CN109476764A - 偶联在经co2-等离子体活化的表面上的水性生物分子 - Google Patents

偶联在经co2-等离子体活化的表面上的水性生物分子 Download PDF

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安娜·沃特豪斯
梅丽莎·罗达斯
亚历山大·L·沃特斯
迈克尔·休珀
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Abstract

本公开提供了例如将实体偶联到固体基材的方法。该方法可包括用等离子体(例如CO2等离子体)处理基材以增加基材的反应性。该实体可为例如结合微生物的生物聚合物。通过这些方法生产的基材可用于多种应用，包括血液透析和诊断试验。

Description

偶联在经CO2-等离子体活化的表面上的水性生物分子
相关申请
本申请要求2016年5月16日提交的US序号62/336,940的权益，以引用的方式将其内容整体并入本文。
序列表
本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表并以引用的方式在此整体并入。在2017年5月11日创建的所述ASCII拷贝被命名为002806-085421-PCT_SL.txt并且大小为119,029字节。
关于联邦政府赞助的研究中的政府权利的声明
本发明随着由US国防部的高级研究计划局授予的HR0011-13-C-0025以及由US国防部的空间和海战系统中心授予的N66001-11-1-4180的政府资助而做出。政府在本发明中具有一定的权利。
背景技术
用于期望部分在表面上的靶向结合的当前方法可能需要化学交联剂和/或可能损害表面的有机冲洗剂。本领域需要将期望的部分偶联到表面的改进方法。
发明内容
在一些方面，本公开提供了一种制备具有附着至其的实体的基材的方法，该方法包括：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分(PGM)的改性基材；
ii)使所述实体在足以使生物聚合物附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；
从而制备具有附着至其的所述实体的基材，
条件是以下的1项或多项：所述基材是流体可渗透的、离子可渗透的、多孔的、柔性的、可高压灭菌的、或不是聚苯乙烯；所述生物聚合物包括融合蛋白；所述生物聚合物包括凝集素；以及
条件是以下的1项或多项：
所述等离子体不是氧等离子体，例如所述等离子体是CO2等离子体；
在所述实体的附着之前，所述改性基材不与交联部分(例如硅烷，例如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))接触或用交联部分(例如硅烷，例如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))衍生化；或
在所述实体的附着之前，所述改性基材不与有机溶剂接触(例如有机醇、例如乙醇)。
在一些方面，本公开还提供了一种包含基材的装置，该基材具有附着至其的实体，该装置通过本文所述的方法生产或可通过本文所述的方法生产。在实施方式中，该装置是血液透析或血液过滤装置。
在一些方面，本公开还提供了一种使用包含基材的装置的方法，所述基材具有附着至其的实体，该装置通过本文所述的方法生产或可通过本文所述的方法生产，所述方法包括在允许样品中的分子结合至所述实体的条件下使所述装置与样品接触。在一些实施方式中，样品是血液透析或血液过滤期间返回至受试者机体的血液样品。
在一些方面，本公开提供了制备具有附着至其的实体(例如多肽、如糖多肽、诸如糖蛋白；核酸；碳水化合物、例如多糖；生物聚合物、小分子、拟肽、药物或可与病原体分子或疾病分子相互作用(例如特异性结合，例如结合糖多肽、如糖蛋白)的部分)的基材的方法，该方法包括：
I：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分(PGM)的改性基材；
ii)使实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述生物聚合物附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；
II：
i)获得包含PGM的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
III：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及
ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方(party)，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；
从而制备具有附着至其的实体的基材，
条件是以下的1项或多项(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10项或全部)：
a)基材是流体可渗透的、离子可渗透的、多孔的、柔性的、可高压灭菌的(例如在高于100℃时保持其结构)、或不是聚苯乙烯；
b)基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的聚苯乙烯；
c)基材包含聚砜(PS)、聚芳醚砜(PAES)或聚醚砜(PES)；
d)基材包含具有隔室、例如腔的结构，例如该结构包含中空纤维；
e)该实体包含特异性结合对的第一成员；
f)该实体包含抗体结构域，例如Fc结构域；
g)该实体包含融合蛋白；
h)该实体包含调理素；
i)该实体包含凝集素；
j)该实体包含多聚体蛋白质的亚基；或
k)经附着的实体交叉连接至第二实体(例如其中所述第二实体附着至所述基材或其中所述第二实体未附着至所述基材)；以及
条件是以下的1项或多项(例如2项或全部)：
l)所述等离子体不是氧等离子体(例如等离子体是CO2等离子体)；
m)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与交联部分(例如硅烷，如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))接触或用交联部分(例如硅烷，如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))衍生化；或
n)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与有机溶剂(例如有机醇，如乙醇)接触。
关于上述a)至k)，在一些实施方式中，存在a)至k)中的2种以上，例如a)和b)、a)和c)、a)和d)、a)和e)、a)和f)、a)和g)、a)和h)、a)和i)、a)和j)、a)和k)、b)和c)、b)和d)、b)和e)、b)和f)、b)和g)、b)和h)、b)和i)、b)和j)、b)和k)、c)和d)、c)和e)、c)和f)、c)和g)、c)和h)、c)和i)、c)和i)、c)和k)、d)和e)、d)和f)、d)和g)、d)和h)、d)和i)、d)和j)、d)和k)、e)和f)、e)和g)、e)和h)、e)和i)、e)和j)、e)和k)、f)和g)、f)和h)、f)和i)、f)和j)、f)和k)、g)和h)、g)和i)、g)和j)、g)和k)、h)和i)、h)和j)、h)和k)、i)和j)、i)和k)、以及j)和k)。关于上述l)至n)，在一些实施方式中，存在l)至n)中的2种以上，例如l)和m)、l)和n)、或m)和n)。在一些实施方式中，存在a)至k)中的一种以及l)至n)中的一种，例如a)和l)、b)和l)、c)和l)、d)和l)、e)和l)、f)和l)、g)和l)、h)和l)、i)和l)、i)和l)、k)和l)、a)和m)、b)和m)、c)和m)、d)和m)、e)和m)、f)和m)、g)和m)、h)和m)、i)和m)、j)和m)、k)和m)、a)和n)、b)和n)、c)和n)、d)和n)、e)和n)、f)和n)、g)和n)、h)和n)、i)和n)、j)和n)、或k)和n)。
在一些实施方式中，该方法包括：I：i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分的改性基材；以及ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。在一些实施方式中，该方法包括：II：i)获得包含PGM的改性基材；以及ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述生物聚合物附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。在一些实施方式中，该方法包括：III：i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述生物聚合物附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
在一些实施方式中，所述实体直接附着至PGM(例如没有来自设置在所述PGM和所述实体之间的间隔物、交联部分、接头、或活化部分的原子)。在一些实施方式中，a)所述实体直接附着至PGM(例如没有来自设置在所述PGM和所述生物聚合物之间的活化部分的原子)；b)使所述基材与所述等离子体接触后，所述实体直接附着至PGM；c)用于使PGM与所述实体附着的所述反应是水性的；d)所述实体在水性条件下与所述改性基材接触；e)PGM(例如羧酸)按碳组成计以至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的丰度形成(例如如通过XPS测定的)，或者如通过碳1s光谱测定的，PGM(例如醇、醛和羧酸)以至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的丰度形成；f)实体以至少约1x1012、1x1013、1x1014、1x1015、1x1016或1x1017个分子/cm2的密度附着(例如如通过结合方法或成像方法测定的)；或g)使所述实体与所述改性基材在pH为6至8(例如pH 7或生理条件)下接触。在一些实施方式中，所述实体以至少约500个实体/μm2、例如约500-2000个实体/μm2、500-1800个实体/μm2、500-1600个实体/μm2或500-1200个实体/μm2的密度附着至基材。在一些实施方式中，所述实体以至少约600个实体/μm2、例如约600-2000个实体/μm2、600-1800个实体/μm2、600-1600个实体/μm2或600-1200个实体/μm2的密度附着至基材。在一些实施方式中，所述实体以至少约800个实体/μm2、例如约800-2000个实体/μm2、800-1800个实体/μm2、800-1600个实体/μm2或800-1200个实体/μm2的密度附着至基材。在一些实施方式中，所述实体以至少约1000个实体/μm2、例如约1000-2000个实体/μm2、1000-1800个实体/μm2、1000-1600个实体/μm2或1000-1200个实体/μm2的密度附着至基材。在一些实施方式中，所述实体以至少约500个实体/μm2、600个实体/μm2、700个实体/μm2、800个实体/μm2、900个实体/μm2、1000个实体/μm2或1100个实体/μm2的密度附着。在一些实施方式中，所述实体为多聚体。
在一些实施方式中，该实体以稳定的方式(例如抗水解的方式，例如使得在水性条件下小于1％、2％、5％或10％的实体在预定的时间段(例如1、2、4、6、12、24、48或72小时)与基材分离的方式)附着至基材。
在一些实施方式中，所述基材包含腔，例如所述基材包含中空纤维。在一些实施方式中，所述基材包含纤维素、取代的纤维素(例如乙酸纤维素、二乙酸纤维素或三乙酸纤维素)；聚砜、聚醚砜、聚芳醚砜、聚乙烯吡咯烷酮、尼龙、聚丙烯腈(PAN)、聚碳酸酯、聚酰胺或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。在一些实施方式中，所述基材包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚苯乙烯。在一些实施方式中，所述基材包含粘合剂或密封剂，并且其中所述粘合剂或密封剂不与有机溶剂(例如有机醇、例如乙醇)接触。在一些实施方式中，所述基材包含透析、超滤、血液滤过、血液透析滤过或血液灌注盒，附着至透析、超滤、血液滤过、血液透析滤过或血液灌注盒，或设置在透析、超滤、血液滤过、血液透析滤过或血液灌注盒中。在一些实施方式中，所述基材包含聚合物、玻璃、金属或陶瓷、或其任意组合。在一些实施方式中，所述基材包含透析膜(例如血液透析膜)。在一些实施方式中，所述基材包含中空纤维膜或非中空纤维膜。
在一些实施方式中，在步骤(ii)中(例如I(ii))，所述改性基材实质上不含交联部分(例如硅烷，如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))。在一些实施方式中，在步骤(ii)中(例如I(ii))，所述改性基材实质上不含有机溶剂，或所述方法不包括使所述改性基材与有机溶剂接触的步骤(例如在步骤(i)之后或在步骤(ii)之前)。在一些实施方式中，所述方法包括使所述改性基材、所述实体或两者与活化部分(例如水溶性活化部分，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC))接触，以活化所述改性基材上的官能团，其中所述官能团任选为羧酸基团。在一些实施方式中，步骤ii)(例如I(ii))的接触在水性缓冲液中进行。在一些实施方式中，步骤ii)(例如I(ii))的接触在包含2-吗啉代-乙磺酸(MES)缓冲液的溶液中进行。在一些实施方式中，步骤ii)(例如I(ii))的接触在约4-5、4.5-5.5、5-6、6-7、7-8或约5的pH下进行。在一些实施方式中，步骤ii)(例如I(ii))的接触进行约4-6小时、6-8小时、8-10小时、10-12小时、12-14小时或14-16小时。
在一些实施方式中，所述活化部分包含未被含在具有附着至其的所述实体的基材中的原子，例如所述活化部分的原子均不被含在具有附着至其的所述实体的基材中。
在实施方式中，所述方法不包括使用活化部分(例如水溶性活化部分、例如EDC)。在实施例中，所述方法包含使用少于5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml或0.001mg/ml的活化部分(例如水溶性活化部分、例如EDC)。
在一些实施方式中，所述PGM包含羧酸，并且所述实体包含胺。在一些实施方式中，所述PGM的羧酸与所述实体的胺基团共价结合。
在一些实施方式中，所述方法包括使所述基材在适于在所述基材上形成预定水平或密度的PGM的条件下与所述等离子体接触。在一些实施方式中，所述PGM包含羟基、醛、环氧化物、过氧化物、巯基、羰基或羧酸基团。在一些实施方式中，所述PGM包含羧酸基团。在一些实施例中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含羧酸基团。在一些实施方式中，PGM包含醛基团。在一些实施方式中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含醛基团。在一些实施方式中，所述PGM包含与所述实体或经活化的实体上的部分反应的部分。
在一些实施方式中，所述等离子体通过等离子体发生器在以下条件中的1个或多个(例如2个、3个、4个或全部)下产生：a)约12-15或13-14mHz(例如13.5mHz)，或者至少约10、11、12、14、15mHz，或者不超过约15、14、13、12、11或10mHz的射频；b)等离子体处理持续足够量的时间以将实体连接至所述改性基材，同时保持实体的活性(例如实体的结合活性)；例如等离子体处理持续约0.1-5分钟，例如约1分钟，或至少约0.1、0.5、1、2、3、4或5分钟，或不超过约5、4、3、2或1分钟；c)等离子体气体压力为约150-350mTorr(例如约200mTorr)，或至少约150、200、250、300或350mTorr，或不超过约350、300、250、200或150mTorr；d)约10-150W的功率，例如约100W；或至少约10、20、30、40、50、75、100、135或150W，或不超过约150、125、100、75、50、40、30、20或10W；或e)所述等离子体发生器在所述等离子体发生器腔室的外部包含电极，例如在所述等离子体发生器腔室的内部不包含电极。
在一些实施方式中，步骤i)的接触包括使多个基材(例如，至少2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个或100个基材)与等离子体发生器腔室中的等离子体接触。
在一些实施方式中，所述实体包含调理素、碳水化合物结合蛋白、钙结合蛋白、二价阳离子结合蛋白和/或抗体的一部分(例如Fc或其部分)。在一些实施方式中，所述实体包含SEQ ID NO：4的多肽或与SEQ ID NO：4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，或者SEQ ID NO：6的多肽或与SEQ ID NO：6至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。在一些实施方式中，所述实体形成多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、12聚体或18聚体。在一些实施方式中，所述实体形成具有彼此交联的至少2个(例如3、4、5、6、12或18个)亚基的多聚体。在一些实施例中，所述生物聚合物形成具有彼此共价连接的至少2个(例如3、4、5、6、12或18个)亚基的多聚体。共价连接可例如通过化学交联形成、自发地形成、或者酶促形成。共价连接可包含例如二硫桥。在一些实施方式中，所述实体形成具有彼此非共价结合的至少2个(例如3、4、5、6、12或18个)亚基的多聚体。
在一些实施方式中，所述方法还包括获取与PGM类型、PGM数量、PGM密度、污染物的存在、经附着的实体的数量、接触角测定(例如水接触角测定)、或表面能测定相关的参数的值；以及将获取的值与标准值进行比较。在一些实施方式中，所述方法进一步包括响应于比较，将包含所述经附着的实体的所述基材分类、接受、拒绝、批准、并入产品、包装、转移到新位置或在商业中发布。在一些实施方式中，该方法进一步包括例如用X射线光子光谱(XPS)评估所述改性基材是否存在PGM。在一些实施方式中，所述方法进一步包括评估所述改性基材的污染物或制备试剂(例如可提取分子、可浸出分子、未连接至基材的FcMBL、活化试剂、交联试剂、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体(例如细菌或真菌))。
在一些实施方式中，所述方法还包括清洁等离子体发生器腔室。所述清洁步骤可在步骤i)、例如I(i)之前进行。该方法可包含进行以下中的1个或多个(例如2个或全部)：a)用溶剂(例如有机溶剂、例如乙醇)洗涤腔室，b)在腔室中产生清洁的等离子体(例如由与步骤i)的等离子体不同的气体制成的清洁的等离子体，例如当步骤i)的等离子体是CO2等离子体时使用O2等离子体进行清洁)；和/或c)通过化学清洁对所述腔室进行清洁。
在一些实施方式中，所述清洁的等离子体被产生约30分钟。在一些实施例中，所述清洁的等离子体处于100-800℃、200-700℃、300-500℃、350-450℃或约400℃的温度(例如峰值温度)。在一些实施方式中，所述清洁的等离子体处于至少约100℃、200℃、300℃或400℃的温度(例如峰值温度)。在一些实施例中，所述清洁的等离子体处于不超过约800℃、700℃、600℃、500℃或400℃的温度(例如峰值温度)。
在实施方式中，所述方法包括确定等离子体发生器腔室的清洁度。例如，所述方法包括a)在清洁步骤期间，监测等离子体的颜色(例如其中当有机物存在时O2等离子体为蓝色并且当有机物不存在时为白色，或当有机物存在时CO2等离子体为深蓝色并且当有机物不存在时为浅蓝色)；或b)在步骤i)的接触期间，监测等离子体的温度，其中，在产生等离子体的第1分钟内等离子体的温度不会升高到大于80℃，或者其中在第1分钟内温度升高到大于80℃表明存在污染物；或c)在清洁步骤期间，监测等离子体的温度，其中等离子体的温度降至低于峰值温度10℃(通常在400-500℃之间)，或者其中温度继续升高或保持峰值温度表明存在污染物或其任意组合。在实施方式中，当该方法表明存在污染物时，延长清洁反应，例如直到该方法表明不存在污染物。在实施方式中，当该方法表明存在污染物时，进行另一清洁方法，例如化学清洁。在实施方式中，当将所述基材设置在所述等离子体发生器腔室中时(例如在步骤i)的接触之前)，进行a)和b)中的一个或两个，a)为在所述等离子体发生器腔室中产生真空(例如小于1Torr的压力)，b)为用气体、例如与用于制备步骤i)的等离子体相同的气体(例如CO2)填充等离子体发生器腔室。在实施方式中，用所述气体(例如CO2)填充所述等离子体发生器腔室例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟，例如约5分钟。在实施方式中，所述方法包括例如通过进行以下的1个或多个来测定所述基材的改性：a)使所述基材与1滴液体例如水接触，并测定液滴的接触角；b)使所述基材与结合所述实体的部分接触(例如其中所述部分包含抗体分子或糖类如甘露糖)，其中所述部分任选地结合或共价连接至可检测标记物；或c)使所述基材与结合PGM的部分(例如包含胺基团的可检测标记物)接触。
在实施方式中，该方法包括在将所述实体附着到所述基材期间提供掩蔽实体，其中所述掩蔽实体抑制所述实体的一部分与例如所述活化部分、所述基材或另一实体(例如生物聚合物、如多肽)的反应。在实施方式中，所述掩蔽实体包含所述实体结合的部分。在实施方式中，实体包含离子结合蛋白、二价离子结合蛋白、钙结合蛋白、调理素(例如凝集素、如钙结合凝集素、诸如MBL)。掩蔽实体可包含所述调理素结合的部分、例如二价阳离子(例如Ca2+)。在一些实施方式中，掩蔽实体包含糖、例如葡萄糖。
在实施方式中，实体结合糖(例如甘露糖或葡萄糖)，并且掩蔽实体包含糖(例如甘露糖或葡萄糖)。在实施方式中，该实体包含调理素、调理素片段(例如甘露糖结合片段)、MBL、MBL片段(例如甘露糖结合片段、如CRD结构域或CRD结构域和颈部结构域)；并且掩蔽实体结合调理素，例如调理素的CRD。在实施方式中，掩蔽实体竞争结合甘露糖，并且在另一实施方式中，掩蔽实体不竞争结合甘露糖。在实施方式中，结合调理素的掩蔽实体是二价阳离子(例如Ca2+)或糖(例如葡萄糖或甘露糖)。在实施方式中，当掩蔽实体与实体复合时，保护所述实体的一个或多个氨基酸残基(例如CRD结构域中的残基、如糖结合位点中的氨基酸)。
在实施方式中，所述实体结合蛋白质(例如细菌或病毒蛋白质)，并且所述掩蔽实体包含蛋白质(例如细菌或病毒蛋白质)。在实施方式中，实体结合脂质，并且掩蔽实体包含脂质。
在实施方式中，在第一选定区域(例如1cm2区域)中的经附着的实体的密度(例如如通过结合测试或成像方法所测定的)为在1个、2个、3个、4个、5个或10个其它的选定区域(例如在基材上的每个1cm2的区域)的密度的50％内。
在实施方式中，所述基材或所述基材的一部分(例如中空纤维的腔)上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
在一些方面，本公开还提供了包含基材(例如可渗透膜)的装置，所述基材具有附着至其的实体(例如多肽、例如包含MBL的一部分的多肽)，其中，例如如通过结合测试所测定的，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂(例如硅烷)。
在一些方面，本公开还提供了包含基材(例如可渗透膜)的装置，所述基材具有附着至其的多个实体(例如多肽、例如包含MBL的一部分的多肽)，其中，例如如通过结合测试所测定的，在第一选定区域(例如1cm2区域)中的经附着的实体的密度为在1、2、3、4、5或10个其它选定区域(例如在基材上的1cm2区域)的密度的50％内，或其中，所述基材或所述基材的一部分(例如中空纤维的腔)上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
在一些方面，本公开还提供了包含基材(例如可渗透膜)的装置，所述基材具有附着至其的实体(例如多肽、例如包含MBL的一部分的多肽)，其中，所述实体的氨基基团(例如赖氨酸侧链的氨基基团或N-末端)直接共价结合至基材上的PGM(例如羧酸)。
在一些方面，本公开还提供了包含基材(例如可渗透膜)的装置，所述基材具有附着至其的实体(例如多肽、例如包含MBL的一部分的多肽)，其中，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2或者小于每个1x1016分子/装置、1x1015分子/装置、1x1014分子/装置、1x1013分子/装置、1x1012分子/装置、1x1011分子/装置、1x1010分子/装置、1x109分子/装置、1x108分子/装置、1x107分子/装置、1x106分子/装置、1x105分子/装置、1x104分子/装置、1x103分子/装置、100分子/装置、10分子/装置或1分子/装置的污染物，例如可提取分子、可浸出分子、未连接至基材的FcMBL、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体(例如细菌或真菌)。
在一些方面，本公开还提供了反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，该基材包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂(例如硅烷)；
实体、例如多肽(例如包含MBL的一部分的多肽)；以及
包含活化部分(例如水溶性活化部分、例如EDC)的水性溶液。
在一些方面，本公开还提供了一种反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，该基材包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂(例如硅烷)；以及
实体，例如多肽、例如包含MBL的一部分的多肽。在实施方式中，所述反应混合物不包含活化部分(例如水溶性活化部分、如EDC)，或者包含少于5mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml或0.001mg/ml的活化部分(例如水溶性活化部分、如EDC)。
在一些方面，本公开还提供了一种反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，
实体，例如多肽、例如包含调理素的一部分(如MBL的一部分)的多肽；以及
掩蔽实体，例如调理素结合的部分或二价阳离子(例如Ca2+)。
在一些实施例中，所述掩蔽实体包含糖、例如葡萄糖。
在一些实施例中，本文所述的反应混合物设置在被配置成产生或含有等离子体的腔室内。
在实施方式中，一方(例如使实体与改性的基材接触的一方)是个人或公司实体。在实施方式中，该方使实体自动与改性的基材接触，例如通过使用或配置自动化设备以进行该接触。
本公开包括前述方面和/或实施方式的任意一个或多个的所有组合、以及与详述和实施例中阐述的任意一个或多个实施方式的组合。
标题、小标题或编号要素或字母要素(例如(a)、(b)、(i)等)仅为便于阅读而呈现。在本文件中标题或者编号要素或字母要素的使用不要求步骤或要素按字母顺序进行、或者步骤或要素必须彼此分离。
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用的方式以其整体并入。
根据说明书和附图以及权利要求，本发明的其它特征、目的和优势将显而易见。
附图说明
图1示出了未处理的PES样品的XPS光谱显示出表面上的初步减少的碳原子。
图2示出了在100W下暴露至CO2等离子体5分钟的PES的XPS光谱显示出显著比例的氧化的碳、尤其是羧酸根基团。
图3示出了PES上的表面羧化物组合物随着在100W功率下的CO2等离子体的暴露时间而增加。
图4示出了在PES芯片上进行的甘露聚糖结合测试，FcMBL通过等离子体/EDC处理偶联到PES芯片。
图5是示出了用吸附至板(上子图)或共价偶联到板(下子图)的FcMBL进行的ELISA测试的灵敏度的一对图。
图6是示出了沿着偶联有FcMBL的过滤器的截面中的FcMBL的存在的图。
图7是示出了沿着偶联有HRP的过滤器的截面中的HRP的存在的图。
图8是示出了FcMBL以4度(上子图)或25度(下子图)附着到基材的图。
图9是示出了具有和不具有添加的钙产生的FcMBL偶联的光谱过滤器实现的甘露聚糖消耗的图。
具体实施方式
定义
如本文所使用的，“活化部分”是指使官能团更具反应性的分子。例如活化部分可与官能团反应(例如共价地)以形成改性的官能团，该官能团具有对于第二官能团的更高的反应性(例如形成共价键的倾向增加)。在一些实施方式中，第一官能团是实体的一部分，并且第二官能团是等离子体产生的部分。在一些实施方式中，活化部分包含未被含在具有附着至其的实体的基材中的原子，例如活化部分的原子都不含在具有附着至其的实体的基材中)。
本文所使用的术语“抗体分子”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)的免疫学上活化的部分，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和单链抗体(例如scFvs)。
如本文所使用的术语“生物聚合物”旨在意指包含生物部分的重复单元的聚合物。代表性的生物聚合物包括但不限于核酸、寡核苷酸、基于氨基酸的聚合物、蛋白质、肽、肽激素、寡糖、脂质、糖脂、脂多糖、磷脂、前述的合成类似物(包括但不限于包含反向核苷酸的聚合物、肽核酸以及上述的组合)。
如本文所使用的，术语“碳水化合物识别结构域”或CRD是指其至少一部分可结合至微生物或病原体或者微生物的片段或病原体的片段的表面上的碳水化合物的区域。例如在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可涵盖甘露糖结合凝集素(MBL)CRD。然而，在一些实施方式中，除了MBLCRD之外，碳水化合物识别结构域还可被解释为涵盖颈部区域。在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可包含其结构域的至少约50％，包括至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更高的能够结合至微生物表面上的碳水化合物的结构域。在一些实施方式中，100％的碳水化合物识别结构域可用于结合至微生物或病原体。在其它实施方式中，碳水化合物识别结构域可包含不能与碳水化合物结合但可具有其它特征或施行其它功能(例如当与微生物或病原体相互作用时向碳水化合物识别结构域提供柔性)的额外的区域。
如本文所使用的，“盒”是指包含基材和附着至其的实体的装置。在一个实施方式中，所述盒包含设置在内部的基材和附着至其的实体。在实施方式中，盒被配置为允许连接至系统的另一要素。盒可为例如可重复使用的或一次性的。血液透析盒指的是配置成允许连接至血液透析机的盒。如本文所使用的，术语“可检测标记物”是指产生指示靶点的存在的可检测信号的组合物。
如本文所使用的，“交联部分”是指可与第一官能团(例如在实体上)共价反应以形成对于第二官能团(例如等离子体产生的部分)具有更高的反应性(例如增加形成共价键的倾向)的改性官能团的分子，并且该交联部分包含在交联反应完成后与第一和/或第二官能团共价结合的原子、例如多个原子。在一些实施方式中，交联部分包含原子例如多个原子，在交联部分介导实体对等离子体生成部分的偶联后，该原子保留并将第一实体连接至等离子体生成部分。在一些实施方式中，交联部分包含原子、例如多个原子，所述原子被含在具有附着至其的实体的基材中。
如本文所使用的，“实体”是指部分、分子或分子复合物。实体可包含：例如小分子；多肽、例如糖多肽(如糖蛋白)；核酸；碳水化合物、例如多糖)；生物聚合物、拟肽或药物、或其任意组合。
如本文所使用的，“可提取分子”是指从基材分离(例如从基材解吸附、从基材溶解或在化学上变得从基材解离)的分子。可提取的分子可离开物质，例如当物质与溶剂(例如水溶剂或有机溶剂)接触时。
如本文所使用的，“糖多肽”是指包含糖基团(例如多个糖基团、如寡糖或多糖链)的多肽。在实施方式中，糖多肽包含N-连接或O-连接的糖基化。
如本文所使用的，“可浸出分子”是指从物质溶出的分子，例如当物质与溶剂(例如水性溶剂或有机溶剂)接触时。
如本文所使用的术语“凝集素”是指包括与糖类(例如碳水化合物)特异性相互作用的天然或遗传学上修饰的(例如重组的)蛋白质的任意分子。如本文所使用的术语“凝集素”还可指源自任意物种(包括但不限于具有期望的碳水化合物结合特异性的植物、动物、昆虫和微生物)的凝集素。植物凝集素的实例包含但不限于豆科植物凝集素家族(如ConA、大豆凝集素、花生凝集素、扁豆凝集素)和来自雪花莲属(雪滴花)植物的雪花莲凝集素(GNA)。植物凝集素的其它实例为禾本科和茄科的凝集素。动物凝集素的实例包含但不限于S型凝集素、C型凝集素、P型凝集素和I型凝集素以及半乳糖凝集素的主要组的任意已知的凝集素。在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可衍生自C型凝集素或其片段。C型凝集素可包含任意需要用于结合的钙的碳水化合物结合蛋白。在一些实施方式中，C型凝集素可包含但不限于胶原凝集素、DC-SIGN及其片段。不希望受理论的束缚，DC-SIGN通常可通过识别其包膜上的含有高甘露糖的糖蛋白和/或作为数种病毒(例如HIV和丙型肝炎)的受体起作用而结合各种微生物。
如本文所使用的，术语“多种微生物”或“微生物”通常是指微小生物体，包括细菌、真菌、病毒、原生动物、古细菌、原生生物(例如藻类)及其组合。术语“微生物”包含活的微生物和死的微生物。术语“微生物”还包含病原微生物或病原体(例如引起诸如鼠疫、结核病和炭疽等疾病的细菌；引起诸如疟疾、昏睡病和弓形虫病等疾病的原生动物；引起诸如癣、念珠菌病或组织胞浆菌病等疾病的真菌；以及引起脓毒症等疾病的细菌或其它微生物)。
如本文所使用的术语“掩蔽实体”是指抑制实体的一部分与反应物反应的分子或部分。反应物可为例如活化部分如交联剂、基材、或另一实体(例如自由基或生物聚合物(如多肽))。在实施方式中，掩蔽实体结合调理素(例如MBL)，例如，掩蔽实体包含二价阳离子(如Ca2+)或糖(如葡萄糖)。
如本文所使用的术语“微生物物质”是指从微生物衍生、起源或分泌的任意物质或组分。例如，微生物物质或从微生物衍生或分泌的组分可包含但不限于细胞壁组分、外膜、质膜、核糖体、微生物囊体(microbial capsule)、菌毛或鞭毛、上述微生物组分的任意片段、衍生自微生物的任意核酸(例如DNA、包括16S核糖体DNA，以及RNA)和微生物内毒素(例如脂多糖)。另外，微生物物质可涵盖可导致对宿主或环境的不利影响(例如毒性)的无活性的微生物物质。
如本文所使用的，“改性基材”是指包含通过使基材与等离子体接触而形成的等离子体产生部分(PGM)(例如官能团)的基材。在实施方式中，所述部分包含羟基、环氧化物、羰基或羧酸基团。在实施方式中，所述部分包含例如在活化部分如EDC存在的情况下与实体(例如生物聚合物)反应的基团。
本文所使用的术语“调理素”是指天然存在的和合成的分子，该分子能够结合或附着至微生物或病原体的表面、或作为吞噬作用过程的结合增强物。
如本文所使用的，“病原体分子或疾病分子”是指与例如促成或指示疾病(例如由病原体引起的疾病)相关的分子或分子的片段。在一些实施方式中，病原体分子是存在于病原体中(例如病原体表面上)的分子。病原体分子或疾病分子包含例如微生物物质、细胞壁组分、外膜、质膜、核糖体、微生物囊体、菌毛或鞭毛、上述微生物组分的任意片段、源自微生物的任意核酸(例如DNA、包括16S核糖体DNA，以及RNA)、以及微生物内毒素(例如脂多糖)或外毒素(例如溶血素和中毒性休克综合征毒素-1)。在实施方式中，病原体分子或疾病分子在物理上与病原体或病原体的片段结合。
术语“肽”或“多肽”可互换使用，用于指氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能。在一些实施方式中，术语“肽”是指小的多肽，例如约15-25个氨基酸的聚合物。
如本文所使用的，“可渗透的”物质是指允许流体通过它的物质。术语“可渗透的”包括可半渗透或可选择性渗透的物质。在一些实施方式中，可渗透的物质允许溶剂(例如水)、而不允许一种或多种溶质通过它。
如本文所使用的“等离子体”是指主要包含正离子和自由电子的物质状态。等离子体通常不具有电荷或非常小的总电荷。“CO2等离子体”是指由CO2气体产生的等离子体，例如包含自由电子、碳和氧原子核。
如本文所使用的“特异性结合对”是指比起对参照分子的亲和力，彼此具有更大亲和力的一对部分或分子。在一些实施方式中，特异性结合对的成员彼此的亲和力小于或等于107、108、109、1010或1011KD。
如本文所使用的，“受试者”和“患者”可互换使用以表示人或动物，例如哺乳动物。通常动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴(例如恒河猴)。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔子和仓鼠。家畜和狩猎动物包括奶牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科动物(例如家猫)、犬科动物(例如狗、狐狸、狼)、鸟类动物(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)和鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在本文所述方面的某些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。受试者可为先前已被诊断患有或者鉴定为遭受或具有由本文所述的任意微生物或病原体引起的疾病或病症的受试者。仅举例来说，受试者可被诊断患有败血症、炎性疾病或感染。
例如用于使用本文的方法附着到基材的实体
实体可包含例如小分子、多肽(例如糖多肽、例如糖蛋白)、核酸、碳水化合物(例如多糖)、生物聚合物、小分子、拟肽、药物、聚合物(例如PEG或PNA)、分泌蛋白、信号分子、膜包埋蛋白、核酸、染色体、细胞核、线粒体、叶绿体、鞭毛、生物矿物、小细胞、抗体分子、抗原、受体或其任意组合。实体还可包含分子的复合物，例如彼此非共价结合的多个分子，例如蛋白质/蛋白质复合物或核酸/蛋白质复合物。本文描述了实体的示例。
在一些实施方式中，实体以本文所述的密度附着，例如以至少约1x1012个分子/cm2、1x1013个分子/cm2、1x1014个分子/cm2、1x1015个分子/cm2、1x1016个分子/cm2或1x1017个分子/cm2或者约500-2000个实体/μm2、500-1800个实体/μm2、500-1600个实体/μm2、500-1200个实体/μm2、600-2000个实体/μm2、600-1800个实体/μm2、600-1600个实体/μm2、600-1200个实体/μm2、800-2000个实体/μm2、800-1800个实体/μm2、800-1600个实体/μm2、800-1200个实体/μm2、1000-2000个实体/μm2、1000-1800个实体/μm2、1000-1600个实体/μm2或1000-1200个实体/μm2附着。在一些实施方式中，该实体为多聚体。
在实施方式中，使用结合测试或成像测试来确定密度。在实施方式中，如实施例7中所述进行成像测试。当检测到非荧光实体时，可添加标记分子，例如如果实体是蛋白质，可添加蛋白质的抗体。抗体可被直接标记、或可添加具有标记物的二抗。
一些合适的实体包括蛋白质、肽、核酸、多糖、糖类、蛋白多糖、肝素、硫酸肝素、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚氨酯、金属和金属氧化物(例如氧化铁、氧化亚铁、氧化铜、铝、氧化铝、氧化锌、锌、镁、钙等)、海藻酸盐/酯、丝、糖胺聚糖、角蛋白、硅酸盐/酯、磷脂、聚乙二醇二醇、乙二醇、聚丙二醇、全氟谷氨酸、全氟聚醚(Krytox)；端羟基的、端胺基的、端甲基的和/或端烃基的聚二甲基硅氧烷；聚砜、聚醚砜、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸-乙醇酸、聚丙烯酰亚胺、聚丁二烯、水、甲酰胺、戊二醛、乙酸、纤维素、角蛋白、壳聚糖、几丁质、聚乳酸、脂肪烃、芳香烃、苯基基团和适配体。
实体可包含至少一个微生物表面结合结构域(包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个微生物表面结合域)。如本文所用的术语“微生物表面结合结构域”是指可特异性地结合至微生物或病原体表面的任意分子或其片段(例如微生物或病原体的表面上存在的任意组分)、和/或任意微生物物质(例如从微生物衍生、起源或分泌的任意物质或组分/片段)。可用于微生物表面结合结构域中的分子可包括例如但不限于肽、多肽、蛋白质、拟肽、抗体分子、抗体片段(例如抗体的抗原结合片段)、碳水化合物结合蛋白质(例如凝集素、糖蛋白、糖蛋白结合分子)、氨基酸、碳水化合物(包括单糖、二糖、三糖和多糖)、脂质、类固醇、激素、脂质结合分子、辅因子、核苷、核苷酸、核酸(例如DNA或RNA、核酸的类似物和衍生物、或适配体)、肽聚糖、脂多糖、小分子及其任意组合。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域可包含碳水化合物识别结构域或其片段。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域可包含拟肽，该拟肽模拟可特异性地结合至微生物或病原体表面和/或任意微生物物质的任意分子或其片段。例如，微生物表面结合结构域可包含模拟任意碳水化合物识别结构域或其片段(例如MBL的碳水化合物识别结构域或其片段、或者本领域已知的任意碳水化合物识别结构域或其片段)的拟肽。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域包含碳水化合物结合蛋白的完整氨基酸序列。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域可具有约10至约300个氨基酸残基的氨基酸序列、或约50至约150个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域可具有至少约5、至少约10、至少约15、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100个或更多氨基酸残基的氨基酸序列。对于任意已知的微生物表面结合分子的序列，本领域技术人员可确定微生物表面结合结构域的氨基酸序列的最佳长度。
在一些实施方式中，实体包含至少一个氨基基团，该氨基基团可与基材表面上的官能团非共价或共价偶联。例如多肽实体的N-末端处或N-末端附近的氨基酸残基(例如赖氨酸或半胱氨酸残基)的伯胺可用于与基材表面上的官能团偶联。在一些实施方式中，多肽中(例如在多肽的N-末端附近、C-末端附近或中心区域中)氨基酸残基(例如赖氨酸)的伯胺可用于与基材表面上的官能团偶联。
抗体分子和其它结合蛋白
在一些实施方式中，所述实体包含免疫球蛋白的至少一部分，所述免疫球蛋白例如：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM(包括其亚类、例如IgG1)；或其经修饰的分子或重组体。在一个实施方式中，该部分保留全长分子的一种或多种生物学功能(例如结合特性)。免疫球蛋白包括IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。免疫球蛋白部分(例如片段)和免疫球蛋白衍生物包括但不限于单链Fv(scFv)、双抗体、Fv和(Fab′)2、三抗体、Fc、Fab、CDR1、CDR2、CDR3、多种CDR的组合、轻Ig链或重Ig链的可变区、四抗体、双功能杂合抗体、框架区、恒定区等(参见Maynard等，(2000)Ann.Rev.Biomed.Eng.2：339-76；Hudson(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9：395-402)。在一个实施方式中，免疫球蛋白分子可涵盖免疫球蛋白直系同源基因，该基因是编码与人源蛋白质具有生物学上等同的功能的蛋白质(例如同源物(包含剪接变体)、突变体和衍生物)的不同生物物种(例如人、狗、猫、小鼠和大鼠)之间的保守的基因。免疫球蛋白直系同源物包括IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的任意的哺乳动物直系同源物，包括人和其它灵长类动物、实验哺乳动物(如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、具有商业意义的哺乳动物(如马、奶牛、骆驼、猪和绵羊)以及伴侣哺乳动物(如家畜，例如兔子、雪貂、狗和猫)、或骆驼、美洲驼或鲨鱼中的直系同源物。
例如，FcMBL分子的Fc部分或本文所述的任意实体的Fc部分可用本文所述的任意的免疫球蛋白片段替换。
在一些实施方式中，所述实体包含粘附分子的至少一部分、或其经修饰分子或重组体。在一个实施方式中，该部分保留全长分子的一种或多种生物学功能(例如结合特性)。粘附分子的非限制性实例包括：细胞粘附分子，例如钙粘着蛋白、选择蛋白、整联蛋白、地址素、淋巴细胞归巢受体(例如CD-34、GLYCAM-1)；突触细胞粘附分子(SynCAMs)；神经细胞粘附分子(NCAMs)；细胞间细胞粘附分子(ICAM-i)；血管细胞粘附分子(VCAM-i)；血小板-内皮细胞粘附分子(PECAM-1)。在一个实施方式中，粘附分子可涵盖本文讨论的直系同源基因。
实体的其它非限制性实例包括CHL1、MAG、连接素和连接素样分子、CD2、CD48、SIGLEC家族成员(例如CD22、CD83)、CTX家族成员(例如CTX、JAMs、BT-IgSF、CAR、VSIG、ESAM)和L1的一部分。在一个实施方式中，该部分保留全长分子的一种或多种生物学功能、例如结合特性。
在一些实施方式中，所述实体包含肝素的至少一部分。肝素结合各种蛋白质，包括生长因子(例如FGF1、FGF2、FGF7)、丝氨酸蛋白酶(例如凝血酶、凝血因子Xa)和丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如抗凝血酶)。在一些实施方式中，该实体包含糖胺聚糖(GAG)的至少一部分。在一些实施方式中，该实体包含至少一种糖胺聚糖(GAG)。GAG包括但不限于肝素/硫酸乙酰肝素GAG(HSGAG)、软骨素/硫酸皮肤素GAG(CSGAG)、硫酸角质素GAG和透明质酸。在一些实施方式中，所述实体包含血红素结合蛋白或其一部分，例如其血红素结合部分。
在一些实施方式中，该实体包含国际申请WO2014/190040中描述的血红素结合分子，通过引用的方式将其整体并入本文。例如该实体可包含含有血红素结合蛋白结构域的经工程化的血红素结合分子。该分子还可包含选自于由接头、微生物结合分子和/或基材结合结构域所组成的组中的第二结构域，其中，第二结构域缀合至血红素结合蛋白结构域。
在一些实施方式中，该实体包含国际申请WO2015/095604中描述的C-反应蛋白(CRP)分子，通过引用将其整体并入本文。例如，该实体可包含微生物靶向分子，该分子包含至少一个第一结构域，该第一结构域包含c-反应蛋白(CRP)的至少一部分。在一些实施方式中，所述分子还包含至少一个第二结构域，该第二结构域任选地包含选自于由以下所组成的组中的结构域的至少一部分：i.免疫球蛋白的Fc区；ii.微生物结合蛋白的微生物结合结构域，其中微生物结合蛋白不是CRP；iii.凝集素的颈部区域；iv.可检测标记物；v.用于与载体支架的表面缀合的结构域；vi.CRP的模式识别受体结构域；以及vii.(i)-(vi)的任意组合；并且任选地c.缀合第一结构域和第二结构域的接头。
在一些实施方式中，实体可包含受体分子的至少一部分或其经修饰的分子或重组体。在一个实施方式中，该部分保留全长分子的一种或多种生物学功能、例如结合特性。受体分子的非限制性实例包括：细胞外受体分子(例如烟碱乙酰胆碱受体、甘氨酸受体、GABA受体、谷氨酸受体、NMDA受体、AMPA受体、红藻氨酸受体、5-HT3受体、P2X受体)；细胞内受体分子(例如环核苷酸门控离子通道、IPS受体、细胞内ATP受体、兰尼碱受体)；免疫受体分子(例如模式识别受体、toll样受体、杀伤活化和杀伤抑制剂受体、补体受体、Fc受体、B细胞受体和T细胞受体)；G蛋白偶联受体分子、病毒受体分子(例如CAR-Coxsackie腺病毒受体)；铁清除受体分子(例如LRP/CD91、CD163)。在一个实施方式中，受体分子可涵盖本文讨论的直系同源基因和蛋白质。在一些实施方式中，该实体包含激素受体。在一些实施方式中，激素受体是肽激素受体或类固醇激素受体。肽激素受体可为结合至其同源激素配体的细胞表面受体或跨膜受体。类固醇激素受体是结合至其同源激素配体的可溶性受体。在一个实施方式中，肽激素受体包含促甲状腺激素受体、促卵泡激素受体、黄体化激素受体、胰高血糖素受体或胰岛素受体。在另一实施方式中，所述受体用于糖皮质激素、雌激素、雄激素、甲状腺激素(T3)、骨化三醇(维生素D)或类视黄醇(维生素A)。在一些实施方式中，跨膜受体是G蛋白偶联受体，该受体结合至Gs或Gi蛋白。
在进一步的实施方式中，所述实体包含富集循环肿瘤细胞的配体(例如针对肿瘤细胞标志物的抗体分子)的至少一部分。富集循环肿瘤细胞的配体包括但不限于EpCAM的抗体分子、CD46的抗体分子、CD24的抗体分子和CD133的抗体分子。在进一步的实施方式中，该实体包含在母体循环中富集胎儿细胞的配体的至少一部分。富集胎儿细胞的配体包括但不限于CD71的抗体分子和血型糖蛋白-A的抗体分子。在进一步的实施方式中，该实体包含富含循环白细胞的配体的至少一部分，例如CD45的抗体分子和CD15的抗体分子。在其它实施方式中，该实体包含非免疫球蛋白结合蛋白的至少一部分，该蛋白经工程化用于特异性结合特性。例如，实体可包含锚蛋白重复序列，或实体可为anticalins。在一个实施方式中，抗运载蛋白可用于筛选用来结合至靶分子的文库(例如参见Gebauer，M.，&Skerra，A.(2009).Engineered protein scaffolds as next-generation antibodytherapeutics.Current opinion in chemical biology，13(3)，245-255；以及Lofblom，J.，Frejd，F.Y，&Stahl，S.(2011).Non-immunoglobulin based proteinscaffolds.Current Opinion in Biotechnology，22(6)，843-848，将其各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方式中，将本文所述的Fc部分或任意免疫球蛋白片段偶联至本文所述的任意实体，所述实体靶向特定配体、细胞或其组合。
在一个实施方式中，Fc区的氨基酸序列包含SEQ ID NO：56。
SEQ ID NO：56描述了Fc结构域的氨基酸序列：
在一些实施方式中，可去除Fc区的N-连接的糖基化。例如，在FcMBL.81中，可通过将抗体中的进行氨基酸编号的Kabat系统中的第297位残基的氨基酸从天冬酰胺改变为天冬氨酸(N297D)来除去糖基化，这对应于该具体的Fc构造中的第82位氨基酸。因此，在一些实施方式中，位置82是D，并且在一些实施方式中，位置82是N。
调理素(例如凝集素)
在一些实施方式中，所述实体包含调理素、例如凝集素。在一些实施方式中，该实体包含微生物表面结合结构域或微生物结合分子。
在一些实施方式中，所述实体包含调理素或其片段。可用于本文所述方法中的调理素的实例包括但不限于：玻连蛋白，纤连蛋白，补体成分如C1q(包含其组分多肽链A、B和C的任一者)，补体片段如C3d、C3b和C4b，甘露糖结合蛋白，胶固素，表面活性蛋白A和D，C-反应蛋白(CRP)，α2-巨球蛋白和免疫球蛋白，例如免疫球蛋白的Fc部分。
在一些实施方式中，所述实体可包含碳水化合物识别结构域。在一些实施方式中，该实体可进一步包含碳水化合物结合蛋白的至少一部分或其部分。在一些实施方式中，碳水化合物结合蛋白的一部分能激活补体系统。在替代的实施方式中，碳水化合物结合蛋白的一部分不能激活补体系统。在一些实施方式中，可选择或配置碳水化合物结合蛋白的一部分(例如通过修饰)而使得其不能激活补体系统。碳水化合物结合蛋白的实例包括但不限于：凝集素，胶原凝集素，纤维胶凝蛋白，甘露糖结合凝集素(MBL)，麦芽糖结合蛋白，树胶醛糖结合蛋白和葡萄糖结合蛋白。可包含在本文所述的微生物表面结合结构域中的额外的碳水化合物结合蛋白可包括但不限于衍生自植物的凝固素或凝集素，例如来自雪花莲属(雪滴花)植物的雪花莲凝集素(GNA)和花生凝集素。在一些实施方式中，正五聚蛋白家族成员(例如C-反应蛋白)也可用作碳水化合物结合蛋白。正五聚蛋白家族成员通常可结合囊化的微生物。碳水化合物结合蛋白可为野生型蛋白、重组蛋白或融合蛋白。这种碳水化合物结合蛋白的相应碳水化合物识别结构域是本领域已知的，并且可被修饰用于本文所述的经工程化的微生物靶向分子的各种实施方式。在一些实施方式中，模拟微生物表面结合结构域(例如碳水化合物识别结构域或其片段)并且能够结合至微生物表面的拟肽或任意的结构模拟物也可用作本文所述的微生物表面结合结构域。
胶原凝集素是属于含有C型凝集素的胶原超家族的可溶性模式识别受体(PRR)。示例性的胶原凝集素包括但不限于：甘露糖结合凝集素(MBL)(也称为甘露聚糖结合凝集素、甘露聚糖结合蛋白或甘露糖结合蛋白)，表面活性蛋白A(SP-A)、表面活性蛋白D(SP-D)，肝胶原凝集素1(CL-L1)，胎盘胶原凝集素1(CL-P1)，胶固素，43kDa的胶原凝集素(CL-43)，46kDa的胶原凝集素(CL-46)及其片段。
甘露糖结合凝集素(MBL)(也称为甘露糖结合蛋白(MBP)或甘露聚糖结合凝集素或甘露聚糖结合蛋白)是钙依赖性血清蛋白，通过结合至多种微生物或病原体(病毒、细菌、真菌、原生动物)表面的碳水化合物可在固有免疫应答中发挥作用(其中可激活补体系统)。MBL还可作为直接调理素并通过标记病原体的表面以促进吞噬细胞的识别和吞入来介导病原体的结合和/或摄取。
MBL是胶原凝集素蛋白家族的成员。天然MBL是由亚基组成的多聚体结构(例如约650kDa)，每个亚基含有三条相同的多肽链。每个MBL多肽链(在长度上含有248个氨基酸残基，具有信号序列SEQ ID NO：1)包含N末端富含半胱氨酸的区域、胶原蛋白样区域、颈部区域和碳水化合物识别结构域(CRD)。每个区域的序列已经被鉴定并且为本领域熟知的。SEQID NO：2示出了没有信号序列的MBL的全长氨基酸序列。
天然MBL的表面或碳水化合物识别功能由通过a-螺旋的卷曲螺旋保持在一起的三个C型碳水化合物识别结构域(CRD)的簇介导。N-末端部分胶原蛋白样结构域由Gly-X-Y三联体组成。短的N-末端结构域含有形成链间二硫键的半胱氨酸残基。血清MBL组装成较大的形体，在啮齿动物中该形体含有2-4个三聚体亚基，在人类中该形体含有多达6个亚基。称为MBPA的所有三种寡聚形式的大鼠血清MBP都可固定补体，尽管较大的寡聚体具有较高的特异活性。许多物种表达第二种形式的MBP。在大鼠中，第二种形式(MBP-C)发现于肝脏中。除含有三种多肽的简单亚基外，MBP-C不形成更高级的寡聚体。
当天然MBL与微生物或病原体表面上的碳水化合物相互作用(例如钙依赖性结合至碳水化合物甘露糖、N-乙酰葡糖胺和/或岩藻糖)时，它可形成补体激活的凝集素途径的病原体识别组件。MBL结合至含有重复的甘露糖或N-乙酰葡糖胺残基的表面阵列。它作为复合物与一种或多种MBP相关的丝氨酸蛋白酶(MASP)一起循环，当复合物结合到合适的表面时，丝氨酸蛋白酶自动激活。MBL和相关的MASP蛋白可激活C2/C4转化酶，导致C4在病原体表面上的沉积和用于吞噬作用的调理作用。天然MBL还可通过MASP蛋白激活凝血功能。
虽然天然MBL可检测微生物或病原体并且充当用于标记微生物以进行吞噬作用的调理素，但天然MBL可能不期望用于治疗微生物诱导的炎性疾病或感染(例如败血症)，因为天然MBL可激活补体系统并诱导炎症应答。在一个实施方式中，所述实体是结合至微生物或病原体的经工程化的MBL分子，该MBL分子包含至少一个碳水化合物识别结构域或其片段(例如衍生自MBL)。在一些实施方式中，经工程化的MBL分子可包含至少2个、至少3个或至少4个碳水化合物识别结构域或其片段。在一些实施方式中，经工程化的MBL分子不激活天然MBL中存在的补体系统或凝血副作用。此类实施方式可用作体内下游应答的显性负性抑制剂或用作不诱导体外补体结合或凝血的微生物结合蛋白。例如，在激活细胞因子和/或炎症级联方面，不具有补体结合和/或凝血结构域的经工程化的MBL分子可充当显性负性蛋白，并因此减少系统炎性综合征和/或败血症症状。
在一些实施方式中，该实体包含二聚体的经工程化的MBL分子。二聚体分子可包含直接或间接连接至接头(例如Fc区)的至少两个碳水化合物识别结构域(例如MBL CRD)。Fc区的N-末端可进一步包含寡肽，例如包含氨基酸序列AKT。在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可进一步包含颈部区域、例如MBL颈部，以提供CRD与微生物相互作用的灵活性。
MBL的碳水化合物识别结构域(CRD)的全长氨基酸序列以SEQ ID NO：4示出。本文描述的经工程化的MBL的碳水化合物识别结构域可具有约10至约300个氨基酸残基、或约50至约160个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方式中，微生物表面结合结构域可具有至少约5个、至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约30个、至少约40个、至少约50个、至少约60个、至少约70个、至少约80个、至少约90个、至少约100个、至少约150个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列。因此，在一些实施方式中，经工程化的MBL分子的碳水化合物识别结构域可包含SEQ ID NO：4。在一些实施方式中，经工程化的MBL分子的碳水化合物识别结构域可包含SEQ ID NO：4的片段。此类片段的示例性氨基酸序列包括但不限于ND(SEQ ID NO：10)、EZN(SEQ ID NO：11：其中Z是任意氨基酸，例如P)、NEGEPNNAGS(SEQ ID NO：12)或其包含EPN的片段、GSDEDCVLL(SEQ ID NO：13)或其包含E的片段、以及LLLKNGQWNDVPCST(SEQ IDNO：14)或其包含ND的片段。对此类CRD片段的修饰(例如通过保守取代)也在本文所述的范围内。在一些实施方式中，本文所述的经工程化的微生物靶向分子的微生物表面结合结构域中使用的MBL或其片段可为野生型分子或重组分子。
本文中提供的用于经工程化的微生物靶向分子的碳水化合物识别结构域的示例性序列并不构成限制。例如，虽然本文提供的示例性序列源自人类物种，但在其它物种如小鼠、大鼠、猪、牛科动物、猫科动物和犬科动物中的相同碳水化合物识别结构域的氨基酸序列是本领域已知的并且在本文所述的范围内。
在一些实施方式中，核酸编码与具有任意已知的碳水化合物结合分子(例如甘露糖结合凝集素)的至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个或更多的连续氨基酸的片段具有大于50％同源性(包括大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或更高的同源性)的碳水化合物识别结构域。
在一些实施方式中，所述实体包含与SEQ ID NO：4的CRD区具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的多肽。在一些实施方式中，所述实体包含与SEQ ID NO：5的CRD区和颈部区域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的多肽。在一些实施方式中，所述实体包含与SEQ ID NO：6的FcMBL具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的多肽。在一些实施方式中，所述实体包含与SEQ ID NO：7或8的FcMBL区域具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致性的多肽。
在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可进一步包含具有氨基酸序列pdgdsslaaserkalqtemarikkwltfslgkq(SEQ ID NO：15)或其片段的MBL的颈部区域。不希望受理论的束缚，所述颈部区域可提供CRD的柔性和合适取向以结合至微生物表面。在一些实施方式中，碳水化合物识别结构域可包含MBL的全长CRD(SEQ ID NO：4；称为“CRD头”)及其颈部区域。编码MBL的全长CRD及其颈部区域的氨基酸序列以SEQ ID NO：5示出。天然MBL“颈部和CRD头部”的晶体结构先前已经在Chang等，(1994)J Mol Biol.241：125-7中示出。技术人员可容易地修饰经鉴定的CRD及其片段，以调节其对微生物表面上的碳水化合物的结合性能和取向(例如通过理论建模和/或体外碳水化合物结合实验)。此外，基于天然MBL“颈部和CRD头部”的晶体结构，可有效模拟CRD头部的至少一个片段以及任选地模拟颈部区域的拟肽也可用作本文所述的MBL分子或经工程化的微生物靶向分子的碳水化合物识别结构域。使用本领域已知的任意方法和已知的晶体结构，本领域技术人员可容易地确定这种拟肽结构而无需过度实验。
在一些实施方式中，微生物靶向分子的碳水化合物识别结构域可进一步包含碳水化合物结合蛋白的一部分。
然而，在某些情况下，取决于各种应用(例如败血症的机体外治疗或体内给药)，由碳水化合物结合蛋白或其片段诱导的补体或凝血活化可能是不期望的。在此类实施方式中，碳水化合物结合蛋白的一部分可排除补体和凝血激活区中的至少一种。举例来说，当碳水化合物结合蛋白为甘露糖结合凝集素或其片段时，甘露糖结合凝集素或其片段可排除位于胶原蛋白样区域上的补体和凝血激活区域中的至少一种。此类实施方式中，甘露糖结合凝集素或其片段可排除SEQ ID NO：2的K55或L56氨基酸残基周围的至少约1个氨基酸残基，包括至少约2个氨基酸残基、至少约3个氨基酸残基、至少约4个氨基酸残基、至少氨基酸约5个氨基酸残基、至少约6个氨基酸残基、至少约7个氨基酸残基、至少约8个氨基酸残基、至少约9个氨基酸残基、至少约10个或更多个氨基酸残基。可从经工程化的MBL分子中排除的包含SEQ ID NO：2的K55或L56的示例性氨基序列包括但不限于：EPGQGLRGLQGPPGKLGPPGNPGPSGS(SEQ ID NO：16)，GKLG(SEQ ID NO：17)，GPPGKLGPPGN(SEQID NO：18)，RGLQGPPGKL(SEQ ID NO：19)，GKLGPPGNPGPSGS(SEQ ID NO：20)，GLRGLQGPPGKLGPPGNPGP(SEQ ID NO：21)或其任意片段。
另外的CRD(例如MBL CRD)以及制备它们的方法描述于例如WO2013/012924的第68-100段中，将该申请通过引用的方式以其整体并入本文。在某些实施方式中，该实体可衍生自经工程化的微生物靶向分子，如国际申请WO2011/090954或WO2013/012924中所述；以引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，所述实体包含至少2个微生物表面结合结构域(例如碳水化合物识别结构域)，包括至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或更多个微生物表面结合结构域，连接在一起形成多聚体微生物表面结合结构域或碳水化合物识别结构域。在此类实施方式中，微生物表面结合结构域(例如碳水化合物识别结构域)之间的距离可被工程化为与靶标微生物表面上的结合位点之间的距离匹配。
多聚体微生物表面结合结构域可具有相同的各单独的微生物表面结合结构域。或者，多聚体微生物表面结合结构域可具有至少1个、至少2个或至少3个与其余结构域不同的微生物表面结合结构域。在此类实施方式中，可使用对微生物表面上的碳水化合物享有共同结合特异性的微生物表面结合结构域。仅举例来说，数种凝集素的纤维蛋白原样结构域具有与包含MBL的C型凝集素的CRD相似的功能，并且用作区分病原体与自身的模式识别受体。包含纤维蛋白原样结构域的此类凝集素之一是血清纤维胶凝蛋白。
血清纤维胶凝蛋白对GlcNAc(N-乙酰基-葡糖胺)、弹性蛋白或GalNAc(N-乙酰基-半乳糖胺)具有共同的结合特异性。纤维蛋白原样结构域负责碳水化合物的结合。在人血清中，已经鉴定出两种类型的纤维胶凝蛋白，称为L-纤维胶凝蛋白(也称为P35、纤维胶凝蛋白L、纤维胶凝蛋白2或hucolin)和H-纤维胶凝蛋白(也称为Hakata抗原、纤维胶凝蛋白3或热不稳定的β2-巨糖蛋白)，并且它们都有凝集素活性。L-纤维胶凝蛋白识别GlcNAc，并且H-纤维胶凝蛋白识别GalNAc。另一种被称为M-纤维胶凝蛋白的纤维胶凝蛋白(也称为P35相关蛋白、纤维胶凝蛋白1或纤维胶凝蛋白A)不被认为是血清蛋白，并且发现于白细胞和肺中。L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白激活与MASP相关的凝集素-补体途径。M-纤维胶凝蛋白、L-纤维胶凝蛋白和H-纤维胶凝蛋白具有钙依赖性凝集素活性。因此，在一些实施方式中，经工程化的微生物靶向分子(例如经工程化的MBL分子)可包含MBL和L-纤维胶凝蛋白碳水化合物识别结构域、MBL和H-纤维胶凝蛋白碳水化合物识别结构域或其组合。
任意的本领域确认的重组碳水化合物结合蛋白或碳水化合物识别结构域也可用于经工程化的微生物靶向分子。例如重组甘露糖结合凝集素(例如但不限于美国专利号5,270,199、6,846,649和美国专利申请No.US 2004/0229212中公开的，以引用的方式将其内容并入本文)可用于构建本文所述的组合物并用于本文所述的方法中。
在一个实施方式中，微生物结合分子包含MBL、MBL的碳水化合物识别结构域或经遗传学上工程化的变体的MBL(FcMBL)，如2011年1月19日提交的国际申请No.WO2011/090954中所述，以引用的方式将其内容并入本文。MBL和经工程化的MBL的氨基酸序列包括但不限于：
(i)MBL全长(SEQ ID NO：1)：
(ii)没有信号序列的MBL(SEQ ID NO：2)：
(iii)截短的MBL(SEQ ID NO：3)：
(iv)MBL的碳水化合物识别结构域(CRD)(SEQ ID NO：4)：
(v)颈部+MBL的碳水化合物识别结构域(SEQ ID NO：5)：
(vi)FcMBL.81(SEQ ID NO：6)：
(vii)AKT-FcMBL(SEQ ID NO：7)：
(viii)FcMBL.111(SEQ ID NO：8)：
在一些实施方式中，微生物结合分子包含选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其微生物结合片段，或者与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。
不希望受理论的束缚，包含凝集素或其经修饰的变体的微生物结合分子可充当广谱病原体结合分子。因此，样品中存在的微生物和/或微生物物质可使用基于凝集素的微生物结合分子结合而不识别微生物。
CD209：在一些实施方式中，微生物结合结构域包含CD209(分化簇209)的碳水化合物识别结构域或其功能片段。CD209是一种在人类中由CD209基因编码的蛋白质。CD209也称为DC-SIGN(树突状细胞特异性细胞间粘附分子-3-捕获非整联蛋白)。DC-SIGN是存在于巨噬细胞和树突状细胞两者上的C型凝集素受体。巨噬细胞上的CD209识别并结合至甘露糖型碳水化合物，这是一类通常在病毒、细菌和真菌上发现的病原体相关分子模式(PAMP)。这种结合相互作用激活吞噬作用。在骨髓和前浆细胞样树突状细胞上，CD209介导树突状细胞滚动与血液内皮的相互作用和CD4+T细胞的活化、以及病原体半抗原的识别。CD209是C型凝集素，并对ICAM3分子具有高亲和力。它通过识别其包膜上的含有高甘露糖的糖蛋白来结合各种微生物，并且尤其是用作如HIV和丙型肝炎等数种病毒的受体。与DC-SIGN结合可促进HIV和丙型肝炎病毒从树突状细胞感染T细胞。因此，与DC-SIGN的结合是HIV感染的重要过程。除了作为粘附分子起作用外，最近的研究还表明CD209可通过调节toll样受体来启动固有免疫。DC-SIGN与其它C型凝集素一起参与树突状细胞对肿瘤的识别。CD209也是用于基于树突状细胞的癌症疫苗的潜在的工程化靶点。CD209的示例性结合靶点包含甘露糖和其它糖。
在一些实施方式中，所述实体包含CD209的碳水化合物识别结构域或其微生物结合片段，并且包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。
CD209L：在一些实施方式中，该实体包含CD209L的碳水化合物识别结构域或其功能片段。CD209L也称为L-SIGN(肝/淋巴结特异性细胞内粘附分子-3捕获非整联蛋白)，并且是II型整合膜蛋白，其与CD209抗原(HIV g120结合蛋白)77％一致。该蛋白质与CD209一样，有效地结合细胞间粘附分子3(ICAM3)和HIV-1 g120两者，并增强T细胞的HIV-1感染。在具有CD209和CD23/FCER2基因的簇中，L-SIGN的基因被定位于19p 13.3。已经发现该基因的多个可变剪接的转录物变体，但尚未确定一些变体的生物学有效性。CD209L的示例性结合靶点包含甘露糖和其它糖。
在一些实施方式中，该实体包含L-SIGN的碳水化合物识别结构域或其微生物结合片段，并且包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。
模式识别受体(PRR)：在一些实施方式中，该实体包含模式识别受体或其功能片段。模式识别受体(PRR)是免疫系统的原始部分。它们是由固有免疫系统的细胞表达的蛋白质，用于鉴定与微生物病原体或细胞应激相关的病原体相关分子模式(PAMP)以及与在细胞受损期间释放的细胞成分相关的损伤相关分子模式(DAMP)。它们也被称为病原体识别受体或原始模式识别受体，因为它们在免疫系统的其它部分之前、特别是在适应性免疫之前形成。通过给定的PRR识别的微生物特异性分子称为病原体相关分子模式(PAMP)，并且包含：细菌碳水化合物(如脂多糖或LPS、甘露糖)，核酸(如细菌或病毒DNA或RNA)，细菌肽(鞭毛蛋白、ax21)，肽聚糖和脂磷壁酸(来自革兰氏阳性细菌)，N-甲酰基甲硫氨酸，脂蛋白和真菌葡聚糖。内源性应激信号称为危险相关分子模式(DAMP)，并且包括尿酸。PGRP的示例性结合靶点包括肽聚糖(PGN)。
根据其配体特异性、功能、定位和/或进化关系对PRR进行分类。在功能的基础上，PRR可分为内吞PRR或信号PRR。信号PRR包括膜结合的Toll样受体和细胞质NOD样受体的大家族。内吞PRR促进吞噬细胞对微生物的附着、吞噬和破坏，而不会中转胞内信号。这些PRR识别碳水化合物并包含巨噬细胞的甘露糖受体、存在于所有吞噬细胞上的葡聚糖受体和识别带电配体的清道夫受体，在所有吞噬细胞上发现并介导凋亡细胞的去除。
在一些实施方式中，PRR是CD14。CD14作为共同受体(与Toll样受体TLR4和MD-2一起)起到检测细菌脂多糖(LPS)的作用。CD14可仅在脂多糖结合蛋白(LBP)的存在下结合LPS。尽管LPS被认为是其主要配体，但CD14也识别其它与病原体相关的分子模式。CD14的示例性结合靶点包括但不限于脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和脂磷壁酸(LTA)。
在一些实施方式中，所述实体包含PRR或其微生物结合片段，并且具有SEQ ID NO：26的氨基酸，或与其至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致的序列。
肽聚糖识别蛋白：肽聚糖识别蛋白(PGRP)是从昆虫到哺乳动物中保守的模式识别分子，并识别细菌及其独特的细胞壁成分肽聚糖(PGN)。PGRP具有至少一个羧基末端PGRP结构域(长约165个氨基酸)，其与噬菌体和细菌2型酰胺酶同源。昆虫有多达19个PGRP，分为短(S)形式和长(L)形式。短形式存在于血淋巴、角质层和脂肪体细胞中，并且有时存在于肠中的表皮细胞和血细胞中，而长形式主要在血细胞中表达。
果蝇、蚊子和哺乳动物分别具有13、7和4种PGRP基因的家族，并且这些基因中的一些是可变剪接的。PGRP在各种细胞和组织中差异表达，它们的表达通常被细菌上调，并且它们介导宿主对细菌感染的应答。昆虫PGRP具有昆虫特有的四种已知效应子功能：前酚氧化酶级联的激活，Toll受体的激活，Imd途径的激活和吞噬作用的诱导。一些昆虫和哺乳动物PGRP共享一种功能：酰胺酶活性，而一些哺乳动物PGRP的抗菌活性对哺乳动物是独特的。昆虫PGRPs的表达通常通过暴露至细菌而上调。
哺乳动物具有四个PGRP的家族，最初被命名为PGRP-S、PGRP-L以及PGRP-1α和PGRP-1β(分别用于“短”、“长”或“中间”转录本)，类似于昆虫PGRPs。随后，人类基因组组织基因命名委员会将其符号分别更改为PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3和PGLYRP-4。该术语也用于小鼠PGRP，并且开始被所有脊椎动物PGRP采用。PGLYRP-2(一种哺乳动物PGRP)是N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶，其水解细菌肽聚糖并降低其促炎活性；PGLYRP-2从肝脏分泌到血液中，并且也由上皮细胞中的细菌诱导。其余的三种哺乳动物PGRP是杀菌蛋白，其作为二硫键连接的同源和异源二聚体分泌。PGLYRP-1主要在多形核白细胞颗粒中表达，并且PGLYRP-3和PGLYRP-4在皮肤、眼睛、唾液腺、咽喉、舌、食道、胃和肠中表达。这三种蛋白质通过与细胞壁肽聚糖相互作用而杀菌，而不是像其它抗菌肽那样透过细菌膜杀菌。这些PGRP的直接杀菌活性或在脊椎动物(或哺乳动物)谱系中演变、或在昆虫中尚待发现。哺乳动物PGLYRP-1、PGLYRP-2、PGLYRP-3和PGLYRP-4在本文中也分别称为PGRP-L、PGRP-2、PGRP-3和PGRP-4。
在一些实施方式中，微生物结合结构域包含PGRP或其片段。在一些实施方式中，微生物结合结构域包含来自人、小鼠、牛或甲壳虫的PGRP或其片段。在一些实施方式中，微生物结合结构域包含PGRP或片段，因此包含选自于由SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ IDNO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35所组成的组中的氨基酸序列。
来自其它物种：在一些实施方式中，该实体包含来自虾的碳水化合物识别结构域或其片段、例如功能性片段。例如，该实体可包含虾的Mj凝集素B或Mj凝集素C的碳水化合物识别结构域或其片段。Mj凝集素C的示例性结合靶点包含微生物细胞壁。在一些实施方式中，实体(例如包含微生物结合结构域的实体)包含氨基酸序列SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：36。
在一些实施方式中，实体(例如包含微生物结合结构域的实体)包含来自小麦胚芽凝集素或WGA的碳水化合物识别结构域或其片段、例如功能性片段。WGA是一种保护小麦(Triticum vulgaris)免于昆虫、酵母和细菌的凝集素。凝集素蛋白与N-乙酰基-D-葡糖胺和唾液酸结合。小麦的天然环境中的N-乙酰-D-葡糖胺发现于昆虫的几丁质中、以及酵母和细菌的细胞膜中。WGA大量发现于小麦籽粒中，但并非排他的。在哺乳动物中，WGA结合的N-乙酰-D-葡糖胺发现于软骨和角膜等地方。在那些动物中，在粘膜中发现唾液酸，例如内鼻的衬里和消化道。在溶液中，WGA主要作为38,000道尔顿的异二聚体存在。它在生理pH下是阳离子的。在一些实施方式中，微生物结合结构域包含来自WGA的碳水化合物识别结构域或其片段，并且包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
在烟草钩虫(烟草天蛾，Manduca sexta)中，已显示肽聚糖识别蛋白起刺激性PRR的作用以增强免疫应答。因此，在一些实施方式中，微生物结合结构域包含来自烟草天蛾的PRR结构域。在一些实施方式中，微生物结合结构域包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
不希望受理论的束缚，本文所述的微生物结合分子或其经修饰的变体可充当广谱病原体结合分子。
因此，可使用本文所述的微生物结合分子捕获测试样品中存在的微生物和/或微生物物质，无需识别微生物，
在一些实施方式中，微生物表面结合结构域包含选自表1中示出的序列的氨基酸序列及其组合。
表1：一些示例性微生物表面结合结构域氨基酸序列
在一些实施例中，微生物结合分子包含选自于由表2中示出的序列及其任意组合所组成的组中的氨基酸序列。
表2：一些示例性的经工程化的微生物结合分子氨基酸序列
抗微生物肽
在一些实施方式中，该实体包含抗微生物肽或其功能片段。在一些实施方式中，所述实体还包含碳水化合物识别结构域，例如抗微生物肽的N-末端或C-末端。此外，抗微生物肽可直接或通过接头(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的肽)连接至碳水化合物识别结构域。在一个实施方式中，抗微生物肽连接至碳水化合物识别结构域的C-末端。
抗微生物肽(也称为宿主防御肽)是固有免疫应答的进化上保守的组分，并且发现于所有类别的生命中。原核细胞和真核细胞(可代表抗微生物肽的靶点)之间存在根本差异。这些肽是有效的广谱抗生素，显示出作为新型治疗剂的潜力。已经证明抗微生物肽杀死革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(包含对常规抗生素有抗性的菌株)分枝杆菌(包含结核分枝杆菌)、包膜病毒、真菌甚至转化或癌变的细胞。与大多数常规抗生素不同，似乎抗微生物肽也可具有通过作为免疫调节剂起作用来增强免疫力的能力。
抗微生物肽是独特且多样化的成组分子，基于它们的氨基酸组成和结构将其分成亚组。
抗微生物肽通常为12至50个氨基酸。这些肽包含由精氨酸、赖氨酸或在酸性环境中的组氨酸提供的2个以上的带正电荷的残基，以及大部分(通常＞50％)疏水残基。这些分子的二级结构遵循4个主题，包括：i)α-螺旋，ii)归因于2个以上的二硫键的存在的β折叠股化的，iii)归因于单个二硫键和/或肽链的环化的存在的β-发夹或环，以及iv)延伸的。许多的这类肽在游离溶液中是非结构化的，并且在分配到生物膜中时折叠成它们的最终构型。它含有沿螺旋分子的一侧排列的亲水氨基酸残基和沿螺旋分子的相对侧排列的疏水性氨基酸残基。抗微生物肽的这种两亲性使得能够分配到膜脂质双层中。与膜结合的能力是抗微生物肽的决定性特征，尽管膜透化作用不是必需的。这些肽具有多种抗微生物活性，包括从膜透化作用到针对一系列细胞质靶点的作用。
抗微生物肽杀菌的作用方式是多种多样的，并且包括破坏膜、干扰代谢和靶向细胞质组分。肽和靶生物体之间的初始接触是静电的，因为大多数细菌表面是阴离子的或疏水的，例如在抗微生物肽毒鱼豆素(Piscidin)中。它们的氨基酸组成、两亲性、阳离子电荷和大小允许它们附着并插入膜双层中以通过“桶板(barrel-stave)”、“毯式(carpet)”或“环形孔(toroidal-pore)”机制形成孔。或者，它们可渗透到细胞中以结合对细胞存活力很重要的细胞内分子，细胞内结合模型包括：抑制细胞壁合成，改变细胞质膜，激活自溶素，抑制DNA、RNA和蛋白质合成，以及抑制某些酶。然而，在许多情况下，确切的杀菌机制尚未知晓。与许多常规抗生素相比，这些肽似乎是杀菌剂(细菌杀灭剂)而不是抑菌剂(细菌生长抑制剂)。通常，通过测定最小抑制浓度(MIC)来确定这些肽的抗微生物活性，MIC是抑制细菌生长的药物的最低浓度。
除了直接杀菌之外，已经证明抗微生物肽具有许多免疫调节剂功能，其可参与感染的清除，包括：改变宿主基因表达的能力，充当趋化因子和/或诱导趋化因子产生，抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子产生，促进伤口愈合，以及调节树突状细胞和适应性免疫应答的细胞的应答。动物模型表明宿主防御肽对于预防和清除感染都很重要。
抗微生物肽由所有物种产生，包括来自细菌、真菌、水螅、昆虫(黄蜂毒素、poneratoxin、天蚕素、家蚕抗菌肽、蜂毒肽等)、青蛙(蛙皮素、dermaseptin等)和哺乳动物(例如cathelicidins、防御素和protegrins)的肽。
在细菌细胞和宿主细胞与抗微生物肽的竞争中，与哺乳动物细胞相比抗微生物肽优先与细菌细胞相互作用，这使得它们能够杀死微生物而对哺乳动物细胞没有显著毒性。在一些实施方式中，抗微生物肽与细菌细胞膜的外叶具有静电相互作用和疏水相互作用。
示例类型的抗微生物肽包括但不限于：阴离子肽(例如来自两栖动物的maximinH5和来自人的皮离蛋白)，通常富含谷氨酸和天冬氨酸；线性阳离子α-螺旋肽(例如来自昆虫的天蚕素、andropin、家蚕抗菌肽、ceratotoxin和蜂毒肽，来自两栖动物的蛙皮素、dermaseptin、铃蟾抗菌肽、brevmin-1、esculentins和buforin II，来自兔子的CAP 18，来自人类的LL37)，通常缺乏半胱氨酸；富含特定氨基酸的阳离子肽(例如来自蜜蜂的abaecin、apidaecins，来自猪的prophenin，来自牛的indoilcidin)，通常富含脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸或色氨酸；以及通常含有1-3个二硫键的阴离子和阳离子肽(例如来自猪的抗菌肽protegrin、brevinins(1个键)，以及来自马蹄蟹的鲎肽素(2个键)，来自人类的防御素(3个键)，果蝇中的菌肽drosomycin(超过3个键))。在一些实施方式中，抗微生物肽是培西加南。
在一些实施方式中，抗微生物肽包含氨基酸序列GSAWWSYWWTQWASELGSPGSP(SEQID NO：54)。
小分子
在一些实施方式中，该实体为小分子。在一些实施方式中，该实体为抗生素、抗肿瘤剂、抗细菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂或抗真菌剂。
药物
在一些实施方式中，该实体为药物，例如小分子或蛋白质药物。在一些实施方式中，该实体为抗生素，如氨苄青霉素、诺氟沙星、利福平、替加环素、头孢哌酮、呋喃唑酮、磺胺嘧啶银、氨苯砜、吉米沙星、磺胺二甲嘧啶、依诺沙星、磺胺异噁唑、头孢吡普(ceftolozane)、百浪多息、磺胺甲嘧啶、磺胺吡啶、格雷沙星、磺胺林、磺胺甲氧哒嗪、乙酸/氢化可的松、磺胺苯酰、磺胺美曲、磺胺对甲氧嘧啶、ciridicatumtoxin B、磺胺苯吡唑、磺胺噁唑、磺胺托嘧啶、磺胺硫脲或磺胺培林。
在一些实施方式中，药物包含阳离子碱性肽，例如多粘菌素B或其组分。药物可包含例如多粘菌素B1、B1-I、B2、B3或B6或其任意组合。
在一些实施方式中，所述实体是抗血小板剂(例如阿司匹林、氯吡格雷(clopridigol)、噻吩并吡啶或P2Y12抑制剂)和/或抗凝血剂(例如香豆定、醋硝香豆醇、苯丙香豆素、阿哌沙班和利伐沙班)。
在一些实施方式中，该实体为抗胆固醇剂(例如他汀类)或抗脂蛋白剂。
核酸
在一些实施方式中，实体可包含至少一种寡核苷酸。可根据基材的类型、结合密度和/或期望的结合强度来配置寡核苷酸的序列和长度。例如如果基材是核酸支架(例如DNA支架)，则可设计基材结合结构域的寡核苷酸序列，使得它与核酸支架的亚序列(基材-结合域可杂交至该处)互补。
在一些实施方式中，寡核苷酸可包含适配体。在实施方式中，适配体为单链、部分单链、部分双链或双链核苷酸序列，该适配体能够通过除Watson-Crick碱基配对或三螺旋构造之外的机制特异性地识别选定的非寡核苷酸分子或成组的分子。适配体可包括但不限于：明确的序列片段和序列(包含核苷酸；核糖核苷酸；脱氧核糖核苷酸；核苷酸类似物；经修饰的核苷酸和包含主链修饰、分支点和非核苷酸残基、基团或桥的核苷酸)。选择用于与分子结合的适配体的方法是本领域众所周知的，并且本领域普通技术人员容易获得。包含适配体的寡核苷酸可具有任意长度，例如约1个核苷酸至约100个核苷酸、约5个核苷酸至约50个核苷酸、或约10个核苷酸至约25个核苷酸。通常，用于与核酸支架杂交的较长寡核苷酸可在经工程化的微生物表面结合结构域和基材之间产生更强的结合强度。
接头
在一些实施方式中，实体包含接头，例如连接实体的两个结构域的接头。在一些实施方式中，两个结构域是本文描述的结构域。在一些实施方式中，接头可直接或间接地连接至一个或多个微生物表面结合结构域。在一些实施方式中，接头还可不受限制地为一种或多种微生物、微生物物质和/或其它靶分子提供结合位点。在此类实施方式中，当微生物结合至微生物表面结合结构域时，接头上的微生物结合位点可结合至相同类型和/或种的微生物。可选地或额外地，接头上的微生物结合位点可捕获与结合至本文所述的微生物表面结合结构域的微生物不同类型和/或种的微生物。
接头可附着至实体的N-或C-末端(例如包含微生物表面结合结构域的实体)。此外，接头可直接或通过另一接头(例如具有1个、2个、3个4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个氨基酸的肽)连接至实体(例如包含微生物表面结合域的实体)。在一个实施方式中，接头附着至实体的N-末端(例如包含微生物表面结合结构域的实体)。
在一些实施方式中，接头包含核酸，例如DNA或RNA。
在一些实施方式中，接头可为任意长度的化学接头。在一些实施方式中，化学接头可包括：直接键或原子，例如氧或硫；单元，例如NH、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH；或原子的链，例如取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C5-C12杂芳基、取代或未取代的C5-C12杂环基、取代的或未取代的C3-C12环烷基，其中一个或多个亚甲基可被O、S、S(O)、SO2、NH或C(O)中断或终止。在一些实施方式中，化学接头可为聚合物链、支链或直链。
基材(例如用于使用本文的方法附着实体)
根据本公开，可使用许多类型的固体基材。在某些实施方式中，使用具有化学反应性表面(或可被活化以提供化学反应性表面的表面)的固体基材。在一个实施方式中，表面是光滑的。在其它实施方式中，表面不限于任意程度的表面粗糙度。在实施方式中，表面是多孔的。
在一些实施方式中，多孔固体基材具有适合低通量血液透析的较小孔径或适合高通量血液透析的较大孔径。在一些实施例中，多孔固体基材具有约为1-2nm、2-5nm、5-10nm、10-20nm、20-50nm、50-100nm、100-200nm、200-500nm或500-1000nm的平均孔径，或者约1-2μm、2-5μm、5-10μm、10-20μm、20-50μm或50-100μm的平均孔径。在一些实施方式中，基材中孔径的标准偏差小于平均孔径的约50％、20％、10％、5％、2％或1％。
在一些实施方式中，固体基材是可渗透的、例如半渗透的。在一些实施方式中，基材对水、肌酸、尿素、钾、磷酸盐、钠、氯化物、葡萄糖或其任意组合而言是可渗透的。在一些实施方式中，可渗透的固体基材对大小达到1、2、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000或20,000道尔顿的分子而言是可渗透的。在一些实施方式中，基材对β-2-微球蛋白(约11,600道尔顿)而言是可渗透的。在一些实施方式中，多孔固体基材对大小大于1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000或100,000道尔顿的分子而言是不可渗透的。在一些实施方式中，多孔固体基材对白蛋白(约66,400道尔顿)而言是不可渗透的。在一些实施方式中，多孔固体基材对细胞而言是不可渗透的。在一些实施方式中，多孔固体基材不包含直径大于约0.1、0.2、0.5、1、2或5微米的孔。在一些实施方式中，多孔固体基材不包含直径大于约0.5微米的孔。
在某些实施例中，固体基材可为光滑表面，例如在2013年1月10日提交的PCT申请号PCT/US2013/021056中描述的那些，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
固体基材的几何形状可为任意形状、形式或构造，以适应各种材料的构型。液体排斥表面可采取的形状、形式和构造的非限制性实例通常包括：球形(例如珠子)，管状(例如用于套管、连接器、导管、针、毛细管或注射器)，平面(例如用于施用至显微镜载玻片、平板、圆片、膜或实验室工作表面)，或任意形状(例如孔、孔板、培养皿、瓷砖、广口瓶、烧瓶、烧杯、小瓶、试管、柱、容器、比色皿、瓶子、鼓、大桶或槽)。固体基材可为柔的或刚性的。
固体基材材料可为能如本文所述进行改性的任意材料。许多固体基材材料是可商购的、或可通过本领域已知的各种制造技术制备。可如本文所述官能化的基材表面的非限制性实例包括例如：纤维素；改性纤维素，例如乙酸纤维素；玻璃；聚合物，例如聚砜、聚芳醚砜、聚苯乙烯、聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)、聚酰胺、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚对苯二甲酸二乙酯、聚氯乙烯、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈等；具有增塑剂的聚合物，如具有邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的聚氯乙烯等；金属；金属合金；准金属；纸张；塑料；各种形式的碳，如金刚石、石墨、富勒烯、石墨烯、碳纳米管、黑碳等；金属氧化物；准金属氧化物；非金属；非金属氧化物和其它陶瓷材料等。
此外，基材可采用如下形式：珠子(包含聚合物微珠、磁性微珠、超顺磁性微珠、超顺磁性纳米粒子等)，过滤器，纤维，筛，网，纤维，中空纤维，支架，板，通道，通常以测试形式使用的其它基材，及其任意组合。基材的实例可包括但不限于：微粒或微珠，纳米管，医疗装置(例如针或导管)或植入物，微芯片，过滤装置或膜，中空纤维反应器，微流体装置，体外装置和混合元件(例如叶轮或混合器)。
基材可由任意材料(例如与待处理的流体相容的任意材料)制成。例如，基材可由本领域已知的任意生物相容性材料制成，例如但不限于聚砜、聚丙烯、聚苯乙烯、金属、金属合金、聚合物、塑料、玻璃、织物、水凝胶及其任意组合。
在某些环境中，选择固体基材以与装置的预期用途相容。例如，在诸如医疗装置的医疗应用中，在实施方式中，基材材料符合FDA关于安全性和生物相容性的标准。
合适的基材材料可含有处于其天然形式的反应性表面部分，或可被处理以提供合适的反应性部分用于与表面处理化合物连接。示例性的反应性表面部分包含含氧的表面基团(如氧化物、氢氧化物、羧基、羰基、苯酚、环氧基团、醌和内酯基团等)，含氮的表面基团(如氨基、C＝N基团、叠氮化物、酰胺、腈基、吡咯样结构等)，含硫部分(如硫醇等)，以及含活性碳的表面基团(如炔烃和烯烃)。
可对基材进行处理以活化基材并使其可适于使用一种或多种活化技术进行改性。示例性的基材处理包括：酸或碱(例如氢氧化钠)处理；氧化、氨化、等离子体(例如如本文所述)、加热、离子、电子、电磁、光子(如紫外光诱导的接枝，诸如引入引发剂如二苯甲酮，随后在接枝位点处引发官能团或聚合物的聚合作用)、微波处理；及其任意组合。在一些实施方式中，使基材经受等离子体处理和第二活化步骤。
在一些实施方式中，固体基材可为粗糙表面。在某些实施方式中，固体基材可为多孔基材。一些合适的粗糙或多孔基材在2012年1月19日提交的PCT申请号PCT/US2012/21928中描述，通过引用的方式将其内容整体并入本文。
在一些实施方式中，固体基材是柔性的，例如用于医学应用中的柔性管。在某些实施方式中，固体基材可为经交联的聚合物。例如，基材可为柔性PDMS、或柔性PVC(例如柔性PVC管)。
在一些实施方式中，基材或包含基材的装置包含被有机溶剂损坏或降解的材料。例如，基材或包含基材的装置可包含：聚氨酯，聚碳酸酯，聚氯乙烯，聚二甲基硅氧烷，聚乙烯吡咯烷酮，灌封化合物(potting compounds)，聚丙烯，聚乙烯，聚对苯二甲酸二乙酯，聚甲基丙烯酸甲酯，橡胶，尼龙，聚砜，聚醚砜，聚芳醚砜，乙酸纤维素，热塑性弹性体，环氧树脂。在一些实施方式中，本文的方法避免使用有机溶剂，并因此不会损坏或降解这些材料。
在一些实施方式中，基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的聚苯乙烯(例如不包含聚苯乙烯)。在一些实施方式中，基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的PLGA(例如不包含PLGA)。在一些实施方式中，基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的硅酮(例如PDMS)(例如不包含硅酮(如PDMS))。在一些实施方式中，基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的聚氨酯或聚氨酯共聚物(例如不包含聚氨酯或聚氨酯共聚物)。
在一些实施方式中，基材是可灭菌和可高压灭菌的(例如具有高于100℃、110℃、120℃、130℃、140℃或150℃的玻璃化转变温度)。可灭菌和可高压灭菌的基材的实例包括聚砜(其玻璃化转变温度高于150℃)和相关聚合物。相比之下，聚苯乙烯的玻璃化转变温度为100℃。
在一些实施方式中，基材包含包括混合元件的装置、附着于包括混合元件的装置或位于包括混合元件的装置中。混合元件可为促进流体混合(例如用于增加与缀合在基材上的实体的接触)的结构部件。混合元件可适用于低剪切混合或高剪切混合。在一些实施方式中，混合元件可包含叶轮。在一些实施方式中，混合元件可包含混合器，例如螺旋混合器或静态混合器。
在一些实施方式中，基材包含包括设置在流动管道中的多个杆或柱的装置、附着于包括设置在流动管道中的多个杆或柱的装置或位于包括设置在流动管道中的多个杆或柱的装置中，所述杆或柱干扰流体的流动。
等离子体和等离子体发生器
在一些实施方式中，所使用的等离子体发生器是电容耦合等离子体发生器，例如来自Diener的Model Nano。等离子体发生器可使用13.56MHz的射频。在实施方式中，等离子体发生器包含在其中产生等离子体的腔室。等离子体发生器腔室可具有适合于将一个或多个基材暴露至等离子体的尺寸。
在一些实施方式中，在处理基材之前清洁等离子体发生器或其一部分，例如等离子体发生器腔室。在一些实施方式中，该清洁包括空腔室的循环(例如低于约0.3、0.2、0.15、0.14、0.1、0.05或0.01mbar的真空)。在实施方式中，清洁包括输入气体(例如O2气体)的步骤(例如在约0.2、0.25、0.26、0.3、0.35或0.4mbar的压力下)。然后可从气体(例如O2气体)产生等离子体。可产生等离子体例如至少5、10、15、20、25、30、45或60分钟。等离子体能够以例如30％、40％、50％、60％、70％的功率产生。
在一些实施方式中，等离子体发生器腔室的清洁包括化学清洁，例如Cras等，“Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation forsilanization”Biosensors&Bioelectronics 14(1999)683-688中所述。在实施方式中，清洁步骤使用/具有酸和/或过氧化物。在实施方式中，清洁步骤使用温和蚀刻(例如使用碱或稀释的氢氟酸)。
在一些实施方式中，在即将进行等离子体处理之前，将基材暴露至诸如CO2的气体(例如当基材在腔室内时)。例如，基材可暴露至将用于产生等离子体的相同气体。在实施方式中，将基材暴露至气体至少约1、2、3、4、5或10分钟。根据本文的非限制性理论，该处理可使PGM更均匀地分布在基材上。
在一些实施方式中，用于产生PGM的等离子体是CO2、O2、N2或NH4等离子体。虽然不希望受理论的束缚，但在一些实施方式中，CO2等离子体比O2等离子体更快地产生PGM(例如羧基部分)，使得等离子体处理步骤更短。在一些实施方式中，等离子体处理步骤小于约10、5、4、3、2或1分钟。在一些实施方式中，等离子体处理步骤小于约50、40、30、20或10秒。在一些实施方式中，等离子体处理步骤约为1、2、3、4、5或10分钟。
偶联反应条件
本部分描述了将实体偶联至等离子体产生部分(例如在固体基材上)的各种合适方式。在一些实施方式中，使用活化部分。
活化部分可用于活化待缀合在一起的组分(例如将实体缀合至固体基材)。可使用用于缀合活化的任意合适的方法和/或试剂，包括本领域已知的方法和/或试剂。示例性的活化部分包括但不限于：1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC或EDAC)，羟基苯并三唑(HOBT)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，2-(1H-7-氮杂苯并三唑)-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯甲基胺(HATU)，N，N′-二异丙基碳二亚胺，N，N′-二环己基碳二亚胺，磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨酸酯，磺酰氯，NHS酯，氟苯酯，氟苯，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，卤代乙酰基(halacetyl)，吡啶基二硫化物，烷氧基胺，双吖丙啶(diazerine)，高碘酸盐，硅烷化，通过等离子体处理的表面活化等。在一个实施例中，用EDC将微生物结合分子(例如FcMBL)缀合至固体基材表面。
在一些实施方式中，反应混合物包含根据下表3的交联剂。
可将任意的反应性基团、包含本领域已知的那些用于偶联。例如可将各种表面反应性基团用于表面偶联，包括但不限于：烷基卤、醛、叠氮化物、氨基、溴或碘乙酰基、羧基、炔烃、烯烃、羟基、环氧基团、酯、硅烷、硫醇等。
在一些实施方式中，偶联反应在缓冲液中进行。示例性缓冲液包括：2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)，哌嗪-N，N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)，N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸(ACES)，3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，N-(2-乙酰氨基)-2-亚氨基二乙酸(ADA)，3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，N，N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)，2-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙烷-2-基]氨基]乙磺酸(TES)，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)，N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)，N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)，3-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸(HEPPS)、硼酸盐、乙酸盐、碳酸盐和磷酸盐。
在一些实施方式中，本文中的方法允许避免使用交联剂，例如异氰酸酯、戊二醛、甲醛、过氧化物、鏻或表3的一类交联剂：
表3交联剂
因此，在一些实施方式中，本文中的方法不包括使基材或实体与交联剂(例如异氰酸酯、戊二醛、甲醛、过氧化物、鏻或表3的交联剂)接触。同样地，在一些实施方式中，本发明中的组合物含有少于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂，所述交联剂如异氰酸酯、戊二醛、甲醛、过氧化物、鏻或表3的交联剂。
掩蔽实体
在实施方式中，本文中的组合物和方法涉及掩蔽实体。不受理论的限制，掩蔽实体可结合至实体(例如调理素、例如MBL、例如FcMBL)，并通过对反应物掩蔽至少一部分实体来帮助实体保留活性(例如活化部分、交联剂或自由基)。在一些实施方式中，掩蔽实体结合至实体(例如多肽)的活性位点或结合表面。掩蔽实体可包含例如二价离子、例如钙。掩蔽实体还可包含例如糖、例如葡萄糖。掩蔽实体可包括多肽、核酸(例如DNA或RNA)、脂质、碳水化合物或小分子。
在一些实施方式中，掩蔽实体包括国际申请WO2014144325中描述的封闭剂，以引用的方式将其整体并入本文。
基于糖的掩蔽实体的实例包含但不限于：己糖(例如葡萄糖)，麦芽糖，甘露糖，N-乙酰基-胞壁酸，氨基糖(例如半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸、N-乙酰葡糖胺)，磺基糖(例如磺基奎诺糖)，海藻糖，纤维二糖，乳糖，乳果糖，蔗糖，低聚果糖，纤维素，几丁质或其任意组合。在一些实施方式中，基于糖的封闭剂可为葡萄糖、麦芽糖、N-乙酰基-胞壁酸或其任意组合。在一个实施方式中，基于糖的封闭剂可包含葡萄糖。在一个实施方式中，基于糖的封闭剂可包含甘露糖。
用途，例如用于血液透析或血液滤过
通过本文所述方法制备的基材可用于捕获靶部分的装置中/用作捕获靶部分的装置，例如液体中的可溶或悬浮靶部分。靶部分的非限制性实例包括微生物和/或微生物物质，其可任选地存在于体液中(例如血液中)。在一个实施方式中，所述装置可结合或捕获至少一种靶部分，例如完整的微生物和/或微生物物质。
在一个方面，该装置用于捕获微生物、微生物物质和/或靶分子，其包括：(i)具有入口和出口的腔室，(ii)设置在腔室中入口和出口之间的至少一个捕获元件，其中捕获元件在其表面上具有至少一个实体，例如本文所述的微生物结合分子。腔室可具有例如圆形、矩形、正方形、椭圆形、三角形、多边形或任意不规则形状的横截面。
在一些实施方式中，本文描述的装置可整合入分流系统或适于连接至分流系统。分流系统可包含第一末端(例如用于收集诸如血液的流体)和第二末端(例如用于将经过滤的流体、如血液返回至患者)。在这样的实施方式中，流过装置的流体可具有结合至实体(例如微生物结合分子)的任意微生物(如果存在)，并在返回至患者之前进行过滤。该装置可设计成便携式的(例如用于诸如军事现场应用的紧急应用)。可将标准分流器插入颈静脉或股静脉中，伴随有附着至分流器的装置。该装置可为一次性的，使得患者可定期更换装置以保持微生物捕获效率，直到他/她被运送到医院进行治疗。
在一些实施方式中，所述装置是血液透析装置，具有对所讨论的溶质而言的膜渗透系数K0和膜面积(A)。透析器效率通常表示为K0A-渗透系数和面积的乘积。在一些实施方式中，本文所述的透析器具有0.3至2.2平方米、例如0.8-2.2平方米的膜表面积，并且K0A的值的范围约为500至1500mL/min。以mL/min表示的K0A可被认为是在非常高的血液和透析液流速下的透析器的最大清除率。
可通过根据本公开改性的基材选择性结合的细菌的非限制性实例包括选自于由下列所组成的组中的属的成员：放线杆菌属(例如伴放线放线杆菌，Actinobacillusactinomycetemcomitans)，不动杆菌属(例如鲍氏不动杆菌，Acinetobacter baumannii)，气单胞菌属(Aeromonas)，博德特氏菌属(Bordetella)(例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)以及副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis))，短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，布鲁氏菌属(Brucella)，拟杆菌属(Bacteroides)(例如脆弱拟杆菌，Bacteroidesfragilis)，伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)(例如洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderiacepacia)和类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei))，疏螺旋体属(Borelia)(例如伯氏疏螺旋体，Borelia burgdorferi)，芽孢杆菌属(Bacillus)(例如炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，弯曲杆菌(Campylobacter)(例如空肠弯曲杆菌，Campylobacter jejuni)，嗜二氧化碳噬细胞菌属(Capnocytophaga)，心杆菌属(Cardiobacterium)(例如人心杆菌，Cardiohacteriumhominis)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，梭菌属(Clostridium)(例如破伤风芽孢梭菌(Clostridium tetani)或艰难梭菌(Clostridium difficile))，衣原体属(Chlamydia)(例如沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)以及鹦鹉热衣原体(Chlamydia psiffaci))，艾肯氏菌属(Eikenella)(例如啮蚀艾肯氏菌，Eikenella corrodens)，肠杆菌属(Enterobacter)，肠球菌属(Enterococcus)，埃希氏菌属(Escherichia)(例如大肠杆菌，Escherichia coli)，弗朗西斯氏菌属(Francisella)(例如土拉热弗朗西斯氏菌，Francisella tularensis)，梭杆菌属(Fusobacterium)，黄质菌属(Flavobacterium)，嗜血杆菌属(Haemophilus)(例如杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)或流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))，螺杆菌属(Helicobacter)(例如幽门螺杆菌，Helicobacter pylori)，金氏菌属(Kingella)(例如金氏金氏菌，Kingellakingae)，克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)(例如肺炎克雷伯氏杆菌，Klebsiellapneumoniae)，乳酸菌属(Lactobacillus)，军团杆菌属(Legionella)(例如嗜肺性军团杆菌，Legionella pneumophila)，李斯特菌属(Listeria)(例如单核细胞增多性李斯特菌，Listeria monocytogenes)，细螺旋体属(Leptospirae)，莫拉克斯氏菌属(Moraxella)(例如卡他莫拉菌，Moraxella catarrhalis)，摩根氏菌属(Morganella)，支原体属(Mycoplasma)(例如人型支原体(Mycoplasma hominis)和肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae))，分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)或麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae))，奈瑟氏菌属(Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis))，诺卡氏菌(Nocardia)，巴斯德氏菌属(Pasteurella)(例如多杀性巴斯德氏菌，Pasteurella multocida)，变形杆菌属(Proteus)(例如普通变形杆菌(Proteusvulgaris)和奇异变形杆菌(Proteus mirablis))，普雷沃氏菌属(Prevotella)，邻单胞菌属(Plesiomonas)(例如类志贺邻单胞菌，Plesiomonas shigelloides)，假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌，Pseudomonas aeruginosa)，普罗威登斯菌属(Providencia)，立克次氏体属(Rickettsia)(例如立氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)和斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi))，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(例如嗜麦芽寡养单胞菌，Stenotrophomonas maltophila)，葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))，链球菌属(Streptococcus)(例如草绿色链球菌(Streptococcus viridans)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A群)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(B组)、牛链球菌(Streptococcus bovis)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))，链霉菌属(Streptomyces)(例如吸水链霉菌，Streptomyces hygroscopicus)，沙门氏菌属(Salmonella)(例如肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))，沙雷氏菌属(Serratia)(例如粘质沙雷氏菌，Serratiamarcescens)，志贺氏杆菌属(Shigella)，螺菌属(Spirillum)(例如小螺菌，Spirillumminus)，密螺旋体属(Treponema)(例如梅毒螺旋体，Treponema pallidum)，韦荣球菌属(Veillonella)，弧菌属(Vibrio)(例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)以及创伤弧菌(Vibrio vulnificus))，耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)以及假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis))，黄单胞菌属(Xanthomonas)(例如嗜麦芽黄单胞菌，Xanthomonas maltophilia)及其组合。
根据本公开改性的基材可选择性地结合各种类型的真菌。通过改性表面选择性结合的真菌的非限制性实例包括以下的属的成员：曲霉属(Aspergillus)(例如黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)以及土曲霉(Aspergillus terreus))，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，念珠菌属(Candida)(例如白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candidakrusei)和Candida gillermondii)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，隐球菌属(Cryptococcus)(例如新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、浅白隐球菌(Cryptococcus albidus)以及罗伦隐球菌(Cryptococcus laurentii))，镰刀菌属(Fusarium)，荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasma capsulatum var.capsulatum)，荚膜组织胞浆菌杜波氏变种(Histoplasma capsulatum var.duboisii)，毛霉菌属(Mucor)，巴西芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)，肺囊虫(Pneumocystis)，酵母菌(Saccharomyces)，申克孢子丝菌(Sporothrix schenckii)，伞枝犁头霉(Absidiacorymbifera)；微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)，无根根霉(Rhizopus arrhizous)及其组合。
根据本公开改性的基材还可选择性地结合各种类型的病毒和病毒样颗粒。在一个或多个实施方式中，由这些表面选择性结合的病毒选自于由如下所组成的组：dsDNA病毒，ssDNA病毒，dsRNA病毒，(+)ssRNA病毒，(-)ssRNA病毒，ssRNA-RT病毒，dsDNA-RT病毒及其组合。由根据本公开改性的表面排斥和/或选择性结合的病毒的非限制性实例包括：巨细胞病毒(CMV)，登革热病毒，埃巴病毒，汉坦病毒，人嗜T淋巴细胞缺陷病毒(HTLV I/II)，细小病毒，肝炎病毒(例如甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎病毒)，人乳头状瘤病毒(HPV)，人类免疫缺陷病毒(HIV)，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，呼吸道合胞病毒(RSV)，水痘带状疱疹，西尼罗河病毒，埃博拉病毒，寨卡，疱疹，脊髓灰质炎，天花，黄热病病毒，鼻病毒，冠状病毒，正粘病毒(流感病毒)(例如流感病毒A型、流感病毒B型、流感病毒C型、鲑鱼传染性贫血病毒(Isavirus)和托高土病毒)，以及它们的组合。
在另一实施方式中，根据本公开改性的基材能够选择性地结合处于悬浮液或溶液中的颗粒，而不会引起表面粘附、表面介导的凝块形成、凝结、结垢或聚集。悬浮液或溶液中的颗粒的非限制性实例包括：细胞(例如正常细胞、患病细胞、寄生细胞、癌细胞、外源细胞、干细胞和感染细胞)，微生物(例如病毒、病毒样颗粒、细菌、噬菌体)，蛋白质和细胞成分(例如细胞器、细胞碎片、细胞膜、外泌体、细胞膜碎片、病毒、病毒样颗粒、噬菌体、细胞溶质蛋白、分泌蛋白、信号分子、嵌入蛋白、核酸/蛋白质复合物、核酸沉淀剂、染色体、细胞核、线粒体、叶绿体、鞭毛、生物矿物质、蛋白质复合物和微细胞)。
用于例如测试和诊断的用途
在一些实施方式中，本文描述的装置(例如根据本文中的方法制备的装置)用于诊断(例如诊断败血症或传染病)。在实施方式中，所述装置包含附着至实体的固体基材，其中所述实体结合微生物或微生物物质。在一些实施方式中，通过等离子体处理固体基材，使固体基材与实体接触，使固体基材与生物样品接触，并确定生物样品中的微生物是否结合至实体来产生诊断装置。诊断方法或系统还可包含可检测标记物。
在一些方面，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含：附着(例如共价附着)至实体(如微生物靶向分子)的固体基材(例如未标记的微生物靶向分子，如包含凝集素或其碳水化合物结合部分的分子，例如包含MBL、例如FcMBL的分子)；以及缀合至微生物特异性的靶向剂的可检测标记物。
在一些方面，本公开提供了一种检测微生物或微生物物质的方法，包含使微生物或微生物物质与如下接触：附着至微生物靶向分子(例如未标记的微生物靶向分子，如包含凝集素或其碳水化合物结合部分的分子，例如包含MBL、例如FcMBL的分子)的固体基材，以及缀合至微生物或微生物物质特异性的靶向剂的可检测标记物。
在一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：微生物或微生物物质；附着至微生物靶向分子(例如未标记的微生物靶向分子，如包含凝集素或其碳水化合物结合部分的分子，例如包含MBL、例如FcMBL的分子)的固体基材；以及缀合至微生物特异性的靶向剂的可检测标记物。
在本文的试剂盒、方法和组合物的一些实施方式中，可检测标记物包含酶。在一些实施方式中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)。在一些实施方式中，对微生物特异性的靶向剂包含经工程化的微生物靶向分子、抗体分子、凝集素或MBL(例如人MBL)。在实施方式中，通过本文描述的方法(例如包括基材的等离子体处理的方法)，将固体基材附着至微生物靶向分子。在实施方式中，附着至微生物靶向分子的固体基材是本文所述的组合物(例如包含很少或不包含交联剂、如硅烷)。在一些实施方式中，试剂盒或组合物或所述方法还包含使酶与酶的基材接触，例如TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)。
本文描述的试剂盒的任意方面的一些实施方式可进一步包含另外的试剂。例如，在一些未标记实体(例如附着至基材的微生物靶向分子)的实施方式中，试剂盒可进一步包含缀合至微生物特异性的靶向剂的一种或多种可检测标记物(例如不受限制地，经工程化的微生物靶向分子或其片段的一种或多种实施方式、对至少一种微生物特异性的抗体分子(例如对革兰氏阳性微生物特异性的抗体分子(例如抗LTA抗体分子)、对革兰氏阴性微生物特异性的抗体分子(例如抗LPS抗体分子)、或对真菌特异性的抗体分子及其任意组合)。使用对缀合至可检测标记物的微生物特异性的另外的靶向剂不仅可促进微生物或病原体的检测，还可增加微生物或病原体的检测的特异性。
在本文中提供的试剂盒的任意方面，当可检测标记物包含酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和适合于比色检测的任意其它酶)时，试剂盒可进一步包含含有酶基材的一个或多个容器，该容器在酶的存在下产生颜色变化。本领域技术人员可容易地识别用于比色检测的任意的本领域公认的酶的合适的酶基材。仅举例来说，碱性磷酸酶的示例性基材可包括：BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/硝基蓝四唑)或PNPP(对硝基苯基磷酸酯)；并且辣根过氧化物酶的示例性基材可包括TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)。
在一些实施方式中，本文描述的诊断装置提供超过3、5、10、100、1000、10,000、100,000或1,000,000的信噪比。
可检测的标记物包括可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任意组合物。合适的标记物包括荧光分子、放射性同位素、核苷酸发色团、酶、底物、化学发光部分、生物发光部分等。标记物可为通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法可检测的组合物。
可使用多种荧光报告染料。通常，荧光团是芳族或杂芳族化合物，并且可为芘、蒽、萘、吖啶、芪、吲哚、苯并吲哚、噁唑、噻唑、苯并噻唑、青色素、羰花青、水杨酸盐/酯、邻氨基苯甲酸盐/酯、香豆素、荧光素、罗丹明或其它类似化合物。
示例性荧光团包括但不限于：1，5IAEDANS；1，8-ANS；4-甲基伞形酮；5-羧基-2，7-二氯荧光素；5-羧基荧光素(5-FAM)；5-羧基萘基荧光素(pH 10)；5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)；5-FAM(5-羧基荧光素)；5-羟色胺(HAT)；5-ROX(羧基-X-罗丹明)；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明)；6-羧基罗丹明6G；6-CR 6G；6-JOE；7-氨基-4-甲基香豆素；7-氨基放线菌素D(7-AAD)；7-羟基-4-甲基香豆素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶；ABQ；酸性品红；ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)；吖啶橙；吖啶红；吖啶黄；锥虫黄；Acriflavin Feulgen SITSA；水母发光蛋白(发光蛋白)；Alexa Fluor 350；Alexa Fluor 430；Alexa Fluor 488；AlexaFluor 532；Alexa Fluor 546；Alexa Fluor 568；Alexa Fluor 594；Alexa Fluor 633；Alexa Fluor 647；Alexa Fluor 660；Alexa Fluor 680；茜素氨羧络合剂；茜素红；别藻蓝蛋白(APC)；AMC，AMCA-S；AMCA(氨甲基香豆素)；AMCA-X；氨基放线菌素D；氨基香豆素；苯胺蓝；硬脂酸蒽(Anthrocyl stearate)；APC-Cy7；APTS；阳离子艳红4G(Astrazon BrilliantRed 4G)；碱性橙R；碱性红6B；阳离子黄7GLL；疟涤平；ATTO-TAG CBQCA；ATTO-TAG FQ；金胺；Aurophosphine G；Aurophosphine；BAO 9(双氨基苯基噁二唑)；BCECF(高pH)；BCECF(低pH)；硫酸小檗碱；β-内酰胺酶；BFP蓝移GFP(Y66H)；BG-647；Bimane；双苯甲酰胺；布兰科福尔FFG；布兰科福尔SV；BOBO-1；BOBO-3；氟硼二吡咯492/515；氟硼二吡咯493/503；氟硼二吡咯500/510；氟硼二吡咯505/515；氟硼二吡咯530/550；氟硼二吡咯542/563；氟硼二吡咯558/568；氟硼二吡咯564/570；氟硼二吡咯576/589；氟硼二吡咯581/591；氟硼二吡咯630/650-X；氟硼二吡咯650/665-X；氟硼二吡咯665/676；氟硼二吡咯F1；氟硼二吡咯FLATP；氟硼二吡咯F1-神经酰胺；氟硼二吡咯R6G SE；氟硼二吡咯TMR；氟硼二吡咯TMR-X缀合物；氟硼荧TMR-X，SE；氟硼荧TR；氟硼二吡咯TRATP；氟硼二吡咯TR-X SE；BO-PRO-1；BO-PRO-3；Brilliant Sulphoflavin FF；钙黄绿素；钙黄绿素蓝；钙深红；钙绿；钙绿-1Ca2+染料；钙绿-2Ca2+；钙绿-5N Ca2+；钙绿-C18Ca2+；钙橙；Calcofluor White；羧基-X-罗丹明(5-ROX)；级联蓝；级联黄；儿茶酚胺；CFDA；CFP(青色荧光蛋白)；叶绿素；色霉素A；色霉素A；CMFDA；腔肠素；腔肠素cp；腔肠素f；腔肠素fcp；腔肠素h；腔肠素hcp；腔肠素ip；腔肠素O；香豆素鬼笔环肽；CPM甲基香豆素；CTC；Cy2；Cy3.1 8；CY3.5；Cy3；Cy5.1 8；Cy5.5；Cy5；Cy7；青色GFP；环AMP荧光传感器(FiCRhR)；d2；Dabcyl；丹酰基；丹酰胺；丹酰尸胺；丹酰氯；丹酰DHPE；丹酰氟；DAPI；Dapoxyl；Dapoxyl 2；Dapoxyl 3；DCFDA；DCFH(二氯二氢荧光黄双乙酸盐)；DDAO；DHR(二氢罗丹明123)；Di-4-ANEPPS；Di-8-ANEPPS(非比例)；DiA(4-Di-16-ASP)；DIDS；二氢罗丹明123(DHR)；DiO(DiOC 18(3))；DiR；DiR(DiIC18(7))；多巴胺；红色荧光蛋白；DTAF；DY-630-NHS；DY-635-NHS；EBFP；ECFP；EGFP；ELF 97；伊红；赤藓红；赤藓红ITC；溴乙啡锭二聚体-1(EthD-1)；吖啶橙(Euchrysin)；氯化铕(111)；铕；EYFP；坚牢蓝；FDA；Feulgen(副品红)；FITC；FL-645；Flazo Orange；Fluo-3；Fluo-4；荧光素二乙酸酯；Fluoro-Emerald；荧光金(羟脒草替)；Fluor-Ruby；FluorX；FM 1-43.TM；FM 4-46；Fura Red(高pH)；Fura-2(高钙)；Fura-2(低钙)；Genacryl Brilliant Red B；Genacryl Brilliant Yellow 10GF；Genacryl Pink 3G；Genacryl Yellow 5GF；GFP(S65T)；GFP红移(rsGFP)；非紫外激发的GFP野生型(wtGFP)；紫外激发的GFP野生型(wtGFP)；GFPuv；Gloxalic Acid；粒状蓝；血卟啉；Hoechst 33258；Hoechst 33342；Hoechst 34580；HPTS；羟基香豆素；羟脒草替(荧光金)；羟色胺；吲哚二碳菁(DiD)；吲哚三碳菁(DiR)；Intrawhite Cf；JC-1；JO-JO-1；JO-PRO-1；LaserPro；Laurodan；LDS 751；Leucophor PAF；Leucophor SF；Leucophor WS；丽丝胺罗丹明；丽丝胺罗丹明B；LOLO-1；LO-PRO-1；萤光黄；Mag Green；麦塔喇红(根皮红B)；镁绿；镁橙；孔雀绿；海蓝；Maxilon Brilliant Flavin 10GFF；Maxilon Brilliant Flavin 8GFF；Merocyanin；甲氧基香豆素；Mitotracker Green FM；Mitotracker Orange；MitotrackerRed；光神霉素；溴二胺(Monobromobimane)；溴二胺(mBBr-GSH)；单氯二胺；MPS(甲基绿焦宁芪)；NBD；NBD胺；尼罗红；硝基苯并噁二唑(Nitrobenzoxadidole)；去甲肾上腺素；核坚牢红；核黄；Nylosan Brilliant lavin E8G；俄勒冈绿TM；俄勒冈绿488-X；俄勒冈绿488；俄勒冈绿500；俄勒冈绿514；太平洋蓝；副品红(Feulgen)；PE-Cy5；PE-Cy7；PerCP；PerCP-Cy5.5；PE-得克萨斯红(613红)；根皮红B(麦塔喇红)；Phorwite AR；Phorwite BKL；Phorwite Rev；Phorwite RPA；膦3R；光致抗蚀剂；藻红蛋白B[PE]；藻红蛋白R[PE]；PKH26；PKH67；PMIA；Pontochrome Blue Black；POPO-1；POPO-3；PO-PRO-1；PO-PRO-3；樱草灵；普施安黄；碘化丙啶(PI)；PyMPO；芘；焦宁；焦宁B；Pyrozal Brilliant Flavin 7GF；QSY 7；芥子喹吖因；试卤灵；RH 414；Rhod-2；罗丹明；罗丹明110；罗丹明123；罗丹明5GLD；罗丹明6G；罗丹明B 540；罗丹明B 200；碱性玫瑰精；罗丹明BB；罗丹明BG；罗丹明绿；Rhodamine Phallicidine；罗丹明鬼笔环肽；罗丹明红；罗丹明WT；玫瑰红；R-藻红蛋白(PE)；红移GFP(rsGFP，S65T)；S65A；S65C；S65L；S65T；蔚蓝GFP；血清素；Sevron Brilliant Red 2B；Sevron Brilliant Red4G；Sevron Brilliant Red B；Sevron Orange；Sevron Yellow L；sgBFP.TM；sgBFP(超发光BFP)；sgGFP；sgGFP(超发光GFP)；SITS；SITS(樱草灵)；SITS(二苯乙烯异硫代磺酸)；SPQ(6-甲氧基-N-(3-磺丙基)-喹啉)；二苯乙烯；磺酰罗丹明B can C；磺酰罗丹明G Extra；四环素；四甲基罗丹明；德克萨斯红；德克萨斯红-X缀合物；硫二羰花青(DiSC3)；噻嗪红R；噻唑橙；硫磺素5；硫磺素S；硫磺素TCN；Thiolyte；噻唑橙(Thiozole Orange)；Tinopol CBS(Calcofluor White)；TMR；TO-PRO-1；TO-PRO-3；TO-PRO-5；TOTO-1；TOTO-3；TriColor(PE-Cy5)；TRITC(四甲基罗丹明异硫氰酸酯)；不褪色的蓝色；不褪色的红色；UltraLite；荧光素钠B；Uvitex SFC；wt GFP；WW 781；XL665；X-罗丹明；XRITC；二甲苯橙；Y66F；Y66H；Y66W；黄色GFP；YFP；YO-PRO-1；YO-PRO-3；YOYO-1和YOYO-3。这些荧光化合物的许多合适形式是可获得并且可使用的。
其它示例性的可检测的标记物包含发光、化学发光、电化学发光和生物发光标志物，例如生物素、荧光素酶(例如细菌、萤火虫、磕头虫等)、荧光素和水母发光蛋白、放射性标记物(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如半乳糖苷酶、葡萄糖醛酸酶(glucorinidases)、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)、过氧化物酶(例如辣根过氧化物酶)和胆碱酯酶)和量热标记物(例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯和乳胶)珠)。教导这种标记物的使用的专利包括U.S.Pat.Nos.3,817,837，3,850,752，3,939,350，3,996,345，4,277,437，4,275,149和4,366,241，以引用的方式将其各自并入本文。在一些实施方式中，可检测的标记物是荧光团或量子点。
检测这种标记物的方法是本领域技术人员公知的。示例性的检测方法包括但不限于：光谱法、荧光法、显微镜成像、伏安法、免疫测试等。因此，例如可使用照相胶片或闪烁计数器检测放射性标记物、可使用光检测器检测荧光标志物以检测发射的光。可检测酶标记物，例如通过向酶提供酶基材并检测由酶基材上的酶的作用产生的反应产物，并且可通过使有色标记物可视化来检测比色标记物。在一些实施方式中，通过使用一种或多种酶测试法、例如酶联测试法(ELISA)检测微生物或微生物物质。可使用许多酶测试法来提供检测。此类酶测试的实例包含但不限于：β-半乳糖苷酶测试，过氧化物酶测试，过氧化氢酶测试，碱性磷酸酶测试等。在一些实施方式中，酶测试可进行配置，以使酶催化涉及酶基材的反应，该反应产生荧光产物。另外，可通过自动图像采集和分析来进行成像分析。
在一些实施方式中，可检测标记物可为“智能标记物”，当其缀合至实体(例如包含微生物结合分子的实体)时是不可检测的，但在微生物酶的存在下，当从经工程化的分子释放时产生颜色变化。因此，当微生物结合至经工程化的微生物结合分子时，微生物释放酶，该酶从经工程化的分子释放可检测标记物。观察到颜色变化表明样品中存在微生物。
在一些实施方式中，基材或附着至其的实体可缀合至标记物、例如可检测标记物。
在一些实施方式中，可检测标记物缀合至野生型微生物结合分子(例如MBL、如人MBL)或本文所述的微生物结合分子。在一些实施方式中，标记分子包含FcMBL。不希望受理论的束缚，基于本文所述的微生物结合分子的标记分子和MBL(例如FcMBL)选择性附着至大范围的微生物，因此它们使得本文所述的方法能够具有高灵敏度和特异性地检测大部分血源性微生物。
在一些实施方式中，酶联测试(ELISA)可用于检测来自标记分子的信号。在ELISA中，标记分子可包含酶作为可检测标记物。每个标记分子可包含一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)酶。另外，每个标记分子可包含用于与微生物结合的一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)位点。
对于ELISA，可使用缀合至酶的任意标记分子。示例性的标记分子包括包含本文所述的微生物结合分子的示例性标记分子。其它示例性标记分子包括包含MBL(例如人MBL)、FcMBL、AKT-FcMBL、小麦胚芽凝集素、凝集素、抗体分子(例如革兰氏阴性抗体分子或革兰氏阳性抗体分子)、抗体的抗原结合片段、适配体、细胞表面受体的配体(激动剂或拮抗剂)等的标记分子。在一些实施方式中，标记分子包括用可检测标记物(例如酶、如辣根过氧化物酶)标记的MBL或FcMBL。
类似地，可随着比色或荧光基材使用多种酶。在一些实施方式中，报告子-酶产生量热变化，该变化可作为特定波长的光吸收来测定。示例性的酶包括但不限于：β-半乳糖苷酶，过氧化物酶，过氧化氢酶，碱性磷酸酶等。在一些实施方式中，酶是辣根过氧化物酶(HRP)或碱性过氧化物酶(AP)。
微生物结合分子和酶可通过接头彼此连接。在一些实施方式中，微生物结合分子和酶之间的接头是酰胺键。在一些实施方式中，微生物结合分子和酶之间的接头是二硫(S-S)键。在一些实施方式中，当微生物结合分子是肽、多肽或蛋白质时，酶可在微生物结合分子的N-末端、C-末端或内部位置连接。类似地，酶可通过其N-末端、C-末端或内部位置连接。
在一个实施方式中，ELISA探针分子可包含连接到HRP的FcMBL分子、或者MBL或其部分。HRP与任意蛋白质和抗体分子的缀合是本领域已知的。在一个实施方式中，通过使用任意的可商购的HRP缀合试剂盒将HRP直接偶联至FcMBL来产生FcMBL-HRP构建体。在一些实施方式中，从包含实体的基材分离或保持结合在包含实体的基材上的微生物可与HRP标记的微生物结合分子(例如连接到HRP的FcMBL分子或者MBL或其部分)一起孵育一段时间(例如至少约5分钟、至少约10分钟、至少约15分钟、至少约20分钟、至少约25分钟、至少约30分钟)。ELISA测试中使用的HRP标记分子的典型浓度可为约1∶500至约1∶20,000稀释度，在一个实施方式中，HRP标记的微生物结合分子(例如连接到HRP分子的FcMBL分子或者MBL或其部分)的浓度可为约1∶1000至约1∶10000稀释度。
通过使识别分子(例如微生物结合分子)多聚化或通过使检测酶(HRP等)多聚化，可获得ELISA信号的进一步放大。例如噬菌体表达可用于产生多聚化的MBL并提供支架以增加HRP的浓度，通过HRP与噬菌体颗粒的直接偶联或使用HRP-抗-MI3缀合的抗体分子。
在一些实施方式中，本文所述的方法或测试可在少于24小时、少于12小时、少于10小时、少于8小时、少于6小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时或更短的时间内检测测试样品中的微生物或微生物物质的存在或不存在和/或鉴定测试样品中的微生物或微生物物质。在一些实施方式中，本文所述的方式或测试可在少于6小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时或更短的时间内检测测试样品中的微生物或微生物物质的存在或不存在和/或鉴定测试样品中的微生物或微生物物质。
根据本文所述的各种实施例，可使怀疑包含微生物和/或微生物物质的测试样品或样品(包括加工的或未加工的任意流体或样本)经受本文描述的测试或方法、试剂盒和系统。测试样品或流体可为液体、超临界流体、溶液、悬浮液、气体、凝胶、浆液及其组合。测试样品或流体可为水性的或非水性的。
在一些实施方式中，测试样品可包括从受试者获得的生物流体。可与本文的装置和组合物接触的生物流体的非限制性实例包括：水，血液(包括全血、等离子体、脐带血和血清)，泌乳产品(例如乳汁)，汗液，粪便，尿液，唾液，泪液，阴道液，前列腺液，牙龈液，羊水，眼内液，脑脊液，精液，痰液，腹水，脓液，鼻咽液(nasopharengal fluid)，伤口渗出液，房水，玻璃体液，胆汁，耳垢，内淋巴，外淋巴，胃液，粘液，腹膜液，胸膜液，皮脂，呕吐物，支气管抽吸物，滑液，气管抽吸物，合成液(例如合成血液、激素、营养素)，其部分以及其组合。在一些实施方式中，生物流体可包括来自受试者的组织样本(例如活组织检查)的匀浆。
在一些实施方式中，从受试者(例如哺乳动物受试者，如人受试者、或家养宠物如猫或狗)获得的生物流体样品可含有来自受试者的细胞。在其它实施方式中，生物流体样品可含有非细胞生物材料，例如血液、唾液或尿液的非细胞部分。
可从受试者或先前收集的样品中新鲜地收集生物流体样品。在一些实施方式中，本文所述的测试和/或方法中使用的生物流体样品可从受试者收集不超过24小时、不超过12小时、不超过6小时、不超过3小时、不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟或更短。
在一些实施方式中，在与本文所述的测试和/或方法一起使用之前，可用化学和/或生物试剂处理本文所述的生物流体样品或任意的流体样品。在一些实施方式中，在将流体样品加入至样品容器之前，样品容器中可存在至少一种化学和/或生物试剂。例如，可将血液收集到血液收集管中，例如包含肝素的化学和/或生物试剂的实例可包括但不限于表面活性剂和洗涤剂、盐、螯合剂、细胞裂解试剂、抗凝血剂、降解酶(例如蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、胶原酶、纤维素酶、淀粉酶)和溶剂，例如缓冲溶液。试剂包括但不限于盐水溶液、PBS溶液、缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲液、EDTA、Tris溶液)及其任意组合。
在一些实施方式中，测试样品可包含从环境来源获得的流体或样本，例如但不限于供水(包含废水)、池塘、河流、水库、游泳池、土壤、食品加工和/或包装工厂、农业场所、水培(包含水培食品农场)、药物制造厂、动物社群设施及其任意组合。
在一些实施方式中，测试样品可包括来自生物培养物的流体(例如培养基)。从生物培养物获得的流体(例如培养基)的实例包括从例如单细胞或多细胞生物(包括原核生物(例如细菌)和真核生物(例如动物细胞、植物细胞、酵母、真菌)，并且包括其部分)的培养或发酵获得的流体。在一些实施方式中，测试样品可包括来自血液培养物的流体。在一些实施方式中，培养基可从任意来源获得，例如但不限于研究实验室、药物制造厂、水培(例如水培食品农场)、诊断测试设施、临床环境以及其任意组合。
在一些实施方式中，测试样品可包括在实验室或临床环境中使用(例如用于生物医学和分子生物学应用)的培养基或试剂溶液。培养基可为用于维持组织、生物体或细胞群的培养基，或者用于培养组织、生物体或细胞群的培养基，该培养基含有维持组织、生物体或细胞群的生存力并支持增殖和生长的营养物。
在一些实施方式中，测试样品可为非生物流体。示例性的非生物流体包括但不限于：水，盐水，浓盐水(brine)，离子液体，缓冲溶液，盐溶液，糖溶液，碳水化合物溶液，脂质溶液，悬浮液，胶体，核酸溶液，烃(例如液体烃)，酸，汽油，石油，液化样品(例如液化样品)及其混合物。
在一些实施方式中，具有附着至其的实体的基材结合本文所述的(如前述部分中描述的)细菌、真菌、病毒、病毒样颗粒、处于溶液中的颗粒或处于悬浮液中的颗粒。
在一些实施方式中，本文描述的测试(例如ELISA)包含封闭剂。封闭剂可为例如国际申请WO2014144325中描述的封闭剂，以引用的方式将其整体并入本文。基于糖类的封闭剂的实例包含但不限于：己糖(例如葡萄糖)，麦芽糖，甘露糖，N-乙酰基-胞壁酸，氨基糖(例如半乳糖胺、葡糖胺、唾液酸、N-乙酰葡糖胺)，磺基糖(例如磺基喹诺糖)，海藻糖，纤维二糖，乳糖，乳果糖，蔗糖，低聚果糖，纤维素，几丁质或其任意组合。
额外的用途
在一些实施方式中，本文的产品和试剂盒可用于检测生物膜中存在的微生物和/或相关的微生物物质，或者用于处理设备表面以防止或抑制生物膜的形成。例如，单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)可在食品加工设备以及其它食品和非食品接触表面中使用的各种材料上形成生物膜(Blackmail，J Food Prot 1996；59：827-31；Frank，J Food Prot 1990；53：550-4；Krysinski，J Food Prot 1992；55：246-51；Ronner，JFood Prot 1993；56：750-8)。通常，在生物膜中，微生物细胞附着至表面，并嵌入由微生物产生的细胞外聚合物质的基材中。生物膜在许多环境中出现并且经常导致各种不期望的效果。例如，生物膜导致工业设备(例如热交换器、管道和船体)结垢，导致热传递减少，能量损失，流体摩擦阻力增加和加速腐蚀。牙齿和牙龈、尿道和肠道以及导管和假肢等植入式医疗设备上的生物膜积累经常导致感染(Characklis W G.Biofilm processes.In：CharacklisW G and Marshall K C eds.New York：John Wiley&Sons，1990：195-231；Costerton等，Annu Rev Microbiol 1995；49：711-45)。
在进一步的实施方式中，本文描述的产品和试剂盒可用于靶向植物微生物和/或相关的微生物物质。植物真菌已引起重大流行病，并带来巨大的社会影响。植物真菌的实例包括但不限于：致病疫霉(Phytophthora infestans)，可可簇叶病菌(Crinipellisperniciosa)，可可链疫孢荚腐(Moniliophthora roreri)，卵菌纲辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)，斐济球腔菌(Mycosphaerella fijiensis)，镰刀菌(Fusarium)，灵芝属真菌(Ganoderma spp fungi)和疫霉属(Phytophthora)。示例性的植物细菌包括洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。示例性的植物病毒包括但不限于：大豆花叶病毒，菜豆荚斑驳病毒，烟草环斑病毒，大麦黄矮病毒，小麦梭条斑病毒，土生花叶病毒，玉米中的小麦条纹病毒，玉米矮花叶病毒，玉米褪绿矮缩病毒，黄瓜花叶病毒，烟草花叶病毒，苜蓿花叶病毒，马铃薯X病毒，马铃薯Y病毒，马铃薯卷叶病毒和番茄金花叶病毒。
在其它实施方式中，本文描述的产品和试剂盒可用于检测或对抗生物恐怖剂、例如炭疽芽孢杆菌(B.Anthracis)和天花。
质量控制
在一些实施方式中，通过本文的方法生产的装置在发布或出售之前进行测试。例如，可进行细胞毒性测试，如ISO 10993-1。在一些实施方式中，进行生物相容性试验。在一些实施方式中，试验表明污染物以小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或10nM存在。
在一个方面，本发明涉及本文所述的组合物、方法和其各自的组分，它们对于本发明是必需的，但还对包含必需或非必需的未指明的元素来说是开放的(“包含”)。在一些实施方式中，待包括在组合物、方法或其各自组分的描述中的其它元素限于那些不会实质上影响本发明的基本特征和新颖特征的元素(“基本由...组成”)。这同样适用于所述方法中的步骤以及其中的组合物和组分。在其它实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法和其各自的元素旨在排除不被认为是对组分、组合物或方法而言的必要元素的任意元素(“由...组成”)。
本发明可以以下编号段落中的任意一个所定义。
1.制备具有附着至其的实体(例如多肽、如糖多肽、诸如糖蛋白；核酸；碳水化合物、例如多糖；生物聚合物；小分子；拟肽；药物；或可与病原体分子或疾病分子相互作用、例如特异性结合的部分，例如结合糖多肽、例如糖蛋白的部分)的基材的方法，所述方法包括：
I：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分(PGM)的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；
II：
i)获得包含PGM的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
III：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及
ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；从而制备具有附着至其的所述实体的基材，
条件是以下的1项或多项(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10项或全部)：
a)所述基材是流体可渗透的、离子可渗透的、多孔的、柔性的、可高压灭菌的(例如在高于100℃时保持其结构)、或不是聚苯乙烯；
b)所述基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的聚苯乙烯；
c)所述基材包含聚砜(PS)、聚芳醚砜(PAES)或聚醚砜(PES)；
d)所述基材包含具有隔室、例如腔的结构，例如所述结构包含中空纤维；
e)所述实体包含特异性结合对的第一成员；
f)所述实体包含抗体结构域，例如Fc结构域；
g)所述实体包含融合蛋白；
h)所述实体包含调理素；
i)所述实体包含凝集素；
j)所述实体包含多聚体蛋白质的亚基；或
k)经附着的实体交叉连接至第二实体，例如其中所述第二实体附着至所述基材或其中所述第二实体未附着至所述基材；以及
条件是以下的1项或多项(例如2项或全部)：
l)所述等离子体不是氧等离子体，例如等离子体是CO2等离子体；
m)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与交联部分(例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))接触或用交联部分(例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))衍生化；或
n)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与有机溶剂(例如有机醇、如乙醇)接触。
2.如段落1所述的方法，所述方法包括：
I：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
3.如段落1所述的方法，所述方法包括：
II：
i)获得包含PGM的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
4.如段落1所述的方法，所述方法包括：
III：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及
ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
5.如段落1所述的方法，其中：
a)将所述实体直接附着至PGM，例如没有来自设置在所述PGM和所述实体之间的活化部分的原子；
b)使所述基材与所述等离子体接触后，将所述实体直接附着至PGM；
c)用于使所述PGM与所述实体附着的反应是水性的；
d)所述实体在水性条件下与所述改性基材接触；
e)PGM、例如羧酸按碳组成计以至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的丰度形成，例如如通过XPS测定的；
f)实体以至少约1x1012个分子/cm2、1x1013个分子/cm2、1x1014个分子/cm2、1x1015个分子/cm2、1x1016个分子/cm2或1x1017个分子/cm2的密度附着，例如如通过结合方法测定的；或
g)使所述实体与所述改性基材在pH为6至8(例如pH 7或生理条件)下接触；或
h)实体以至少约500个实体/μm2、600个实体/μm2、700个实体/μm2、800个实体/μm2、900个实体/μm2、1000个实体/μm2或1100个实体/μm2的密度附着。
6.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含腔，例如所述基材包含中空纤维。
7.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含：纤维素，取代的纤维素，例如乙酸纤维素、二乙酸纤维素或三乙酸纤维素；聚砜、聚醚砜、聚芳醚砜、聚乙烯吡咯烷酮、尼龙、聚丙烯腈(PAN)、聚碳酸酯、聚酰胺或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
8.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚苯乙烯。
9.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含粘合剂或密封剂，并且其中所述粘合剂或密封剂不与有机溶剂、例如有机醇、如乙醇接触。
10.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含透析、超滤、血液滤过、血液透析滤过或血液灌流盒。
11.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含聚合物、玻璃、金属或陶瓷或其任意组合。
12.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材包含中空纤维膜或非中空纤维膜。
13.如前述段落中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，所述改性基材实质上不含交联部分，例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)。
14.如前述段落中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，所述改性基材实质上不含有机溶剂，或其中所述方法不包括使所述改性基材与有机溶剂接触的步骤，例如在步骤(i)之后或在步骤(ii)之前。
15.如前述段落中任一项所述的方法，所述方法包括使所述改性基材、所述实体或两者与活化部分接触，以活化所述改性基材上的官能团，其中所述官能团任选为羧酸基团；所述活化部分例如水溶性活化部分、如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
16.如前述段落中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在水性缓冲液中进行。
17.如前述段落中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在包含2-吗啉代-乙磺酸(MES)缓冲液的溶液中进行。
18.如前述段落中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在约4-5、4.5-5.5、5-6、6-7、7-8或约5的pH下进行。
19.如前述段落中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触进行约4-6小时、6-8小时、8-10小时、10-12小时、12-14小时或14-16小时。
20.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述活化部分包含未被含在具有附着至其的所述实体的所述基材中的原子，例如所述活化部分的原子均不被含在具有附着至其的所述实体的所述基材中。
21.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羧酸，并且所述实体包含胺。
22.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM的羧酸与所述实体的胺基团共价结合。
23.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述等离子体是CO2等离子体。
24.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述等离子体是O2、N2或NH4等离子体。
25.如前述段落中任一项所述的方法，其中，使所述基材在适于在所述基材上形成预定水平或密度的PGM的条件下与所述等离子体接触。
26.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羟基、醛、环氧化物、过氧化物、巯基、羰基或羧酸基团。
27.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羧酸基团。
28.如前述段落中任一项所述的方法，其中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含羧酸基团。
29.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含醛基团。
30.如前述段落中任一项所述的方法，其中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含醛基团。
31.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含与所述实体、例如与活化部分接触的实体上的部分反应的部分。
32.根据前述段落中任一项所述的方法，其中，所述等离子体通过等离子体发生器在以下条件中的1个或多个(例如2个、3个、4个或全部)下产生：
a)约13-14mHz、例如13.5mHz的射频；
b)等离子体处理持续足够量的时间、例如所述等离子体处理持续约0.1-5分钟、如约1分钟)，以将所述实体连接至所述改性基材，同时保持所述实体的活性、例如所述实体的结合活性；
c)等离子体气体压力为约150-350mTorr、例如约200mTorr；
d)约10-150W、例如约100W的功率；或
e)所述等离子体发生器在所述等离子体发生器腔室的外部包含电极，例如在所述等离子体发生器腔室的内部不包含电极。
33.如前述段落中任一项所述的方法，其中，步骤i)的接触包括使多个基材(例如至少2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个或100个基材)与等离子体发生器腔室中的等离子体接触。
34.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述实体包含调理素、碳水化合物结合蛋白、钙结合蛋白、二价阳离子结合蛋白和/或抗体的一部分，例如Fc或其部分。
35.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述实体包含SEQ ID NO：4的多肽或与SEQ ID NO：4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，或者SEQID NO：6的多肽或与SEQ ID NO：6至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。
36.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述实体形成多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、12聚体或18聚体。
37.如段落36所述的方法，其中，所述实体形成具有彼此交联的至少两个亚基的多聚体。
38.如前述段落中任一项所述的方法，所述方法还包括：
获取与PGM类型、PGM数量、PGM密度、污染物的存在、经附着的实体的数量、接触角测定(例如水接触角测定)、或表面能测定相关的参数值；以及
将获取的值与标准值进行比较。
39.根据段落38所述的方法，所述方法进一步包括：响应于所述比较，将包含所述经附着的实体的所述基材分类、接受、拒绝、批准、并入产品、包装、转移到新位置或在商业中发布。
40.根据前述段落中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如用X射线光子光谱(XPS)评估所述改性基材是否存在PGM。
41.如前述段落中任一项所述的方法，所述方法进一步包括评估所述改性基材的污染物或制备试剂，例如可提取分子、可浸出分子、未连接至所述基材的FcMBL、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体，所述生物体例如细菌或真菌。
42.根据前述段落中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如通过进行以下的1个或多个、例如2个或全部而在步骤i)之前清洁所述等离子体发生器腔室：
a)用溶剂、例如有机溶剂、如乙醇洗涤所述腔室，
b)在所述腔室中产生清洁的等离子体，例如由与步骤i)的等离子体的不同气体制成的清洁的等离子体，例如当步骤i)的所述等离子体是CO2等离子体时使用O2等离子体进行清洁；和/或
c)通过化学清洁对所述腔室进行清洁。
43.如段落42所述的方法，其中，所述清洁的等离子体被产生约30分钟、处于约400℃的温度、或两者。
44.根据前述段落中任一项所述的方法，所述方法包括通过进行以下的1个或多个、例如2个或全部来确定所述等离子体发生器腔室的清洁度：
a)在清洁步骤期间，监测所述等离子体的颜色，例如其中当有机物存在时O2等离子体为蓝色并且当有机物不存在时为白色，或当有机物存在时CO2等离子体为深蓝色并且当有机物不存在时为浅蓝色；或
b)在步骤i)的接触期间，监测所述等离子体的温度，其中，在产生所述等离子体的第1分钟内，所述等离子体的温度不会升高到大于80℃；其中，在第1分钟内温度升高到大于80℃表明存在污染物；或
c)在清洁步骤期间，监测所述等离子体的温度，其中，所述等离子体的温度降至低于峰值温度10℃、通常在400-500℃之间；其中，温度继续升高或保持所述峰值温度表明存在污染物。
45.根据前述段落中任一项所述的方法，所述方法包括：当将所述基材设置在所述等离子体发生器腔室中时、例如在步骤i)的所述接触之前，进行a)和b)中的一个或两个，a)为在所述等离子体发生器腔室中产生真空、例如小于1Torr的压力，b)为用气体、例如与用于制备步骤i)的所述等离子体相同的气体、如CO2填充等离子体发生器腔室。
46.根据段落45所述的方法，其中，用所述气体、例如CO2填充所述等离子体发生器腔室例如至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟，例如约5分钟。
47.根据前述段落中任一项所述的方法，所述方法包括例如通过进行以下的一个或多个来测定所述基材的改性：
a)使所述基材与1滴液体、例如水接触，并测定液滴的接触角；
b)使所述基材与结合所述实体的部分接触，例如其中所述部分包含抗体分子或糖类、如甘露糖，其中所述部分任选地结合或共价连接至可检测标记物；或
c)使所述基材与结合PGM的部分、例如包含胺基团的可检测标记物接触。
48.如前述段落中任一项所述的方法，所述方法包括在将所述实体附着至所述基材期间提供掩蔽实体，其中所述掩蔽实体抑制所述实体的一部分与例如所述活化部分、所述基材或另一实体的反应，所述另一实体例如生物聚合物、如多肽。
49.如段落48所述的方法，其中，所述掩蔽实体包含所述实体结合的部分。
50.如段落48所述的方法，其中，所述实体包含调理素、例如MBL，并且所述掩蔽实体包含所述调理素结合的部分、例如二价阳离子如Ca2+、或糖如葡萄糖。
51.如前述段落中任一项所述的方法，其中，例如如通过结合测试测定的，在第一选定区域、例如1cm2区域中的经附着的实体的密度为在1个、2个、3个、4个、5个或10个其它的选定区域、例如在基材上的每个1cm2的区域的密度的50％内。
52.如前述段落中任一项所述的方法，其中，所述基材或所述基材的一部分、例如中空纤维的腔上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
53.一种包含基材的装置，所述基材具有附着至其的实体，所述装置通过段落1-52中任一项的方法生产。
54.一种包含基材的装置，所述基材具有附着至其的实体，所述装置可通过段落1-52中任一项的方法生产。
55.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，例如如通过结合测试测定的，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂、例如硅烷。
56.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的多个实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，例如如通过结合测试测定的，在第一选定区域、例如1cm2区域中的经附着的实体的密度为在1个、2个、3个、4个、5个或10个其它的选定区域、例如在所述基材上的1cm2区域的密度的50％内，或其中所述基材或所述基材的一部分、例如中空纤维的腔上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
57.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述实体的氨基基团(例如赖氨酸侧链的氨基基团或N-末端)直接共价结合至所述基材上的PGM(例如羧酸)。
58.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2或者小于1x1016分子/装置、1x1015分子/装置、1x1014分子/装置、1x1013分子/装置、1x1012分子/装置、1x1011分子/装置、1x1010分子/装置、1x109分子/装置、1x108分子/装置、1x107分子/装置、1x106分子/装置、1x105分子/装置、1x104分子/装置、1x103分子/装置、100分子/装置、10分子/装置或1分子/装置的污染物，例如可提取分子、可浸出分子、未连接至所述基材的FcMBL、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体，所述生物体例如细菌或真菌。
59.反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，所述基材包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂、例如硅烷；
实体，例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽；以及
包含活化部分、例如水溶性活化部分、如EDC的水性溶液。
60.反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，
实体，例如多肽，如包含调理素的一部分、如MBL的一部分的多肽；以及
掩蔽实体，例如调理素结合的部分或二价阳离子、例如Ca2+。
61.如段落60所述的反应混合物，其中，所述掩蔽实体包含糖、例如葡萄糖。
62.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述实体以约500-2000个实体/μm2、500-1800个实体/μm2、500-1600个实体/μm2、500-1200个实体/μm2、600-2000个实体/μm2、600-1800个实体/μm2、600-1600个实体/μm2、600-1200个实体/μm2、800-2000个实体/μm2、800-1800个实体/μm2、800-1600个实体/μm2、800-1200个实体/μm2、1000-2000个实体/μm2、1000-1800个实体/μm2、1000-1600个实体/μm2或1000-1200个实体/μm2的密度附着至所述基材。
实施例
现在将对本发明进行一般性地描述，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，所述实施例仅旨在用于说明本发明的某些方面和实施方式的目的，而并不旨在限制本发明。因此，将显而易见的是，任意公开的具体构成和实验计划可在本公开的范围内被替代。
实施例1：经CO2处理的聚醚砜的X射线光子光谱(XPS)研究
大多数塑料在其表面上没有用于以生物分子将表面适当功能化的足够的反应性基团。将XPS用于表征用等离子体改性的塑料表面上的氧化程度，以验证在偶联之前存在的期望的反应性部分。
制备PES样品
聚醚砜(PES)片材获得自Goodfellow Cambridge Limited。通过将材料切割成8mmx 11mm的矩形来制备片材样品。通过涡旋将样品在70％乙醇/水溶液中洗涤3次，然后用70％乙醇/水洗涤三次。在等离子体处理之前，将样品在室内空气中干燥。
PES的CO2等离子体处理
将PES样品在变化的时间或变化的功率下暴露至CO2等离子体。18.56MHz射频电容耦合等离子体发生器是来自Diener的Model Nano。首先通过循环用空腔室清洁腔室中的污染物。首先将腔室抽吸至0.14mbar的真空，然后随着输入纯O2气体1分钟而升高至0.26mbar的压力。然后在150W(50％功率)下产生等离子体30分钟。一旦装置冷却(最多4小时)，将样品引入腔室中。然后将腔室抽吸至0.14mbar的真空，然后随着输入纯CO2气体5分钟而升高至0.26mbar的压力。等离子体处理时间在100瓦特下从0分钟、0.5分钟、1分钟、3分钟至5分钟变化。通过XPS在同一天分析样品以鉴定PES表面上添加的羧酸根官能度的存在。
PES的XPS
在Thermo Scientific K-Alpha光谱仪上进行PES样品的X射线光电子光谱(XPS)分析。光谱仪从铝Kα源产生12V电子束。以X射线能量为1.4866keV和线宽为0.85eV探测PES样品。使用400μm的X射线斑点尺寸来获得相对于平均面积的导函数的变化(derivedfunctional changes)。在每个PES样品上的一个点处分析化学组成。
在CasaXPS程序上完成每个光谱的成分分析。
对于C1s光谱，定量以下峰值：
表4：碳1s的峰值分配
化学作用 BE(eV)
C-C 285.0
C-O 286.6
C＝O 287.6
O-C＝O 289.0
图1示出了天然(未处理的)PES样品的XPS分析。图2示出了经等离子体处理的PES样品的XPS分析。
XPS光谱的组分分析表明，增加CO2等离子体中的处理时间产生增加的经氧化的碳部分、特别是羧化物部分的百分比(参见图3)。这些羧酸根基团现在可用于通过交联化学而偶联至目标分子上的胺基团(例如EDC)。
实施例2：用氨基量子点对经CO2处理的PES进行官能化
方法
用来自Life Technologies(Cat#Q21521MP)的QDOT 655ITK氨基(PEG)量子点对PES样品进行功能化。将PES首先用100W的CO2等离子体处理1分钟，样品面朝上取向处于培养皿中。在等离子体处理之后，将样品转移到多孔24孔板中，经等离子体处理的侧朝上。
通过将两个新鲜的小瓶(250μl)的制造商溶液合并到Eppendorf管中来制备量子点。轻轻涡旋该溶液以混合暗红色溶液。通过将307μL的点溶解在pH 7.0的14mL的1mMPIPES溶液中来制备QDots溶液的稀释液。
将化学物质以四个分组施用至PES样品。
1.)(-)EDC共轭；(-)CO2等离子体
2.)(+)EDC共轭；(-)CO2等离子体
3.)(-)EDC共轭；(+)CO2等离子体
4.)(+)EDC共轭；(+)CO2等离子体
在PIPES缓冲液中制备EDC溶液至浓度为20mg/mL。向孔中的各PES样品中加入12.8μL稀释的Qdot原液。加入587.2μL PIPES缓冲液。向孔中加入200μL EDC溶液或200μL PIPES缓冲液。各孔中的反应混合物的总体积为0.8μL。在室温下将孔板在定轨摇床上振荡1小时。随后，将孔板置于4℃的定轨摇床上过夜。
缀合后，从各孔中除去Qdots溶液。用1mL去离子(DI)水(Millipore-18.2Mohm水)冲洗每个孔。将各PES片样品转移到Eppendorf管并在0.5％Tween-20的DI水溶液中超声处理5分钟。从Eppendorf管中吸出吐温溶液，并用DI水代替溶液。将样品管涡旋10秒。用吐温溶液替换DI水，并将样品再次超声处理5分钟。最后，将各样品用DI水冲洗并涡旋三次。在显微镜评估之前，将样品储存在4℃的DI水中。
共聚焦成像
将样品在Leica SP5 X MP倒置共聚焦显微镜上成像。成像的目的是通过量化作为面积的函数的荧光来评估表面官能化的程度。用Cohert Chameleon多光子激光器实现激发，峰值中心位于810nm。激光器的功率输出为3.2W。将检测器的增益固定为500。将共焦针孔固定在55.10μm。
将检测器配置成在分开的通道上收集PES的自发荧光和Qdots的红色荧光。
对于各化学条件，将三个PES片在3个点处成像。扫描区域为512x 512像素或620x620微米。基于Qdot处理表面的观察，目测确定针对各样品收集的平面数。通过如下进行切片：贯穿样品进行扫描以在大块样品中定位自发荧光区域并取出焦点(focus)以定位材料表面，然后是自由空间的区域。
分析
将ImageJ软件用于量化表面层的荧光强度，荧光强度是附着至表面的量子点的量的测定值。掩模用于排除点的聚集。分析显示在CO2等离子体处理和EDC耦合的表面上的量子点的最大覆盖率，表明对于最大表面涂覆而言两个步骤均必要。
扫描电子显微镜
用SEM进一步表征PES膜以确定亚波长(＜200nm)分辨率下的量子点的分布。成像显示，当用CO2等离子体和EDC交联化学处理时，点被紧密地集成在表面上。
跟随有偶联至胺的CO2等离子体向一般表面上提供均匀、致密的生物分子涂层。该过程用于将FcMBL偶联至PES。通过测定其结合甘露聚糖的能力，FcMBL是官能性的(图4)。使用以下方法：
共价偶联：PES芯片
1.将PES芯片放入12孔板中。等离子体处理(100W，1分钟)
2.在1x PBS中将FcMBL稀释至125μg/ml
3.在1x PBS中以1mg/ml溶解EDC
4.将FcMBL与EDC 1∶1混合，轻轻倒置
5.将FcMBL-EDC等分到PES芯片上，500μl/孔。在4℃下孵育过夜
6.用1x PBS以3x 1ml/孔洗涤PES芯片
甘露聚糖结合：PES芯片
7.封闭PES芯片：10mM葡萄糖，TBS-T Ca++中的0.1％BSA，500μl/孔。在室温下孵育振荡1小时
8.洗涤PES芯片：3x1ml/孔，TBS-T Ca++
9.在TBS-T Ca++中将甘露聚糖稀释至31.25μg/ml
10.将甘露聚糖等分到PES芯片上，500μl/孔。在室温下孵育振荡1小时
11.洗涤PES芯片：3x 1ml/孔，TBS-T Ca++
12.在10ml3％BSA/TBS-T Ca++中稀释1.5μl rhMBL-HRP
13.将rhMBL-HRP等分到PES芯片上，500μl/孔。在室温下孵育振荡1小时
14.洗涤PES芯片：3x 1ml/孔，TBS-T Ca++
15.将PES芯片转移到新的12孔板
16.显色：500μl/孔的TMB。在室温下孵育1分钟
17.淬灭反应：250μl/孔的硫酸
18.将样品转移至96孔板，100μl/孔，三重复
19.在450nm下读数
实施例3：对透析盒的FcMBL附着和等离子体处理
使用以下方法将FcMBL附着至透析盒。
在腔室清洁循环(例如如实施例1中所述)之后，将中空纤维透析盒(“透析器”)放置在玻璃架上的腔室中，大致位于腔室后部和腔室入口之间的中间位置。将腔室抽真空至0.14mbar的压力，然后暴露至0.26mbar纯CO25分钟以确保过滤器充满CO2气体。腔室在100W下产生等离子体1分钟，保持0.26mbar的压力。
用含有0.5mg/mL EDC和250μg/mL FcMBL的冷(4℃)MES pH 5溶液填充过滤器。将过滤器冷却并在4℃下储存过夜(～16hr)。将滤器用2L PBS溶液冲洗，然后用1L具有10mMEDTA的PBS冲洗。将过滤器储存在4℃直至使用。
实施例4：用于ELISA中的经等离子体处理的板
该实施例说明用于检测全血中的甘露聚糖时，共价结合的ELISA的灵敏度显著大于被动吸附的ELISA(图5)。
按如下进行FcMBL与96孔板的共价偶联：
1.等离子体处理96孔ELISA板(CO2，100W，1分钟)
2.在1x PBS中将FcMBL稀释至31.25微克(μg)/ml
3.在1x PBS中将EDC溶解至1mg/ml
4.将FcMBL溶液与EDC溶液混合，轻轻倒置
5.将FcMBL-EDC 100μl/孔等分到经等离子体处理的96孔板上
6.在4℃孵育过夜
7.用1x PBS以4x 200μl/孔洗涤板
8.封闭板：10mM葡萄糖，处于TBS-T Ca++的0.1％BSA，200μl/孔。在室温下孵育1小时，以350RPM振荡
9.用TBS-T Ca++以4x 200μl/孔洗涤板
10.在TBS-T Ca++或全血中稀释甘露聚糖至62.5ng/ml，并完成7次2倍稀释
11.以三重复等分甘露聚糖稀释液，100μl/孔。在室温下孵育30分钟，以350RPM振荡
12.用TBS-T Ca++以4x 200μl/孔洗涤板
13.稀释rhMBL-HRP，以1.5μl处于10ml3％BSA/TBS-T Ca++中
14.将rhMBL-HRP等分至100μl/孔。在室温下孵育30分钟，以350RPM振荡
15.用TBS-T Ca++以4x 200μl/孔洗涤板
16.等分TMB，100μl/孔。在室温下孵育约1分钟
17.淬灭反应：等分硫酸，50μl/孔
18.将板在450nm下读数
实施例5：测试FcMBL与基材的附着
该实施例描述了在中空纤维内进行的Fc测试：
1.将FcMBL共价偶联至中空纤维后，用1x PBS以3x 10ml冲洗纤维
2.切开中空纤维壳，以显露出内部纤维
3.使用镊子，移出1根纤维，切成1英寸长的片，并将每个片放入12孔板的1个孔中
4.封闭：等分3％BSA/TBS-T Ca++，500μl/孔。在室温下孵育1小时，振荡
5.用TBS-T Ca++以500μl/孔洗涤3次
6.在1％BSA/TBS-T Ca++中以1∶10,000稀释HRP-缀合的抗-Fc抗体(Jackson)
7.等分抗-Fc抗体溶液，500μl/孔。在室温下孵育1小时，振荡
8.用TBS-T Ca++以500μl/孔洗涤3次
9.显色：等分TMB，500μl/孔。孵育约1分钟
10.淬灭反应：等分硫酸，250μl/孔
11.以三重复将100μl/孔移液到96孔板中
12.在450nm下读取
中空纤维上的Fc的ELISA证实FcMBL沿着过滤器的长度偶联(图6)。所有FcMBL水平均高于背景(对照)水平(数据未示出)。
在类似的实验中，HRP共价偶联至1kd MWCO光谱过滤器，并且发现沿着长度均匀地偶联(图7)。缺乏EDC的阴性对照反应产生远低于0.1的OD450值(数据未示出)。
实施例6：偶联缓冲条件
向偶联缓冲液中加入10mM钙有助于以钙依赖性方式保留FcMBL对结合配体的官能度。这很可能是由于FcMBL的结合口袋中的螯合羧酸根基团的保护。另外，将缓冲液冷却至4℃有助于保留偶联的FcMBL的官能度，如通过结合甘露聚糖的能力所测定的(图8)。
这转化为在缀合缓冲液中的具有钙的过滤器上的更多甘露聚糖结合(更大的消耗)(图9和表5)。
表5具有和不具有添加的钙的甘露聚糖消耗
实验 甘露糖消耗％
对照 10％
FcMBL过滤器(MES pH 5) 27％
FcMBL过滤器(MES pH 5具有钙) 50％
实施例7：量化附着至表面的实体的密度
在该实施例中，表面聚醚砜(PES)在CO2等离子体的暴露下用羧酸基团进行官能化。更具体地，将感兴趣的生物分子用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)连接至改性的PES表面。
通过比较胺官能化量子点与CO2等离子体改性的聚醚砜表面的表面的结合来检查EDC缀合化学的有效性。胺官能化的量子点用作蛋白质上的胺残基的合适的类似物。用以下的实验群组研究将量子点连接至PES表面的效果：
1.-EDC，-CO2
2.+EDC，-CO2
3.-EDC，+CO2
4.+EDC，+CO2
对于每个群组，制备三个样品用于通过电子显微镜进行目视检查和颗粒计数。
按如下制备样品。通过添加76.8μL制造商的原液(QDot 655ITKTM氨基(PEG)量子点，Invitrogen(Cat#Q21521MP))和4.7mL的100mM MES缓冲溶液(pH＝5)来制备QDots原液。将溶液在培养基环境下轻轻涡旋30秒以确保混合。
称量3.8mg EDC(ThermoScientific，Cat#22980)并溶于3.8mL MES缓冲液中，以得到1mg/mL的浓度。
将来自等离子体改性群组的PES芯片在100W下暴露至CO2等离子体1分钟。在等离子体改性后，将PES芯片单独放入24孔板的孔中。
将芯片各自浸入400μL的pH＝5的100mM MES，或400μL的MES-EDC溶液中。立即将400μL QDOT溶液加入至24孔板的每个孔中。核查芯片以确保适当的浸没。将样品置于4℃的振荡器(LabNet Orbit P4，速度＝25)上过夜。
然后从PES样品中吸出反应溶液。立即用DI水清洗样品以除去过量的QDots。将PES芯片转移至1.5mL Eppendorf管并浸入DI水中。将具有PES芯片的管超声处理1小时。超声处理后，吸去DI水并将芯片浸入30％EtOH中。再在乙醇中进行1小时超声处理。超声处理后，用五等分的30％乙醇清洗每个芯片。清洗后，将样品进行干燥并在真空下储存。
QDot样品的成像和图像分析按如下进行。
将样品安装到具有碳带的存根(stubs)上。碳胶/墨水用于密封PES芯片表面和存根之间的任意间隙。在SEM成像之前，在EMS 300T D Dual Head Sputter Coater上用1nm的Pt∶Pd(80∶20)溅射样品。
PES上QDots的电子显微镜术在Zeiss FESEM Supra 55VP上以3keV进行。使用InLens检测器捕获图像。用于粒子分析的所有图像均在400,000X放大率下拍摄。显微镜的视场成像为753nm x 565nm＝425,000nm2。
对于经MES处理的群组，在3个样品中的每一个上成像7-8个点。
使用ImageJ中的粒子计数算法计算聚醚砜(PES)芯片的表面上的QDots。该过程以下列方式进行。通过估计图像比例尺中的像素长度来校准图像尺度。用带通功能将图像中的表面粗糙度最小化。大型结构减少到10个像素。小型结构最多可达3个像素。其次，将图像阈值化。随着Intermodes激活而运行阈值。“Below”值保持在0.00％。“Above”值在视觉上进行了优化，以最大限度地减少影响粒子数量的外来特征。该值的量级取决于表面上颗粒的频率。在阈值化之后，图像被转换为二进制图像。对于粒子计数，将尺寸限度设定为15nm至无穷大。圆度参数(circularity parameter)为0.5-1。在上述设置中，粒子可能被轻微低估，因为小团簇可能看起来像是一个粒子。
将每个群组的估计的粒子计数显示在下表6中。单因子ANOVA给出p值为0.002。在没有CO2的情况下，仅观察到低水平的结合。在没有添加EDC的情况下，观察到颗粒结合至PES的表面(参见表6，样品3)。随着EDC和CO2的添加，QDOT颗粒的频率相对于无CO2的对照增加了近2-3倍。第4组中的增加的QDot颗粒频率支持EDC碳二亚胺化学功能的有效性。虽然不希望受理论的束缚，但第3组中增加的颗粒频率可通过替代化学来解释，例如亚胺形成或席夫碱。
表6不同偶联条件下的颗粒计数
样品 平均计数 标准差 粒子密度(点/μm<sup>2</sup>)
1.)-EDC，-CO<sub>2</sub> 249 77 586
2.)+EDC，-CO<sub>2</sub> 251 25 590
3.)-EDC，+CO<sub>2</sub> 634 163 1492
4.)+EDC，+CO<sub>2</sub> 527 46 1240
虽然不希望受理论的束缚，但一种解释是在CO2-等离子体衍生化下，赋予表面的化学官能度将由羧酸根基团支配。CO2离子等离子体处理的额外结果可能是醛官能度的存在。醛表面官能度的存在将允许通过聚乙二醇化的量子点上的伯胺进行表面醛基的亲核攻击。在该反应中，质子通过伯胺的氮和用从羰基置换的羟基形成的水而失去，留下亚胺或席夫碱。

Claims (62)

1.制备具有附着至其的实体(例如多肽、如糖多肽、诸如糖蛋白；核酸；碳水化合物、例如多糖；生物聚合物；小分子；拟肽；药物；或可与病原体分子或疾病分子相互作用、例如特异性结合的部分，例如结合糖多肽、例如糖蛋白的部分)的基材的方法，所述方法包括：
I：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分(PGM)的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；
II：
i)获得包含PGM的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
III：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及
ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；从而制备具有附着至其的所述实体的基材，
条件是以下的1项或多项(例如2项、3项、4项、5项、6项、7项、8项、9项、10项或全部)：
a)所述基材是流体可渗透的、离子可渗透的、多孔的、柔性的、可高压灭菌的(例如在高于100℃时保持其结构)、或不是聚苯乙烯；
b)所述基材包含少于90％、80％、70％、60％或50％的聚苯乙烯；
c)所述基材包含聚砜(PS)、聚芳醚砜(PAES)或聚醚砜(PES)；
d)所述基材包含具有隔室、例如腔的结构，例如所述结构包含中空纤维；
e)所述实体包含特异性结合对的第一成员；
f)所述实体包含抗体结构域，例如Fc结构域；
g)所述实体包含融合蛋白；
h)所述实体包含调理素；
i)所述实体包含凝集素；
j)所述实体包含多聚体蛋白质的亚基；或
k)经附着的实体交叉连接至第二实体，例如其中所述第二实体附着至所述基材或其中所述第二实体未附着至所述基材；以及
条件是以下的1项或多项(例如2项或全部)：
l)所述等离子体不是氧等离子体，例如等离子体是CO2等离子体；
m)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与交联部分(例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))接触或用交联部分(例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS))衍生化；或
n)在所述实体的附着之前，所述改性基材不与有机溶剂(例如有机醇、如乙醇)接触。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
I：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含等离子体产生部分的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
II：
i)获得包含PGM的改性基材；以及
ii)使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
4.如权利要求1所述的方法，所述方法包括：
III：
i)使所述基材与等离子体接触以形成包含PGM的改性基材；以及
ii.a)将包含PGM的所述改性基材分类为适合于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触；或
ii.b)将包含PGM的所述改性基材运输、销售、运送、转移控制权或转移所有权至如下的一方，所述一方用于使所述实体(例如生物聚合物、如多肽)在足以使所述实体附着至所述改性基材的条件下与所述改性基材接触。
5.如权利要求1所述的方法，其中：
a)将所述实体直接附着至PGM，例如没有来自设置在所述PGM和所述实体之间的活化部分的原子；
b)使所述基材与所述等离子体接触后，将所述实体直接附着至PGM；
c)用于使所述PGM与所述实体附着的反应是水性的；
d)所述实体在水性条件下与所述改性基材接触；
e)PGM、例如羧酸按碳组成计以至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的丰度形成，例如如通过XPS测定的；
f)实体以至少约1x1012个分子/cm2、1x1013个分子/cm2、1x1014个分子/cm2、1x1015个分子/cm2、1x1016个分子/cm2或1x1017个分子/cm2的密度附着，例如如通过结合方法测定的；或
g)使所述实体与所述改性基材在pH为6至8(例如pH 7或生理条件)下接触；或
h)实体以至少约500个实体/μm2、600个实体/μm2、700个实体/μm2、800个实体/μm2、900个实体/μm2、1000个实体/μm2或1100个实体/μm2的密度附着。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含腔，例如所述基材包含中空纤维。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含：纤维素，取代的纤维素，例如乙酸纤维素、二乙酸纤维素或三乙酸纤维素；聚砜、聚醚砜、聚芳醚砜、聚乙烯吡咯烷酮、尼龙、聚丙烯腈(PAN)、聚碳酸酯、聚酰胺或聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚苯乙烯。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含粘合剂或密封剂，并且其中所述粘合剂或密封剂不与有机溶剂、例如有机醇、如乙醇接触。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含透析、超滤、血液滤过、血液透析滤过或血液灌流盒。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含聚合物、玻璃、金属或陶瓷或其任意组合。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材包含中空纤维膜或非中空纤维膜。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，所述改性基材实质上不含交联部分，例如硅烷、如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(ii)中，所述改性基材实质上不含有机溶剂，或其中所述方法不包括使所述改性基材与有机溶剂接触的步骤，例如在步骤(i)之后或在步骤(ii)之前。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括使所述改性基材、所述实体或两者与活化部分接触，以活化所述改性基材上的官能团，其中所述官能团任选为羧酸基团；所述活化部分例如水溶性活化部分、如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在水性缓冲液中进行。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在包含2-吗啉代-乙磺酸(MES)缓冲液的溶液中进行。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触在约4-5、4.5-5.5、5-6、6-7、7-8或约5的pH下进行。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤ii)的接触进行约4-6小时、6-8小时、8-10小时、10-12小时、12-14小时或14-16小时。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述活化部分包含未被含在具有附着至其的所述实体的所述基材中的原子，例如所述活化部分的原子均不被含在具有附着至其的所述实体的所述基材中。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羧酸，并且所述实体包含胺。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM的羧酸与所述实体的胺基团共价结合。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述等离子体是CO2等离子体。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述等离子体是O2、N2或NH4等离子体。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，使所述基材在适于在所述基材上形成预定水平或密度的PGM的条件下与所述等离子体接触。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羟基、醛、环氧化物、过氧化物、巯基、羰基或羧酸基团。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含羧酸基团。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含羧酸基团。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含醛基团。
30.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％或50％的所述PGM包含醛基团。
31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PGM包含与所述实体、例如与活化部分接触的实体上的部分反应的部分。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述等离子体通过等离子体发生器在以下条件中的1个或多个(例如2个、3个、4个或全部)下产生：
a)约13-14mHz、例如13.5mHz的射频；
b)等离子体处理持续足够量的时间、例如所述等离子体处理持续约0.1-5分钟、如约1分钟)，以将所述实体连接至所述改性基材，同时保持所述实体的活性、例如所述实体的结合活性；
c)等离子体气体压力为约150-350mTorr、例如约200mTorr；
d)约10-150W、例如约100W的功率；或
e)所述等离子体发生器在所述等离子体发生器腔室的外部包含电极，例如在所述等离子体发生器腔室的内部不包含电极。
33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤i)的接触包括使多个基材(例如至少2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个或100个基材)与等离子体发生器腔室中的等离子体接触。
34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述实体包含调理素、碳水化合物结合蛋白、钙结合蛋白、二价阳离子结合蛋白和/或抗体的一部分，例如Fc或其部分。
35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述实体包含SEQ ID NO:4的多肽或与SEQ ID NO:4至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽，或者SEQID NO:6的多肽或与SEQ ID NO:6至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致的多肽。
36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述实体形成多聚体，例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、12聚体或18聚体。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述实体形成具有彼此交联的至少两个亚基的多聚体。
38.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：
获取与PGM类型、PGM数量、PGM密度、污染物的存在、经附着的实体的数量、接触角测定(例如水接触角测定)、或表面能测定相关的参数值；以及
将获取的值与标准值进行比较。
39.根据权利要求38所述的方法，所述方法进一步包括：响应于所述比较，将包含所述经附着的实体的所述基材分类、接受、拒绝、批准、并入产品、包装、转移到新位置或在商业中发布。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如用X射线光子光谱(XPS)评估所述改性基材是否存在PGM。
41.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括评估所述改性基材的污染物或制备试剂，例如可提取分子、可浸出分子、未连接至所述基材的FcMBL、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体，所述生物体例如细菌或真菌。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法进一步包括例如通过进行以下的1个或多个、例如2个或全部而在步骤i)之前清洁所述等离子体发生器腔室：
a)用溶剂、例如有机溶剂、如乙醇洗涤所述腔室，
b)在所述腔室中产生清洁的等离子体，例如由与步骤i)的等离子体不同的气体制成的清洁的等离子体，例如当步骤i)的所述等离子体是CO2等离子体时使用O2等离子体进行清洁；和/或
c)通过化学清洁对所述腔室进行清洁。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述清洁的等离子体被产生约30分钟、处于约400℃的温度、或两者。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括通过进行以下的1个或多个、例如2个或全部来确定所述等离子体发生器腔室的清洁度：
a)在清洁步骤期间，监测所述等离子体的颜色，例如其中当有机物存在时O2等离子体为蓝色并且当有机物不存在时为白色，或当有机物存在时CO2等离子体为深蓝色并且当有机物不存在时为浅蓝色；或
b)在步骤i)的接触期间，监测所述等离子体的温度，其中，在产生所述等离子体的第1分钟内，所述等离子体的温度不会升高到大于80℃；其中，在第1分钟内温度升高到大于80℃表明存在污染物；或
c)在清洁步骤期间，监测所述等离子体的温度，其中，所述等离子体的温度降至低于峰值温度10℃、通常在400-500℃之间；其中，温度继续升高或保持所述峰值温度表明存在污染物。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括：当将所述基材设置在所述等离子体发生器腔室中时、例如在步骤i)的所述接触之前，进行a)和b)中的一个或两个，a)为在所述等离子体发生器腔室中产生真空、例如小于1Torr的压力，b)为用气体、例如与用于制备步骤i)的所述等离子体相同的气体、如CO2填充等离子体发生器腔室。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，用所述气体、例如CO2填充所述等离子体发生器腔室例如至少约1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟或10分钟，例如约5分钟。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括例如通过进行以下的一个或多个来测定所述基材的改性：
a)使所述基材与1滴液体、例如水接触，并测定液滴的接触角；
b)使所述基材与结合所述实体的部分接触，例如其中所述部分包含抗体分子或糖类、如甘露糖，其中所述部分任选地结合或共价连接至可检测标记物；或
c)使所述基材与结合PGM的部分、例如包含胺基团的可检测标记物接触。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括在将所述实体附着至所述基材期间提供掩蔽实体，其中所述掩蔽实体抑制所述实体的一部分与例如所述活化部分、所述基材或另一实体的反应，所述另一实体例如生物聚合物、如多肽。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述掩蔽实体包含所述实体结合的部分。
50.如权利要求48所述的方法，其中，所述实体包含调理素、例如MBL，并且所述掩蔽实体包含所述调理素结合的部分、例如二价阳离子如Ca2+、或糖如葡萄糖。
51.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，例如如通过结合测试测定的，在第一选定区域、例如1cm2区域中的经附着的实体的密度为在1个、2个、3个、4个、5个或10个其它的选定区域、例如在基材上的每个1cm2的区域的密度的50％内。
52.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基材或所述基材的一部分、例如中空纤维的腔上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
53.一种包含基材的装置，所述基材具有附着至其的实体，所述装置通过权利要求1-52中任一项的方法生产。
54.一种包含基材的装置，所述基材具有附着至其的实体，所述装置可通过权利要求1-52中任一项的方法生产。
55.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，例如如通过结合测试测定的，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂、例如硅烷。
56.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的多个实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，例如如通过结合测试测定的，在第一选定区域、例如1cm2区域中的经附着的实体的密度为在1个、2个、3个、4个、5个或10个其它的选定区域、例如在所述基材上的1cm2区域的密度的50％内，或其中所述基材或所述基材的一部分、例如中空纤维的腔上的所述1cm2区域的10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％的密度在彼此或一个孔的底部、多个孔的底部或中空纤维的50％、40％或30％内。
57.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述实体的氨基基团(例如赖氨酸侧链的氨基基团或N-末端)直接共价结合至所述基材上的PGM(例如羧酸)。
58.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述装置包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2或者小于1x1016分子/装置、1x1015分子/装置、1x1014分子/装置、1x1013分子/装置、1x1012分子/装置、1x1011分子/装置、1x1010分子/装置、1x109分子/装置、1x108分子/装置、1x107分子/装置、1x106分子/装置、1x105分子/装置、1x104分子/装置、1x103分子/装置、100分子/装置、10分子/装置或1分子/装置的污染物，例如可提取分子、可浸出分子、未连接至所述基材的FcMBL、EDC、溶剂(例如MES缓冲液)、内毒素、热原、核酸酶或生物体，所述生物体例如细菌或真菌。
59.反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，所述基材包含小于1x1016分子/cm2、1x1015分子/cm2、1x1014分子/cm2、1x1013分子/cm2、1x1012分子/cm2、1x1011分子/cm2、1x1010分子/cm2、1x109分子/cm2、1x108分子/cm2、1x107分子/cm2、1x106分子/cm2、1x105分子/cm2、1x104分子/cm2、1x103分子/cm2、100分子/cm2、10分子/cm2或1分子/cm2的交联剂、例如硅烷；
实体，例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽；以及
包含活化部分、例如水溶性活化部分、如EDC的水性溶液。
60.反应混合物，所述反应混合物包含：
基材、例如可渗透膜，
实体，例如多肽，如包含调理素的一部分、如MBL的一部分的多肽；以及
掩蔽实体，例如调理素结合的部分或二价阳离子、例如Ca2+。
61.如权利要求60所述的反应混合物，其中，所述掩蔽实体包含糖、例如葡萄糖。
62.一种包含基材、例如可渗透膜的装置，所述基材具有附着至其的实体、例如多肽、如包含MBL的一部分的多肽，其中，所述实体以约500-2000个实体/μm2、500-1800个实体/μm2、500-1600个实体/μm2、500-1200个实体/μm2、600-2000个实体/μm2、600-1800个实体/μm2、600-1600个实体/μm2、600-1200个实体/μm2、800-2000个实体/μm2、800-1800个实体/μm2、800-1600个实体/μm2、800-1200个实体/μm2、1000-2000个实体/μm2、1000-1800个实体/μm2、1000-1600个实体/μm2或1000-1200个实体/μm2的密度附着至所述基材。
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