしX1、X2、X3は、独立に、任意のアミノ酸から選択される。アミノ酸は、タンパク質構成アミノ酸から選択されることが好ましく、例えばこのペプチドは、少なくとも50%のタンパク質構成アミノ酸を含むことができる。やはり好ましいのは、特に生体内でペプチドの安定性および/または薬力学を変化させるため、1個以上の非タンパク質構成アミノ酸を含むことである。この配列内のY(チロシン)はリン酸化されていることが好ましい。マウスでは、相同配列は、マウスSykのアミノ酸313〜322(Syk313−322)を有するSFNPYEPTGG(配列番号2)である。ラットでは、相同配列は、Sykの313〜322(Syk313−322)に位置するSFNPYEPTGG(配列番号2)である。アカゲザルでは、相同配列は、Sykの319〜328(Syk319−328)に位置するSFNPYEPEVA(配列番号3)である。ヒトでは、相同配列は、Sykの296〜305(Syk296−305)に位置するSFNPYEPELA(配列番号4)である。したがって特に好ましい一実施態様では、Cblファミリータンパク質結合ペプチドは、配列SFNPYEPTGG(配列番号2)、SFNPYEPEVA(配列番号3)、SFNPYEPELA(配列番号4)のいずれかを含んでいる。X1はTまたはEであることが好ましい。X2は、G、L、Vのいずれかであることが好ましい。X3は、GまたはAであることが好ましい。これら配列のバリアントも可能であるため、本発明は、SFNPYEPX1X2X3(配列番号1)、SFNPYEPTGG(配列番号2)、SFNPYEPEVA(配列番号3)、SFNPYEPELA(配列番号4)から選択された配列で任意の位置に1個または2個のアミノ酸の欠失または置換を有するものを含むペプチドを提供または利用することにも関する。
本発明の特に好ましい一実施態様では、Cblファミリータンパク質結合ペプチドは、以下のコンセンサス配列:STVSFNPYEPX1X2X3X4WX5(配列番号5)を含んでいる。ただしX1、X2、X3、X4、X5は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい。マウスでは、相同配列は、Sykの310〜325(Syk310−325)に位置するSTVSFNPYEPTGGPWG(配列番号6)である。ラットでは、相同配列は、Sykの310〜325(Syk310−325)に位置するSTVSFNPYEPTGGAWG(配列番号7)である。アカゲザルでは、相同配列は、Sykの316〜331(Syk316−331)に位置するSTVSFNPYEPEVAPWA(配列番号8)である。ヒトでは、相同配列は、Sykの293〜308(Syk293−308)に位置するSTVSFNPYEPELAPWA(配列番号9)である。したがって関連する一実施態様では、Cblファミリータンパク質結合ペプチドは、配列STVSFNPYEPTGGPWG(配列番号6)、STVSFNPYEPTGGAWG(配列番号7)、STVSFNPYEPEVAPWA(配列番号8)、STVSFNPYEPELAPWA(配列番号9)のいずれかを含んでいる、好ましくはその配列からなる。特に、開示されている配列中に示されている配列部分−PYE−の中のチロシン(Y)はリン酸化されている。X1はTまたはEであることが好ましい。X2は、G、L、Vのいずれかであることが好ましい。X3は、GまたはAであることが好ましい。X4は、PまたはAであることが好ましい。X5は、GまたはAであることが好ましい。また、これら配列のバリアントも可能であるため、本発明は、STVSFNPYEPX1X2X3X4WX5(配列番号5)、STVSFNPYEPTGGPWG(配列番号6)、STVSFNPYEPTGGAWG(配列番号7)、STVSFNPYEPEVAPWA(配列番号8)、STVSFNPYEPELAPWA(配列番号9)から選択された配列で任意の位置に1個または2個または3個のアミノ酸の欠失または置換を有するものを含むペプチドを提供または利用することにも関する。
Cblファミリータンパク質結合ペプチド(または融合ペプチドに含まれているその一部)は、アミノ酸の長さが5〜100個の短いペプチドであることが好ましく、アミノ酸の長さは8〜80個、または12〜60個が好ましい。
どの実施態様でも、融合ペプチド全体として、長さがアミノ酸15〜500個のペプチドが可能であり、アミノ酸の長さは15〜200個が好ましく、アミノ酸の長さは18〜100個がより一層好ましい。
CblファミリーのメンバーのTKBドメインに結合し、そのことによってその活性を抑制するCblファミリータンパク質結合ペプチドは、任意の形態、または複合体、または組成物にして細胞に投与することができる。投与のためのこの形態、複合体、組成物により、Cblファミリータンパク質結合ペプチドは、生きている細胞の中に入ることが可能になり、そのことによって細胞膜を通過する。好ましいのは、細胞送達部分または膜透過部分との複合体(例えば膜透過ペプチドとの融合ペプチド)である。複合体と融合ペプチドは、リンカー部分またはリンカーペプチドによって接続することができる。そのようなリンカーは通常は小さく、例えば10kDa未満、または5kDa未満、または長さがアミノ酸0個または1個から20個である。細胞に投与するための他の形態に含まれるのは、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームである。
興味深いことに、Cbl−bのTKBドメインに結合する融合ペプチド(図11e)は、カンジダ・アルビカンスの刺激(図11g、図11h;図12b)とがん(図15a)に応答して免疫機能を顕著に改善する。さらなる効果が、Cbl−bとc−Cblの両方で、腫瘍抗原に対するT細胞応答の活性化において示された。したがって別の1つの側面では、本発明は、細胞送達部分と、Cblファミリーのメンバー(Cbl−bおよび/またはc−Cblが好ましい)のTKBドメインに結合する(特に上記の)Cbl−b結合ペプチドとを含む融合ペプチドに関する。特に融合ペプチドは、細胞送達部分と、CblファミリーのメンバーのTKBドメインに結合するCblファミリータンパク質結合ペプチドを含むか、細胞送達部分と、CblファミリーのメンバーのTKBドメインに結合するCblファミリータンパク質結合ペプチドからなる(したがってこのペプチドは、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドとも呼ばれる)。細胞送達部分として膜透過ペプチドが可能である。細胞への送達で可能な経路は、小胞などと細胞膜の融合であり、脂質二重層、移行、エンドサイトーシスのいずれかを通じて侵入する。
膜透過ペプチド(CPP)は、通常はカチオン性または両親媒性の短いペプチドであり、多彩な生物学的積荷(cargo)の細胞内送達を媒介する(Bechara他、2013年;Jones他、2005年、en.wikipedia.org/wiki/Cell−penetrating_peptide、これらはすべて、参照によって本明細書に組み込まれている)。タンパク質に由来するペプチドと、キメラペプチドと、合成CPPが、CPPの識別可能な主要な3つのクラスである(Bechara他、2013年)。CPPは低い毒性などの重要な利点を有するため、インビトロと生体内において、生物学的に活性なペプチドを細胞間で輸送するための一般的なバイオテクノロジーの技術になっている(Jones他、2005年;Lindsay他、2002年)。したがって好ましい一実施態様では、融合ペプチドの細胞送達部分は膜透過ペプチドである。CPPの重要な代表例は、アンテナペディア、Tat、トランスポータン、dNP1、dNP2(Lim他、2015年)、ポリアルギニンである。アンテナペディアは、取り込みの多さと細胞毒性の両方を考慮すると、インビトロでのペプチド送達にとって特に有用であることが示されている(Jones他、2005年)。特に有効なのは、2個、3個、4個、5個、6個、7個、またはそれ以上のカチオン(特にカチオン性アミノ酸残基であるH、K、Rであり、KとRから選択することが好ましい)を含むCPPである。CPPの選択は、DRQIKIWFQNRRMKWKK(配列番号10)、GRKKRRQRRRPPQ(配列番号11)、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL(配列番号12)、(KKDKKDERRXAK)m(配列番号13)(ただし1≦m≦5であり、XAは、KとRから選択される)、(KIKKXBKKKGRK)m(配列番号14)(ただし1≦m≦5であり、XBは、V、I、T、(R)nから選択され、6≦n≦12である)からなされることが好ましい。これらのCPP配列は繰り返すこと、例えば二重にすることができる。好ましいCPPは、KIKKTKKKGRKKIKKTKKKGRK(配列番号43のアミノ酸1〜22)である。CPP(または融合タンパク質に含まれている)は長さがアミノ酸8〜100個であり、長さがアミノ酸10〜80個または12〜60個であることが好ましい。
別の好ましい一実施態様では、融合ペプチドのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、上記のようにSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであるか、Sykに由来する。CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであるとともに、自然免疫の調節因子であることが好ましい。このペプチドは、自然抗寄生虫免疫または自然抗真菌免疫または自然抗がん免疫の調節因子であることが好ましい。
CblファミリーのメンバーのTKBドメインに結合する別のタンパク質またはペプチド(例えば、骨格筋成長のカギとなる中間体であってインスリン様増殖因子(IGF−1)によって調節されるインスリン受容体基質1(IRS−1)(Nakao他、2009年;Ohno他、2016年)、またはT細胞発達とリンパ球活性化においてある役割を果たす70kDaのゼータ関連タンパク質(Zap−70)のタンパク質またはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチド)を用いることができる。それに加え、受容体チロシンキナーゼ(RTK)(例えばCblファミリーのメンバーのTKBドメインと相互作用するEGFR、Met受容体、CSF1受容体)の中に位置する残基を用いることができる(Mancini他、2002年;Nakao他、2009年;Ohno他、2016年;Peschard他、2001年;Peschard他、2004年;Tsygankov他、2001年)。Cbl−bのTKB結合部位のいくつかは、ホスホチロシンを含む配列モチーフを共有している。例えばCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、配列モチーフN/DXpYを有することが好ましい。ただしXは任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質生成および/または非タンパク質構成アミノ酸を含有することが好ましい。N/Dはアスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)であり、pYはホスホチロシンである。より好ましいのは、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列モチーフN/DX1pYX2P(配列番号15)を持つことである。ただしX1とX2は任意のアミノ酸から選択され、上記のようにタンパク質生成および/または非タンパク質構成アミノ酸を含有することが好ましい。N/Dはアスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)であり、pYはホスホチロシンである。より一層好ましいのは、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、アミノ酸5〜20個の長さの配列を持つこと、および/またはSykとの配列一致が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%であることである。さらなる一実施態様では、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、Zap−70またはIRS−1の断片である。マウスとヒトのZap−70では、配列モチーフN/DX1pYX2P(配列番号15)の相同配列は、マウスの288〜292の位置(マウスZap−70288−292)、ヒトの290〜294の位置(ヒトZap−70290−294)にあるDGpYTP(配列番号16)である。マウスとヒトのIRS−1では、配列モチーフN/DX1pYX2Pの相同配列は、マウスの606〜610の位置(マウスIRS−1606−610)、ヒトの610〜614の位置(ヒトIRS−1610−614)にあるDGpYMP(配列番号17)である。したがってさらに別の好ましい一実施態様では、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、DGpYTPまたはDGpYMPを含むか、DGpYTPまたはDGpYMPからなる。
CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがチロシンを含んでいて、そのチロシンがリン酸化されていることが好ましい。チロシンをリン酸化するとCblファミリーのメンバー(特にCbl−b)との相互作用が増加するため、チロシンのリン酸化は、本発明のあらゆる側面における好ましい一実施態様である。
これらペプチドの任意のものをレトロ−インベルソ(retro−inverso)ペプチドとして用いることができる。レトロ−インベルソペプチドは、配列が逆転している。すなわち左から右に向かって書かれる配列をN末端からC末端へと読むのではなく、配列をC末端からN末端へと読む。レトロ−インベルソペプチドの1つの利点は、増大した安定性である。レトロ−インベルソ配列になったどのペプチドもL型ではなくてD型である(Brugidou他、1995年;Snyder他、2004年;Tugyi他、2005年;Wang他、2017年を参照されたい)。例えば配列番号1のコンセンサス配列(SFNPYEPX1X2X3)は、dX3dX2dX1dPdEdYdPdNdFdS(ただし「d」はD型アミノ酸を表わす)になる(レトロ−インベルソSFNPYEPX1X2X3とも呼ばれる)。あるいは配列番号10(DRQIKIWFQNRRMKWKK)の膜透過ペプチドは、dKdKdWdKdMdRdRdNdQdFdWdIdKdIdQdRdDになる(レトロ−インベルソDRQIKIWFQNRRMKWKKとも呼ばれる)。他の特性は以前のままである。すなわちチロシンはリン酸化されていることが好ましく、他のペプチド(正常なペプチドとさらに別のレトロ−インベルソペプチドの両方)に含まれるか、他のペプチドに結合するか、他のペプチドと融合することができる。ペプチドの安定性増大を実現するのに所与のペプチド配列の配列全体をレトロ−インベルソ型にする必要はなく、1個または数個のアミノ酸で十分である。例えばCblファミリー結合ペプチドと膜透過ペプチドの一方または両方が、1個、2個、3個、4個、5個、6個、またはそれ以上のレトロ−インベルソアミノ酸を含有しており、CPPは、レトロ−インベルソアミノ酸またはレトロ−インベルソ配列を含有することが好ましい。便宜上の理由で、D−アミノ酸がさらに隣接していない1個のD−アミノ酸が含まれる場合には、このアミノ酸を、配列逆転が起こっていないため単純にD型と呼ぶ。2個以上のD−アミノ酸が連続している場合には、連続したこれらD−アミノ酸の配列を逆転させ、この部分をレトロ−インベルソ型と呼ぶ。
本発明はさらに、融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。担体は、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進することができる。
好ましい一実施態様では、医薬として許容可能な担体は、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームから選択される。これらは、細胞へのペプチドの取り込みを、治療に利用するために、または治療以外に利用するためにも、増大させることができる。医薬組成物は、医薬として許容可能な塩、緩衝液、等張剤、医薬として許容可能な担体を含むことができる。医薬用担体は組成物の適合性を向上させ、活性成分の可溶性改善と生物学的利用能改善を可能にする。その例は、乳化剤、増粘剤、レドックス成分、デンプン、アルコール溶液、ポリエチレングリコール、脂質である。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、非経口投与(特に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、腹腔内投与)用に調製されるか、非経口投与で使用される。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、局所投与用に調製されるか、局所投与で使用され、皮膚浸透増進剤をさらに含むことが好ましい。適切な皮膚浸透増進剤の選択は、安息香酸C12−C15アルキル、ペンチレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシジグリコール、ジメチルスルホキシド、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート(モノラウリン酸ポリエチレンソルビタン)、レシチンと、これらの混合物を含むグループからなされる。別の好ましい一実施態様では、医薬組成物は、腫瘍内投与用および/または腫瘍周辺投与用に調製されるか、腫瘍内投与および/または腫瘍周辺投与で使用される。
本発明のペプチドまたは医薬組成物は治療用であることが好ましく、そのペプチドまたは組成物が患者に投与される。より好ましいのは、そのペプチドまたは医薬組成物が、患者の真菌感染症および/またはがんの予防用または治療用であることである。
Toll様受容体(TLR)とCLRは、侵入する病原体(病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれる)の保存されている構造を認識し、したがって免疫応答を誘導することが示されている(KawaiとAkira、2010年;KawaiとAkira、2011年)。Chibaら(2014年)は、CLRデクチン−1が腫瘍細胞を認識し、その帰結として抗腫瘍応答のために自然免疫細胞を活性化することを証明した。デクチン−1は、腫瘍細胞が特異的に発現する糖エピトープのための受容体として機能する。近位デクチン−1シグナル伝達の負の調節におけるCbl−bの機能が原因で、TKB結合ペプチドはデクチン−1のシグナル伝達を増大させて自然免疫系による腫瘍細胞の免疫認識に影響を与える。Cbl−bを本発明で抑制することによる免疫系の活性化増大に加え、この機構が、自然免疫系によって駆動される抗腫瘍免疫をさらに増進する。したがって本発明のさらに好ましい一実施態様では、本発明のペプチドまたは医薬組成物は、腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫(特に細胞内寄生虫)感染症、真菌症、薬剤性免疫抑制の予防または治療に使用される。特に好ましいのは、腫瘍とがんの治療である。本明細書では、本発明のCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが腫瘍の成長を低下させ、免疫系の抗腫瘍反応性を増大させることが示された。治療するさらに別の疾患または病気は、先天性または後天性の免疫不全(例えばエイズ)、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、薬剤性免疫抑制、がんと、場合によっては疾患特異的抗原の選択によって特徴づけられる。固形腫瘍を含むがんの治療が特に好ましい。
腫瘍細胞ではN−グリカン構造が大いに発現している。本発明の別の好ましい一実施態様では、本発明のペプチドまたは医薬組成物は、N−グリカンを大量に発現しているそのような腫瘍の予防または治療に用いるためのものである。特定のタイプの細胞内の高レベルのN−グリカン量(モル)は、腫瘍でないそのタイプの細胞で見られるN−グリカンの少なくとも1.5倍である。腫瘍でないそのタイプの細胞は、例えばメラノサイト、上皮細胞、リンパ球、間葉細胞、肺細胞、血液細胞、肝細胞である。本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に従って治療すべきがん疾患または腫瘍疾患の選択は、卵巣がん、精巣がん、前立腺がん、乳がん;消化管のがん疾患(特に胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がん、食道がん、肝臓がん);腎臓がん、皮膚がん(特にメラノーマ)、基底細胞癌、扁平細胞癌;神経芽細胞腫、膠芽腫、肺がん、甲状腺がん、肉腫、頭部と首のがん、扁平細胞癌、リンパ腫、白血病からなされる(ただし「がん」、「腫瘍」、「癌」などは、本明細書では常に交換可能に使用され、悪性疾患を意味する)。
使用するペプチドまたは医薬組成物は、融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを1mg〜500mg含むものを、好ましくは7日間、14日間、21日間、28日間までのいずれか、および/または毎日、患者に腹腔内注射によって投与することが好ましい。5mg〜200mgと10mg〜100mgも、好ましい用量である。
Cbl−bは、自然免疫系と獲得免疫系の負の調節因子である(図3)。したがって本明細書に規定したCbl−b結合ペプチドは、ワクチンアジュバントとして投与するとき、自然免疫反応と獲得免疫反応の両方を正方向に刺激することができる。具体的には、本明細書に規定したCbl−b結合ペプチドは、ワクチン接種の間にチェックポイント阻害を取り除くことができる。したがって本発明によって患者でワクチンアジュバントとして用いるためのCbl−b阻害剤または他の任意のCblファミリータンパク質阻害剤も提供され、そのCblファミリータンパク質阻害剤は、本明細書に規定したCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである。一実施態様では、ワクチン接種は、腫瘍、ウイルス感染症、細菌感染症、寄生虫感染症のいずれかに対するものである。関連する一実施態様では、本発明により、アジュバントとしてCblファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンが提供される。Cblファミリータンパク質阻害剤は、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、少なくとも1つの抗原であることが好ましい。
本明細書では、「ワクチン接種」は、絶対的な意味、すなわち免疫系による絶対的な保護につながる免疫原の投与と理解するのではなく、免疫系による保護を増大させるため、および/または免疫系、特にワクチン抗原に対する免疫系の細胞を活性化させるための免疫学的投与と理解するべきである。本発明のCblファミリータンパク質阻害剤、特に本発明のペプチドは、患者でワクチン抗原に対する免疫反応性を増大させる、および/または患者で免疫反応性そのものを増大させる。
好ましい一実施態様では、治療する患者は哺乳動物である。さらに好ましい一実施態様では、患者はヒトである。別の一実施態様では、ワクチンアジュバントとして用いるCblファミリータンパク質阻害剤は、抗原を含むワクチンとともに患者に投与されて、その抗原に対する免疫反応がCblファミリータンパク質抑制によって増大することになる。代わりの一実施態様では、Cblファミリータンパク質阻害剤は、ワクチンを投与する前および/または後に患者に投与される。
本発明により、Cblファミリータンパク質の抑制が全身性真菌感染症と皮膚真菌感染症(カンジダ症が好ましい)の治療に有効であることが示された(例えば実施例3、図5h)。皮膚真菌感染症としてさらに皮膚糸状菌症が可能であり、全身性真菌感染症としてアスペルギルス症も可能である。皮膚真菌感染症は局所療法によって治療することができる。局所抗真菌投与剤形に含まれるのは、クリーム、軟膏、ゲル、ローション、粉末、溶液、スプレーである。本発明では、本明細書に記載した融合ペプチドを用いた治療が、すでに罹患している真菌性敗血症の治療において有効であることがさらに証明された(実施例6、図10j、図10k、図12g〜図12k)。真菌性敗血症は増加しつつあり、かなりの罹患率と死亡率に関係していると報告されている(LepakとAndes、2011年)。好ましい一実施態様では、本発明のCblファミリータンパク質阻害剤、ペプチド、組成物のいずれかを用いて治療する真菌感染症は、皮膚糸状菌感染症またはアスペルギルス感染症である。真菌感染症は、急性、全身性、皮膚性のいずれかであることが好ましい。
患者は、敗血症(特に真菌感染症が原因の敗血症(「真菌性敗血症」))に罹患しているか、敗血症になるリスクがあることが好ましい。免疫刺激、特に病原体に対する免疫反応を本発明で増大させることにより、敗血症のリスクを阻止するか低下させることができる。急性敗血症では、免疫クリアランスを早めることができる。
治療する疾患または病気は、急性でも慢性でもよい。慢性状態は、少なくとも90日間と定義される。急性の治療は、その疾患または病気になってから0日目〜89日目、好ましくは4日目〜30日目に開始することができる。
本発明の好ましい実施態様では、Cblファミリーのメンバーの機能低下または機能抑制は一過性である。すなわち機能は一時的に低下するだけであるため、例えば阻害剤の消費または分解によって再び回復することができる。インビトロまたは患者の体内での免疫細胞内のCblファミリーの一時的低減を、例えば治療が成功するまで繰り返して実施することもできる。
本発明のさらに好ましい一実施態様では、Cblファミリータンパク質阻害剤またはペプチドまたは医薬組成物は、患者の静脈内、動脈内、筋肉内、血管内、皮下、腹腔内のいずれかに投与される。より好ましいのは、治療すべき患者が哺乳動物であることである。より一層好ましいのは、患者がヒトであることである。
別の好ましい一実施態様では、使用するCblファミリータンパク質阻害剤またはペプチドは、医薬として許容可能な担体(特に小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソーム)を用いて患者に投与される。
したがって本発明は、自然免疫を調節する(特に増大させる)方法にも関係しており、この方法は、例えば上述のように患者の体内の少なくとも免疫細胞内でCblファミリータンパク質を抑制することを含んでいる。本明細書に開示した融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを患者に投与することが好ましい。より好ましいのは、自然免疫が、自然抗寄生虫免疫、自然抗真菌免疫、自然抗腫瘍免疫であることである。
本発明の治療が標的とする免疫細胞、または本発明の治療による影響を受ける免疫細胞は、抗原提示細胞、および/またはPBMC(末梢血単球細胞)、および/またはTリンパ球、および/またはBリンパ球、および/または単球、および/またはマクロファージ、および/または樹状細胞であることが好ましく、特に、Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、CD4+ Tリンパ球、特にTh1、Th2、Th17、Treg(制御性T細胞)、CTL(細胞傷害性T細胞)、NK細胞であることが好ましい。
本発明はさらに、ペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤とを含むキットに関する。このキットは、患者で細胞内投与に適していることが好ましい。上記のように患者への任意の投与経路を選択することができる。キットは、化合物(例えば本発明のペプチドまたはCblファミリータンパク質阻害剤)と、細胞を処理するための医薬組成物または他の試薬の補助物質とを収容する容器を含むことができ、このキットを本発明の任意の方法または任意の利用で用いることができる。容器および/またはキットは、刺激をさらに大きくするため、(本発明のペプチドとは別に)さらなる免疫刺激物質(サイトカイン、または他の受容体(例えばTLR)のリガンドが好ましい)、または表面分子(CD3および/またはCD28が好ましい)に対する抗体も含むことができる。同様に、キットまたは容器は、安定化させる成分、媒体、緩衝液も含むことができる。
キットでは、または患者または細胞の併用療法では、インビトロまたはインビボで、本発明のCblファミリータンパク質阻害剤を別の免疫刺激化合物と組み合わせることができる。免疫刺激化合物は免疫細胞刺激サイトカインなどであり、そのサイトカインの選択は、例えば一般的なγ鎖サイトカイン(特に、IL−2、IL−15、IL−21);適応免疫系と自然免疫系両方の細胞を刺激するサイトカイン(特にIL−12、IL−23、IL−27);エフェクタ細胞サイトカイン(例えばIL−1、IL−17、IL−18);インターフェロン、(特にインターフェロンα);インターフェロン刺激因子;抗体(特に腫瘍細胞表面分子、TLRリガンド、PAMP受容体リガンドを認識する抗体であり、特にTLR−1、TLR−2、TLR−3、TLR−7、TLR−8、TLR−9のアゴニストが好ましい)からなされる。本発明による免疫細胞刺激サイトカイン、適応免疫系と自然免疫系両方のサイトカイン、エフェクタ細胞サイトカイン、インターフェロン刺激因子の選択は、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−11、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17a、IL−17f、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−25、IL−26、IL−27、IL−28、IL−29、IL−30、IL−31、IL−32、IL−33、IL−34、IL−35、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、IFN−λ、TNF(以前はTNFα)、リンホトキシンα(以前はTNFβ)を含むグループからなされることが好ましい。本発明の物質を投与する文脈で用いられる「同時に」または「とともに」または「との組み合わせで」または「と組み合わせて」という表現は、Cblファミリータンパク質阻害剤以外の少なくとも1つの免疫刺激化合物を投与することを意味する。投与が複数の異なる医薬組成物を用いてなされる場合には、組み合わせ投与は、同時に、または順番に実施することができる。
Cblファミリーのタンパク質(例えばCbl−b)は、インビトロで自然免疫細胞(特にマクロファージと樹状細胞)において機能し、Cbl−bの抑制によって免疫細胞の免疫応答または活性が増大した。したがって本発明は、免疫細胞の活性化に関する。免疫細胞として、抗原提示細胞、および/またはPBMC(末梢血単球細胞)、および/またはTリンパ球、および/またはBリンパ球、および/または単球、および/またはマクロファージ、および/または樹状細胞が可能であり、特に、Tリンパ球、CD8+ Tリンパ球、CD4+ Tリンパ球、特にTh1、Th2、Th17、Treg(制御性T細胞)、CTL(細胞傷害性T細胞)、NK細胞が可能である。このような細胞は、本発明のCblファミリータンパク質阻害剤で処理して刺激することもできる。したがって本発明により、免疫細胞を刺激または活性化するインビトロの方法として、その細胞を、本明細書に開示した融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと接触させること、またはそのペプチドで処理することを含む方法が提供される。この方法は、活性化または刺激された免疫細胞によるサイトカインの産生を含むことが好ましい。例えば産生されるサイトカインは、IL−6、IL−1β、IL−23、TNFから選択される。
本明細書では、「治療する」または「治療」という用語は、すでに存在する疾患状態または病気を治癒させること、または疾患状態または病気からの回復の可能性を大きくすることを意味する。治療するには、抑制すること、すなわち疾患状態または病気の進行を停止させることと、改善させること、すなわち疾患の後退を引き起こすことも含むことができる。治療は、患者の治癒に至らなくても疾患の症状を改善することでもよい。
本明細書では、「予防する」または「予防」という用語は、患者または対象で疾患状態または病気が起こるのを完全に止めることを意味するのではなく、疾患状態または病気が進行するリスクを減らすことを意味する。
好ましい一実施態様では、本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な非経口投与用の1種類以上の賦形剤をさらに含むことができる。適切な賦形剤は当業者に知られており、例えば水(特に注射用の水)、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、緩衝液、ハンク溶液、小胞形成化合物(例えば脂質)、不揮発性油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の5%デキストロース、等張性と化学的安定性を増大させる物質、緩衝液、保存剤が挙げられる。この医薬組成物は、それを必要とする患者(すなわち本明細書で言及した疾患または病気に罹患している患者、または本明細書で言及した疾患または病気が進行するリスクを有する患者)に(薬として)当業者に知られた適切な手続きで投与することができる。この医薬組成物の好ましい投与経路は、非経口投与、特に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、髄腔内投与、皮下投与、腹腔内投与、局所投与である。非経口投与のためには、本発明の医薬組成物は、医薬として許容可能な上記の担体とともに製剤にされて、注射可能な単位剤形で、例えば溶液、懸濁液、乳液として提供される。しかし用量と投与方法は、治療する個々の患者によって異なる。この医薬組成物は、他のペプチド投与計画から知られている適切な任意の用量で、または所与の個人のために特別に評価されて最適化された用量で投与することができる。例えば活性剤(すなわち本発明の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチド)は、医薬組成物の中に1mg〜10g、好ましくは50mg〜2g、特に100mg〜1gの量で存在することができる。通常の用量は、患者の体重(kg)をもとにして決定することもでき、例えば好ましい用量は、(投与セッションごとに)体重1kg当たり0.1mg〜100mg、特に体重1kg当たり1mg〜10mgの範囲である。投与は、例えば1日1回、2日に1回、1週間に1回、2週間に1回が可能である。本発明の医薬組成物の好ましい投与様式は非経口投与であるため、液体であること、または液体(例えば減菌水、脱イオン水、蒸留水、減菌等張リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS))に容易に溶けることが好ましい。このような組成物1000μg(乾燥重量)は、本発明の活性剤を0.1〜990μg(好ましくは1〜900μg、より好ましくは10〜200μg)と、(好ましくは最終体積の中に等張緩衝液を生じさせるため)場合によっては1〜500μg(好ましくは1〜100μg、より好ましくは5〜15μg)の(緩衝)塩と、場合によっては0.1〜999.9μg(好ましくは100〜999.9μg、より好ましくは200〜999μg)の他の賦形剤を含むことが好ましい。このような乾燥組成物100mgを減菌脱イオン水/蒸留水、または減菌等張リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)に溶かして最終体積を0.1〜100ml(好ましくは0.5〜20ml、より好ましくは1〜10ml)にすることが好ましい。
本明細書では、「結合している」または「結合する」という用語は、分子A(例えばCblファミリータンパク質に結合する分子であるCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドなど)が、分子B(Cblファミリータンパク質様Cbl−b、特にそのTKBドメイン)に対して1000nM(好ましくは100nM未満、より好ましくは50nM未満、より一層好ましくは10nM未満、特に5nM未満)よりも小さい(すなわち「より強い」)解離定数(「親和性」とも呼ばれる)を有することを要求する。
予防または治療する患者は哺乳動物であることが好ましく、特にヒトであることが好ましい。典型的には、(本明細書に規定した真菌感染症に罹患していることが好ましく、特に本明細書に規定した真菌感染症と診断されている)患者は、本発明の治療を必要としている。真菌感染症を予防するための本発明の処置の文脈では、患者として、真菌感染症に罹患していないが、真菌感染症が進行するリスクがある患者(例えば免疫不全患者)が可能である。別の一実施態様では、(本明細書に規定したがんに罹患していることが好ましく、特に本明細書に規定したがんと診断されている)患者は、本発明の治療を必要としている。がんを予防するための本発明の処置の文脈では、患者として、がんに罹患していないが、がんが進行するリスクがある患者が可能である。
本明細書では、「TKB結合ペプチド」という用語は、Cblファミリー結合タンパク質(例えばCblファミリーのメンバー(例えばCbl−b)のTKBドメインに結合するCbl−b結合ペプチド)を意味する。
「含む」は、個数制限のない用語として用いられており、他の要素も存在していてよいことを意味する。「からなる」は、個数制限のある用語として用いられているため、記載されている本発明の1つの要素または要素群は、記載されている要素だけからなる。ある1つの要素または要素群を含むと記載されている本発明の一実施態様は、そうでないと述べられているのでなければ、その要素または要素群だけからなることも可能である。
「1つの」という単語の使用は、請求項および/または明細書の中で「含む」という用語とともに用いるときには「1つ」を意味することができるが、「1つ以上」、「少なくとも1つ」、「2つ以上」の意味とも合致している。
以下の実施態様で本発明をさらに規定する。
1.細胞送達部分と、casitas B系列リンパ腫ファミリー(Cblファミリー)TKBドメイン結合ペプチドとを含む融合ペプチド。そのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、Cblファミリータンパク質のチロシンキナーゼ結合(TKB)ドメインに結合する。あらゆる実施態様と本発明のさらなる定義2〜47では、Cblファミリータンパク質はCbl−bであることが好ましく、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、Cbl−bのTKBドメインに結合するCbl−b結合ペプチドである。
2.前記細胞送達部分が膜透過ペプチドである、項1に記載の融合ペプチド。
3.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、脾臓チロシンキナーゼ(Syk)のペプチド断片である、項1または2に記載の融合ペプチド。
4.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列モチーフN/DXpYを有する(ただしXは任意のアミノ酸から選択され、N/Dはアスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)であり、pYはホスホチロシンである)、項1〜3のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
5.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列モチーフN/DX1pYX2Pを有する(ただしX1とX2は任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましく、N/Dはアスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)であり、pYはホスホチロシンである)、項1〜4のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
6.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、70kDaのゼータ関連タンパク質(Zap−70)またはインスリン受容体基質1(IRS−1)のペプチド断片である、項1、2、4、5のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
7.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがCblファミリーのメンバーに結合し、チロシンを含んでいて、そのチロシンがリン酸化されている、項1〜6のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
8.以下のコンセンサス配列:
SFNPYEPX1X2X3
を含み(ただしX1〜X3は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい)、より好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのペプチド断片である、項1〜7のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
SFNPYEPX1X2X3
を含み(ただしX1〜X3は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい)、より好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのペプチド断片である、項1〜7のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
9.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列SFNPYEPTGGを含む、項8に記載の融合ペプチド。
10.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列SFNPYEPTGGを含む、項8に記載の融合ペプチド。
11.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列SFNPYEPEVAを含む、項8に記載の融合ペプチド。
12.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列SFNPYEPELAを含む、項8に記載の融合ペプチド。
13.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykに由来していて以下のコンセンサス配列:
STVSFNPYEPX1X2X3X4WX5
(ただしX1〜X5は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい)を含み、好ましくはこのコンセンサス配列からなり、より好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのペプチド断片である、項1〜12のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
STVSFNPYEPX1X2X3X4WX5
(ただしX1〜X5は、独立に、任意のアミノ酸から選択され、上記のタンパク質構成アミノ酸および/または非タンパク質構成アミノ酸を含むことが好ましい)を含み、好ましくはこのコンセンサス配列からなり、より好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのペプチド断片である、項1〜12のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
14.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列STVSFNPYEPTGGPWGを含み、好ましくはこの配列からなる、項13に記載の融合ペプチド。
15.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列STVSFNPYEPTGGAWGを含み、好ましくはこの配列からなる、項13に記載の融合ペプチド。
16.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列STVSFNPYEPEVAPWAを含み、好ましくはこの配列からなる、項13に記載の融合ペプチド。
17.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが配列STVSFNPYEPELAPWAを含み、好ましくはこの配列からなる、項13に記載の融合ペプチド。
18.前記配列中のチロシンがリン酸化されている、項8〜17のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
19.前記膜透過ペプチドが、DRQIKIWFQNRRMKWKK、GRKKRRQRRRPPQ、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL、(KKDKKDERRXAK)m(ただし1≦m≦5である)から選択され、XAがK、R、(KIKKXBKKKGRK)m(ただし1≦m≦5である)から選択され、XBがV、I、T、(R)n(ただし6≦n≦12である)から選択される、項2〜18のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
20.項1〜19のいずれか1項に規定した細胞送達部分と、CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを含んでいて、そのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがイントラマーまたはアプタマーであって、Cbl−bなどのCblファミリータンパク質を抑制し、好ましくはCblファミリータンパク質のTKBドメインに結合する、融合タンパク質。
21.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであり、そのペプチドが自然免疫の調節因子である、項1〜20のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
22.前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであり、そのペプチドが、自然抗寄生虫免疫、または自然抗真菌免疫、または自然抗腫瘍免疫の調節因子である、項1〜21のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
23.項1〜22のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、細胞へのそのペプチドの取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物。
24.医薬として許容可能な前記担体が、小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームから選択される、項23に記載の医薬組成物。
25.非経口投与用、特に静脈内投与用、動脈内投与用、筋肉内投与用、髄腔内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用、局所投与用いずれかに調製されている、項23または24に記載の医薬組成物。
26.局所投与用に調製されており、好ましくは皮膚浸透促進剤をさらに含む、項23または24に記載の医薬組成物。
27.治療用であり、患者に投与される、項1〜26のいずれか1項に記載のペプチドまたは医薬組成物。
28.患者で真菌感染症の予防または治療に用いるための、項27に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
29.SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである、項27または28に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
30.腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症(特に細胞内寄生虫感染症)、薬剤性免疫抑制いずれかの予防または治療に用いるための、項27〜29のいずれか1項に従って使用するためのペプチドまたは医薬組成物。
31.項27〜30のいずれか1項に記載のペプチドまたは医薬組成物であって、そのペプチドが、患者に、前記融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを1mg〜500mgの用量にして、好ましくは7日間、14日間、21日間、28日間までのいずれか、および/または毎日投与される、ペプチドまたは医薬組成物。
32.患者でワクチンアジュバントとして治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤、好ましくはCbl−b阻害剤であって、好ましくはそのCblファミリータンパク質阻害剤がCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであり、より好ましくはSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである、Cblファミリータンパク質阻害剤。
33.患者で真菌感染症の予防または治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤であって、その真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症またはクリプトコッカス症である、Cblファミリータンパク質阻害剤。
34.患者で真菌感染症の予防または治療に用いるためのCblファミリータンパク質阻害剤であって、そのCblファミリータンパク質阻害剤が、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドを含む、Cblファミリータンパク質阻害剤。
35.前記真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症であり、特にカンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症、またはカンジダ・ドゥブリニエンシス感染症である、項27〜34のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
36.前記真菌感染症が皮膚糸状菌感染症またはアスペルギルス感染症である、項27〜34のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
37.前記真菌感染症が、急性、または全身性、または皮膚性である、項27〜36のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
38.前記患者が真菌性敗血症に罹患しているか、真菌性敗血症が進行するリスクを有する、項27〜37のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
39.前記患者に静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、血管内投与、皮下投与、腹腔内投与、髄腔内投与のいずれかで投与される、項27〜38のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
40.前記患者が哺乳動物であり、好ましくはヒトである、項27〜39のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤、またはペプチド、または医薬組成物。
41.医薬として許容可能な担体、特に小胞、ミセル、リポソーム、ミクロソームのいずれかを用いて前記患者に投与される、項27〜40のいずれか1項に従って使用するためのCblファミリータンパク質阻害剤またはペプチド。
42.Cblファミリータンパク質阻害剤をアジュバントとして含むワクチンであって、好ましくはそのCblファミリータンパク質阻害剤が、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、少なくとも1つの抗原を含み、好ましくはそのCblファミリータンパク質阻害剤が、項1〜22と項27〜40のいずれか1項に記載のものである、ワクチン。
43.好ましくは項1〜22と項27〜40のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたはCblファミリータンパク質阻害剤を患者に投与することによってCblファミリータンパク質を抑制することを含む、自然免疫を調節するための、特に自然免疫を増進するための方法。
44.前記自然免疫が、抗寄生虫免疫、抗真菌免疫、抗腫瘍免疫のいずれかである、項43に記載の方法。
45.項1〜31のいずれか1項に記載のペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤、好ましくは患者の細胞内投与に適した賦形剤とを含むキット。
46.インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法であって、その細胞を、項1〜22のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと接触させるか、そのペプチドで処理することを含む方法。
47.サイトカインが産生され、好ましくはそのサイトカインがIl−6、IL−1β、TNFから選択される、項46に記載のインビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法。
本発明はさらに、以下の図面と実施例によって説明されるが、本発明がそれらに限定されることはない。
実施例1 − 材料と方法
マウス:Cbl−bΔ/Δマウス、Cbl−bC373A/C373Aマウス、Rag2Δ/Δ欠損マウスは以前に報告されており、それらのマウスをC57BI/6バックグラウンドで飼育した。マウスの遺伝子型をPCRによって評価した。注目すべきことに、それぞれ出産の同腹マウスから年齢と性別だけがマッチしたマウスを実験で使用した。オーストリアの現行法に合致した倫理的動物ライセンスプロトコルに従ってすべてのマウスを飼育して維持した。
骨髄キメラマウスの作製:骨髄キメラマウスを作製するため、8週齢の野生型またはRag2Δ/Δ欠損のC57BI/6マウスに放射線量を分割して照射し(2×6Gy)、2回目の照射の18時間後に300万個のドナー細胞を静脈内に注入することによってマウスを再構成した。実験は、完全な再構成が可能になるよう8週間後に実施した。再構成の8週間後、適用した条件下での再構成の効率を、同時出産のCD45.1レシピエントマウスを用い、脾臓細胞を染色してCD45.1(レシピエント由来)とCD45.2(ドナー由来)を探すことによって調べると、常に98%超であった。
好中球、単球、樹状細胞の単離と分化:好中球は、Ly−6G標識の後、マウスの頸骨と大腿骨から、以前に報告されている(Boxio他、2004年)ようにしてPercoll勾配(GE Healthcare社)を利用して単離するか、MACS技術(Miltenyi社)を利用して精製した。骨髄単球は、CD11b、Ly−6G、Ly−6Cに対して特異的な抗体を用いて標識した後、FACSソーティングによって精製した。脾臓樹状細胞は、CD19、TCRβ、Ly−6G、CD11cに対する抗体を用いて標識した後にFACSソーティングした。精製した好中球、単球、脾臓樹状細胞をRPMI−1640培地(PAA社)の中で培養した。骨髄前駆細胞からの分化によってBM−DCまたはBM−Mが得られた。末梢血の単球または好中球を顎下瀉血によって取得し、カリウムEDTA試験管(Sarstedt社、ドイツ国)の中に回収した。塩化アンモニウムカリウム(ACK)緩衝液を用いて赤血球細胞を溶解させた。
フローサイトメトリー:Fc受容体をブロックした後、氷の上のFACS染色緩衝液(2%FBSと2mM EDTAを補足したPBS)の中で30分間かけて白血球を抗体で標識した。Fixable Viability Dye eFluor780(eBioscience社)を用いて細胞の生存を評価した。臓器をコラゲナーゼ4(Worthington社)/DNAアーゼ(Roche社)で消化させ、生存性染色し、Fcをブロックし、抗体染色し、フローサイトメトリーによって免疫細胞のリクルートを評価した。サンプルはBD LSRIIフローサイトメータを用いて取得し、データはFlowJoソフトウエア(Treestar社)を用いて分析した。
サイトカイン放出、ROS生成、カスパーゼ−8活性の測定:eBioscience社(IL−1β、TNF、IL−6、IL−12、IL−23)またはR&D Systems社(IL−1Ra)から購入したELISAキットを製造者の指示に従って用い、細胞培養物の上清によるサイトカイン分泌、または腹腔洗浄液の中のサイトカイン分泌を評価した。以前に報告されている(Bourgeois他、2009年)ようにして、プローブとしてルミノールを用いたアッセイで活性酸素種(ROS)をリアルタイムで90分間にわたって測定した。CaspGLOWアッセイ(Promega社)を製造者の指示に従って利用してカスパーゼ−8活性を評価した。
ファゴサイトーシスアッセイ:ファゴサイトーシスアッセイのため、100mM HEPES緩衝液(pH7.5)の中でカンジダ・アルビカンス(株SC5314)をAlexa 488で標識した。BM−DCまたはBM−Mを標識したカンジダ・アルビカンスとともに37℃で45分間培養した。食細胞に接着しているが食細胞によるファゴサイトーシスは受けない真菌細胞による蛍光をトリパンブルー(Sigma Aldrich社)でクエンチし、ファゴサイトーシスの割合をフローサイトメトリーによって評価した。
殺菌アッセイ:殺真菌活性を評価するため、指定された免疫細胞を96ウエルのプレートに1×105細胞/ウエルの密度で播種した。細胞をカンジダ・アルビカンスとともに1:500の感染多重度で24時間培養した。インキュベーションの後、最終濃度4%のパラホルムアルデヒドを添加して食細胞を固定した。その後、カンジダ・アルビカンスをCrystal Violet(Sigma社)で染色し、食細胞ありのウエルと食細胞なしのウエルでのコロニー数を比較することによって殺菌を評価した。
マウスの感染症とクロドロン酸リポソーム処理:8〜10週齢のマウスの静脈内に105コロニー形成単位(CFU)のカンジダ・アルビカンス(株SC5314)、106コロニー形成単位(CFU)のカンジダ・ドゥブリニエンシス、105CFUのリステリア・モノサイトゲネス(株EGD)のいずれかを感染させた。カンジダ・アルビカンスのCFUは、報告されている(Wirnsberger他、2014年)ようにしてさまざまな臓器から評価した。クロドロン酸リポソームまたはPBSリポソームで処理する実験では、カンジダ・アルビカンスを静脈内に感染させる24時間前と24時間後の両方に、マウスに、マウスの体重10g当たり100μlのリポソームを腹腔内注射した。クロドロン酸またはPBSの対照リポソームはclodronateliposomes.orgから取得し、製造者の指示に従って取り扱った。すべてのマウス感染実験が、ウイーン医科大学の倫理委員会によって評価され、科学・研究局(ウイーン、オーストリア国)によって承認された。
BM−MとBM−DCの刺激実験:BM−MとBM−DCを、カンジダ・アルビカンス(株SC5314)、ザイモサン(Invivogen社)、カードラン(Invivogen社)、TDM(Invivogen社)、CpG(Invivogen社)、LPS(Invivogen社)、カンジダ・アルビカンス菌糸のいずれかで刺激した。抑制実験では、細胞を刺激する30分前にSyk阻害剤R406(Selleckchem社)、抗デクチン−1抗体(Invivogen社)、MG132(Calbiochem社)、Dynasore(Sigma−Aldrich社)のいずれかで処理した(MOI:免疫細胞:カンジダ・アルビカンス=1:2)。カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ドゥブリニエンシスの真菌単離体は、親切にもAllgemeines Krankenhaus Vienna(AKH)から提供された。真菌単離体をPCRによって調べ、それぞれの種を確認した。
定量PCR:SV−Total RNA Isolation System(Promega社)またはRneasy Kit(Qiagen社)を用いてmRNAを単離し、Reverse Transcription System(Promega社)またはiScript cDNA synthesis Kit(Biorad社)を用いて逆転写した。KAPA SYBR Fast Universal(Peqlab社)を用いてqPCRを実施した。
ウエスタンブロッティングと免疫沈降:ウエスタンブロッティングを標準的なプロトコルに従って実施した。リン酸化されたエピトープを探すため、1×TBS/0.1%Tween−20の中の5%ウシ血清アルブミン、または1×TBS/0.1%Tween−20の中の4%BSAでブロットを1時間ブロックした後、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。その後、ブロットを1×TBS/0.1%Tween−20の中で15分間ずつ3回洗浄した後、HRP共役二次抗体(1:2500;GE Healthcare社、#NA9340V)とともに室温で45分間インキュベートし、1×TBS/0.1%Tween−20の中で15分間ずつ3回洗浄し、増強化学発光(ECL Plus、Pierce社)を利用して可視化した。抗β−アクチンmAbを用いてタンパク質負荷を制御した。Cbl−b免疫沈降実験のため、細胞をカンジダ・アルビカンスで刺激し、ホスファターゼ阻害剤とプロテイナーゼ阻害剤(Halt プロテアーゼ/ホスファターゼ混合型阻害剤;Thermo Scientific社)を含有するRIPA緩衝液(Cell Signaling Technology社)の中で溶解させ、Protein A/G Plus Agaroseビーズ(Santa Cruz Biotechnology社)でプレクリアし、抗Cbl−b抗体とともに一晩インキュベートした。示されている抗体を用いて沈降物をウエスタンブロッティングによって分析した。デクチン−1とデクチン−2の免疫沈降物に関しては、示されている遺伝子型のBM−MをE−64(10μM)で30分間前処理し、カンジダ・アルビカンス酵母、またはカンジダ・アルビカンス菌糸を示されている期間にわたって感染させ、氷の上の2%SDSを含有するRIPA緩衝液の中で30分間溶解させ、SDSなしのRIPA緩衝液で希釈して最終SDS濃度を0.4%にした。短時間の超音波処理の後、抗デクチン−1抗体または抗デクチン−2抗体を1μg/mlの濃度で用いてライセートを免疫沈降させた。示されている抗体を用いて沈降物をウエスタンブロッティングによって分析した。
インビトロでのユビキチン化アッセイ:インビトロでのユビキチン化アッセイのための反応混合物は、100nmのUbe1(自家精製)、500nMのUbcH5b(Enzo Life Sciences社)、150nMの完全長ヒトCbl−b(Abnova社)またはヒトCbl−b29−483、触媒不活性なヒトC373A Cbl−b29−483変異体のいずれかと、100mMのユビキチン(Sigma−Aldich社)に加え、300nMの基質を、反応緩衝液(20mMのトリス−HCl pH7.5、150mMのNaCl、10mMのMgCl2、1mMのDTT)の中に含有していた。基質は、活性な(リン酸化された)ヒトSyk(Merck Millipore社)と、不活性な(リン酸化されていない)ヒトSyk−GST(Life technologies社)であった。1mMのATPを添加して反応を開始させ、37℃で30分間インキュベートした。TKB結合ペプチドを媒介としたCbl−b抑制に関しては、Cbl−bを濃度100μMのTKB結合ペプチドとともに24℃で20分間プレインキュベートした後、反応混合物に添加した。アッセイをSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare社)に移し、抗ユビキチン抗体または抗Syk抗体を用いてブロットした。
組み換えCbl−b29−483と組み換えC373A Cbl−b29−483の作製:Cbl−b29−483コード配列とC373A Cbl−b29−483コード配列をpGEX−2TKベクターにクローニングしてグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質を得た。Terrific Broth培地中でOD600を1にして0.3mMのイソプロピル−D−チオガラクトピラノシドを用い、20℃で一晩インキュベートすることにより、大腸菌BL21の中での発現を誘導した。細胞を溶解緩衝液(20mMのトリス−HCl pH7.5、100mMのNaCl、1mMのEDTA、0.5%のトリトンX−100)の中で溶解させ、3回軽く超音波処理し、グルタチオンセファロース4B(GE Healthcare社)とともに4℃で一晩インキュベートした。その後、セファロースビーズを溶解緩衝液で5回洗浄し、結合したタンパク質を溶離緩衝液(50mMのトリス−HCl、pH8.0、20mMの還元されたグルタチオン)で溶離させた。SDS−PAGEとウエスタンブロッティングを利用して溶離液のサイズと純度を調べた。
組織病理学:組織病理学的分析のため、腎臓を10%中性緩衝化ホルマリンの中で固定し、標準的な手続きに従って処理し、パラフィンの中に包埋し、切片にした。厚さ2μmの切片をヘマトキシリンとエオシン(H&E)、ヨウ素酸シッフ(PAS)、抗Ly−6G(Biolegend社;クローン1A8)のいずれかで染色した。抗原賦活化(BOND Epitope Retrievalキット、Leica社)の後、DAB増感と、1:100の一次抗体希釈液を用いた免疫組織化学を実施した。4μmの切片をゴモリメテナミン銀(GMS;Merck社)で染色した。染色されたスライドをPannoramicスライドスキャナ(3D Histech社)で走査し、炎症の重篤度と病巣内真菌負荷を以下の基準に基づいて評価した。
Definiens Tissue Studio(商標)ソフトウエアを適用し、冒された腎臓内のLy−6G+細胞による浸潤の程度を評価した。スライドの代表的な領域内の興味ある領域と細胞を手作業で分類してソフトウエアのアルゴリズムを訓練することで、Ly−6G陽性標的対象を同定し、非標的対象を排除した。標的対象は、形態と陽性免疫組織学的染色に基づいて同定した。その後、最適化されたアルゴリズムを適用して全スライドを自動的に分析した。分析の有効性は、両方の群からの代表的なスライドの組織病理学的検証によって確認した。
ペプチドの合成:ABI 433a Peptide Synthesizer(Applied−Biosystems社)でTKB結合ペプチドを合成するため固相ペプチド合成(SPPS)法を利用した。ペプチドをUltimate 3000 RP−HPLCシステム(Thermo Scientific社)で精製し、4800 MALDI TOF/TOF分析装置(ABSciex社)で分析した。凍結乾燥させたペプチドをPBSに溶かし、−80℃で保管した。
免疫蛍光:カンジダ・アルビカンスを感染させる24時間前にBM−CDをμ−スライド(IBIDI社)の上に播種した。感染後、細胞を氷上の4%PFAの中で20分間固定し、室温で10分間浸透させ(0.2%トリトンX−100を含むPBS)、室温で1時間ブロックした(3%BSAを含むPBS)。その後、細胞を3%BSAの中でSyk(1:100)またはShp−2(1:100)に対する一次抗体とともに一晩インキュベートした。次に細胞をPBSの中で洗浄し、3%BSAの中で室温にて抗ウサギAlexa555抗体(1:500)とともに1時間インキュベートした。細胞をPBSの中で洗浄した後、DAPIで対比染色し、Zeiss LSM780共焦点顕微鏡で直接画像を取得した。
NanoLC−MS分析:本研究で使用したナノHPLCシステムは、Q Exactive Plus質量分析器(Thermo Scientific社)に接続されていてProxeonナノスプレー源(Thermo Scientific社)を備えるUltiMate 3000 HPLC RSLCナノシステム(Thermo Scientific社)であった。ペプチドは、0.1%TFAを移動相として用いてトラップカラム(Thermo Fisher Scientific社、アムステルダム、オランダ国、PepMap C18、5mm×300μm ID、5μmの粒子、孔径100Å)に流速25μl/分で装填した。10分後、トラップカラムを分析カラム(Thermo Fisher Scientific社、アムステルダム、オランダ国、PepMap C18、500mm×75μm ID、2μmの粒子、100Å)に合わせて切り換えた。230nl/分の流速とバイナリ2h勾配を利用して165分間にわたってペプチドを溶離させた。30℃で平衡させるため、勾配は、98%水/ギ酸(99.9/0.1;v/v)と2%水/アセトニトリル/ギ酸(19.92/80/0.08;v/v/v)から開始し、120分間かけて35%水/ギ酸(99.9/0.1;v/v)と65%水/アセトニトリル/ギ酸(19.92/80/0.08;v/v/v)まで増加させた後、勾配を5分間かけて10%水/ギ酸(99.9/0.1;v/v)と90%水/アセトニトリル/ギ酸(19.92/80/0.08;v/v/v)にし、この比率を5分間維持し、その後、2分間かけて98%水/ギ酸(99.9/0.1;v/v)と2%水/アセトニトリル/ギ酸(19.92/80/0.08;v/v/v)に戻した。Q Exactive質量分析器をデータ依存モードで作動させ、フル走査(m/zの範囲370〜1650、公称解像度70,000、標的値3×106)の後、12種類の最も豊富なイオンのMS/MS走査を利用した。MS/MSスペクトルは、正規化された衝突エネルギー27%、分離幅2、標的値1×105を利用して取得した。断片化のために選択した前駆イオン(帯電状態2以上)を10秒間ダイナミック排除リストに載せた。アンダーフィル比を強度閾値が4×104になる20%に設定した。ペプチド一致機能と同位体排除機能を作動させた。
質量分析データの分析:ペプチドを同定するため、生ファイルをProteome Discoverer(バージョン1.4.0.288、Thermo Scientific社)にロードした。検索エンジンノードMSAmanda(Dorfer他、2014年)を利用し、生成したすべてのMS/MSスペクトルをFlyBase配列データベース(22,256個の配列;20,222,850個の残基)と、Taxonomy humanを用いたSwissprot配列データベース(20,170個の配列、11,318,213個の残基)で検索した。以下の検索パラメータを用いた:システインのβ−メチルチオ化を固定された修飾として設定し、メチオニンの酸化、リシンのアセチル化、セリン、トレオニン、チロシンのリン酸化、アスパラギンとグルタミンの脱アミド化、リシンのユビキチン化を可変修飾として設定した。トリプシンペプチドに関してタンパク質の質量に制限なしの中でモノアイソトピック質量を検索した。ペプチドの質量の許容誤差は±5ppmに設定し、断片の質量の許容誤差は±0.03Daに設定した。消化不備(missed cleavage)の最大数は2に設定した。Proteome Discovererに組み込んだPercolatorアルゴリズムを用いて結果をフィルタして1%FDRにした。Proteome Discovererに組み込まれていてホスホRSに基づくツールptmRS(Taus他、2011年)でペプチド内の可変修飾の部位を特定した。
データ分析と統計:特に断わらない限り、本明細書の中のすべての数値を平均値±標準偏差で与える。すべてのインビトロ実験を3〜5回独立に繰り返した。生体内実験は2〜6回繰り返した。図面と統計的分析は、PraphPad Prismソフトウエア(GraphPad Software社)を利用して生成させた。分析で除外したマウスはおらず、Definies Tissue studioソフトウエアを用いて組織病理学的分析をブラインドで実施した。マウスは遺伝子型に基づいて実験群に割り当て、性別と年齢が一致した群の中でランダム化した。マウスは近交系で性別と年齢が一致しているため、実験コホート間で似た分散になると仮定した。先験的なサンプルサイズ評価は実施しなかった。群の大きさは、使用したモデル系またはアッセイについて経験的に評価した変動性に基づいており、群は、第一種過誤と第二種過誤を最小にするためできるだけ多くのマウスを含んでいた。データは、示してあるように、対応のないスチューデントの両側t検定または二元配置分散分析を利用して分析した。生存率分析ではログ・ランク検定を実施した。P値<0.05を統計的に有意であるとした。
以下の抗体を本研究では使用した。
以下のPCRプライマーを本研究では使用した。
ヒトT細胞アッセイ:ヒトの血液からLymphoprep(商標)PBMC単離キット(Stemcell Technologies社)を製造者の指示に従って用いて末梢血単球細胞(PBMC)を精製した。CD4 MicroBeadsまたはCD8 MicroBeads(Miltenyi Biotec社)をそれぞれ用いるとともにMACS技術(Miltenyi Biotec社)を利用してヒトのCD4+T細胞またはCD8+ T細胞をPBMCから精製した。増殖アッセイのため、CD3抗体(OKT3、0.1μg/ml)とCD28抗体(CD28.2、0.1μg/ml)を含むPBSで平底96ウエルプレートを37℃にて2時間にわたって被覆した。増殖による拡張をモニタするため、カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル(CFSE;eBioscience社)で標識したT細胞を用いてアッセイを実施した。T細胞をX−VIVO 15という化学的に規定された無血清造血細胞培地(Lonza社)の中で、示されている濃度のペプチドまたはビヒクル対照とともに培養した。72時間後、細胞にCD4に対する抗体(RPA−T4、Brilliant Violet 510で標識、Biolegend社)またはCD8に対する抗体(RPA−T8、APC−eFluor 780 labeled, eBioscience社)と、CD69に対する抗体(FN50、PE/Cy7で標識、Biolegend社)で標識し、Beckman Coulter Galliosフローサイトメータで分析した。データはBeckman Coulter Kaluzaソフトウエアを用いて分析した。増幅アッセイの細胞培地の上清へのIFN−γの分泌は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を製造者(BD Biosciences社)の指示に従って用いて調べた。
マウスT細胞アッセイ:MACS技術(Miltenyi Biotec社)を利用し、プールした脾臓とリンパ節からマウスCD4+T細胞を精製した。増幅アッセイのため、CD3抗体(145−2C11、Biolegend社)とCD28抗体(37.51、Biolegend社)を含むPBSで平底96ウエルプレートを37℃にて2時間にわたって被覆した。精製したT細胞を細胞増殖染料eFluor 670(eBioscience社)で標識し、10%ウシ胎仔血清(Sigma社)、L−グルタミン(Thermo Fisher社)、ペニシリンとストレプトマイシン(Thermo Fisher社)を補足したIMDM細胞培地(Gibco社)の中で、5ng/mlの組み換えIL−2(Biolegend社)と示された濃度のペプチドの存在下にて培養した。3日後、細胞を固定可能な生存染料eFluor 780(Thermo Fisher社)で染色し、CD4抗体(RM4−5、Brilliant Violet 711、Biolegend社)で染色した。細胞をBD LSR Fortessa IIフローサイトメータ(Becton Dickinson社)で分析し、データをFlowJo v10.0.8ソフトウエア(Tree Star社)を用いて分析した。
B16−SIY生体内腫瘍モデル:(Spranger、2014年)に記載されているB16−SIY腫瘍細胞を、10%ウシ胎仔血清(Sigma社)、L−グルタミン(Thermo Fisher社)、ペニシリンとストレプトマイシン(Thermo Fisher社)を補足したDMEM細胞培地(Gibco社)の中で培養した。106個の腫瘍細胞を皮内に移植してC57Bl/6マウスの中に入れた。腫瘍細胞を接種して24時間後からマウスの腹腔内に100μgの示されたペプチドまたはビヒクル対照を2日に1回注射した。その後、示された時点で体重と腫瘍の体積を測定した。
マウスHoxb8−造血前駆細胞の作製と、shRNAを媒介としたcblノックダウン:以前に報告されている(Redecke、2013年)ようにして、全cblb+/+骨髄細胞または全cblbΔ/Δ骨髄細胞からFlt3−Hoxb8−造血前駆細胞を作製し、培養し、GM−CSF樹状細胞(DC)へと分化させた。cblまたはウミホタルルシフェラーゼを標的とする安定なHoxb8−造血前駆細胞shRNA系を生成させるためのMiR−E骨格を含有するレンチウイルスベクターが以前に報告されている(Fellmann、2013年)。cblまたはウミホタルルシフェラーゼを標的とするshRNAを、PCR増幅により、97merオリゴヌクレオチド(cbl:5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGCTACGACGATGATGATGATGAATAGTGAAGCCACAGATGTATTCATCATCATCATCGTCGTAATGCCTACTGCCTCGGA−3’)(配列番号37);ウミホタルのルシフェラーゼ:5’−TGCTGTTGACAGTGAGCGCAGGAATTATAATGCTTATCTATAGTGAAGCCACAGATGTATAGATAAGCATTATAATTCCTATGCCTACTGCCTCGGA−3’(配列番号38);IDT)から、以前に報告されているmir−E順プライマー(5’−AGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGC−3’(配列番号39)またはmir−E逆プライマー(5’−GCTCGAATTCTAGCCCCTTGAAGTCCGAGG−3’(配列番号40)))(Fellmann、2013年)を用い、これらレンチウイルスベクターにクローニングした。cblまたは対照shRNAを安定に発現する細胞系は、eGFPレポータ遺伝子の発現に基づき、感染した細胞系のレンチウイルス形質導入とFACSソーティングによって取得した。GM−CSFの存在下でshRNA発現細胞系を樹状細胞(DC)へと分化させ、上記のようにしてROS生成を調べた。
上記の表には、本研究で使用した追加のペプチドが掲載されている。第1列は、一文字のアミノ酸コードで表わしたSYK由来のペプチド配列の名称と種(Mはマウス、Hはヒト)を示している。第2列の太字の配列は、膜透過ペプチド(CPP)のアミノ酸配列を一文字コードで示している。第2列の中に星印(*)で示してあるのは、SYK由来のペプチド配列またはスクランブルドペプチド配列のリン酸化された中心チロシンである。スクランブルドペプチドは、マウスまたはヒトのSYKに由来する配列のアミノ酸配列を中心ホスホチロシンのまわりにスクランブルするが、CPP部分はそのまま残すことによって得られた。
実施例2 − Cbl−bまたはCbl−b触媒活性の欠損が真菌症の病状を改善する
抗真菌免疫におけるCbl−bの潜在的な役割を調べるため、Cbl−bΔ/Δ同腹子と対照Cbl−b+/+同腹子の全身に致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた。それに加え、触媒的に不活性なCbl−bを有するCbl−bC373A/C373Aマウス(Paolino他、2011年)にカンジダ・アルビカンスを感染させた。Cbl−bタンパク質の欠損(図2a)またはCbl−b触媒機能の欠損によって真菌症の病状が顕著に改善されたことは、Cbl−b+/+同腹子と比べたときの感染後の体重減少の低下(図1a)と顕著な死亡遅延(図1b)に示されている。これらの結果に合致して、対照Cbl−b+/+同腹子と比較したとき、Cbl−bΔ/Δマウスの腎臓、脾臓、肝臓、肺における真菌負荷の顕著な低下も観察することができた(図1c)。全身感染の7日後の冒された腎臓の組織病理学的分析から、これらの結果が確認された;Cbl−bΔ/Δマウスは、ヨウ素酸シッフ染色による評価で腎炎の減少を示し(図1d、図1e)、ゴモリメテナミン銀(GMS)染色による評価でカンジダ・アルビカンス酵母と菌糸の数の減少を示した(図1f、図1g)。真菌負荷の減少に合致して、感染したCbl−bΔ/Δマウスの腎臓切片に関する好中球特異的マーカーLy−6Gでの染色による評価で、対照Cbl−b+/+同腹子と比較したときに好中球浸潤の顕著な減少が検出された(図1h、図1i)。Cbl−b欠損の保護効果は、カンジダ・アルビカンスの感染に限定されていなかった。というのも、カンジダ・ドゥブリニエンシスの臨床単離体の致死量を全身感染させると、Cbl−bΔ/Δマウスを対照Cbl−b+/+同腹子と比較したとき、死亡率とキネティクスに関して同様の結果になったからである(図2c)。重度の真菌感染症におけるCbl−b欠損の保護効果が、自然免疫機能が広範囲で制御を外れた結果であるかどうかを評価するため、Cbl−b欠損マウスと同腹子対照マウスにグラム陽性菌リステリア・モノサイトゲネスを感染させた。Cbl−bの欠損がリステリア・モノサイトゲネスに感染したマウスの死亡率に影響を与えることはなかった(図2d)。この結果は、Cbl−bの欠損が、カンジダ・アルビカンスとカンジダ・ドゥブリニエンシスの全身感染に対して顕著な抵抗力を有することを示している。
観察された保護効果の細胞的基礎の見通しを得るため、C57Bl/6レシピエントマウスに致死線量を照射し、同一遺伝子型のCbl−bΔ/Δ同腹マウス、Cbl−bC373A/C373A同腹マウス、Cbl−b+/+同腹マウスいずれかからの骨髄を用いて再構成することによって骨髄キメラ動物を作製した。再構成の後、コホートに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた。放射線感受性造血区画におけるCbl−b欠損は、全身のCbl−b欠損に反映された(図3a、図3b)。適応免疫においてCbl−bが役割を果たしているという理由で、次に、観察された抗真菌活性に対する適応免疫細胞の潜在的な寄与を調べた。その目的で、適応免疫系が欠けたCbl−b+/+/Rag2Δ/Δ二重欠損マウスとCbl−bΔ/Δ/Rag2Δ/Δ二重欠損マウスを作製した。重要なことだが、自然免疫系におけるCbl−b欠損と、適応免疫の不在下におけるCbl−b欠損は、致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させたとき、全身ノックアウト表現型に非常によく似ていた(図3c、図3d)。それに加え、自然免疫系に対するCbl−b欠損の潜在的な効果を制限するため、Cbl−bΔ/Δレシピエントマウスに致死線量を照射し、Cbl−bΔ/Δ/Rag2Δ/Δ骨髄グラフトまたはCbl−b+/+/Rag2Δ/Δ骨髄グラフトで再構成することによって骨髄キメラマウスを作製した。再び、Cbl−b欠損がカンジダ・アルビカンスの全身感染に対して保護効果を与えることを観察できた(図3e、図3f)。これは、Cbl−bが自然抗真菌免疫を制御していることを示す。
抗真菌防御にとって重要な自然免疫細胞の発達または維持に対するCbl−b欠損の潜在的な効果を調べるため、Cbl−bΔ/Δ同腹マウスとCbl−b+/+同腹マウスの骨髄と脾臓の中の主要な自然免疫系列の細胞密度と細胞組成を評価した。骨髄と脾臓両方のLy−6G+好中球と脾臓NK細胞でわずかなレベル上昇を観察することができた(図2e、図2f)。これが単球または好中球の浸潤に影響を与える可能性があるかどうかを調べるため、カンジダ・アルビカンスの全身チャレンジに対する単球または好中球のリクルートを感染してから24時間後に定量した。感染後のこの早期の時点で、Cbl−bΔ/Δマウスの腎臓、肺、肝臓への免疫浸潤が同等であるか、わずかに低下さえしていることを観察できた(図4a、図4b、図4c)。CLRファミリーのメンバーであるデクチン−1によるカンジダ・アルビカンスの細胞壁のβ−グルカンの認識が、抗真菌免疫反応において決定的に重要であることが示されている(Brown他、2001年)。Cbl−bΔ/Δ同腹マウスと対照Cbl−b+/+同腹マウスの末梢血の単球と好中球でのデクチン−1の発現が同等であることが検出された(図4d、図4e)。さらに、デクチン−1(Clec7a)とデクチン−2(Clec4n)、デクチン−3(Clec4d)とMincle(Clec4e)のmRNA発現は、qPCRによって評価すると、Cbl−bΔ/ΔマウスとCbl−b+/+マウスの脾臓細胞と骨髄細胞において同等であった(図4f、図4g)。重要なことだが、Cbl−bΔ/ΔマウスとCbl−b+/+マウスは、カンジダ・アルビカンスの全身チャレンジに応答して同等な初期細胞リクルートパターンを示したにもかかわらず、冒された臓器内の真菌負荷は感染後24時間ですでに顕著に低下した(図4h)。これは、Cbl−b欠損により自然免疫細胞の殺真菌活性が増大するという考え方を支持している。
実施例3 − Cbl−bの欠損は、全身真菌感染と皮膚真菌感染の両方に対する抵抗力を与える
Cbl−b欠損の保護効果を他の感染経路に拡張できるかどうかを調べるため、皮膚カンジダ・アルビカンス感染のモデルを使用した(Igyarto他、2011年)。このモデルでは、真菌負荷の顕著な低下によって証明されるように、カンジダ・アルビカンスによる皮膚コロニー形成に対するCbl−bΔ/Δマウスの抵抗力が同腹対照マウスと比較して増大することが再び観察された(図3g)。カンジダ・アルビカンスの皮膚感染に対する免疫反応は、適応免疫細胞と自然免疫細胞の間のクロストークによって特徴づけられる(Igyarto他、2011年;Kashem他、2015年)ため、カンジダ・アルビカンス皮膚感染をRag2欠損バックグラウンドで実現した。Cbl−b+/+/Rag2Δ/Δ欠損マウスは、Cbl−b+/+/Rag2+/+マウスと比べて真菌負荷がわずかに増加していたが、統計的有意には達していなかった。重要なことだが、適応免疫系の不在下でのCbl−b欠損は、Cbl−bΔ/Δ/Rag2Δ/Δマウスの皮膚における真菌負荷の低下によって証明されるように、Cbl−b+/+/Rag2Δ/Δ同腹対照マウスと比べて真菌コロニー形成に対する保護効果を持つことが再び観察された(図3h)。したがって自然免疫細胞におけるCbl−b欠損は、全身と皮膚のカンジダ・アルビカンス感染に対する抵抗力を与える。
実施例4 − Cbl−bは、樹状細胞とマクロファージの抗真菌活性を制御する
自然免疫系の中での殺真菌活性は、主に好中球、マクロファージ、DCに起因する(Drummond他、2015年)。Cbl−b欠損がこれらのタイプの細胞の抗真菌活性に及ぼす効果を直接調べるため、感染していないマウスからの骨髄好中球、感染していないマウスの骨髄から単離した骨髄由来のマクロファージ(BM−M)、骨髄由来の樹状細胞(BM−DC)、骨髄単球、脾臓から単離した脾臓DCをカンジダ・アルビカンスとともに培養することによってインビトロ殺菌アッセイを実施した。Cbl−bΔ/Δ骨髄好中球、Cbl−bC373A/C373A骨髄好中球、Cbl−b+/+骨髄好中球を比較したとき、殺真菌活性の有意差を観察することはできなかった(図5a)。しかしBM−MとBM−DC、骨髄単球と脾臓DC(両方とも感染していないマウスから単離)は、Cbl−bまたはCbl−bリガーゼ機能の不在下でカンジダ・アルビカンスを殺す効力が増大した(図5b、図5c、図5d、図5e)。注目すべきことに、ファゴサイトーシスの割合は、3つの遺伝子型すべてのBM−MまたはBM−DCの間で同等であった(図6a、図6b)。DCとマクロファージによる抗真菌応答におけるCbl−bのより顕著な役割に合致して、カンジダ・アルビカンスで刺激した細胞からのライセートと感染していない細胞からのライセートの両方で、BM−DCとBM−Mの中のCbl−bタンパク質が、骨髄好中球と比べてより高レベルであることが観察された(図6c)。したがってCbl−bは、BM−MとBM−DCの両方の殺真菌活性と、単離された骨髄由来の単球と脾臓DCの殺真菌活性を制御する。
以前の観察に合致して、Dynasoreを用いてファゴサイトーシスを薬理学的に抑制することによってBM−DCを媒介とした殺菌が阻止される。同様に、抗体を媒介としてデクチン−1をブロックすることによりカンジダ・アルビカンスの殺菌が顕著に減少し、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCの両方における真菌殺菌の増加が、Cbl−b+/+細胞で観察されるレベルまで低下した(図5f)。それに加え、R406を用いてSykを薬理学的に抑制することにより、カンジダ・アルビカンスの殺菌がほぼ完全に阻止された(図5g)。次に、Cbl−b欠損または欠陥のあるCbl−bリガーゼ機能が、BM−M、BM−DC、骨髄由来の単球、脾臓DCがROSを生成する能力に影響を与えるかどうかを測定した。Cbl−bΔ/Δ骨髄好中球またはCbl−bC373A/C373A骨髄好中球は、カンジダ・アルビカンスに応答したROS生成のキネティクスと量の両方に関し、Cbl−b+/+骨髄好中球と有意に異なってはいなかった(図6d)。しかしCbl−bΔ/ΔまたはCbl−bC373A/C373AのBM−M、BM−DC、骨髄単球、脾臓DCの殺真菌活性の増加は、カンジダ・アルビカンスによって誘導されるROS生成が、Cbl−bが十分な細胞と比べて増加していることと相関していた(図6e〜図6h)。真菌チャレンジに対するこの異常な細胞応答がカンジダ・アルビカンスを用いた刺激に特異的であるかどうかを調べるため、BM−DCを、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・クルセイ、カンジダ・ドゥブリニエンシスの臨床単離体で刺激した。Cbl−bが欠損していることで、これらの異なる真菌を用いた刺激に応答してROS生成が顕著に増加することが再び観察された(図6i〜図6k)。したがってCbl−b欠損により、臨床的に重要ないくつかの真菌病原体に対する免疫応答が増加する。
カンジダ・アルビカンスを媒介としたBM−DCの活性化も、Sykに依存したインフラマソームの活性化を開始させ、そのことによってカスパーゼ−8によるプロ−インターロイキン−1β(IL−1β)の分断が可能になる(Gringhuis他、2012年;Zwolanek他、2014年)。カンジダ・アルビカンスで刺激したCbl−bΔ/ΔBM−DCまたはCbl−bC373A/C373A BM−DCにおけるカスパーゼ−8の活性の顕著な増加(図7a)と成熟IL−1βの放出が対照Cbl−b+/+ BM−DCと比べて増加することが実際に観察されたが、それは、デクチン−1ブロッキング抗体によって減少させることができた(図7b)。Sykを薬理学的に抑制することによっても、3つの遺伝子型すべてのBM−DCからのIL−1β分泌がほぼ完全に阻止された(図7c)。同様に、カンジダ・アルビカンスで刺激したCbl−bΔ/ΔBM−DCまたはCbl−bC373A/C373A BM−DCからの成熟IL−1βの産生と放出がCbl−b+/+ BM−DCと比べて増加することが見いだされた(図7d)。
カンジダ・アルビカンスの感染に対する転写応答をモニタするため、炎症促進性サイトカインのmRNAのレベルを評価した。Cbl−b+/+ BM−DCと比べたとき、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCではIL−1β、IL−6、TNF、IL−23、IL−12の転写産物のレベルが有意に増加することが観察された(図7e)。サイトカインのmRNA発現のこの増加は、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCによる炎症促進性サイトカインIL−6とTNFの分泌がCbl−b+/+ BM−DCと比べて顕著に増加することと相関していた(図7f、図7g)。デクチン−1をブロックすると3つの遺伝子型すべてでIL−6とTNFの放出が減少し、重要なことに、Cbl−b欠損BM−DCにおけるサイトカイン放出の増加も減少した(図7f、図7g)。再度、Sykを薬理学的に抑制することにより、カンジダ・アルビカンスで刺激した3つの遺伝子型すべてのBM−DCによるIL−6とTNFの放出がほぼ完全に阻止された(図7h、図7i)。Cbl−bΔ/Δ細胞とCbl−bC373A/C373A細胞をCbl−b+/+対照細胞と比べると、カンジダ・アルビカンスで刺激することで、BM−DCによるIL−23とIL−12の放出も実質的に増加し(図7j、図7k)、BM−MによるIL−6とTNFの放出も増加した(図7l、図7m)。それに加え、カンジダ・アルビカンスで刺激したBM−DCによる抗炎症メディエータIL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)の分泌を調べた。Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−b+/+BM−DCを比較したとき、IL−1Raの分泌の有意な増加が観察された(図7n)。
デクチン−1の寄与をさらに調べるため、用量を増やしていくザイモサン(カンジダ・アルビカンスの細胞壁ホモジェネート)またはカードラン(精製したβ−グルカン)に応答した3つの遺伝子型すべてのBM−DCによるサイトカイン分泌を比較した。ザイモサンと、デクチン−1アゴニストであるカードランを用いて刺激することで、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCによるIL−1β、IL−6、TNFの放出が増加した(図8a〜図8f)。Cbl−b欠損は致死的なリステリア・モノサイトゲネス感染症で死亡率に影響を与えなかった(図2d参照)ため、TLR4アゴニストであるリポ多糖(LPS)またはTLR9アゴニストであるCpGを用いた刺激に対するBM−DCの応答におけるCbl−bの潜在的な役割を調べた。TLR4とTLR9の両方とも、リステリア・モノサイトゲネス感染症に関与する重要な病原体関連分子パターン受容体である。重要なことだが、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−b+/+BM−DCを比較したとき、高用量または低用量のLPSまたはCpGを用いた刺激に応答した炎症促進性サイトカインIL−6とTNFの分泌に有意差は観察されなかった(図8g〜8j)。したがってCbl−bは、カンジダ・アルビカンス感染に対してBM−DCとBM−Mがデクチン−1/Sykを媒介として応答する際のカギとなる調節因子である。
これまでのデータは、Cbl−b欠損、またはCbl−b活性の欠如が、インビトロでの抗真菌免疫応答の深刻な異常につながることを示していた。観察された違いを炎症部位にリクルートされた免疫細胞で再現できるかどうか調べるため、Cbl−bΔ/ΔマウスとCbl−b+/+マウスの腹腔内にカンジダ・アルビカンスを感染させるチャレンジを行ない、24時間後にその抗真菌活性を評価した。Cbl−b欠損により免疫細胞が腹膜腔に全面的に浸潤することでROS応答が増加した。Cbl−bΔ/Δマウスでは、Cbl−b+/+マウスと比べてROS生成の増加がすでに観察され、カンジダ・アルビカンスでさらに再刺激しなくても細胞が浸潤した(図5h、図5i)。同様に、Cbl−bΔ/Δ免疫浸潤物の殺真菌活性は、Cbl−b+/+同腹対照マウスからの免疫細胞浸潤物と比べて増大した(図5j)。カンジダ・アルビカンスを腹腔内に感染させると炎症性の単球/マクロファージと好中球の両方がリクルートされる。どのタイプの細胞が観察されたこの違いに寄与しているかを調べるため、好中球と単球/マクロファージを全浸潤免疫細胞からFACSで精製し、カンジダ・アルビカンスを用いた再刺激後にそれらの細胞がROSを生成させる能力を調べた。腹腔にリクルートされたCbl−bΔ/Δ単球/マクロファージによってROSの生成がCbl−b+/+細胞と比べて増加することが観察されたが、腹腔にリクルートされた好中球では観察されなかった(図5k、図5l)。それに加え、腹腔内洗浄液で炎症性サイトカインIL−6とTNFのほか、IL−1Raを調べた。インビトロ実験に見られるように、Cbl−bΔ/ΔマウスとCbl−b+/+マウスからの腹腔内洗浄液を比較したとき、IL−6とTNFの両方とIL−1Raで増加が観察された(図8k)。
データは、真菌チャレンジに対するCbl−b欠損の保護効果が、好中球ではなくて、組織に常在しているかリクルートされた貪食免疫細胞によって媒介されることを示していた。好中球に固有の効果を調べるため、クロドロン酸リポソームを用いて生体内で貪食免疫細胞を欠乏させた。クロドロン酸リポソームは、マクロファージ、単球のサブポピュレーション、DCサブセットを欠乏させる一方で、好中球には影響を与えないことが報告されている(Buiting他、1994年;Buiting他、1996年;Qian他、1994年;Sunderkotter他、2004年;van Rooijen他、1992年)。貪食細胞を24時間前に欠乏させ、24時間後にカンジダ・アルビカンスを全身感染させ、体重減少と生存率の経時変化をモニタした。貪食細胞を欠乏させると、Cbl−b+/+マウスとCbl−bΔ/Δマウスの両方で、対照PBSリポソームで処理したコホートと比べて体重減少が有意に増加した(Qian他、1994年)(図5m)。重要なことだが、クロドロン酸リポソームで処理したCbl−bΔ/ΔマウスとCbl−b+/+マウスの間に有意差はなかった(図5m)。同様に、PBSリポソームで処理したCbl−bΔ/ΔコホートとCbl−b+/+コホートを比較すると、Cbl−b欠損によって生存期間が延長したが、クロドロン酸リポソームによる貪食細胞の欠乏により、Cbl−b欠損が原因で生存延長のあらゆる恩恵が完全に消失した(図5n)。これらのデータは、貪食細胞におけるCbl−b欠損が、カンジダ・アルビカンス全身感染に対して観察される有利な効果にとって極めて重要であることを示している。
実施例5 − Cbl−bの欠損が、カンジダ・アルビカンスに応答した、CLRを媒介としたシグナル伝達を増進する
Cbl−b欠損、またはCbl−bリガーゼ機能の欠損が、BM−DCによるシグナル伝達応答の大きさを変えるかどうかを調べるため、カンジダ・アルビカンスを用いた刺激の30分後、60分後、90分後にチロシンリン酸化を分析した。Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCから調製したライセートでは、対照Cbl−b+/+BM−DCと比較して、カンジダ・アルビカンス刺激に応答してチロシンリン酸化が大きく増加することが、調べたすべての刺激時点で観察された(図9a)。CLRによる古典的シグナル伝達には、SrkキナーゼとShp−2の近位活性化が関与していて、その近位活性化によってその後Sykが活性化される(Deng、2015年)。カンジダ・アルビカンスを用いてBM−DCを刺激した後に同等なSrcチロシンリン酸化が観察されたが、リン酸化されたShp−2とSykのレベルは上昇していた(図9b)。Sykを抑制することで抗真菌効果がデクチン−1をブロックすることと比べて増加するため、デクチン−1、デクチン−2/3、Mincleのシグナル伝達におけるCbl−b欠損の役割をさらに調べた。これら表面受容体は、Cbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−b+/+BM−DCにおいて同等のレベルで発現した(図10a)とはいえ、Cbl−bの不在下では、熱で殺したカンジダ・アルビカンス(HK;デクチン−1を活性化させるため)、カンジダ・アルビカンス菌糸(Hyph;デクチン−2/3を活性化させるため)、トレハロース−6,6−ジミコレート(TDM;Mincleを活性化させるため)に応答してSykとShp−2のリン酸化の増加が観察された(図9c)。それに加え、カンジダ・アルビカンスで刺激したCbl−bΔ/ΔBM−DCとCbl−bC373A/C373A BM−DCにおいて遠位CLRシグナル伝達分子PLCγ2とp65 NF−κBのリン酸化の増加が観察された(図9d)。イムノブロットに合致するように、Cbl−bΔ/ΔBM−DCは、共焦点顕微鏡によって分析すると、カンジダ・アルビカンスで刺激した後に、リン酸化されたShp−2(図9e)とリン酸化されたSyk(図9f)の両方のレベルが上昇した。これらのデータは、カンジダ・アルビカンス感染に応答した近位CLRシグナル伝達の調節においてCbl−bが中心的な機能を有することを明らかにしている。
実施例6 − Cbl−bは、Syk、デクチン−1、デクチン−2をユビキチン化の標的とする
E3リガーゼCbl−bが近位CLRシグナル伝達にとって極めて重要な分子をポリユビキチン化できるかどうかを調べるため、組み換えタンパク質を用いてユビキチン化アッセイを実施した。これらのアッセイでは、組み換えShp−2のポリユビキチン化は検出されなかったが、活性な組み換えSykのロバストなポリユビキチン化が観察された(図11a)。Cbl−bによって形成される鎖連結のタイプを質量分析によって分析すると、K48連結ユビキチン鎖だけに由来する独自のペプチド(FAGKQLED)(配列番号36)が同定された(図10b)。Cbl−b基質の特異性には、アミノ末端チロシンキナーゼ結合(TKB)ドメインが主に関与している。この考え方に合致するように、カルボキシ末端ユビキチン関連(UBA)ドメインを欠いているがTKBドメインとRINGフィンガードメインは含有する頭部切断Cbl−bタンパク質(Cbl−b29−483)は、相変わらずSykに対するユビキチン化活性を示した(図11a)。予想されるように、Cbl−b29−483のC373A変異体は、Sykポリユビキチン化活性を示さなかった(図11a)。重要なことだが、非リン酸化組み換えSykは、Cbl−b29−483によるポリユビキチン化が大きく減少した(図11b)。これは、Cbl−bが、活性化されたSykを標的とすることと合致している。SykとCbl−bの間の相互作用を調べるため、同時免疫沈降実験を実施した。カンジダ・アルビカンスを用いてBM−DCを刺激した後にSykとCbl−bの同時免疫沈降が増加することを観察できた(図11c)。プロテアソームブロッカーMG132で処理すると、すべてのSykではなくてリン酸化されたSykの増加が、カンジダ・アルビカンスで刺激したCbl−b+/+BM−DCからのライセートで観察された。重要なことだが、カンジダ・アルビカンスで刺激したCbl−bΔ/ΔBM−DCをMG132で処理したとき、リン酸化されたSykのレベルは変化しなかった(図11d)。これは、Cbl−bが、プロテアソームターゲティングを通じてその効果を媒介することを示している。これらの結果は、Cbl−bが、活性なSykをユビキチン化できることを示している。
Cbl−b欠損がCLR刺激によって開始される近位シグナル伝達に及ぼす潜在的な追加の効果を調べるため、CLRファミリーのメンバーであるデクチン−1とデクチン−2がCbl−bを媒介とした分解の標的としても機能する可能性があるかという疑問を提起した。そこでBM−Mをカンジダ・アルビカンスまたはカンジダ・アルビカンス菌糸で刺激し、デクチン−1とデクチン−2それぞれのタンパク質レベルを、刺激後のさまざまな時点で調べた。デクチン−1とデクチン−2のレベルは対照細胞の中で時間経過とともに低下したが、その発現レベルはCbl−bの不在下で一定に留まった(図10c、図10d)。デクチン−1とデクチン−2が真菌刺激に応答してユビキチン化するかどうかを調べ、そうなる場合にはユビキチン化が、Cbl−b細胞、Cbl−bΔ/Δ細胞、Cbl−b+/+細胞が刺激されたことに依存するかどうかを調べるため、デクチン−1またはデクチン−2を免疫沈降させ、ユビキチンをブロットした。カンジダ・アルビカンスまたはカンジダ・アルビカンス菌糸を用いた刺激に応答したデクチン−1とデクチン−2それぞれのユビキチン化を観察した。このユビキチン化は、Cbl−bの不在下で減少した(図10e、図10f)。これらのデータは、Cbl−bが、デクチン−1とデクチン−2のタンパク質レベルを調節するとともに近位シグナル伝達分子Sykを調節することによってCLRのシグナル伝達を調節していることを示している。
実施例7 − Cbl−bを抑制することによってインビトロと生体内での抗真菌免疫が増進する
遺伝子データと生化学的データに基づき、CblファミリーのTKBが媒介する基質認識が阻止されることで、CLR刺激の下流でSykの活性化が異常になっている可能性があると推測された。この仮説を検証するため、ショウジョウバエのアンテナペディアのホメオドメイン由来の膜透過ペプチド(May他、2000年)と、Sykに由来する長さがアミノ酸16個のリン酸化されたペプチドでチロシン317(Y317)を含むもの(Cblファミリーリガーゼを媒介としたSykターゲティングに必要であることが報告されている(Sohn他、2003年;Yankee他、1999年;Zou他、2009年))と、周囲の隣接領域からなる融合ペプチドを設計した(図11e)。アンテナペディアのペプチドを付着させると、付着したペプチドを細胞質に効率的に送達できることが報告されている(Jones他、2005年)。組み換えCbl−bをこのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドとともにプレインキュベートすると、活性なSykのインビトロでのユビキチン化が完全に阻止される(図11f)。真菌刺激に応答したBM−DCにおけるROS生成の活性化はSykに依存するため、新規なCbl−b−TKBドメイン結合ペプチドの存在下でのROS生成をモニタした。興味深いことに、ペプチド干渉により、カンジダ・アルビカンス刺激に応答してBM−DCによるROS生成が大きく増加した(図11g)。観察された効果は、Cbl−bΔ/Δ細胞におけるROS生成の増加をはるかに超えていた。このペプチド干渉戦略は、あらゆるCblファミリーのリガーゼ(c−Cbl、Cbl−b、Cbl−3)がTKBを媒介として基質タンパク質を標的とすることを潜在的に抑制するため、Cblファミリーのリガーゼは少なくとも冗長に作用できるように思われる。そのシナリオに沿うように、Cbl−b欠損BM−DCでは、Cbl−bが十分な細胞と比べてペプチド干渉に対する感度の顕著な増大が観察された(図10g)。非常に重要なことだが、CblファミリーTKB結合ペプチドも、インビトロでのカンジダ・アルビカンス感染時にBM−DCの殺真菌活性を増大させた(図11h)。注目すべきことに、アンテナペディアのペプチドだけを添加しても、リン酸化されたスクランブルドペプチドを添加しても、ROS生成や、BM−DCの殺真菌活性に影響はなかった。
抑制性ペプチドで観察されたインビトロの効率が理由で、Cblファミリーのリガーゼを抑制することが、生体内で真菌性敗血症に対する免疫応答性と免疫機能を向上させるための新規な1つの戦略となる可能性があるかどうかを調べた。そこでCbl−bΔ/Δ同腹マウスとCbl−b+/+同腹対照マウスに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させ、高用量の抑制性CblファミリーTKBドメイン結合ペプチド(100μg、腹腔内、0日目と2日目)で2回処理するか、処理なしで放置した。驚くべきことに、2回だけ処理したマウスは、処理していない対照コホートと比較した体重減少の減少と遅延した死亡によって証明されるように、野生型Cbl−b+/+マウスで顕著な保護効果を示した(図12a、図12b)。それに加え、ペプチド処理によって血中尿素窒素のレベルが減少した(図12c)。これは、腎臓損傷が減ったことを示している。ペプチド処理によってCbl−bΔ/Δマウスに対する保護効果が与えられることはなかった(図10h)。TKB結合阻害剤の濃度が1/5(1回の注射で20μg)に低下しても、同等な結果が得られた(図12d、図12e;図10i)。低用量ペプチド処理で観察された罹患率の低下に合致するように、ペプチドで処理したマウスの腎臓で真菌負荷の有意な低下が検出された(図12f)。マウスをアンテナペディアのペプチドまたはスクランブルドリン酸化対照ペプチドで処理しても、処理なしの対照コホートと比べて罹患率または死亡率に影響はなかった。Cbl−b+/+マウスではペプチド処理に保護機能があることが理由で、すでに罹患している真菌性敗血症におけるTKB結合ペプチドの治療薬としての可能性を最終的に調べた。そこでマウスに致死量のカンジダ・アルビカンスを感染させた後、2日目と3日目に処理した(1回の腹腔内注射で100μg)。驚くべきことに、この処理計画により、2回目のペプチド処理の2日後にさらなる体重減少が完全に阻止され、腎臓の真菌負荷が有意に減少し、マウスが死亡から保護されさえした(図12g、図12h、図12i)。組織病理学的分析から、腎炎(図12j、図12k)、真菌負荷(図10j)、好中球浸潤(図10k)の有意な減少を示すこれらの知見が確認された。したがってCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、抗真菌免疫を増進し、致死的なカンジダ・アルビカンス敗血症から保護することができる。
実施例8 − CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、マウスDCにおいてCBL−BとCBLの両方を抑制する
活性なSYKは、活性化されたB細胞の中のCBL−BとCBLの両方により、プロテアソーム分解の標的にされる(Kitaura、2007年;Sohn、2003年)。CLB−B TKBドメイン結合ペプチドはSYKに由来するため、CBL−BとCBLの両方に結合してそれらを抑制するペプチドとして機能することができた。図5gに見られるように、CLB−B TKB結合ペプチド(M1)の存在下でCbl−b+/+ BM−DCをカンジダ・アルビカンスで刺激すると、このペプチドで処理していない対照と比べてROS生成が有意に低下した。ROS生成の増加は、ペプチド(M1)で処理した細胞内のCbl−bΔ/Δ BM−DCでは、処理なしの対照細胞と比べて相変わらず検出可能であった。ペプチド処理がCbl−bΔ/Δ細胞におけるROS生成に及ぼす追加の効果がCBLの抑制によるかどうかを調べるため、Cbl−b+/+マウスとCbl−bΔ/ΔマウスからHoxb8造血前駆体(Redecke、2013年)を導出し、Cblを標的とするshRNA、またはウミホタルのルシフェラーゼを標的とする陰性対照としてのshRNAに導入した。CBL−Bが十分なHoxb8造血前駆体、CBL−Bが欠けたHoxb8造血前駆体、CBLとCBL−Bの両方が欠けたHoxb8造血前駆体を樹状細胞(DC)に分化させた後、CLB−B TKBドメイン結合ペプチド(M1)の存在下または不在下でカンジダ・アルビカンスに感染させたときのROS生成を調べた。Cbl−bΔ/Δ DCでは、カンジダ・アルビカンスに感染させたときのROS生成がCbl−b+/+細胞と比べて増加した。CBLとCBL−B両方の欠失により、DCによるROS生成は、CBL−Bだけが欠けた細胞と比べてさらに増加した。重要なことだが、CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチド(M1)で処理すると、Cbl−b+/+ DCとCbl−bΔ/Δ DCではROSの生成が増加する一方で、CBLとCBL−Bの両方が欠けた細胞ではROS生成がさらに増加することはなかった(図13a)。これらの結果は、カンジダ・アルビカンス感染に応答してSYKを媒介としてROSが生成する際の調節においてCBL−BとCBLが少なくとも部分的に冗長な機能を有することを示している。さらに、CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチド(M1)は、CBL−BとCBLの両方に作用するように見える。というのも、CBL−BとCBLの両方が欠けた細胞をカンジダ・アルビカンスに感染させてペプチドで処理しても、ペプチドで処理していない対照と比べてROS生成のさらなる上方調節がなかったからである。したがってペプチド処理により、DCでのSYKを媒介としたROS生成においてCBL/CBL−B二重欠損が表現型模写される。
実施例9 − CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドで処理すると、マウスCD4+T細胞の増殖応答が増大する
骨髄免疫細胞で観察された抗真菌免疫反応以外の細胞応答を調節するのにCBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドを応用できることを調べるため、T細胞増殖アッセイを実施した。なぜなら、T細胞の増殖は、マウスT細胞の中のCBL−Bによって調節されることが以前に報告されている(Bachmaier、2000年;Chiang、2000年)からである。CBLファミリーTKB結合ペプチド(M3;図14a)の存在下では、プレートに結合したCD3抗体、またはプレートに結合したCD3抗体と可溶性CD28抗体での刺激に応答してマウスCbl−b+/+ CD4+ T細胞の増殖応答が、ペプチド処理のないCbl−b+/+ CD4+細胞と比べて用量に依存して増加することが観察された。CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドのスクランブルドバリアント(M4)(同じアミノ酸組成で、中心のホスホチロシンが、変化していないアンテナペディアのペプチドに融合したもの)を対照として使用すると、Cbl−b+/+ CD4+ T細胞の増殖が、ペプチドで処理していない細胞と比べてほんのわずかに増加した(図14b)。ペプチド(M3)を媒介としたCBL−B活性の抑制は、最適ではない刺激条件(すなわち低濃度のCD3)下において、CD28を媒介とした同時刺激シグナルの存在下と不在下の両方でより顕著な効果を示した(図14a、図14b)。
CblファミリーのメンバーによってB細胞受容体が開始する応答の部分的に冗長な調節(Kitaura、2007年)と同様、マウスT細胞におけるCBL−BとCBL両方の欠損は、T細胞受容体刺激に応答したT細胞増殖をさらに増進させる(Naramura、2002年)。これらのデータと、CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドの二重機能に合致するように、CBL−BとCBLの両方を抑制し、Cbl−bΔ/Δマウスに由来するCD4+ T細胞を刺激すると、TKBドメイン結合ペプチド(M3)の存在下では、処理していない対照細胞と比べて増殖応答が顕著に増加した(図14c)。スクランブルド対照ペプチドで細胞を処理すると、ここでもCbl−bΔ/Δ T細胞の増殖応答は、処理していない対照細胞と比べてほんのわずかだが増加した(図14d)。まとめると、SYKに由来するCBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、DCによるC型レクチン受容体を媒介としたROS生成と、マウスCD4+ T細胞におけるT細胞受容体を媒介とした細胞増殖の両方において、CBL−BとCBLの阻害剤として機能する。
実施例10 − CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドで処理すると、メラノーマモデルにおける生体内抗腫瘍免疫応答が増大する
Cbl−bは、抗腫瘍免疫応答のチェックポイント調節因子であり、Cbl−bΔ/Δ T細胞は、さまざまな動物の腫瘍モデルにおいて腫瘍に対して免疫応答を増大させることが示されている(Loeser,JEM、2007年;Chiang、2007年)。CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドが媒介する免疫調節の効率をがん免疫応答において調べるため、C57Bl/6マウスの皮下に106個のB16−SIYメラノーマ細胞を接種し、腫瘍を移植されたマウスを、ビヒクル、100μgのスクランブルドペプチド(M2)、100μgのCBLファミリーTKBドメイン結合ペプチド(M1)のいずれかで2日ごとに処理し、腫瘍の体積と体重の経時変化を記録した。ペプチド処理が観察期間中に体重増加に影響を与えることはなかったが、CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチド(M1)で処理したマウスでは、ビヒクルで処理した対照コホートと比べて腫瘍体積の顕著な減少が観察された(図15a、図15b)。これらの結果は、TKBドメイン結合ペプチドでの処理が、抗真菌免疫応答だけでなく、抗腫瘍免疫の調節においても有効であることの証拠を提供する。
実施例11 − CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドで処理すると、ヒトT細胞の増殖と活性化が増進する
ヒト細胞におけるCBL−Bサイレンシング実験から、マウスとヒトのT細胞でCBL−Bが同様の免疫調節機能を持つことが示されている(Pedraza−Alva、2011年;Stromnes、2010年)ため、CBL−Bは、ヒトのがんにおけるチェックポイント阻止を抑制するための標的として有望である。ヒトT細胞においてCBL−Bがペプチドを媒介として抑制される効率を調べるため、マウスアッセイで使用するCBL−B TKBドメイン結合ペプチドのヒト化バリアント(ペプチドH1)を作製した。マウスT細胞で得られた結果に合致するように、ヒトのCD4+ T細胞とCD8+ T細胞の増殖応答は、プレートに結合したCD3/CD28抗体を用いた刺激に応答して、ペプチド(H1)の用量に依存して顕著に増加することが観察された(図16a、図16b)。同様に、ヒトCBL−B TKB結合ペプチド(H1)の存在下では、CD4+ T細胞による炎症促進性サイトカインIFN−γの産生が有意に増加した(図16c)。ペプチド処理がT細胞受容体刺激を変化させることと合致するように、ヒト化CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチド(H1)で処理すると、T細胞上のマーカーCD69の活性化が、処理していない対照細胞と比べて用量に依存して上方調節されることがさらに観察された(図16d)。スクランブルド対照ペプチド(H2)のわずかな効果が記録されたが、ヒト化CBLファミリーTKBドメイン結合ペプチドで処理した細胞で観察された効果よりも実質的に小さかった。
参考文献
本明細書中に引用された全ての文献は、その全体が参照によって本明細書中に援用される。
Claims (18)
- 細胞送達部分と、casitas B系列リンパ腫ファミリー(Cblファミリー)チロシンキナーゼ結合(TKB)ドメイン結合ペプチドを含む融合ペプチド。
- 前記細胞送達部分が膜透過ペプチドである、請求項1に記載の融合ペプチド。
- 前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、脾臓チロシンキナーゼ(Syk)のペプチド断片である、請求項1または2に記載の融合ペプチド。
- 前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドがCbl−b結合ペプチドであり、好ましくはCbl−bのTKBドメインの結合ペプチドである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、配列モチーフN/DXpY、好ましくはN/DX1pYX2Pを有し(ここで、X、X1およびX2は任意のアミノ酸から選択され、N/Dはアスパラギン(N)またはアスパラギン酸(D)であり、pYはホスホチロシンである)、前記配列モチーフが、場合によってはD型またはレトロ−インベルソ型のアミノ酸を1個以上含有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、以下のコンセンサス配列:
SFNPYEPX1X2X3
を含み(ここでX1〜X3は、独立に、任意のアミノ酸から選択される)、好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドはSykのペプチド断片であり、より好ましくは前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドは、配列SFNPYEPTGG、SFNPYEPTGG、SFNPYEPEVA、またはSFNPYEPELAを含み、これら配列のいずれかは、場合によってはD型またはレトロ−インベルソ型の1個以上のアミノ酸を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の融合ペプチド。 - 前記配列中のチロシンがリン酸化されている、請求項6に記載の融合ペプチド。
- 前記CblファミリーTKBドメイン結合ペプチドが、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであって、前記ペプチドは自然免疫の調節因子であり、好ましくは自然抗寄生虫免疫、または自然抗真菌免疫、または自然抗腫瘍免疫の調節因子である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合ペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、前記ペプチドの細胞取り込みを促進する、医薬として許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、好ましくは医薬として許容可能な前記担体は、小胞、ミセル、リポソームおよびミクロソームから選択され、より好ましくは前記医薬組成物は、非経口投与用、特に静脈内投与用、動脈内投与用、筋肉内投与用、髄腔内投与用、皮下投与用、腹腔内投与用、または局所投与用いずれかに調製されており、好ましくは皮膚浸透促進剤をさらに含む医薬組成物。
- 治療に利用するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物であって、前記ペプチドまたは組成物は患者に投与されるものであり、好ましくは前記ペプチドはSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである、融合ペプチドまたは医薬組成物。
- 患者で、腫瘍、がん、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症(特に細胞内寄生虫感染症)、もしくは薬剤性免疫抑制の予防または治療に利用するための、請求項10に記載の融合ペプチドまたは医薬組成物。
- 患者の治療においてワクチンアジュバントとして利用するためのCblファミリータンパク質阻害剤であって、好ましくはCblファミリータンパク質阻害剤はCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドであり、より好ましくはSykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドである、Cblファミリータンパク質阻害剤。
- 患者の真菌感染症の予防または治療に利用するためのCblファミリータンパク質阻害剤であって、前記真菌感染症が、酵母感染症、好ましくはカンジダ症またはクリプトコッカス症である、Cblファミリータンパク質阻害剤。
- 患者の真菌感染症の予防または治療に利用するためのCblファミリータンパク質阻害剤であって、前記Cblファミリータンパク質阻害剤が、SykのCblファミリー結合ペプチドを含む、Cblファミリータンパク質阻害剤。
- 前記真菌感染症が酵母感染症であり、好ましくはカンジダ症(特にカンジダ・アルビカンス感染症、カンジダ・グラブラタ感染症、カンジダ・クルセイ感染症またはカンジダ・ドゥブリニエンシス感染症)、皮膚糸状菌感染症、またはアスペルギルス感染症である、請求項10〜14のいずれか1項に記載の利用のためのCblファミリータンパク質阻害剤またはペプチドまたは医薬組成物。
- アジュバントとしてCblファミリータンパク質阻害剤を含むワクチンであって、好ましくは前記Cblファミリータンパク質阻害剤が、SykのCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと、少なくとも1つの抗原を含み、好ましくは前記Cblファミリータンパク質阻害剤が、請求項1〜8および請求項10〜15のいずれか1項に定義されるものある、ワクチン。
- 請求項1〜16のいずれか1項に記載のペプチドと、医薬として許容可能な賦形剤、好ましくは患者の細胞内投与に適していることが好ましい賦形剤とを含むキット。
- インビトロまたはインビボで免疫細胞を刺激または活性化する方法であって、前記免疫細胞を、請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合ペプチドまたはCblファミリーTKBドメイン結合ペプチドと接触させる、または処理することを含み、好ましくはサイトカインが産生され、より好ましくは前記サイトカインがIL−6、IL−1β、IL−23およびTNFから選択される、方法。
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