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Description
F8R1−2及びF8R3−4メガヌクレアーゼによるゲノムDNAの切断がエクソン1−22の逆位を刺激するかどうかを決定するために、まず、F8R1−2又はF8R3−4メガヌクレアーゼをコードする200ngのmRNAでHEK293細胞をトランスフェクトし、7日後にgDNAを採取した。プライマーセットH1R/H1Fを用いたPCRによってgDNAを分析して、正常エクソン1−22の位置を検出し、プライマーセットH1F/H2/3Rを用いて逆位エクソン1−22の位置を検出した(図8)。図8Aは、モック処理(レーン1)、又はF8R1−2x.15(レーン2)、F8R1−2x.27(レーン3)、F8R3−4x.43(レーン4)、F8R3−4x.70(レーン5)で処理したHEK293細胞からのH1R/H1FプライムPCR反応を搭載したアガロースゲルを示す。レーン6は、未処理のヒト細胞gDNA鋳型を用いた対照PCRを含む。レーン7は鋳型なしのPCR陰性対照を含む。図8Bは、モック処理(レーン1)、又はF8R1−2x.15(レーン2)、F8R1−2x.27(レーン3)、F8R3−4x.43(レーン4)、F8R3−4x.70(レーン5)で処理したHEK293細胞からのH1F/H2/3RプライムPCR反応を搭載したアガロースゲルを示す。レーン6は、未処理のヒト細胞gDNA鋳型を用いた対照PCRを含む。レーン7は鋳型なしのPCR陰性対照を含む。図8BのPCR断片の存在は、本発明に包含されるF8Rメガヌクレアーゼを用いたエクソン1−22の逆位の成功を示す。
F8R9−10、F8R11−12、F8R13−14、及びF8R15−16メガヌクレアーゼによるゲノムDNAの切断がエクソン1−22の逆位を刺激するかどうかを決定するために、まず、各個々のヌクレアーゼをコードする200ngのmRNAでHEK293細胞をトランスフェクトし、トランスフェクション後2日目及び8日目にgDNAを採取した。プライマーセットH1R/H1Fを用いたPCRによって、gDNAを分析して、正常エクソン1−22の位置を検出し、プライマーセットH1F/H2/3Rで逆位エクソン1−22の位置を検出した(図9)。図9は、モック処理(レーン1)、又はF8R9−10x.38(レーン2)、F8R9−10x.70(レーン3)、F8R11−12x.56(レーン4)、F8R11−12x.69(レーン5)、F8R13−14x.3(レーン6)、F8R13−14x.13(レーン7)、F8R15−16x.14(レーン8)、F8R15−16x.85(レーン9)で処理したHEK293細胞からのH1R/H1FプライムPCR反応(上)及びH1F/H2/3RプライムPCR反応(下)を搭載したアガロースゲルを示す。レーン10は、未処理のヒト細胞gDNA鋳型を用いた対照PCRを含む。レーン11は鋳型なしのPCR陰性対照を含む。H1F/H2/3RプライムPCR反応(図9の下半分)におけるPCR断片の存在は、本発明に包含されるF8Rメガヌクレアーゼを用いたエクソン1−22の逆位の成功を示している。
2つの逆向きint22h反復間の患者T細胞におけるゲノム断片の首尾良い復帰の際に、逆位断片上に位置付けられているHIUプライマー結合部位は、H3D及びHIDプライマー結合部位に対して再配向される。HIU/HID PCRは、12kbアンプリコンを生じ、第VIII因子遺伝子の野生型配置への復帰を示す。PCR断片をアガロースゲル電気泳動で分析し、臭化エチジウムで可視化した。
F8R3−4x.43、F8R11−12x.69、又はF8R15−16x.14ヌクレアーゼ(又は対照としてのGFP)をコードするmRNAで処理した血友病A患者T細胞由来のゲノムDNAを、長距離PCRで分析した(図12)。GFP mRNAで処理した患者T細胞から単離されたゲノムDNAからは、H3D/HID断片のみが増幅され得る(レーン1a及びレーン1b)。F8R3−4x.43、F8R11−12x.69、又はF8R15−16x.14ヌクレアーゼ処理した患者T細胞のゲノムDNAをPCR鋳型として使用すると、HIU/HIDプライマー及びH3D/HIDプライマーの両方の組み合わせが、それぞれサイン野生型(約12kb)及び逆位(約11kb)のアンプリコンを生じた(レーン3a及びレーン3b:F8R3−4x.43、レーン4a及びレーン4b:F8R11−12x.69、レーン5a及びレーン5b:F8R15−16x.14)。ヌクレアーゼ処理により、編集されたゲノムと編集されていないゲノムとの細胞の混合集団が生成されたため、H3D/HID断片は、F8Rヌクレアーゼ処理した患者T細胞のゲノムDNAから依然として増幅されていた。
Claims (15)
- 第VIII因子遺伝子のエクソン1−22の逆位を特徴とする血友病Aを有する被験体を治療するための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、操作されたヌクレアーゼをコードする核酸であって、前記操作されたヌクレアーゼがインビボで発現する、核酸と、を含み、
前記操作されたヌクレアーゼは、前記第VIII因子遺伝子のint22h−1配列内に位置する第1の認識配列に対する特異性を有する、医薬組成物。 - 前記int22h−1配列が、配列番号3又は配列番号4と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記int22h−1配列が、配列番号3又は配列番号4を含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記第1の認識配列がF8A1コード配列内にある、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記F8A1コード配列が、配列番号5又は配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記F8A1コード配列が、配列番号5又は配列番号6を含む、請求項4又は5に記載の医薬組成物。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、前記第1の認識配列と同一である第2の認識配列に対して特異性を有し、前記第2の認識配列が、X染色体の前記第VIII因子遺伝子のテロメアの反復配列に位置し、前記反復配列は、前記int22h−1配列に対して逆向きであることを除いて、前記int22h−1配列と同一であるか、又は高度の相同性を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記反復配列が、int22h−2配列又はint22h−3配列である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記核酸がmRNAである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、前記核酸を含む組換えDNA構築物を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物が、前記核酸を含むウイルスベクターを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項11に記載の医薬組成物。
- 前記操作されたヌクレアーゼが、操作されたメガヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、コンパクトTALEN、CRISPR、又はmegaTALである、請求項1〜12のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記操作されたヌクレアーゼが操作されたメガヌクレアーゼである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の医薬組成物。
- 前記第1の認識配列が配列番号9を含む、請求項14に記載の医薬組成物。
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