JP2019522630A - Co2プラズマ活性化表面にカップリングする水性生体分子 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2016年5月16日に出願された米国特許出願第62/336,940号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体として本明細書に組み入れられる。
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、参照によりその全体として本明細書によって組み入れられる配列表を含有する。2017年5月11日に作成された該ASCIIコピーは、002806-085421-PCT_SL.txtと名前を付けられ、サイズが119,029バイトである。
本発明は、米国国防総省・宇宙海軍戦闘システムセンター(Space and Naval Warfare Systems Center U.S. Department of Defense)によって授与されたN66001-11-1-4180、および米国国防総省・国防高等研究計画局(Defense Advanced Research Projects Agency U.S. Department of Defense)によって授与されたHR0011-13-C-0025の下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
表面への所望の部分の標的結合のための現在の方法は、該表面に損傷を与え得る化学的架橋剤および/または有機洗浄を要し得る。表面に所望の部分をカップリングする改善された方法の必要性が、当技術分野において存在する。
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分(PGM)を含む改変基体を形成する工程;
(ii)改変基体への生物学的ポリマーの付着に十分な条件下で、実体と改変基体とを接触させる工程
を含み、それによって、実体が付着している基体を作製し、
ただし、
基体が、流体透過性、イオン透過性、多孔質、柔軟、加圧滅菌可能、もしくはポリスチレン以外であること;
生物学的ポリマーが融合タンパク質を含むこと;
生物学的ポリマーがレクチンを含むこと
のうちの1つまたは複数を条件とし;かつ
ただし、
プラズマが酸素プラズマ以外であること、例えばプラズマはCO2プラズマであること;
改変基体が、実体の付着前に、架橋部分、例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)と接触しないもしくはそれで誘導体化されないこと;または
改変基体が、実体の付着前に、有機溶媒、例えば有機アルコール、例えばエタノールと接触しないこと
のうちの1つまたは複数を条件とする。
I:
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分(PGM)を含む改変基体を形成する工程;
(ii)改変基体への生物学的ポリマーの付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;
II:
(i)PGMを含む改変基体を得る工程;および
(ii)改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;あるいは
III:
(i)基体とプラズマとを接触させて、PGMを含む改変基体を形成する工程;および
(ii.a)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させるのに適したものとして分類する工程;または
(ii.b)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる関係者(party)に、運ぶ、売却する、輸送する、その管理を移す、もしくはその所有を移す工程
を含み、それによって、実体が付着している基体を作製し、
ただし、
(a)基体が、流体透過性、イオン透過性、多孔質、柔軟、加圧滅菌可能(例えば、100Cよりも上で構造を保持する)、もしくはポリスチレン以外であること;
(b)基体が、90、80、70、60、もしくは50%未満のポリスチレンを含むこと;
(c)基体が、ポリスルホン(PS)、ポリアリルエーテルスルホン(PAES)、もしくはポリエーテルスルホン(PES)を含むこと;
(d)基体が、コンパートメント、例えば内腔を有する構造を含み、例えば該構造が中空繊維を含むこと;
(e)実体が特異的結合ペアの第一のメンバーを含むこと;
(f)実体が抗体ドメイン、例えばFcドメインを含むこと;
(g)実体が融合タンパク質を含むこと;
(h)実体がオプソニンを含むこと;
(i)実体がレクチンを含むこと;
(j)実体が多量体タンパク質のサブユニットを含むこと;または
(k)付着した実体が第二の実体に架橋される、例えば第二の実体が基体に付着している、もしくは第二の実体が基体に付着していないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはすべて)を条件とし;かつ
ただし、
(l)プラズマが酸素プラズマ以外であること、例えばプラズマがCO2プラズマであること;
(m)改変基体が、実体の付着前に、架橋部分(例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS))と接触しないもしくはそれで誘導体化されないこと;または
(n)改変基体が、実体の付着前に、有機溶媒(例えば有機アルコール、例えばエタノール)と接触しないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2つまたはすべて)を条件とする。
1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えばEDC、を含む水溶液
を含む反応混合物も提供する。
1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む基体、例えば透過膜;および
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド
を含む反応混合物も提供する。態様において、反応混合物は、活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えばEDCを含まない、または5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、もしくは0.001mg/ml未満のそれを含む。
基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばオプソニンの一部分、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
マスキング実体、例えばオプソニンが結合する部分、または二価カチオン、例えばCa2+
を含む反応混合物も提供する。
定義
本明細書において使用するとき、「活性化部分」とは、官能基をより反応性にする分子を指す。例えば、活性化部分は、官能基と(例えば、共有結合的に)反応して、第二の官能基に対するより高い反応性、例えばそれとの共有結合性結合を形成する増加した傾向、を有する改変官能基を形成し得る。一部の態様において、第一の官能基は実体の一部であり、第二の官能基はプラズマ発生部分である。一部の態様において、活性化部分は、実体が付着している基体に含まれていない原子を含む、例えば活性化部分の原子のいずれも、実体が付着している基体に含まれない。
実体には、例えば小分子、ポリペプチド、例えば糖ポリペプチド、例えば糖タンパク質、核酸、炭水化物、例えば多糖、生物学的ポリマー、小分子、ペプチド模倣物、薬物、ポリマー(例えば、PEGまたはPNA)、分泌タンパク質、シグナル伝達分子、膜に埋め込まれたタンパク質、核酸、染色体、核、ミトコンドリア、葉緑体、鞭毛、生体鉱物、ミニ細胞、抗体分子、抗原、受容体、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。実体には、タンパク質/タンパク質複合体または核酸/タンパク質複合体など、互いに非共有結合で結合した分子の複合体、例えば複数の分子も含まれ得る。実体の例は、本明細書において記載される。
一部の態様において、実体は、免疫グロブリン、例えばそれらのサブクラス(例えば、IgG1)を含めたIgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMの少なくとも一部分、またはその改変分子もしくは組換えを含む。1つの態様において、該一部分は、全長分子の1つまたは複数の生物学的機能(例えば、結合特性)を保持する。免疫グロブリンには、IgG、IgA、IgM、IgD、およびIgEが含まれる。免疫グロブリンの一部分(例えば、フラグメント)および免疫グロブリン誘導体には、一本鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、Fv、および(Fab')2、トリアボディ、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、CDRの組み合わせ、軽または重Ig鎖の可変領域、テトラボディ、二重特異性ハイブリッド抗体、フレームワーク領域、定常領域等が含まれるが、それらに限定されるわけではない(Maynard et al, (2000) Ann. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76;Hudson (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402を参照されたい)。1つの態様において、免疫グロブリン分子は、ヒト由来タンパク質と生物学的に同等の機能を有するタンパク質(例えば、ホモログ(スプライス変種を含む)、変異体、および誘導体)をコードする、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、およびラットなどの種々の生物学的種の間で保存された遺伝子である免疫グロブリンオルソログ遺伝子を包含し得る。免疫グロブリンオルソログには、ヒトおよび他の霊長類、実験哺乳類(マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなど)、商業的に重要な哺乳類(ウマ、ウシ、ラクダ、ブタ、およびヒツジなど)、ならびにまた伴侶動物(飼い慣らされた動物、例えばウサギ、フェレット、イヌ、およびネコなど)、またはラクダ、ラマ、またはサメにおけるオルソログを含めて、IgG、IgA、IgM、IgD、またはIgEの任意の哺乳類オルソログが含まれる。
一部の態様において、実体は、レクチンなどのオプソニンを含む。一部の態様において、実体は、微生物表面結合ドメインまたは微生物結合分子を含む。
、またはNDを含むそのフラグメントが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば保存的置換による、そのようなCRDフラグメントの改変も、本明細書において記載される範囲内にある。一部の態様において、本明細書において記載される操作された微生物標的分子の微生物表面結合ドメインにおいて用いられるMBLまたはそのフラグメントは、野生型分子または組換え分子であり得る。
、またはその任意のフラグメントが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
(i)MBL全長(SEQ ID NO:1):
(ii)シグナル配列なしのMBL(SEQ ID NO:2):
(iii)切断されたMBL(SEQ ID NO:3):
(iv)MBLの炭水化物認識ドメイン(CRD)(SEQ ID NO:4):
(v)MBLのネック+炭水化物認識ドメイン(SEQ ID NO:5):
(vi)FcMBL.81(SEQ ID NO:6):
(vii)AKT-FcMBL(SEQ ID NO:7):
(viii)FcMBL.111(SEQ ID NO:8):
一部の態様において、微生物結合ドメインは、CD209(分化のクラスター209)の炭水化物認識ドメインまたはその機能的フラグメントを含む。CD209は、ヒトにおいてCD209遺伝子によってコードされるタンパク質である。CD209は、DC-SIGN(樹状細胞特異的細胞間接着分子-3捕獲非インテグリン(Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin))としても知られる。DC-SIGNは、マクロファージおよび樹状細胞の両方に存在するC型レクチン受容体である。マクロファージ上のCD209は、ウイルス、細菌、および真菌によく見い出される病原体関連分子パターン(PAMP)の分類であるマンノース型炭水化物を認識しかつ結合する。この結合相互作用は、食作用を活性化する。骨髄系樹状細胞および前形質細胞様(pre-plasmacytoid)樹状細胞上で、CD209は、血液内皮との樹状細胞ローリング相互作用およびCD4+ T細胞の活性化、ならびに病原体ハプテンの認識を媒介する。CD209はC型レクチンであり、ICAM3分子に対する高い親和性を有する。それは、様々な微小生物に、それらのエンベロープ上の高マンノース含有糖タンパク質を認識することによって結合し、とりわけ、HIVおよびC型肝炎などのいくつかのウイルスに対する受容体として機能する。DC-SIGNへの結合は、HIVおよびC型肝炎ウイルスが樹状細胞からT細胞に感染するのを促進し得る。ゆえに、DC-SIGNへの結合は、HIC感染にとって重要な過程である。接着分子として機能する以外に、最近の研究は、CD209が、トール様受容体を変調することによって自然免疫を開始し得ることも示している。DC-SIGNは、他のC型レクチンとともに、樹状細胞による腫瘍の認識に関与する。CD209は、樹状細胞に基づく癌ワクチンの潜在的な操作標的でもある。CD209の例示的な結合標的には、マンノースおよび他の糖類が含まれる。
一部の態様において、実体は、CD209Lの炭水化物認識ドメインまたはその機能的フラグメントを含む。CD209Lは、L-SIGN(肝臓/リンパ節特異的細胞内接着分子-3捕獲非インテグリン)とも呼ばれ、HIV gl20結合タンパク質のCD209抗原と77%同一であるII型内在性膜タンパク質である。このタンパク質は、CD209と同様に、細胞間接着分子3(ICAM3)およびHlV-1 gl20の両方に効率的に結合し、T細胞のHIV-1感染を増強する。L-SIGNに対する遺伝子は、CD209およびCD23/FCER2遺伝子を有するクラスターにおいて19p13.3にマッピングされる。複数の選択的スプライスによる転写産物変種がこの遺伝子に対して見い出されているが、一部の変種の生物学的妥当性は決定されていない。CD209Lの例示的な結合標的には、マンノースおよび他の糖類が含まれる。
一部の態様において、実体は、パターン認識受容体またはその機能的フラグメントを含む。パターン認識受容体(PRR)は、免疫系の原始的部分である。それらは、微生物病原体または細胞ストレスと関連付けされる病原体関連分子パターン(PAMP)、ならびに細胞損傷の間に放出される細胞成分と関連付けされる損傷関連分子パターン(DAMP)を同定する、自然免疫系の細胞によって発現されるタンパク質である。それらは、免疫系の他の部分の前に、特に適応免疫の前に進化したため、病原体認識受容体または原始的パターン認識受容体とも呼ばれる。所定のPRRによって認識される微生物特異的分子は、病原体関連分子パターン(PAMP)と呼ばれ、細菌炭水化物(リポ多糖またはLPS、マンノースなど)、核酸(細菌またはウイルスDNAまたはRNAなど)、細菌ペプチド(フラジェリン、ax21)、ペプチドグリカンおよびリポタイコ酸(グラム陽性細菌由来)、N-ホルミルメチオニン、リポタンパク質、ならびに真菌グルカンを含む。内因性ストレスシグナルは、危険関連分子パターン(DAMP)と呼ばれ、尿酸を含む。PGRPに対する例示的な結合標的には、ペプチドグリカン(PGN)が含まれる。
ペプチドグリカン認識タンパク質(PGRP)は、昆虫から哺乳類まで保存されているパターン認識分子であり、細菌およびそれらの固有の細胞壁成分のペプチドグリカン(PGN)を認識する。PGRPは、少なくとも1つのカルボキシ末端PGRPドメイン(およそ165アミノ酸長)を有し、それはバクテリオファージおよび細菌2型アミダーゼと相同である。昆虫は、短い(S)および長い(L)形態に分類される最高19種のPGRPを有する。短い形態は、血リンパ、クチクラ、および脂肪体細胞に、ときには胃腸および血球における表皮細胞に存在し、一方で長い形態は主に血球に発現される。
一部の態様において、実体は、エビ由来の炭水化物認識ドメインまたはそのフラグメント(例えば、機能的な)を含む。例えば、実体は、エビのMjレクチンCまたはMjレクチンBの炭水化物認識ドメインまたはそのフラグメントを含み得る。MjレクチンCに対する例示的な結合標的には、微生物細胞壁が含まれる。一部の態様において、実体(例えば、微生物結合ドメインを含む実体)は、アミノ酸配列SEQ ID NO:23またはSEQ ID NO:36を含む。
一部の態様において、実体は、抗微生物ペプチドまたはその機能的フラグメントを含む。一部の態様において、実体は、例えば抗微生物ペプチドのN末端またはC末端に、炭水化物認識ドメインをさらに含む。さらに、抗微生物ペプチドは、炭水化物認識ドメインに、直接的にまたはリンカー(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはそれを上回る数のアミノ酸のペプチド)を介して連結され得る。1つの態様において、抗微生物ペプチドは、炭水化物認識ドメインのC末に連結される。
一部の態様において、実体は小分子である。一部の態様において、実体は、抗生物質、抗新生物剤、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、または抗真菌剤である。
一部の態様において、実体は薬物、例えば小分子またはタンパク質薬物である。一部の態様において、実体は、アンピシリン、ノルフロキサシン、リファンピン、チゲサイクリン、セフォペラゾン、フラゾリドン、スルファジアジン銀、ダプソン、ゲミフロキサシン、スルファジミジン、エノキサシン、スルフイソキサゾール、セフトロザン、プロントジル、スルファメラジン、スルファピリジン、グレパフロキサシン、スルファレン、スルファメトキシピリダジン、酢酸/ヒドロコルチゾン、スルファベンズアミド、スルファメトロール、スルファメトキシジアジン、ビリジカタムトキシン(ciridicatumtoxin)B、スルファフェナゾール、スルファモキソール、スルファメトミジン、スルファチオ尿素、またはスルファペリンなどの抗生物質である。
一部の態様において、実体は、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドの配列および長さは、基体のタイプ、結合密度、および/または所望の結合強度に従って構成され得る。例えば、基体が核酸足場、例えばDNA足場である場合、基体結合ドメインのオリゴヌクレオチド配列は、それが、基体結合ドメインがハイブリダイズし得る核酸足場の部分配列に相補的であるように設計され得る。
一部の態様において、実体は、リンカー、例えば実体の2つのドメインを接続するリンカーを含む。一部の態様において、2つのドメインは、本明細書において記載されるドメインである。一部の態様において、リンカーは、1つまたは複数の微生物表面結合ドメインに直接的または間接的に接続し得る。限定されることなく、一部の態様において、リンカーは、1種もしくは複数種の微生物、微生物物質、および/または他の標的分子に対する結合部位も提供し得る。そのような態様において、微生物は微生物表面結合ドメインに結合するため、リンカー上の微生物結合部位は、同じタイプおよび/または種の微生物に結合し得る。あるいはまたは加えて、リンカー上の微生物結合部位は、本明細書において記載される微生物表面結合ドメインに結合するものとは異なるタイプおよび/または種の微生物を捕捉し得る。
多くのタイプの固体基体が、本開示に従って用いられ得る。ある特定の態様において、化学的反応性表面(つまり、活性化されて化学的反応性表面を提供し得る表面)を有する固体基体が用いられる。1つの態様において、表面は平滑である。他の態様において、表面は、いかなる程度の表面粗度にも限定されない。態様において、表面は多孔質である。
一部の態様において、用いられるプラズマ発生器は、容量結合(coupled)プラズマ発生器、例えばDiener製のModel Nanoである。プラズマ発生器は、13.56MHzの無線周波数を利用し得る。態様において、プラズマ発生器は、その中でプラズマが産生されるチャンバーを含む。プラズマ発生器チャンバーは、プラズマに1つまたは複数の基体を曝露するのに適切なサイズのものであり得る。
本節は、プラズマ発生部分に、例えば固体基体上に、実体をカップリングする様々な適切なやり方を記載する。一部の態様において、活性化部分が用いられる。
態様において、本明細書における組成物および方法はマスキング実体を伴う。理論によって限定されることなく、マスキング実体は、実体、例えばオプソニン、例えばMBL、例えばFcMBLに結合し得、実体の少なくとも一部分を反応物、例えば活性化部分、架橋剤、またはフリーラジカルからマスクすることによって、実体が活性を保持するのを助け得る。一部の態様において、マスキング実体は、実体(例えば、ポリペプチド)の活性部位または結合表面に結合する。マスキング実体は、例えばカルシウムなどの二価イオンを含み得る。マスキング実体は、例えばグルコースなどの糖類も含み得る。マスキング実体は、ポリペプチド、核酸(例えば、DNAまたはRNA)、脂質、炭水化物、または小分子を含み得る。
本明細書において記載される方法によって作製された基体は、液体中の可溶性または懸濁された標的部分など、標的部分を捕捉するための装置において/として用いられ得る。標的部分の非限定的な例には、任意で体液、例えば血液中に存在し得る、微生物および/または微生物物質が含まれる。一態様において、装置は、無傷の微生物、および/または微生物物質など、少なくとも1種の標的部分に結合し得るまたは捕捉し得る。
一部の態様において、本明細書において記載される装置(例えば、本明細書における方法に従って作製された装置)は、例えば敗血症または感染性疾患の診断のために用いられる。態様において、装置は、実体が付着した固体基体を含み、該実体は微生物または微生物物質に結合する。一部の態様において、診断用装置は、固体基体をプラズマ処理し、該固体基体と実体とを接触させ、該固体基体と生物学的サンプルを接触させ、および該生物学的サンプル中の微生物が該実体に結合するかどうかを判定することによってもたらされる。診断方法またはシステムは、検出可能な標識も含み得る。
一部の態様において、本明細書における産物およびキットを用いて、バイオフィルムに存在する微生物および/もしくは関連する微生物物質を検出し得る、または機器表面を処理してバイオフィルムの形成を防止し得るもしくは阻害し得る。例えば、リステリア・モノサイトゲネスは、食品加工機器ならびに他の食品および非食品接触表面において用いられる様々な原料の上にバイオフィルムを形成し得る(Blackmail, J Food Prot 1996; 59:827-31;Frank, J Food Prot 1990; 53:550-4;Krysinski, J Food Prot 1992; 55:246-51;Ronner, J Food Prot 1993; 56:750-8)。典型的に、バイオフィルムにおいて、微生物細胞は表面に付着し、微小生物によって産生される細胞外ポリマー材料のマトリックス中に埋め込まれる。バイオフィルムは多くの環境において生じ、多種多様の望ましくない効果に高頻度でつながる。例えば、バイオフィルムは、熱交換器、パイプライン、および船体などの産業機器のファウリングを引き起こし、熱伝達の低下、エネルギー損失、流体摩擦抵抗の増加、および腐食の加速をもたらす。歯および歯肉、尿路および腸管、ならびにカテーテルおよびプロテーゼなどの埋没された医療装置の上へのバイオフィルム蓄積は、感染症に高頻度でつながる(Characklis W G. Biofilm processes. In: Characklis W G and Marshall K C eds. New York: John Wiley & Sons, 1990:195- 231;Costerton et at, Annu Rev Microbiol 1995; 49:711-45)。
一部の態様において、本明細書における方法によって産生された装置は、発売されるまたは販売される前に試験される。例えば、ISO 10993-1などの細胞毒性アッセイが実施され得る。一部の態様において、生体適合性試験が実施される。一部の態様において、試験は、汚染物質が約1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、または10nM未満で存在することを示す。
1.
実体(例えば、ポリペプチド、例えば糖ポリペプチド、例えば糖タンパク質;核酸;炭水化物、例えば多糖;生物学的ポリマー;小分子;ペプチド模倣物;薬物;または病原性もしくは疾患性分子と相互作用し得る、例えば特異的に結合し得る、例えば糖ポリペプチド、例えば糖タンパク質に結合し得る部分)が付着している基体を作製する方法であって、
I:
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分(PGM)を含む改変基体を形成する工程、および
(ii)改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;
II:
(i)PGMを含む改変基体を得る工程、および
(ii)改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;あるいは
III:
(i)基体とプラズマとを接触させて、PGMを含む改変基体を形成する工程、および
(ii.a)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させるのに適したものとして分類する工程、または
(ii.b)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる関係者に、運ぶ、売却する、輸送する、その管理を移す、もしくはその所有を移す工程
を含み、それによって、実体が付着している基体を作製し、
ただし、
(a)基体が、流体透過性、イオン透過性、多孔質、柔軟、加圧滅菌可能(例えば、100Cを超えても構造を保持する)、もしくはポリスチレン以外であること;
(b)基体が、90、80、70、60、もしくは50%未満のポリスチレンを含むこと;
(c)基体が、ポリスルホン(PS)、ポリアリルエーテルスルホン(PAES)、もしくはポリエーテルスルホン(PES)を含むこと;
(d)基体が、コンパートメント、例えば内腔を有する構造を含み、例えば該構造が中空繊維を含むこと;
(e)実体が特異的結合ペアの第一のメンバーを含むこと;
(f)実体が抗体ドメイン、例えばFcドメインを含むこと;
(g)実体が融合タンパク質を含むこと;
(h)実体がオプソニンを含むこと;
(i)実体がレクチンを含むこと;
(j)実体が多量体タンパク質のサブユニットを含むこと;または
(k)付着した実体が第二の実体に架橋される(例えば、第二の実体が基体に付着している、または第二の実体が基体に付着していない)こと
のうちの1つまたは複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはすべて)を条件とし;かつ
ただし、
(l)プラズマが酸素プラズマ以外である(例えば、プラズマがCO2プラズマである)こと;
(m)改変基体が、実体の付着前に、架橋部分(例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS))と接触せず、かつそれで誘導体化されないこと;または
(n)改変基体が、実体の付着前に、有機溶媒(例えば有機アルコール、例えばエタノール)と接触しないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2つまたはすべて)を条件とする、方法。
2.
I:
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分を含む改変基体を形成する工程;および
(ii)該改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる工程
を含む、パラグラフ1の方法。
3.
II:
(i)PGMを含む改変基体を得る工程;および
(ii)該改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる工程
を含む、パラグラフ1の方法。
4.
III:
(i)基体とプラズマとを接触させて、PGMを含む改変基体を形成する工程;および
(ii.a)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体、例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチドと該改変基体とを接触させるのに適したものとして分類する工程;または
(ii.b)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる関係者に、運ぶ、売却する、輸送する、その管理を移す、もしくはその所有を移す工程
を含む、パラグラフ1の方法。
5.
(a)例えばPGMと実体との間に配置される活性化部分由来の原子なしで、実体がPGMに直接付着する;
(b)基体とプラズマとを接触させた後、実体がPGMに直接付着する;
(c)PGMと実体とを付着させるための1つもしくは複数の反応が水性である;
(d)実体が、水性条件下で改変基体と接触する;
(e)PGM、例えばカルボン酸が、例えばXPSによって測定されるように、炭素組成で少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、もしくは20%の存在量で形成される;
(f)実体が、例えば結合法によって測定されるように、1cm2あたり少なくとも約1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、もしくは1×1017個の分子の密度で付着する;または
(g)実体が、6〜8のpH(例えば、pH7または生理学的条件)で改変基体と接触する;または
(h)実体が、少なくとも約500、600、700、800、900、1000、もしくは1100個の実体/μm2の密度で付着する、
パラグラフ1の方法。
6.
基体が内腔を含み、例えば基体は中空繊維を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
7.
基体が、セルロース、置換セルロース、例えば酢酸セルロース、二酢酸セルロース、もしくは三酢酸セルロース;ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、ナイロン、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリカーボネート、ポリアミド、またはポリメチルメタクリレート(PMMA)を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
8.
基体がポリジメチルシロキサン(PDMS)またはポリスチレンを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
9.
基体が接着剤または密閉剤を含み、かつ該接着剤または密閉剤が、有機溶媒、例えば有機アルコール、例えばエタノールと接触しない、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
10.
基体が、透析、限外濾過、血液濾過、血液透析濾過、または血液灌流カートリッジを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
11.
基体が、ポリマー、ガラス、金属、もしくはセラミック、またはその任意の組み合わせを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
12.
基体が中空繊維または非中空繊維膜を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
13.
工程(ii)において、改変基体が、架橋部分、例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)を実質的に含んでいない、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
14.
工程(ii)において、改変基体が有機溶媒を実質的に含んでいない、または
前記方法が、例えば工程(i)の後もしくは工程(ii)の前に、改変基体と有機溶媒とを接触させる工程を含まない、
前記パラグラフのいずれか一つの方法。
15.
改変基体、実体、またはその両方と、活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とを接触させて、改変基体上の官能基を活性化する工程を含み、
該官能基が任意でカルボン酸基である、
前記パラグラフのいずれか一つの方法。
16.
工程(ii)の接触させる工程が、水性バッファー中で実施される、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
17.
工程(ii)の接触させる工程が、2-モルホリノ-エタンスルホン酸(MES)バッファーを含む溶液中で実施される、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
18.
工程(ii)の接触させる工程が、約4〜5、4.5〜5.5、5〜6、6〜7、7〜8、または約5のpHで実施される、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
19.
工程(ii)の接触させる工程が、約4〜6、6〜8、8〜10、10〜12、12〜14、または14〜16時間実施される、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
20.
活性化部分が、実体が付着している基体に含まれていない原子を含む、例えば活性化部分の原子のいずれも、実体が付着している基体に含まれていない、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
21.
PGMがカルボン酸を含み、かつ実体がアミンを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
22.
PGMのカルボン酸が、実体のアミン基と共有結合で結合する、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
23.
プラズマがCO2プラズマである、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
24.
プラズマが、O2、N2、またはNH4プラズマである、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
25.
基体とプラズマとを接触させる工程が、基体上に既定のレベルまたは密度のPGMを形成するのに適切な条件下にある、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
26.
PGMが、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシド基、ペルオキシド基、スルフヒドリル基、カルボニル基、またはカルボン酸基を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
27.
PGMがカルボン酸基を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
28.
PGMの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、または50%がカルボン酸基を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
29.
PGMがアルデヒド基を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
30.
PGMの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、または50%がアルデヒド基を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
31.
PGMが、実体、例えば活性化部分と接触している実体上の部分と反応性である部分を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
32.
プラズマが、以下の条件:
(a)約13〜14mHz、例えば13.5mHzの無線周波数;
(b)プラズマ処理が、実体の活性、例えば結合活性を維持しながら改変基体に実体を連結させるのに十分な時間続き、例えばプラズマ処理が、約0.1〜5分間、例えば約1分間続くこと;
(c)プラズマガス圧が、約150〜350mTorr、例えば約200mTorrであること;
(d)約10〜150W、例えば約100Wの出力;または
(e)プラズマ発生器が、プラズマ発生器チャンバーの外側に電極を含み、例えばプラズマ発生器チャンバーの内側には電極を含まないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2、3、4つ、またはすべて)の下でプラズマ発生器によって発生される、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
33.
工程(i)の接触させる工程が、複数の基体(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、50、または100個の基体)とプラズマとをプラズマ発生器チャンバー内で接触させることを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
34.
実体が、オプソニン、炭水化物結合タンパク質、カルシウム結合タンパク質、二価カチオン結合タンパク質、および/または抗体の一部分、例えばFcもしくはその一部分を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
35.
実体が、SEQ ID NO:4のポリペプチドまたはSEQ ID NO:4と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一のポリペプチド、あるいはSEQ ID NO:6のポリペプチドまたはSEQ ID NO:6と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一のポリペプチドを含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
36.
実体が、多量体、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、12量体、または18量体を形成する、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
37.
実体が、互いに架橋した少なくとも2つのサブユニットを有する多量体を形成する、パラグラフ36の方法。
38.
PGMのタイプ、PGMの数、PGMの密度、汚染物質の存在、付着した実体の数、接触角測定値(例えば、水接触角測定値)、または表面エネルギー測定値に関連したパラメーターの値を取得する工程、および
取得した値と標準値とを比較する工程
をさらに含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
39.
比較に対応して、分類する工程、合格とする工程、不合格とする工程、認可する工程、製品に組み入れる工程、包装する工程、新たな場所に移す工程、または商業に流通させる工程をさらに含み、
基体が、付着した実体を含む、
パラグラフ38の方法。
40.
例えばX線光子分光法(XPS)により、PGMの存在について改変基体を評価する工程をさらに含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
41.
汚染物質または製造試薬、例えば抽出され得る分子、浸出し得る分子、基体に連結されていないFcMBL、EDC、溶媒(例えば、MESバッファー)、内毒素、発熱物質、ヌクレアーゼ、または生物、例えば細菌もしくは真菌について、改変基体を評価する工程
をさらに含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
42.
例えば、
(a)プラズマ発生器チャンバーを溶媒(例えば有機溶媒、例えばエタノール)で洗浄すること;
(b)該チャンバー内で浄化プラズマを産生すること(例えば、工程(i)のプラズマとは異なるガスから作られた浄化プラズマ、例えば工程(i)のプラズマがCO2プラズマである場合、O2プラズマを用いた浄化);および/または
(c)化学清浄によって該チャンバーを清浄すること
のうちの1つまたは複数(例えば、そのうちの2つまたはすべて)を実施することによって、工程(i)の前に該プラズマ発生器チャンバーを浄化する工程
をさらに含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
43.
浄化プラズマが、約30分間、約400Cの温度で、またはその両方で産生される、パラグラフ42の方法。
44.
(a)浄化工程の間、プラズマの色をモニターする工程であって、例えばO2プラズマは、有機物が存在する場合に青色であり、有機物が存在しない場合に白色である、もしくはCO2プラズマは、有機物が存在する場合に暗青色であり、有機物が存在しない場合に水色である、工程;または
(b)工程(i)の接触させる工程の間、プラズマの温度をモニターする工程であって、プラズマの温度は、プラズマが産生される最初のわずかな時間に80Cを超えて上昇せず、最初のわずかな時間に80Cを超えて上昇する温度は汚染物質の存在を示す、工程;または
(c)浄化工程の間、プラズマの温度をモニターする工程であって、プラズマの温度は、ピーク温度(典型的に、400〜500C)から10Cを下回って下降し、上昇し続けるかもしくはピーク温度を維持する温度は汚染物質の存在を示す、工程
のうちの1つまたは複数(例えば、2つまたはすべて)を実施することによって、プラズマ発生器チャンバーの清浄度を判定する工程
を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
45.
基体がプラズマ発生器チャンバー内に配置される場合、例えば工程(i)の接触させる工程の前に、
(a)プラズマ発生器チャンバー内に真空(例えば、1Torr未満の圧力)を創出すること、および
(b)ガス、例えば工程(i)のプラズマを作るために用いられた同じガス、例えばCO2で、プラズマ発生器チャンバーを充填すること
の一方または両方を実施する工程を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
46.
プラズマ発生器チャンバーを、例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間、例えば約5分間、ガス、例えばCO2で充填する、パラグラフ45の方法。
47.
例えば、
(a)基体と1滴の液体、例えば水とを接触させ、該1滴の液体の接触角を測定すること;
(b)基体と、実体に結合する部分とを接触させることであって、例えば該部分が抗体分子またはマンノースなどの糖質を含み、該部分が、任意で、検出可能な標識に結合されるもしくは共有結合で連結される、こと;または
(c)基体と、PGMに結合する部分、例えばアミン基を含む検出可能な標識とを接触させること
のうちの1つまたは複数を実施することによって、基体の改変を測定する工程
を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
48.
基体に実体が付着する際にマスキング実体を提供する工程であって、マスキング実体が、実体の一部分と、例えば活性化部分、基体、または別の実体、例えばポリペプチドなどの生物学的ポリマーとの反応を阻害する、工程
を含む、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
49.
マスキング実体が、実体が結合する部分を含む、パラグラフ48の方法。
50.
実体がオプソニン、例えばMBLを含み、かつマスキング実体が、オプソニンが結合する部分、例えば二価カチオン、例えばCa2+、または糖類、例えばグルコースを含む、パラグラフ48の方法。
51.
例えば結合アッセイによって測定される、第一の選択エリア、例えば1cm2エリアにおける付着した実体の密度が、1、2、3、4、5、または10個の他の選択エリア、例えば基体上のそれぞれ1cm2のエリアの密度の50%以内である、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
52.
基体上または基体の一部分上、例えば中空繊維の内腔上の、1cm2エリアの10、20、30、40、50、60、または70%の密度が、互いの、または1つのウェルの底部、複数のウェルの底部、もしくは中空繊維の50、40、または30%以内である、前記パラグラフのいずれか一つの方法。
53.
パラグラフ1〜52のいずれか一つの方法によって産生された、実体が付着している基体
を含む、装置。
54.
パラグラフ1〜52のいずれか一つの方法によって産生可能な、実体が付着している基体
を含む、装置。
55.
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、
例えば結合アッセイによって測定されるように、1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む、装置。
56.
付着した複数種の実体、例えば複数種のポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドを有する基体、例えば透過膜を含む装置であって、
例えば結合アッセイによって測定される、第一の選択エリア、例えば1cm2エリアにおける付着した実体の密度が、1、2、3、4、5、または10個の他の選択エリア、例えば基体上の1cm2のエリアの密度の50%以内である、あるいは基体上または基体の一部分上、例えば中空繊維の内腔上の、1cm2エリアの10、20、30、40、50、60、または70%の密度が、互いの、または1つのウェルの底部、複数のウェルの底部、もしくは中空繊維の50、40、または30%以内である、装置。
57.
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、該実体のアミノ基(例えば、リジン側鎖またはN末端のアミノ基)が、該基体上のPGM(例えば、カルボン酸)に共有結合で直接結合される、装置。
58.
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、
1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、もしくは1分子未満、または1つの装置あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、もしくは1分子未満の汚染物質、例えば抽出され得る分子、浸出し得る分子、基体に連結されていないFcMBL、EDC、溶媒(例えば、MESバッファー)、内毒素、発熱物質、ヌクレアーゼ、または生物、例えば細菌もしくは真菌を含む、装置。
59.
1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えばEDCを含む、水溶液
を含む反応混合物。
60.
基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばオプソニンの一部分、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
マスキング実体、例えばオプソニンが結合する部分、または二価カチオン、例えばCa2+
を含む、反応混合物。
61.
マスキング実体が糖類、例えばグルコースを含む、パラグラフ60の反応混合物。
62.
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、該実体が、約500〜2000、500〜1800、500〜1600、500〜1200、600〜2000、600〜1800、600〜1600、600〜1200、800〜2000、800〜1800、800〜1600、800〜1200、1000〜2000、1000〜1800、1000〜1600、または1000〜1200個の実体/μm2の密度で該基体に付着している、装置。
ほとんどのプラスチックは、生体分子で表面を充分に官能化するのに十分な反応基をそれらの表面に有しない。XPSを用いて、プラズマで改変されたプラスチックの表面上の酸化の程度を特徴付けし、カップリングの前に、必要とされる反応性部分が存在することを検証した。
ポリエーテルスルホン(PES)シートを、Goodfellow Cambridge Limitedから得た。原料を8mm×11mmの長方形に切り取ることによって、シートのサンプルを調製した。サンプルを70%エタノール/水溶液中でボルテックスによって3回洗浄し、その後70%エタノール/水で3回リンスした。プラズマ処理の前に、サンプルを室内の空気中で乾燥させた。
PESサンプルを、様々な時間または様々な出力でCO2プラズマに曝露した。18.56MHzの無線周波数の容量結合プラズマ発生器は、Diener製のModel Nanoであった。まず、空チャンバーとのサイクルにより、チャンバーから汚染物質を清浄した。まず、チャンバーを0.14mbarで真空に引っ張り、次いで、1分間の純粋なO2ガスインプットで0.26mbarの圧力に上昇させた。次いで、プラズマを150W(50%出力)で30分間発生させた。ユニットが冷却した時点で、サンプルをチャンバー内に導入した(最高4時間)。次いで、チャンバーを0.14mbarで真空に引っ張り、次いで、5分間の純粋なCO2ガスインプットで0.26mbarの圧力に上昇させた。プラズマ処理時間は、100ワットで0分間、0.5分間、1分間、3分間、および5分間に変動した。サンプルを同日中にXPSによって分析して、PES表面上の付加されたカルボキシレート官能基の存在を同定した。
PESサンプルのX線光電子分光法(XPS)分析を、Thermo Scientific K-Alpha分光計で実施した。分光計は、アルミニウムKα供給源から12Vの電子ビームを発生する。PESサンプルを0.85eVの線幅で1.4866keVのx線エネルギーにおいてプローブした。x線スポットサイズ400μmを採用して、平均面積にわたる誘導された官能基変化を得た。化学組成を、各PESサンプルに対して1つのスポットにおいて分析した。
式1:ポリエーテルスルホンの構造
方法
PESサンプルを、Life Technologies製のQDOT 655 ITK Amino(PEG) quantum dots(Cat# Q21521MP)で官能化した。まず、サンプルをペトリディッシュの中で上向きにして、PESを100WにおけるCO2プラズマで1分間処理した。プラズマ処理の後、プラズマ処理された側を上にして、サンプルをマルチウェル24ウェルプレートに移した。
1.)(-) EDCコンジュゲート;(-) CO2プラズマ
2.)(+) EDCコンジュゲート;(-) CO2プラズマ
3.)(-) EDCコンジュゲート;(+) CO2プラズマ
4.)(+) EDCコンジュゲート;(+) CO2プラズマ
サンプルをLeica SP5 X MP倒立共焦点顕微鏡で撮像した。イメージングの目的は、面積の関数として蛍光を定量化することによって、表面官能化の程度を査定することであった。励起はCohert Chameleon多光子レーザーで達成され、ピークは810nmに中心があった。レーザーの電力アウトプットは3.2Wであった。検出器のゲインを500に固定した。共焦点ピンホールを55.10umに固定した。
ImageJソフトウェアを用いて、表面に付着した量子ドットの量の測定値である、表面層の蛍光強度を定量化した。マスクを用いて、ドットの凝集体を除外した。解析は、CO2プラズマ処理されかつEDCカップリングされた表面上の量子ドットの最大被覆率を示しており、最大表面コーティングには両工程が必要となることを示した。
PESフィルムをSEMでさらに特徴付けして、サブ波長(<200nm)分解能における量子ドットの分布を判定した。イメージングにより、CO2プラズマおよびEDC架橋化学の両方で処理された場合、ドットは表面上で密に詰め込まれることが明らかになった。
共有結合性カップリング:PESチップ
1.PESチップを12ウェルプレートに置く。プラズマ処理する(100W、1分間)。
2.FcMBLを1×PBS中125ug/mlに希釈する。
3.EDCを1×PBS中1mg/mlで溶解する。
4.FcMBLとEDCとを1:1で混合し、軽く反転させる。
5.FcMBL-EDCをPESチップ上に等分する、500ul/ウェル。4Cで一晩インキュベートする。
6.1×PBSを用いて3×1ml/ウェルでPESチップを洗浄する。
マンナン結合:PESチップ
7.PESチップをブロッキングする:10mMグルコース、TBS-T Ca++中0.1%BSA、500ul/ウェル。RTで1時間、振とうしながらインキュベートする。
8.PESチップを洗浄する:3×1ml/ウェル、TBS-T Ca++。
9.マンナンをTBS-T Ca++中31.25ug/mlに希釈する。
10.マンナンをPESチップ上に等分する、500ul/ウェル。RTで1時間、振とうしながらインキュベートする。
11.PESチップを洗浄する:3×1ml/ウェル、TBS-T Ca++。
12.rhMBL-HRP 1.5ulを10mlの3%BSA/TBS-T Ca++中に希釈する。
13.rhMBL-HRPをPESチップ上に等分する、500ul/ウェル。RTで1時間、振とうしながらインキュベートする。
14.PESチップを洗浄する:3×1ml/ウェル、TBS-T Ca++。
15.PESチップを新たな12ウェルプレートに移す。
16.発色:500ul/ウェルのTMB。RTで1分間インキュベートする。
17.消光反応:250ul/ウェルの硫酸。
18.サンプルを96ウェルプレートに移す、三つ組で100ul/ウェル。
19.450nmで読み取る。
FcMBLを、以下の方法を用いて透析カートリッジに付着させた。
本実施例は、共有結合で結合したELISAの感度が、全血におけるマンナンの検出に関して、受動吸着ELISAよりも有意に大きかったことを例証する(図5)。
1.96ウェルELISAプレートをプラズマ処理する(CO2、100W、1分間)。
2.FcMBLを1×PBS中31.25マイクログラム(ug)/mlに希釈する。
3.EDCを1×PBS中1mg/mlに溶解する。
4.FcMBL溶液とEDC溶液とを混合し、軽く反転させる。
5.プラズマ処理された96ウェルプレート上にFcMBL-EDCを100ul/ウェルで等分する。
6.4Cで一晩インキュベートする。
7.1×PBSを用いて4×200ul/ウェルでプレートを洗浄する。
8.プレートをブロッキングする:10mMグルコース、TBS-T Ca++中0.1%BSA、200ul/ウェル。350RPMで振とうしながら、RTで1時間インキュベートする。
9.TBS-T Ca++を用いて4×200ul/ウェルでプレートを洗浄する。
10.マンナンをTBS-T Ca++または全血中62.5ng/mlに希釈し、7回の2倍希釈を完了する。
11.マンナン希釈物を三つ組で等分する、100ul/ウェル。350RPMで振とうしながら、RTで30分間インキュベートする。
12.TBS-T Ca++を用いて4×200ul/ウェルでプレートを洗浄する。
13.rhMBL-HRP 1.5ulを10mlの3%BSA/TBS-T Ca++中に希釈する。
14.rhMBL-HRPを100ul/ウェルで等分する。350RPMで振とうしながら、RTで30分間インキュベートする。
15.TBS-T Ca++を用いて4×200ul/ウェルでプレートを洗浄する。
16.TMBを100ul/ウェルで等分する。RTで約1分間インキュベートする。
17.消光反応:硫酸を50ul/ウェルで等分する。
18.450nmでプレートを読み取る。
本実施例は、中空繊維の内側で実施されたFcアッセイを記載する。
1.中空繊維にFcMBLを共有結合でカップリングした後、1×PBSを用いて3×10mlで繊維を洗い流す。
2.中空繊維ケーシングを切り開いて、内部繊維を晒す。
3.ピンセットを用いて、1本の繊維を取り出し、1インチ長切片に切り分け、各切片を12ウェルプレートの1ウェルの中に置く。
4.ブロッキング:3%BSA/TBS-T Ca++を等分する、500ul/ウェル。振とうしながら、室温で1時間インキュベートする。
5.TBS-T Ca++を用いて3回洗浄する、500ul/ウェル。
6.HRPコンジュゲート抗Fc抗体(Jackson)を1%BSA/TBS-T Ca++中1:10,000に希釈する。
7.抗Fc抗体溶液を500ul/ウェルで等分する。振とうしながら、室温で1時間インキュベートする。
8.TBS-T Ca++を用いて3回洗浄する、500ul/ウェル。
9.発色:TMBを500ul/ウェルで等分する。約1分間インキュベートする。
10.消光反応:硫酸を250ul/ウェルで等分する。
11.96ウェルプレートに100ul/ウェルを三つ組でピペットで移す。
12.450nmで読み取る。
カップリングバッファーへの10mMカルシウムの添加は、カルシウム依存的様式で結合リガンドに対するFcMBLの機能性を保持するのを助ける。これは、FcMBLの結合ポケットにおけるキレートカルボキシレート基の保護による可能性が高い。加えて、バッファーを4Cに冷やすことは、マンナンに結合する能力によって測定されるように、カップリングしたFcMBLの機能性を保持するのを助ける(図8)。
本実施例において、表面ポリエーテルスルホン(PES)を、CO2プラズマの曝露下でカルボン酸基で官能化した。より具体的には、関心対象の生体分子を、(1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩のEDCを用いて改変PES表面に連結させた。
1.-EDC、-CO2
2.+EDC、-CO2
3.-EDC、+CO2
4.+EDC、+CO2
Claims (62)
- 実体(例えば、ポリペプチド、例えば糖ポリペプチド、例えば糖タンパク質;核酸;炭水化物、例えば多糖;生物学的ポリマー;小分子;ペプチド模倣物;薬物;または病原性もしくは疾患性分子と相互作用し得る、例えば特異的に結合し得る、例えば糖ポリペプチド、例えば糖タンパク質に結合し得る部分)が付着している基体を作製する方法であって、
I:
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分(PGM)を含む改変基体を形成する工程、および
(ii)改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;
II:
(i)PGMを含む改変基体を得る工程、および
(ii)改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と改変基体とを接触させる工程;あるいは
III:
(i)基体とプラズマとを接触させて、PGMを含む改変基体を形成する工程、および
(ii.a)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させるのに適したものとして分類する工程、または
(ii.b)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる関係者に、運ぶ、売却する、輸送する、その管理を移す、もしくはその所有を移す工程
を含み、それによって、実体が付着している基体を作製し、
ただし、
(a)基体が、流体透過性、イオン透過性、多孔質、柔軟、加圧滅菌可能(例えば、100Cを超えても構造を保持する)、もしくはポリスチレン以外であること;
(b)基体が、90、80、70、60、もしくは50%未満のポリスチレンを含むこと;
(c)基体が、ポリスルホン(PS)、ポリアリルエーテルスルホン(PAES)、もしくはポリエーテルスルホン(PES)を含むこと;
(d)基体が、コンパートメント、例えば内腔を有する構造を含み、例えば該構造が中空繊維を含むこと;
(e)実体が特異的結合ペアの第一のメンバーを含むこと;
(f)実体が抗体ドメイン、例えばFcドメインを含むこと;
(g)実体が融合タンパク質を含むこと;
(h)実体がオプソニンを含むこと;
(i)実体がレクチンを含むこと;
(j)実体が多量体タンパク質のサブユニットを含むこと;または
(k)付着した実体が第二の実体に架橋される(例えば、第二の実体が基体に付着している、または第二の実体が基体に付着していない)こと
のうちの1つまたは複数(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、またはすべて)を条件とし;かつ
ただし、
(l)プラズマが酸素プラズマ以外である(例えば、プラズマがCO2プラズマである)こと;
(m)改変基体が、実体の付着前に、架橋部分(例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS))と接触せず、かつそれで誘導体化されないこと;または
(n)改変基体が、実体の付着前に、有機溶媒(例えば有機アルコール、例えばエタノール)と接触しないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2つまたはすべて)を条件とする、方法。 - I:
(i)基体とプラズマとを接触させて、プラズマ発生部分を含む改変基体を形成する工程;および
(ii)該改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる工程
を含む、請求項1記載の方法。 - II:
(i)PGMを含む改変基体を得る工程;および
(ii)該改変基体への実体の付着に十分な条件下で、実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる工程
を含む、請求項1記載の方法。 - III:
(i)基体とプラズマとを接触させて、PGMを含む改変基体を形成する工程;および
(ii.a)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体、例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチドと該改変基体とを接触させるのに適したものとして分類する工程;または
(ii.b)PGMを含む改変基体を、該改変基体への実体の付着に十分な条件下で実体(例えば生物学的ポリマー、例えばポリペプチド)と該改変基体とを接触させる関係者に、運ぶ、売却する、輸送する、その管理を移す、もしくはその所有を移す工程
を含む、請求項1記載の方法。 - (a)例えばPGMと実体との間に配置される活性化部分由来の原子なしで、実体がPGMに直接付着する;
(b)基体とプラズマとを接触させた後、実体がPGMに直接付着する;
(c)PGMと実体とを付着させるための1つもしくは複数の反応が水性である;
(d)実体が、水性条件下で改変基体と接触する;
(e)PGM、例えばカルボン酸が、例えばXPSによって測定されるように、炭素組成で少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、もしくは20%の存在量で形成される;
(f)実体が、例えば結合法によって測定されるように、1cm2あたり少なくとも約1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、もしくは1×1017個の分子の密度で付着する;または
(g)実体が、6〜8のpH(例えば、pH7または生理学的条件)で改変基体と接触する;または
(h)実体が、少なくとも約500、600、700、800、900、1000、もしくは1100個の実体/μm2の密度で付着する、
請求項1記載の方法。 - 基体が内腔を含み、例えば基体は中空繊維を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体が、セルロース、置換セルロース、例えば酢酸セルロース、二酢酸セルロース、もしくは三酢酸セルロース;ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリルエーテルスルホン、ポリビニルピロリドン、ナイロン、ポリアクリロニトリル(PAN)、ポリカーボネート、ポリアミド、またはポリメチルメタクリレート(PMMA)を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体がポリジメチルシロキサン(PDMS)またはポリスチレンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体が接着剤または密閉剤を含み、かつ該接着剤または密閉剤が、有機溶媒、例えば有機アルコール、例えばエタノールと接触しない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体が、透析、限外濾過、血液濾過、血液透析濾過、または血液灌流カートリッジを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体が、ポリマー、ガラス、金属、もしくはセラミック、またはその任意の組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体が中空繊維または非中空繊維膜を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程(ii)において、改変基体が、架橋部分、例えばシラン、例えば(3-アミノプロピル)トリメトキシシラン(APTMS)を実質的に含んでいない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程(ii)において、改変基体が有機溶媒を実質的に含んでいない、または
前記方法が、例えば工程(i)の後もしくは工程(ii)の前に、改変基体と有機溶媒とを接触させる工程を含まない、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 改変基体、実体、またはその両方と、活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)とを接触させて、改変基体上の官能基を活性化する工程を含み、
該官能基が任意でカルボン酸基である、
前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 工程(ii)の接触させる工程が、水性バッファー中で実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程(ii)の接触させる工程が、2-モルホリノ-エタンスルホン酸(MES)バッファーを含む溶液中で実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程(ii)の接触させる工程が、約4〜5、4.5〜5.5、5〜6、6〜7、7〜8、または約5のpHで実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 工程(ii)の接触させる工程が、約4〜6、6〜8、8〜10、10〜12、12〜14、または14〜16時間実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 活性化部分が、実体が付着している基体に含まれていない原子を含む、例えば活性化部分の原子のいずれも、実体が付着している基体に含まれていない、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMがカルボン酸を含み、かつ実体がアミンを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMのカルボン酸が、実体のアミン基と共有結合で結合する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- プラズマがCO2プラズマである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- プラズマが、O2、N2、またはNH4プラズマである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体とプラズマとを接触させる工程が、基体上に既定のレベルまたは密度のPGMを形成するのに適切な条件下にある、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMが、ヒドロキシル基、アルデヒド基、エポキシド基、ペルオキシド基、スルフヒドリル基、カルボニル基、またはカルボン酸基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMがカルボン酸基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、または50%がカルボン酸基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMがアルデヒド基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、または50%がアルデヒド基を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- PGMが、実体、例えば活性化部分と接触している実体上の部分と反応性である部分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- プラズマが、以下の条件:
(a)約13〜14mHz、例えば13.5mHzの無線周波数;
(b)プラズマ処理が、実体の活性、例えば結合活性を維持しながら改変基体に実体を連結させるのに十分な時間続き、例えばプラズマ処理が、約0.1〜5分間、例えば約1分間続くこと;
(c)プラズマガス圧が、約150〜350mTorr、例えば約200mTorrであること;
(d)約10〜150W、例えば約100Wの出力;または
(e)プラズマ発生器が、プラズマ発生器チャンバーの外側に電極を含み、例えばプラズマ発生器チャンバーの内側には電極を含まないこと
のうちの1つまたは複数(例えば、2、3、4つ、またはすべて)の下でプラズマ発生器によって発生される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 工程(i)の接触させる工程が、複数の基体(例えば、少なくとも2、3、4、5、10、20、50、または100個の基体)とプラズマとをプラズマ発生器チャンバー内で接触させることを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 実体が、オプソニン、炭水化物結合タンパク質、カルシウム結合タンパク質、二価カチオン結合タンパク質、および/または抗体の一部分、例えばFcもしくはその一部分を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 実体が、SEQ ID NO:4のポリペプチドまたはSEQ ID NO:4と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一のポリペプチド、あるいはSEQ ID NO:6のポリペプチドまたはSEQ ID NO:6と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%同一のポリペプチドを含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 実体が、多量体、例えば二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、12量体、または18量体を形成する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 実体が、互いに架橋した少なくとも2つのサブユニットを有する多量体を形成する、請求項36記載の方法。
- PGMのタイプ、PGMの数、PGMの密度、汚染物質の存在、付着した実体の数、接触角測定値(例えば、水接触角測定値)、または表面エネルギー測定値に関連したパラメーターの値を取得する工程、および
取得した値と標準値とを比較する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 比較に対応して、分類する工程、合格とする工程、不合格とする工程、認可する工程、製品に組み入れる工程、包装する工程、新たな場所に移す工程、または商業に流通させる工程をさらに含み、
基体が、付着した実体を含む、
請求項38記載の方法。 - 例えばX線光子分光法(XPS)により、PGMの存在について改変基体を評価する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 汚染物質または製造試薬、例えば抽出され得る分子、浸出し得る分子、基体に連結されていないFcMBL、EDC、溶媒(例えば、MESバッファー)、内毒素、発熱物質、ヌクレアーゼ、または生物、例えば細菌もしくは真菌について、改変基体を評価する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 例えば、
(a)プラズマ発生器チャンバーを溶媒(例えば有機溶媒、例えばエタノール)で洗浄すること;
(b)該チャンバー内で浄化プラズマを産生すること(例えば、工程(i)のプラズマとは異なるガスから作られた浄化プラズマ、例えば工程(i)のプラズマがCO2プラズマである場合、O2プラズマを用いた浄化);および/または
(c)化学清浄によって該チャンバーを清浄すること
のうちの1つまたは複数(例えば、そのうちの2つまたはすべて)を実施することによって、工程(i)の前に該プラズマ発生器チャンバーを浄化する工程
をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 浄化プラズマが、約30分間、約400Cの温度で、またはその両方で産生される、請求項42記載の方法。
- (a)浄化工程の間、プラズマの色をモニターする工程であって、例えばO2プラズマは、有機物が存在する場合に青色であり、有機物が存在しない場合に白色である、もしくはCO2プラズマは、有機物が存在する場合に暗青色であり、有機物が存在しない場合に水色である、工程;または
(b)工程(i)の接触させる工程の間、プラズマの温度をモニターする工程であって、プラズマの温度は、プラズマが産生される最初のわずかな時間に80Cを超えて上昇せず、最初のわずかな時間に80Cを超えて上昇する温度は汚染物質の存在を示す、工程;または
(c)浄化工程の間、プラズマの温度をモニターする工程であって、プラズマの温度は、ピーク温度(典型的に、400〜500C)から10Cを下回って下降し、上昇し続けるかもしくはピーク温度を維持する温度は汚染物質の存在を示す、工程
のうちの1つまたは複数(例えば、2つまたはすべて)を実施することによって、プラズマ発生器チャンバーの清浄度を判定する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 基体がプラズマ発生器チャンバー内に配置される場合、例えば工程(i)の接触させる工程の前に、
(a)プラズマ発生器チャンバー内に真空(例えば、1Torr未満の圧力)を創出すること、および
(b)ガス、例えば工程(i)のプラズマを作るために用いられた同じガス、例えばCO2で、プラズマ発生器チャンバーを充填すること
の一方または両方を実施する工程を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - プラズマ発生器チャンバーを、例えば少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10分間、例えば約5分間、ガス、例えばCO2で充填する、請求項45記載の方法。
- 例えば、
(a)基体と1滴の液体、例えば水とを接触させ、該1滴の液体の接触角を測定すること;
(b)基体と、実体に結合する部分とを接触させることであって、例えば該部分が抗体分子またはマンノースなどの糖質を含み、該部分が、任意で、検出可能な標識に結合されるもしくは共有結合で連結される、こと;または
(c)基体と、PGMに結合する部分、例えばアミン基を含む検出可能な標識とを接触させること
のうちの1つまたは複数を実施することによって、基体の改変を測定する工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - 基体に実体が付着する際にマスキング実体を提供する工程であって、マスキング実体が、実体の一部分と、例えば活性化部分、基体、または別の実体、例えばポリペプチドなどの生物学的ポリマーとの反応を阻害する、工程
を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 - マスキング実体が、実体が結合する部分を含む、請求項48記載の方法。
- 実体がオプソニン、例えばMBLを含み、かつマスキング実体が、オプソニンが結合する部分、例えば二価カチオン、例えばCa2+、または糖類、例えばグルコースを含む、請求項48記載の方法。
- 例えば結合アッセイによって測定される、第一の選択エリア、例えば1cm2エリアにおける付着した実体の密度が、1、2、3、4、5、または10個の他の選択エリア、例えば基体上のそれぞれ1cm2のエリアの密度の50%以内である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 基体上または基体の一部分上、例えば中空繊維の内腔上の、1cm2エリアの10、20、30、40、50、60、または70%の密度が、互いの、または1つのウェルの底部、複数のウェルの底部、もしくは中空繊維の50、40、または30%以内である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜52のいずれか一項記載の方法によって産生された、実体が付着している基体
を含む、装置。 - 請求項1〜52のいずれか一項記載の方法によって産生可能な、実体が付着している基体
を含む、装置。 - 実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、
例えば結合アッセイによって測定されるように、1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む、装置。 - 付着した複数種の実体、例えば複数種のポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドを有する基体、例えば透過膜を含む装置であって、
例えば結合アッセイによって測定される、第一の選択エリア、例えば1cm2エリアにおける付着した実体の密度が、1、2、3、4、5、または10個の他の選択エリア、例えば基体上の1cm2のエリアの密度の50%以内である、あるいは基体上または基体の一部分上、例えば中空繊維の内腔上の、1cm2エリアの10、20、30、40、50、60、または70%の密度が、互いの、または1つのウェルの底部、複数のウェルの底部、もしくは中空繊維の50、40、または30%以内である、装置。 - 実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、該実体のアミノ基(例えば、リジン側鎖またはN末端のアミノ基)が、該基体上のPGM(例えば、カルボン酸)に共有結合で直接結合される、装置。
- 実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、
1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、もしくは1分子未満、または1つの装置あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、もしくは1分子未満の汚染物質、例えば抽出され得る分子、浸出し得る分子、基体に連結されていないFcMBL、EDC、溶媒(例えば、MESバッファー)、内毒素、発熱物質、ヌクレアーゼ、または生物、例えば細菌もしくは真菌を含む、装置。 - 1cm2あたり1×1016、1×1015、1×1014、1×1013、1×1012、1×1011、1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、または1分子未満の架橋剤、例えばシランを含む基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
活性化部分、例えば水溶性活性化部分、例えばEDCを含む、水溶液
を含む反応混合物。 - 基体、例えば透過膜;
実体、例えばポリペプチド、例えばオプソニンの一部分、例えばMBLの一部分を含むポリペプチド;および
マスキング実体、例えばオプソニンが結合する部分、または二価カチオン、例えばCa2+
を含む、反応混合物。 - マスキング実体が糖類、例えばグルコースを含む、請求項60記載の反応混合物。
- 実体、例えばポリペプチド、例えばMBLの一部分を含むポリペプチドが付着している基体、例えば透過膜を含む装置であって、該実体が、約500〜2000、500〜1800、500〜1600、500〜1200、600〜2000、600〜1800、600〜1600、600〜1200、800〜2000、800〜1800、800〜1600、800〜1200、1000〜2000、1000〜1800、1000〜1600、または1000〜1200個の実体/μm2の密度で該基体に付着している、装置。
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