KR20220009950A - 효소 발현의 조절 및 자가-불활성화를 위한 조성물 그리고 효소의 오프-타깃 활동성의 조정 방법 - Google Patents

효소 발현의 조절 및 자가-불활성화를 위한 조성물 그리고 효소의 오프-타깃 활동성의 조정 방법 Download PDF

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제임스 엠. 윌슨
카밀로 브레톤
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

뉴클레아제가 표적되는 서열을 갖는 숙주 세포에 전달 이후 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 링크되는 뉴클레아제 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열 그리고 뉴클레아제에 대한 표적 서열 또는 이의 발현 이후 뉴클레아제에 의해 인식되는 돌연변이된 표적 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레아제 조정 서열을 포함하는 유전자 편집 뉴클레아제 발현 카세트가 제공된다. 유전자 편집 뉴클레아제 발현 카세트를 포함하는 벡터가 제공된다. 동종을 함유하는 조성물 및 사용 방법이 또한 제공된다.

Description

효소 발현의 조절 및 자가-불활성화를 위한 조성물 그리고 효소의 오프-타깃 활동성의 조정 방법
발명의 배경
조작된 뉴클레아제의 용도는 기능장애적 유전자 편집에 대하여 기재되었다. 상기 뉴클레아제의 AAV-매개된 전달은 또한 기재되었다. 하지만, 뉴클레아제의 AAV-매개된 전달이 반복된 재투여에 대하여 필요를 회피하는 반면, 생성된 뉴클레아제는 벡터 형질도입 이후 표적 조직에서 연속적으로 발현되고, 이는 면역 반응 및 세포성 독성을 유도할 수 있다.
추가로, 양쪽 시험관내 및 생체내 연구는 뉴클레아제가, 전달 비히클과 무관하게, 오프-타깃 활동성을 시사하는, 게놈의 다른 영역에서 인델 (삽입 및 결실)을 생성한다는 것을 보여주었다.
필요한 것은 유전자 편집을 위한 개선된 조성물 및 방법이다.
발명의 개요
오프-타깃 활동성의 감소를 제공하고, 그래서 전달된 효소의 안전성을 개선하는 효소를 위한 전달 시스템이 제공된다. 시스템은 유전자가 세포에서 지속하는 시스템, 예컨대 AAV-매개된 전달에 의해 전달된 효소에서 및/또는 유전자 편집 요법에서 사용에 특히 양호하게 맞춤화된다.
일 양태에서, 자가-조정 유전자 편집 뉴클레아제 발현 카세트가 제공된다. 발현 카세트는 (a) 뉴클레아제가 표적되는 서열을 갖는 숙주 세포에 전달 이후 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 링크되는 뉴클레아제 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열; 및 (b) 뉴클레아제에 대한 표적 서열 또는 이의 발현 이후 뉴클레아제에 의해 인식되는 돌연변이된 표적 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레아제 조정 서열을 포함한다. 임의로, 코딩 서열은 뉴클레아제 코딩 서열과 프레임내 적어도 하나의 펩타이드 분해 신호를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 단백질 분해 신호는 10개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 단백질 분해 서열은 약 42개 아미노산 길이의 PEST 서열이다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 1개 초과 단백질 분해 신호를 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는, 뉴클레아제 코딩 서열 업스트림, 다운스트림 또는 안에서 정착될 수 있는, 돌연변이된 표적 서열을 포함한다. 발현 카세트가 2개 이상 뉴클레아제 조정 서열을 갖는 구현예에서, 이들은 독립적으로 정착될 수 있거나 동일한 또는 상이한 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트는 1개 초과 단백질 분해 신호를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 단백질 분해 서열에 융합된 메가뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 및 숙주 세포에서 융합 단백질로서 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는 자가-불활성화 메가뉴클레아제 발현 카세트가 제공된다. 특정 구현예에서, 단백질 분해 신호는 10개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이이다. 특정 구현예에서, 단백질 분해 서열은 약 42개 아미노산 길이의 PEST 서열이다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 1개 초과 단백질 분해 신호를 포함한다.
특정 구현예에서, 유전자 편집에 유용한 재조합성 AAV는 AAV 캡시드 그리고 AAV 캡시드에서 패키징된 벡터 게놈을 포함하고, 상기 벡터 게놈은 발현 카세트를 캡시드에 패키징하는데 요구된 AAV 역위된 말단 반복부 (ITR) 서열 그리고 선행 단락에서 기재된 대로 발현 카세트를 포함함.
본원에 기재된 경우에 발현 카세트 그리고 1개 이상의 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 비-벡터 기반된 전달 시스템, 예를 들면, 액체 나노입자 (LNP)에 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 비-바이러스성 벡터 (예를 들면, 플라스미드 또는 다른 유전적 요소)로 조작되고, 이 재조합성 벡터는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 혼합되어 약학적 조성물을 형성한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 바이러스성 벡터로 조작되고, 이 재조합성 벡터는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 혼합되어 약학적 조성물을 형성한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 벡터 게놈으로 조작되고 AAV 캡시드에 패키징되어 재조합성 아데노-연관된 바이러스 (rAAV)를 형성하고, rAAV는 담체, 희석제 및/또는 부형제와 혼합되어 약학적 조성물을 형성한다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 발현 카세트, 비-바이러스성 벡터 (예를 들면, DNA 또는 RNA), 또는 바이러스성 벡터 (예를 들면,rAAV 또는 렌티바이러스)는, 본원에 기재된 경우에 환자에서 유전자 편집을 위하여 투여가능하다. 특정 구현예에서, 본 방법은 비-배아성 유전자 편집에 유용하다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 (예를 들면, 출생 내지 약 9 개월)이다. 특정 구현예에서, 환자는 유아보다 나이가 많은, 예를 들면, 12 개월 이상이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 약학적 조성물은 환자에서 유전자 편집을 위하여 투여가능하다. 특정 구현예에서, 본 방법은 비-배아성 유전자 편집에 유용하다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 (예를 들면, 출생 내지 약 9 개월)이다. 특정 구현예에서, 환자는 유아보다 나이가 많은, 예를 들면, 12 개월 이상이다.
본 발명의 다른 양태 및 이점은 본 발명의 하기 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 AAV "자살" 벡터의 도식적 표현이다. AAV 벡터는 표적 서열 (*가 있는 다크 바), 8개 미스매치를 함유하는 돌연변이체 표적 서열 (*mut가 있는 다크 바), 및 PEST 서열 (선이 있는 블랙 바)의 조합으로 메가뉴클레아제 (M2PCSK9)를 삽입시킴으로써 작제되었다.
도 2a는 생체내 실험의 시간선을 도시한다. 마우스 연구. 인간 PCSK9 (hPCSK9)-발현 AAV는 RAG KO 마우스에서 정맥내로 (IV) 주사되었다. 2 주후, AAV 자살 벡터 또는 상응하는 대조군 (AAV8.M2PCSK9)의 단일 용량은 처리된 마우스에 IV 주사되었다. 비-인간 영장류 연구. AAV.MutTarget.M2PCSK9-PEST 또는 AAV.M2PCSK9는 붉은털 원숭이에 투여되었다. 간 생검은 처리후 18 일차 또는 128 일차에 수집되었다.
도 2b는 정제된 AAV 벡터내 표적 영역에서 인델을 도시한다.
도 3a (좌) 및 도 3b (우)는 hPCSK9 유전자에서 그리고 AAV 자살 벡터에서 메가뉴클레아제-유도된 인델을 도시한다. 마우스는 지시된 AAV 벡터로 처리되었고 AAV9.hPCSK9 투여후 지시된 시간에 안락사되었다. 각 표적에 대하여 인델%는 총 판독의 백분율로서 도시된다.
도 4a (좌) 및 도 4b (우)는 메가뉴클레아제 자살 시스템의 생체내 오프-타깃 활동성을 도시한다. 숙주 게놈에서 고유 AAV 통합 부위의 수는 AAV9.hPCSK9 투여후 4 및 9 주에 수득된 간 DNA 샘플에서 식별되었고 정량화되었다 (좌). 수득된 목록으로부터, 가장 흔한 오프-타깃 자리들 중 9개는 선택되었고 이들 좌위에서 인델%는 NGS에 의해 계산되었고 메가뉴클레아제-단독 대조군에 비해 플롯팅되었다 (우).
도 5a - 5i는 AAV 자살 벡터가 붉은털 원숭이에 투여되었던 때 결과를 도시한다. 벡터 투여후 상이한 시간에 혈청 샘플에서 PCSK9 (도 5a) 및 LDL 단백질 수준 (도 5b). 앰플리콘-Seq (도 5c) 또는 AMP-Seq 방법 (도 5d)에 의해 검출된 경우에 PCSK9 유전자 안에서 표적 서열에서의 인델% 그리고 벡터 투여후 18 일차 (d18)에 고유 오프-타깃 부위의 수 (도 5e). d18에 NHP 간에서 AAV 게놈 카피 수 및 메가뉴클레아제 mRNA 수준 (도 5f). 메가뉴클레아제 DNA/mRNA에 특이적인 프로브를 사용하여 d18에 간 생검으로부터 수득된 간 섹션에서 제자리 하이브리드화 (도 5g). PCSK9 표적 영역에서 편집은 이전에 관찰된 경우에 PCSK9에서 저감을 유도하였고 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725), 이는 또한 벡터 주사후 상이한 시간에 LDL 수준에서 감소로 이어진다 (도 5h 및 5i, 각각).
도 6은 AAV.TTR "자살" 벡터의 도식적 표현이다. AAV 벡터는 표적 서열, 8개 미스매치를 함유하는 돌연변이체 표적 서열, 및 PEST 서열의 조합으로 메가뉴클레아제를 삽입시킴으로써 작제되었다.
도 7a - 7c는 게놈성 DNA에 통합된 AAV ITR의 서열 분석을 제공한다. 도 7a는 모든 AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9 처리된 간 샘플 (SRR6343442)에 대하여 온-타깃 AMP-Seq 데이터의 메타-분석이다. 우리의 목적은 벡터 ITR 안에서 가장 빈번한 ITR 통합 시작 부위를 식별하는 것이었다. 도 7b는 AAV2 5' ITR (NC_001401.2)의 이차 구조를 도시한다. 가장 빈번하게 통합된 시작 부위 위치가 도시된다. ITR-Seq 프라이머 GSP_ITR3.AAV2 결합 부위는 적색으로 강조된다. A-A', B-B' 및 C-C', 회문식 아암; RBE, rep-결합 요소; TRS, 말단 분해능 부위. 도 7c는 ITR 통합 부위의 게놈식 식별에 사용된 ITR-Seq 프로토콜의 도식적 다이아그램이다.
도 8a - 8c는 생체내 AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9의 온- 및 오프-타깃 활동성의 분석을 도시한다. 도 8a는 벡터 투여 이후 17 및 128 일에 수집된 AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9 처리된 간 샘플에 대하여 ITR-Seq 식별된 통합 부위이다. 도 8b는, 엑손, 인트론, 유전자간, 전사 시작 부위 (TSS), 및 전사 종결 부위 (TTS) 안에서 부위들의 수를 도시하는, ITR 식별된 ITR 통합 부위의 기능적 주석이다. 도 8c는, 식별된 부위의 총 수의 백분율로서 나타나는, 의도된 표적 서열을 매칭하는 뉴클레오타이드의 수에 따라 컴퓨터로 생성된 랜덤 DNA 서열 (점선)에 대하여 또는 어느 한쪽 M1PCSK9 또는 M2PCSK9 (바)로 처리된 2마리 동물에 대하여 17/18 일차에 ITR 통합 부위의 분포를 도시한다
도 9a - 9d는 GUIDE-Seq 및 ITR-Seq 식별된 오프-타깃의 비교를 도시한다. AAV 투여후 17 일차에 3x1013 GC/kg (도 9a), 6x1012 GC/kg (도 9b)으로 AAV8-M1PCSK9 또는 6x1012 GC/kg (도 9c 및 도 9d)으로 AAV8-M2PCSK9로부터 생체내 ITR-Seq (좌 섹션) 그리고 M1PCSK9 또는 M2PCSK9에 대하여 시험관내 GUIDE-Seq (우 섹션)으로부터 수득된 식별된 표적 부위의 샘플 세트 교차점. GUIDE-Seq가 아닌 ITR-Seq (좌 섹션)에 의해 식별된 오프-타깃은 생체내 ITR-Seq에 의해 식별된 오프-타깃의 총 수의 백분율로서 지시된다. 양쪽 ITR-Seq 및 GUIDE-Seq에 의해 식별된 오프-타깃은 벤 다이어그램의 백색 섹션으로서 도시된다.
도 10a-10b는 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열이 효소 코딩 서열에서 삽입되는 구현예를 도시한다. 도 10a는 10-아미노산 핵 국재화 신호 (NLS) 이어서 표적 서열 (아미노산 10-20로부터 발현된 단백질, 이어서 뉴클레아제의 활성 부문을 보여주는 아미노산 정렬이다. 제1 아미노산 서열 M2PCSK9는 이의 NLS가 있는 참조 메가뉴클레아제의 단편, 다른 작제물이 삽입할 장소를 언급하는 공간, 그리고 위치 18에서 시작하는 뉴클레아제의 서열을 보여준다. M2PCSK9[역위된 표적 #1]은 표적 서열이 NLS와 효소 사이 안티-센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9[표적 #1]은 표적 서열이 NLS와 효소 사이 센스 가닥에서 삽입하였던 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9 [표적 #2]는 상이한 표적 서열이 NLS와 효소 사이 센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9 [역위된 표적 #2]는 (mut)표적 서열이 NLS와 효소 사이 안티-센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. [표적]M2PCSK9는 22 bp 표적 서열이 NLS 뒤에 코딩 서열을 대체하여, 효소의 6개 아미노산의 치환을 초래하는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. [역위된표적]M2PCSK9는 22 bp 표적 서열이 반대편 가닥에서 NLS 뒤에 코딩 서열을 대체하여, 효소의 7개 아미노산의 대체를 초래하는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. 도 10b는, 유비퀴틴-독립적인 단일 단백질 분해 신호 (데그론)을 갖는 것 (AR-6)인, PCSK9 메가뉴클레아제 융합 단백질, 및 2개 단백질 분해 신호, AR-6 및 PEST를 갖는 PCSK9 메가뉴클레아제 융합 단백질의 설계를 도시한다.
발명의 상세한 설명
본원에 제공된 조성물 및 방법은 (예를 들면, 발현 카세트의 전달 이후) 지속적으로 발현된 효소의 오프-타깃 활동성을 최소화하도록 및/또는 발현된 효소의 활동성을 조정하기 위해 설계된다. 세포에서 축적할 수 있는 비-분비 효소 및/또는 분비에 앞서 원하던 수준보다 높게 축적하는 효소를 이용한 이들 조성물 및 방법의 용도가 특히 바람직하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 유전자 편집 효소, 특히 메가뉴클레아제를 이용한 용도에 잘 어울린다. 하지만, 다른 적용은 당업자에게 분명할 것이다.
본원에 사용된 경우에, 적당한 효소는 메가뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제, 전사 활성제형 (TAL) 이펙터 뉴클레아제 (TALEN), 클러스터링된, 규칙적으로 간격화된 짧은 회문식 반복부 (CRISPR)/엔도뉴클레아제 (Cas9, Cpf1, 등)로부터 선택될 수 있다. 적당한 메가뉴클레아제의 예는, 예를 들면, 미국 특허 8,445,251; US 9,340,777; US 9,434,931; US 9,683,257, 및 WO 2018/195449에서 기재된다. 다른 적당한 효소는 핵산-프로그램화된 방식으로 RNA를 결합시킬 수 있는 뉴클레아제-불활성 화농성 연쇄상구균 CRISPR/Cas9 (Nelles 등, Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9, Cell, 165(2):P488-96 (April 2016)), 및 염기 편집기 (예를 들면, Levy 등. Cytosine and adenine base editing of the brain, liver, retina, heart and skeletal muscle of mice via adeno-associated viruses, Nature Biomedical Engineering, 4, 97-110 (Jan 2020))를 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제가 아니다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 CRISPR-연관된 뉴클레아제가 아니다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 TALEN이 아니다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제는 귀소 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG (서열번호: 1) 패밀리의 구성원이다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제는 22개 염기 쌍 인식 서열 서열번호: 2 - CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG를 인식하고 컷팅하는 귀소 엔도뉴클레아제의 I-CreI 패밀리의 구성원이다. 예를 들면, WO 2009/059195, 참고. 포유류, 효모, 식물, 박테리아성, 및 바이러스성 게놈에서의 부위를 포함하는, 광범위하게-발산형 DNA 부위를 표적하기 위해 ICreI 및 다른 귀소 엔도뉴클레아제를 포괄적으로 재설계할 수 있는 모노-LAGLIDADG 귀소 엔도뉴클레아제를 이성적으로-설계하는 방법이 기재되었다 (WO 2007/047859).
적당하게, 본원에 기재된 뉴클레아제에 대한 코딩 서열은, 효소에 대하여 표적 부위를 함유하는 세포에서 효소 - 단백질 분해 신호 (데그론) 또는 효소의 발현을 지시하는 조절 요소에 작동가능하게 링크된, 어느 한쪽 자가-불활성화 구성요소, 자가-조정 구성요소, 또는 양쪽을 추가로 함유하는 발현 카세트로 조작된다.
자가-불활성화 뉴클레아제 융합 단백질
일 구현예에서, 자가-불활성화 뉴클레아제 발현 카세트는 뉴클레아제 및 적어도 하나의 단백질 분해 신호를 포함하는 융합 단백질이 생산되도록 단백질 분해 신호와 프레임내 융합된 뉴클레아제에 대하여 코딩 서열을 함유한다. 일 구현예에서, 자가-불활성화 뉴클레아제 발현 카세트는 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 단백질 분해 신호를 포함하는 융합 단백질이 생산되도록 단백질 분해 신호와 프레임내 융합된 메가뉴클레아제에 대하여 코딩 서열을 함유한다. 편의상, 하이픈화된 구문 용어 "효소 - 단백질 분해 신호"는 상기 융합 단백질을 지칭하는데 사용된다. 이것은 융합 단백질을 카복시 말단에 정착되는 중인 단백질 분해 신호로, 또는 융합 단백질에서 존재하는 중인 단 1개의 상기 단백질 분해 신호로 제한하기 위한 것이 아니다. 유사하게, 효소의 특정한 유형, 예를 들면, 상기 구문에서 "뉴클레아제", "메가뉴클레아제", "엔도뉴클레아제" 및 기타 등등이 특정될 수 있고, 달리 특정되지 않는 한, 제한되지 않는 중인 단백질 분해 신호의 자리 및 수에 관하여 동일한 해석이 적용됨이 이해될 것이다.
본원에 기재된 경우에, 단백질 분해 신호는 효소의 분해를 매개하는 단백질의 한 부문이고, 이는 또한 데그론으로 명칭될 수 있다. 이론에 의한 구속되기의 바램 없이, 이의 천연 기질 (표적 서열)의 존재가 융합 단백질의 효소적 활동성에 의해 감소된 때 효소 (예를 들면, 뉴클레아제) 및 적어도 하나의 단백질 분해 신호를 함유하는 융합 단백질이 세포로부터 효소의 제거를 촉진시킴으로써 온-타깃 효능 손상시킴 없이 오프-타깃 활동성을 감소시키는 것으로 믿어진다. 단백질 분해 신호는 단백질의 반감기를 감소시키고 그러므로 또한 축적된 단백질의 수준을 감소시킨다. 단백질 수준에서 이 저감은 뉴클레아제 오프-타깃 활동성 감소를 돕는 것으로 믿어진다. 펩타이드 분해 신호는 표적 서열에서 효소 (예를 들면, 뉴클레아제)의 활동성과 독립적으로 작업한다.
적당한 단백질 분해 신호는, 예를 들면, PEST 신호, 붕괴 박스, 또는 또 다른 불안정화 펩타이드를 포함할 수 있다.
"PEST" 서열은 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S), 및 트레오닌 (T)이 풍부한 펩타이드 서열이다. 이 서열은 단백질의 세포내 반감기를 감소시키는, 즉, 단백질 분해 신호로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 본원에 제공된 예는 42개 아미노산 (서열번호: 4 KLSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV; 코딩 서열 서열번호: 3)의 PEST 서열을 활용한다. 하지만, 특정 구현예에서, 이 서열을 함유하는 더 긴 아미노산 서열, 또는 이 서열의 더 짧은 아미노산 단편들 단편은 선택될 수 있고, 예를 들면, 서열은 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 또는 41개 아미노산 길이이도록 아미노- 및/또는 카복시-말단에 절단될 수 있다.
특정 구현예에서, 또 다른 단백질 분해 신호 서열은 선택될 수 있다. 상기 단백질 분해 신호 서열은 약 10개 아미노산 내지 약 50개 아미노산 길이, 또는 그들 사이의 값들일 수 있다.
특정 구현예에서, 오르니틴 데카복실라제 (ODC) 데그론은 적당한 단백질 분해 신호 서열의 공급원으로서 선택될 수 있다. [J Erales and P. Coffino, Biochimca et Biophsyica Acta, 1843 (2014) 216-221. 또 다른 구현예에서, 유비퀴틴 데그론은 단백질 분해 신호로서 선택될 수 있다 [KT Fortmann, 등, J Mol Biol. 2015 August 28; 427(17): 2748-2756]. 더욱 다른 데그론은 선택될 수 있다.
단백질 분해 신호는 뉴클레아제 코딩 서열의 아미노 (N-) 말단에 조작될 수 있다. 임의로, 여러 단백질 분해 신호는 존재할 수 있다. 2개 이상 단백질 분해 신호가 존재하는 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 2개 이상 단백질 분해 신호가 들어있는 융합 단백질이 제공되는 경우, 신호들 중 1개 이상이 N-말단에 정착될 수 있고, 신호들 중 1개 이상이 카복시 말단에 정착될 수 있거나, 또는 이들의 조합일 수 있다 (예를 들면, 1개 신호는 N-말단에 정착될 수 있고 1개는 단일 융합 단백질의 카복시 말단에 정착될 수 있고; 1개 신호는 N-말단에 정착될 수 있고 2개 신호는 단일 융합 단백질의 카복시 말단에 정착될 수 있고, 2개 단백질 분해 신호는 N-말단에 정착될 수 있고 1개 신호는 단일 융합 단백질 등의 카복시 말단에 정착될 수 있다).
본원에서 예는 벡터 게놈에서 PEST 서열(들)을 함유하는 AAV 벡터의 용도를 예시한다. 특정 구현예에서, 벡터 게놈은 상이한 벡터 (예를 들면, 재조합성 보카바이러스)에 패키징될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 상이한 바이러스성 벡터에, 비-바이러스성 벡터에, 및/또는 상이한 전달 시스템에 패키징될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "발현 카세트"는 코딩 서열, 프로모터를 포함하고, 이에 대하여 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 지칭하고, 카세트는 바이러스성 벡터 (예를 들면, 바이러스성 입자)의 캡시드에 패키징될 수 있고/거나 유전적 요소로 조작될 수 있다. 전형적으로, 바이러스성 벡터를 생성하기 위하여 상기 발현 카세트는 바이러스성 게놈 및 다른 발현 대조군 서열 예컨대 본원에 기재된 것들의 신호를 패키징시킴으로써 측접된 본원에 기재된 서열을 함유한다.
발현 카세트는 전형적으로 발현 대조군 서열 또는 조절 서열의 부분으로서 프로모터 서열을 함유한다. 일 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 선택될 수 있다. 예를 들어, 간-특이적 프로모터를 원하면, 티록신 결합 글로불린 (TBG), 또는 다른 간-특이적 프로모터 [예를 들면, The Liver Specific Gene Promoter Database, Cold Spring Harbor, rulai.schl.edu/LSPD, 참고] 예컨대, 예를 들면, 알파 1 항-트립신 (A1AT); 인간 알부민 (Miyatake 등, J. Virol., 71:5124 32 (1997), humAlb); B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (Sandig 등, Gene Ther., 3:1002 9 (1996)); TTR 최소 인핸서/프로모터; 알파-항트립신 프로모터; T7 프로모터; 및 (인트론없는 scAAV를 요구하는) LSP (845 nt)25로부터 선택할 수 있다. 다른 프로모터, 예컨대 바이러스성 프로모터, 구성적 프로모터, 조절가능한 프로모터 [예를 들면, WO 2011/126808 및 WO 2013/049493, 참고], 또는 생리학적 단서에 반응적인 프로모터는 사용될 수 있다 본원에 기재된 벡터에서 활용될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터 또는 프로모터/인핸서는 서열번호: 11-16 중 임의의 것에서 표시된 것이다.
프로모터 이외에, 발현 카세트 및/또는 벡터는 다른 적당한 "조절 요소" 또는 "조절 서열"을 함유할 수 있고, 이는 비제한적으로 인핸서; 전사 인자; 전사 종결자; 효율적 RNA 가공 신호 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호 (polyA); 세포질성 mRNA, 예를 들어 우드처크 간염 바이러스 (WHP) 전사후 조절 요소 (WPRE)를 안정시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코자크 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 인코딩된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 적당한 polyA 서열의 예는, 예를 들면, SV40, 소 성장 호르몬 (bGH), 및 TK polyA를 포함한다. 적당한 인핸서의 예는, 예를 들면, 알파 태아단백질 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP (TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서)를, 다른 것들 중에서, 포함한다. 일 구현예에서, 인트론은 서열번호: 11-16 중 임의의 것에서 표시된 것이다. 일 구현예에서, polyA는 서열번호: 11-16 중 임의의 것에서 표시된 것이다.
이들 대조군 서열 또는 조절 서열은 단백질 및 펩타이드 코딩 서열에 작동가능하게 링크된다.
자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트
특정 구현예에서, 뉴클레아제가 표적되는 서열을 갖는 숙주 세포에 전달 이후 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 링크되는 뉴클레아제 코딩 서열 그리고 뉴클레아제에 대하여 표적 서열 또는 이의 발현 이후 뉴클레아제에 의해 인식되는 돌연변이된 표적 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레아제 조정 서열을 함유하는 자가-조정 유전자 편집 뉴클레아제 발현 카세트가 제공된다. 임의로, 이들 구현예에서 뉴클레아제는, 참고로 편입되는, 이전의 섹션에서 기재된 경우에 단백질 분해 신호가 있는 융합 단백질의 형태일 수 있다.
용어 "인식 서열" 또는 "인식 부위"는 엔도뉴클레아제에 의해 결합되고 분할되는 핵산 서열 (예를 들면, cDNA를 포함하는, 예를 들면, DNA)을 지칭한다. 특정 메가뉴클레아제 경우, 인식 서열은 22개 염기 쌍 길이이고 4개 염기 쌍에 의해 분리되는 역위된, 9개 염기 쌍 "절반 부위"의 쌍을 포함한다. 단일-쇄 메가뉴클레아제의 경우에, 단백질의 N-말단 도메인은 제1 절반-부위를 접촉시키고 단백질의 C-말단 도메인은 제2 절반-부위를 접촉시킨다. 하지만, 다른 뉴클레아제 및 메가뉴클레아제는 본원에 기재된 경우에 더 짧은 또는 더 긴 인식 부위 (예를 들면, 약 10개 염기 쌍 내지 약 40개 염기 쌍)를 가질 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 뉴클레아제에 대하여 인식 서열을 포함하는 세포의 DNA의 영역을 지칭한다. 특정 구현예에서, 표적 부위 또는 표적 서열은 세포의 염색체성 DNA이다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 조정 서열은 세포에서 인식 부위의 전장보다 세포에서 뉴클레아제 인식 부위의 서열과 동일한 (100% 동일한) 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 뉴클레아제 조정 서열은 표적 서열과 100% 동일하지만, 최고 5 - 10%만큼 길이 (예를 들면, 22 bp 인식 부위에 대하여, 약 18-20 bp 길이)가 더 짧다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 조정 서열은 세포에서 인식 부위와 비교된 경우에 돌연변이체 서열을 갖는 서열을 갖는다. 상기 서열은 1개 이상의 염기 쌍에서 미스매치를 갖도록 설계된다.
아래 예에서, 예시된 메가뉴클레아제는 22bp 서열을 인식하고 결과적으로 이들 발현 카세트에서 선택된 각 효소 조정 서열은 22bp이었다. 이들 22bp 서열에 대하여 돌연변이체 표적 서열은 최고 35 내지 37% 미스매치, 즉, 표적 서열과 상이한 8 bp를 함유하였다. 하지만, 다른 변동은 당업자에게 분명할 것이다.
미스매치의 더 낮은 또는 더 높은 백분율은 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 1개 미스매치만이 존재한다. 다른 구현예에서, 2 내지 12개 미스매치가 존재한다. 특정 구현예에서, 미스매치는 비-연속적이다. 특정 구현예에서 미스매치의 2개 또는 3개는 연속 뉴클레오타이드일 수 있다. 임의로 단일 미스매치 및 연속 미스매치 (예를 들면, 2개 또는 3개)의 조합은 단일 돌연변이체 표적에서 돌연변이되지 않은 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 구현예에서, 다른 미스매치 민감성 뉴클레아제는 더 짧은 또는 더 긴 서열, 예를 들면, 약 12개 염기 쌍 내지 40개 염기 쌍 길이를 인식할 수 있다. 돌연변이체 표적 서열은 표적 세포에서 효소의 의도된 표적 서열로부터 0.5% 내지 45% 미스매치 (즉, 발산형 뉴클레오타이드 서열)를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 표적 서열은, 예를 들어, 오프-타깃 예측/식별 방법 (예컨대 GUIDE-Seq 또는 ITR-Seq)을 사용함으로써, 그리고 그들의 순위 (이들 서열에서의 인델%, 또는 GUIDE-Seq 판독, ITR-Seq 판독의 수)에 따라, 상이한 수준에서, 또는 심지어 의도된 표적 서열보다 더 양호하게 작업할 수 있는 것들을 선택함으로써 조작된다.
특정 구현예에서, 효소 조정 서열, 예를 들면, 돌연변이체 표적 서열 또는 표적 서열은 효소의 발현을 지시하는 프로모터 서열의 다운스트림 정착될 수 있다.
특정 구현예에서, 효소 조정 서열, 예를 들면, 돌연변이체 표적 서열 또는 표적 서열은 효소 코딩 서열의 다운스트림 정착될 수 있다.
특정 구현예에서, 효소 조정 서열, 예를 들면, 돌연변이체 표적 서열 또는 표적 서열은 뉴클레아제 코딩 서열 안에서 정착될 수 있다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 발현 카세트 (또는 동종을 함유하는 벡터 게놈)는 여러 효소 조정 서열을 가지며, 이들은 서로 동일할 수 있거나 상이할 수 있다. 효소 조정 서열은 탠덤으로 정착될 수 있거나, 비-코딩 스페이서, 인트론, 인트론들 사이, 또는 또 다른 조절 요소, 또는 효소 코딩 서열 중 1개 이상만큼 서로 분리될 수 있다. 예를 들어, 적어도 제1 효소 조정 서열은 효소 코딩 서열의 업스트림 정착될 수 있고 제2 효소 조정 서열은 (예를 들면, polyA에 앞서) 효소 코딩 서열의 다운스트림 정착될 수 있다. 상이한 여러 효소 조정 서열이 존재하는 경우, 적어도 1개는 돌연변이체 표적 서열이다. 상기 구현예에서, 2개 이상 상이한 돌연변이체 표적 서열은 뉴클레아제 발현 카세트에서 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 효소 조정 서열은 뉴클레아제 코딩 서열 안에서 (예를 들면, 이의 5' 또는 3' 말단에) 정착된다. 일 구현예에서 표적 서열은 서열번호: 5 - TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA이다. 일 구현예에서, 돌연변이체 표적 서열은 서열번호: 6 - TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA이다.
일 구현예에서, PCSK9 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 WO 2018/195449A1에서 기재된 것들로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, TTR 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 구현예에서, TTR-표적은 서열번호: 7: GCTGGACTGGTATTTGTGTCTG이다. 특정 구현예에서, TTR-MutTarget은 서열 서열번호: 8: T C G GGACT TT T G TTTG CC TCT T 를 갖는다.
일 구현예에서, HOA 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
일 구현예에서, BCKDC 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
일 구현예에서, APOC3 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다.
일 구현예에서, PCSK9 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
일 구현예에서, TTR 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
임의로, 발현 카세트는 번역되지 않은 영역(들)에서 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. miRNA 표적 서열은 트랜스진 발현이 바람직하지 않고/거나 트랜스진 발현의 감소된 수준이 바람직한 세포에서 존재하는 miRNA에 의해 특이적으로 인식되도록 설계된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 후근 신경절에서 뉴클레아제의 발현을 특이적으로 감소시키는 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, miRNA 표적 서열은 3' UTR, 5' UTR, 및/또는 양쪽 3' 및 5' UTR에서 정착되고, 일부 구현예에서, miRNA 표적 서열은 발현 카세트에서 조절 서열에 작동가능하게 링크된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 drg-특이적 miRNA 표적 서열의 적어도 2개 탠덤 반복부를 포함하고, 여기서 적어도 2개 탠덤 반복부는 동일할 수 있거나 상이할 수 있는 적어도 제1 miRNA 표적 서열 및 적어도 제2 miRNA 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 탠덤 miRNA 표적 서열은 연속적이거나 1 내지 10개 핵산의 스페이서에 의해 분리되고, 여기서 상기 스페이서는 miRNA 표적 서열이 아니다. miRNA DRG-특이적 서열의 논의는, "Compositions for DRG-Specific Reduction of Transgene Expression" 명칭으로, 2019년 12월 20일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US19/67872에서 제공되고, 이 문헌은 본원에 참고로 구체적으로 편입된다.
바이러스성 및 비-바이러스성 벡터
뉴클레아제 코딩 서열 및 적어도 하나의 단백질 분해 신호 및/또는 적어도 하나의 표적 또는 돌연변이체 표적 부위를 함유하는, 본원에 기재된 발현 카세트는 표적 세포에 전달을 위하여 임의의 적당한 유전적 요소로 조작될 수 있다.
본원에 사용된 경우에 "벡터"는 상기 핵산 서열의 복제 또는 발현을 위하여 적절한 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 서열을 포함하는 생물학적 또는 화학적 모이어티이다. 공통 벡터는 비-바이러스성 벡터 및 바이러스성 벡터를 포함한다. 본원에 사용된 경우에, 비-바이러스성 시스템은 나노입자, 전기천공 시스템 및 신규 생체재료, 노출된 DNA, 파아지, 트랜스포존, 플라스미드, 코스미드 (Phillip McClean, www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/-plsc731/cloning/cloning4.htm) 및 인공 염색체 (Gong, Shiaoching, 등. "A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes." Nature 425.6961 (2003): 917-925)로부터 선택될 수 있다.
"플라스미드" 또는 "플라스미드 벡터"는 일반적으로 벡터 명칭에 의해 선행되고/거나 후행되는 소문자 p에 의해 본원에 지정된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 플라스미드, 다른 클로닝 및 발현 벡터, 이들의 특성, 및 이들의 작제/조종 방법은 당업자에게 용이하게 분명하다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 핵산 서열 또는 본원에 기재된 경우에 발현 카세트는, 거기에 운반된 뉴클레아제 서열을 이동시키는, 숙주 세포, 예를 들면, 노출된 DNA, 파아지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜, 등에의 전달에 및/또는 바이러스성 벡터 생성에 유용한 적당한 유전적 요소 (벡터)로 조작된다. 선택된 벡터는, 형질감염, 전기천공, 리포좀 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅된 펠릿, 바이러스성 감염 및 원형질체 융합을 포함하는, 임의의 적당한 방법에 의해 전달될 수 있다. 상기 작제물을 만드는데 사용된 방법은 핵산 조종에 능숙한 이들에게 알려지고 유전 공학, 재조합 공학 및 합성 기법을 포함한다. 예를 들면, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 참고.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 바이러스성 캡시드에 패키징하기 위하여 벡터 게놈에서 정착된다. 예를 들어, AAV 벡터 게놈 경우, 발현 카세트의 구성요소는 AAV 역위된 말단 반복부 서열에 의해 극단 5' 말단 및 극단 3' 말단에 측접된다. 예를 들어, 5' AAV ITR, 발현 카세트, 3' AAV ITR. 다른 구현예에서, 자가-상보적 AAV는 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스성 시스템, 렌티바이러스 벡터 시스템, 또는 아데노바이러스성 시스템은 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 벡터 게놈은 서열번호: 11-16 중 임의의 것에서 표시된 것이다.
일 구현예에서, PCSK9 메가뉴클레아제 및 PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 WO 2018/195449A1에서 기재된 것들로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에서, TTR 메가뉴클레아제 및 PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다.
일 구현예에서, HOA1-2 또는 HOA3-4 메가뉴클레아제 및 PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다.
일 구현예에서, BCKDC 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다.
일 구현예에서, APOC3 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST) 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다.
일 구현예에서, PCSK9 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 인코딩하는 제공되는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
일 구현예에서, TTR 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
일 구현예에서, HOA1-2 또는 HOA3-4 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
일 구현예에서, APOC3 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
일 구현예에서, BCKDC 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터가 제공된다. 특정 구현예에서, 메가뉴클레아제는 메가뉴클레아제-PEST 융합 단백질로서 발현된다.
임의의 적당한 비-바이러스성 벡터 (예를 들면, 플라스미드 또는 다른 유전적 요소), 또는 바이러스성 벡터는 선택될 수 있다. 바이러스성 벡터는 재조합성 보카바이러스, 재조합성 렌티바이러스, 재조합성 아데노바이러스, 또는 재조합성 아데노-연관된 바이러스일 수 있다.
AAV 벡터
특정 구현예에서, 재조합성 AAV가 제공된다. "재조합성 AAV" 또는 "rAAV"는 2개 요소, AAV 캡시드 및 AAV 캡시드 안에서 패키징된 적어도 비-AAV 코딩 서열을 함유하는 벡터 게놈을 함유하는 DNAse-저항성 바이러스성 입자이다. 달리 특정되지 않는 한, 이 용어는 문구 "rAAV 벡터"와 호환적으로 사용될 수 있다. rAAV는, 임의의 기능적 AAV rep 유전자 또는 기능적 AAV cap 유전자가 부족하고 자손을 생성할 수 없기 때문에, "복제-결함성 바이러스" 또는 "바이러스성 벡터"이다. 특정 구현예에서, 유일한 AAV 서열은, ITR들 사이 정착된 조절 서열 및 유전자가 AAV 캡시드 안에서 패키징되게 하기 위해 벡터 게놈의 극단 5' 및 3' 말단에 전형적으로 정착된, AAV 역위된 말단 반복부 서열 (ITR)이다.
AAV 캡시드의 공급원은 수십개의 천연 발생 및 이용가능한 아데노-연관된 바이러스, 뿐만 아니라 조작된 AAV 중 임의의 하나일 수 있다. 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 바이러스성 벡터는 표적 세포에 전달을 위하여 패키징된 핵산 서열인 AAV 단백질 캡시드를 갖는 AAV DNase-저항성 입자이다. AAV 캡시드는, 선택된 AAV에 의존하여, 대략 1:1:10 내지 1:1:20의 비율로 정이십면체 대칭으로 배열되는, 60개 캡시드 (cap) 단백질 서브유닛, VP1, VP2, 및 VP3으로 구성된다. 다양한 AAV는 상기 식별된 경우에 AAV 바이러스성 벡터의 캡시드에 대하여 공급원으로서 선택될 수 있다. 예를 들면, 미국 공개 특허 출원 번호 2007-0036760-A1; 미국 공개 특허 출원 번호 2009-0197338-A1; EP 1310571, 참고. 또한, WO 2003/042397 (AAV7 및 다른 유인원 AAV), 미국 특허 7790449 및 미국 특허 7282199 (AAV8), WO 2005/033321 및 US 7,906,111 (AAV9), 및 WO 2006/110689, WO 2003/042397 (rh.10) 및 WO 2018/160582 (AAVhu68) 참고. 이들 문헌은 또한 AAV를 생성하기 위하여 선택될 수 있는 다른 AAV를 기재하고 참고로 편입된다. 달리 특정되지 않는 한, AAV 캡시드, ITR, 및 본원에 기재된 다른 선택된 AAV 구성요소는, 제한 없이, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV8bp, AAV7M8, AAVAnc80, AAVrh10, 및 AAVPHP.B로서 흔히 식별된 AAV 그리고 알려진 또는 언급된 AAV의 임의의 것의 변이체 또는 아직 발견되지 않은 AAV 또는 이들의 변이체 또는 혼합물을 포함하는, 임의의 AAV 중으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 본원에 참고로 편입되는, WO 2005/033321, 참고. 일 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV1 캡시드 또는 이의 변이체, AAV8 캡시드 또는 이의 변이체, AAV9 캡시드 또는 이의 변이체, AAVrh.10 캡시드 또는 이의 변이체, AAVrh64R1 캡시드 또는 이의 변이체, AAVhu.37 캡시드 또는 이의 변이체, 또는 AAV3B 또는 이의 변이체이다. 그들 전체가 참고로 본원에 편입되는, 2019년 2월 27일 출원되고 "NOVEL ADENO-ASSOCIATED VIRUS (AAV) VECTORS, AAV VECTORS HAVING REDUCED CAPSID DEAMIDATION AND USES THEREFOR" 각각 명칭으로 하는, PCT/US19/19804 및 PCT/US19/19861 또한 참고.
본원에 사용된 경우에, "벡터 게놈"은 바이러스성 입자를 형성하는 rAAV 캡시드 내부에서 패키징된 핵산 서열을 지칭한다. 상기 핵산 서열은 AAV 역위된 말단 반복부 서열 (ITR)을 함유한다. 본원에 예에서, 벡터 게놈은, 최소한으로, 5'부터 3'까지, AAV 5' ITR, 코딩 서열(들), 및 AAV 3' ITR을 함유한다. 캡시드외 상이한 공급원 AAV인, AAV2로부터의 ITR, 또는 그 밖의 전장 ITR은 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, ITR은 생산 동안 rep 기능 또는 트랜스보완 AAV를 제공하는 AAV와 동일한 AAV 공급원 출신이다. 추가로, 다른 ITR은 사용될 수 있다. 추가로, 벡터 게놈은 유전자 산물의 발현을 지시하는 조절 서열을 함유한다. 벡터 게놈의 적당한 구성요소는 더욱 상세히 본원에 논의된다.
AAV 바이러스성 벡터 (예를 들면, 재조합성 (r) AAV) 생산하기에서 사용하기 위하여, 발현 카세트는 임의의 적당한 벡터, 예를 들면, 플라스미드에서 운반될 수 있고, 이는 패키징 숙주 세포에 전달된다. 본 발명에서 유용한 플라스미드는 이들이, 기타 중에, 원핵 세포, 곤충 세포, 포유류 세포에서 시험관내 복제 및 패키징에 적당하도록 조작될 수 있다. 숙주 세포의 적당한 형질감염 기법 및 패키징은 알려지고/거나 당업자에 의해 용이하게 설계될 수 있다.
벡터로서 사용에 적당한 AAV의 생성 및 단리 방법은 당업계에 알려진다. 일반적으로, 예를 들면, Grieger & Samulski, 2005, "Adeno-associated virus as a gene therapy vector: Vector development, production and clinical applications," Adv. Biochem. Engin/Biotechnol. 99: 119-145; Buning 등, 2008, "Recent developments in adeno-associated virus vector technology," J. Gene Med. 10:717-733; 아래 인용된 참고문헌들 참고, 이들 각각은 이 전체가 참고로 본원에 편입됨. 트랜스진을 비리온에 패키징하기 위하여, ITR은 발현 카세트를 함유하는 핵산 분자와 동일한 작제물에서 시스에서 요구된 유일한 AAV 구성요소이다. cap 및 rep 유전자는 트랜스로 공급될 수 있다.
용어 "AAV 중간체" 또는 "AAV 벡터 중간체"는 그 안에 패키징된 원하는 게놈성 서열이 부족한 조립된 rAAV 캡시드를 지칭한다. 이들은 또한 "빈" 캡시드로서 명칭될 수 있다. 상기 캡시드는 발현 카세트의 검출불가능한 게놈성 서열, 또는 유전자 산물의 발현을 달성하는데 불충분한 단지 부분적으로 패키징된 게놈성 서열을 함유할 수 있다. 이들 빈 캡시드는 관심 유전자를 숙주 세포로 이동시키는데 비-기능적이다.
본원에 기재된 재조합성 아데노-연관된 바이러스 (AAV)는 알려지는 기법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2, 참고. 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산 서열; 기능적 rep 유전자; 최소한으로, AAV 역위된 말단 반복부 (ITR) 및 트랜스진으로 구성된 발현 카세트; 및 발현 카세트를 AAV 캡시드 단백질에 패키징시키는 충분한 헬퍼 기능을 함유하는 숙주 세포를 배양시키는 단계를 관여시키다. 캡시드의 생성 방법, 그에 대한 코딩 서열, 및 rAAV 바이러스성 벡터의 생산 방법은 기재되었다. 예를 들면, Gao, 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (10), 6081-6086 (2003) 및 US 2013/0045186A1, 참고.
일 구현예에서, 재조합성 AAV 생산하기에 유용한 생산 세포 배양물이 제공된다. 상기 세포 배양물은 AAV 캡시드 단백질을 숙주 세포에서 발현시키는 핵산; AAV 캡시드, 예를 들면, 숙주 세포에서 산물의 발현을 지시하는 서열에 작동가능하게 링크된 유전자 산물을 인코딩하는 비-AAV 핵산 서열 및 AAV ITR을 함유하는 벡터 게놈에 패키징하는데 적당한 핵산 분자; 그리고 핵산 분자를 재조합성 AAV 캡시드에 패키징시키는데 충분한 AAV rep 기능 및 아데노바이러스 헬퍼 기능을 함유한다. 일 구현예에서, 세포 배양물은 포유류 세포 (예를 들면, 기타 중에, 인간 배아성 신장 293 세포) 또는 곤충 세포 (예를 들면, 바큘로바이러스)로 구성된다.
임의로 rep 기능은 캡시드를 제공하는 AAV 이외 AAV에 의해 제공된다. 예를 들어 rep는, 비제한적으로, AAV1 rep 단백질, AAV2 rep 단백질, AAV3 rep 단백질, AAV4 rep 단백질, AAV5 rep 단백질, AAV6 rep 단백질, AAV7 rep 단백질, AAV8 rep 단백질; 또는 rep 78, rep 68, rep 52, rep 40, rep68/78 및 rep40/52; 또는 이의 단편; 또는 또 다른 공급원일 수 있다. 임의로, rep 및 cap 서열은 세포 배양물에서 동일한 유전적 요소에 있다. rep 서열과 cap 유전자 사이 스페이서가 있을 수 있다. 이들 AAV 또는 돌연변이체 AAV 캡시드 서열 중 임의의 것은 숙주 세포에서 이의 발현을 지시하는 외인성 조절 대조군 서열의 제어 하에 있을 수 있다.
일 구현예에서, 세포는 적당한 세포 배양물 (예를 들면, HEK 293) 세포에서 제조된다. 본원에 기재된 유전자 요법 벡터의 제조 방법은 당업계에서 널리 알려진 방법 예컨대 유전자 요법 벡터의 생산에 사용된 플라스미드 DNA의 생성, 벡터의 생성, 및 벡터의 정제를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이고 생성된 플라스미드는 관심 유전자 및 AAV 게놈을 인코딩하는 AAV 시스-플라스미드, AAV rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 트랜스-플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드이다. 벡터 생성 공정은 방법 단계 예컨대 세포 배양의 개시, 세포의 계대, 세포의 씨딩, 플라스미드 DNA로 세포의 형질감염, 무혈청 배지로의 형질감염후 배지 교환, 그리고 벡터-함유 세포 및 배양 배지의 수확을 포함할 수 있다. 수확된 벡터-함유 세포 및 배양 배지는 본원에 조 세포 수확물로서 지칭된다. 더욱 또 다른 시스템에서, 유전자 요법 벡터는 바큘로바이러스-기반된 벡터로 감염에 의해 곤충 세포에 도입된다. 이들 생산 시스템에 관해서 검토를 위하여, 일반적으로, 예를 들면, Zhang 등, 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929 참고하고, 이 각각의 내용은 이 전체가 본원에 참고로 편입됨. 이들 및 다른 AAV 생산 시스템의 제조 및 사용 방법은, 이 각각의 내용이 이 전체가 본원에 참고로 편입되는, 하기 미국 특허에서 또한 기재된다: 5,139,941; 5,741,683; 6,057,152; 6,204,059; 6,268,213; 6,491,907; 6,660,514; 6,951,753; 7,094,604; 7,172,893; 7,201,898; 7,229,823; 및 7,439,065.
조 세포 수확물은 그 이후 대상 방법 단계 예컨대 벡터 수확물의 농축, 벡터 수확물의 정용여과, 벡터 수확물의 미세유동화, 벡터 수확물의 뉴클레아제 소화, 미세유동화된 중간체의 여과, 크로마토그래피에 의한 조 정제, 초원심분리에 의한 조 정제, 접선 유동 여과에 의한 완충액 교환, 및/또는 벌크 벡터를 제조하기 위한 제형화 및 여과일 수 있다.
높은 염 농도에서 2-단계 친화도 크로마토그래피 정제 이어서 음이온 교환 수지 크로마토그래피는 벡터 약물 산물을 정제하는데 그리고 빈 캡시드를 제거하는데 사용된다. 이들 방법은 더욱 상세히 2016년 12월 9일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/065970 및 이의 우선권 서류, 2016년 4월 13일 출원된, 미국 특허 출원 번호 62/322,071 그리고, 참고로 본원에 편입되는, "Scalable Purification Method for AAV9" 명칭으로 2015년 12월 11일 출원된, 62/226,357에서 기재된다. AAV8에 대한 정제 방법, 2016년 12월 9일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/065976 및 이의 우선권 서류 2016년 4월 13일 출원된, 미국 특허 출원 번호 62/322,098 및 2015년 12월 11일, 및 rh10 출원된, 62/266,341, 2016년 12월 9일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US16/66013 및 이의 우선권 서류, 2016년 4월 13일 출원된, 미국 특허 출원 번호 62/322,055 및 2015년 12월 11일 또한 출원된, "Scalable Purification Method for AAVrh10" 명칭으로, 62/266,347, 그리고 AAV1에 대하여, 2016년 12월 9일 출원된, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/065974 및 이의 우선권 서류 2016년 4월 13일 출원된, 미국 특허 출원 번호 62/322,083 및 2015년 12월 11일 출원된, "Scalable Purification Method for AAV1"로, 62/26,351은 참고로 본원에 모두 편입된다.
빈 및 전체 입자 함량을 계산하기 위해, 선택된 샘플 (예를 들면, 본원에 예에서 GC의 # = 입자의 #인 요오딕사놀 구배-정제된 제제)에 대하여 VP3 밴드 부피는 로딩된 GC 입자에 대해 플롯팅된다. 생성된 선형 방정식 (y = mx+c)은 테스트 물품 피크의 밴드 부피에서 입자의 수를 계산하는데 사용된다. 로딩된 20 μL 당 입자 (pt)의 수는 그 다음 50을 곱해서 입자 (pt) /mL를 제공한다. GC/mL로 분할된 Pt/mL는 입자 대 게놈 카피 (pt/GC)의 비율을 제공한다. Pt/mL-GC/mL는 빈 pt/mL를 제공한다. pt/mL에 의해 분할되고 x 100된 빈 pt/mL는 빈 입자의 백분율을 제공한다.
일반적으로, 패키징된 게놈으로 빈 캡시드 및 AAV 벡터 입자를 검정하는 방법은 당업계에 알려졌다. 예를 들면, Grimm 등,　Gene Therapy　(1999) 6:1322-1330; Sommer 등,　Molec. Ther. (2003) 7:122-128, 참고. 변성된 캡시드에 대하여 테스트하기 위해, 본 방법은, 3개 캡시드 단백질을 분리시킬 수 있는 임의의 겔, 예를 들어, 완충액에서 3-8% 트리스-아세테이트를 함유하는 구배 겔로 이루어지는, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 처리된 AAV 스톡을 적용하는 단계, 그 다음 샘플 재료가 분리되는 때까지 겔을 실행시키는 단계, 그리고 겔을 나일론 또는 니트로셀룰로스 막, 바람직하게는 나일론에 블랏팅하는 단계를 포함한다. 항-AAV 캡시드 항체는 그 다음 변성된 캡시드 단백질에 결합하는 일차 항체, 바람직하게는 항-AAV 캡시드 단클론성 항체, 가장 바람직하게는 B1 항-AAV-2 단클론성 항체로서 사용된다 (Wobus 등, J. Virol. (2000) 74:9281-9293). 일차 항체에 결합하고 일차 항체와의 결합을 검출하기 위한 수단을 함유하는 것, 더욱 바람직하게는 그것에 공유 결합된 검출 분자를 함유하는 항-IgG 항체, 가장 바람직하게는 겨자무 과산화효소에 공유 링크된 양 항-마우스 IgG 항체인, 이차 항체가 그 다음 사용된다. 결합을 검출하는 방법, 바람직하게는 방사성 동위원소 방출, 전자기 복사 또는 비색 변화를 검출할 수 있는 검출 방법, 가장 바람직하게는 화학발광 검출 키트는 일차 및 이차 항체들 사이 결합을 절반-정량적으로 결정하는데 사용된다. 예를 들어, SDS-PAGE 경우, 컬럼 분획으로부터 샘플은 취득될 수 있고 환원 제제 (예를 들면, DTT)를 함유하는 SDS-PAGE 로딩 완충액에서 가열되고, 캡시드 단백질은 사전-성형 구배 폴리아크릴아미드 겔 (예를 들면, Novex)에서 분해되었다. 은 염색은 제조업체 지침 또는 다른 적당한 염색 방법, 즉 SYPRO 루비 또는 쿠마씨 염색에 따라 SilverXpress (Invitrogen, CA)를 사용하여 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 컬럼 분획에서 AAV 벡터 게놈 (vg)의 농도는 정량적 실시간 PCR (Q-PCR)에 의해 측정될 수 있다. 샘플은 희석되고 DNase I (또는 또 다른 적당한 뉴클레아제)로 소화되어 외인성 DNA를 제거한다. 뉴클레아제의 불활성화 후, 샘플은 추가로 희석되고 프라이머들 사이 DNA 서열에 특이적인 TaqMan™ 형광원성 프로브 및 프라이머를 사용하여 증폭된다. 형광의 정의된 수준 (임계값 주기, Ct)에 도달하는데 요구된 주기의 수는 Applied Biosystems Prism 7700 Sequence Detection System에서 각 샘플에 대하여 측정된다. AAV 벡터에서 함유된 것과 동일한 서열을 함유하는 플라스미드 DNA는 Q-PCR 반응에서 표준 곡선을 생성하는데 이용된다. 샘플로부터 수득된 주기 임계값 (Ct) 값은 플라스미드 표준 곡선의 Ct 값으로 이것을 정상화시킴으로써 벡터 게놈 역가를 결정하는데 사용된다. 디지털 PCR에 기반된 종점 검정은 또한 사용될 수 있다.
일 양태에서, 넓은 스펙트럼 세린 프로테아제, 예를 들면, (예컨대 Qiagen으로부터 상업적으로 이용가능한) 프로테이나제 K를 활용하는 최적화된 q-PCR 방법이 사용된다. 더욱 특히,　최적화된 qPCR 게놈 역가 검정은 표준 검정과 유사하지만, DNase I 소화 후, 샘플이 프로테이나제 K 완충액으로 희석되고 프로테이나제 K로 처리되고 이어서 열 불활성화되는 것은 제외된다. 적당히 샘플은 샘플 크기와 맞먹는 양에서 프로테이나제 K 완충액으로 희석된다. 프로테이나제 K 완충액은 2 배 이상까지 농축될 수 있다. 전형적으로, 프로테이나제 K 처리는 약 0.2 mg/mL이지만, 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL 가변될 수 있다. 처리 단계는 일반적으로 약 55 ℃에 약 15 분 동안 시행되지만, 더 낮은 온도 (예를 들면, 약 37 ℃ 내지 약 50 ℃)에 더 오랜 시기 (예를 들면, 약 20 분 내지 약 30 분) 동안, 또는 더 높은 온도 (예를 들면, 최고 약 60 ℃)에 더 짧은 시기 (예를 들면, 약 5 내지 10 분) 동안 수행될 수 있다. 유사하게, 열 불활성화는 일반적으로 약 95 ℃에 약 15 분 동안이지만, 온도는 낮아질 수 있고 (예를 들면, 약 70 내지 약 90 ℃) 시간은 연장될 수 있다 (예를 들면, 약 20 분 내지 약 30 분). 샘플은 그 다음 희석되고 (예를 들면, 1000 배) 표준 검정에서 기재된 경우에 TaqMan 분석에 적용된다.
추가적으로, 또는 대안적으로, 액적 디지털 PCR (ddPCR)이 사용될 수 있다. 예를 들어, ddPCR에 의한 단일-가닥 및 자가-상보적 AAV 벡터 게놈 역가를 결정하는 방법이 기재되었다. 예를 들면, M. Lock 등, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods. 2014 Apr;25(2):115-25. doi: 10.1089/hgtb.2013.131. Epub 2014 Feb 14, 참고.
간단히, 게놈-결핍 AAV 중간체로부터 패키징된 게놈성 서열을 갖는 rAAV 입자를 분리시키는 방법은 고속 액체 크로마토그래피에 재조합성 AAV 바이러스성 입자 및 AAV 캡시드 중간체를 포함하는 현탁액을 적용하는 단계를 관여시키고, 여기서 AAV 바이러스성 입자 및 AAV 중간체는 높은 pH에서 평형화된 강한 음이온 교환 수지에 결합되고, 약 260 및 약 280에 자외선 흡광도에 대하여 용출액을 모니터링하면서 염 구배에 적용된다. pH는 선택된 AAV에 의존하여 조정될 수 있다. 예를 들면, 참고로 본원에 편입되는 WO2017/160360 (AAV9), WO2017/100704 (AAVrh10), WO 2017/100676 (예를 들면, AAV8), 및 WO 2017/100674 (AAV1)], 참고. 본 방법에서, AAV 전체 캡시드는 A260/A280의 비율이 변곡점에 도달하는 때 용출되는 분획에서 수집된다. 하나의 예에서, 친화도 크로마토그래피 단계 경우, 정용여과된 산물은 AAV2 혈청형을 효율적으로 포착하는 Capture SelectTM Poros- AAV2/9 친화도 수지 (Life Technologies)에 적용될 수 있다. 이들 이온성 조건 하에서, 상당한 백분율의 잔여 세포성 DNA 및 단백질은 컬럼을 통해 유동하고, 그 동안 AAV 입자는 효율적으로 포착된다.
약학적 조성물
약학적 조성물은 발현 카세트, (바이러스성 또는 비-바이러스성) 동종을 함유하는 벡터 또는 발현 카세트를 함유하는 또 다른 시스템 중 1개 이상 그리고 1개 이상의 담체, 현탁화 제제, 및/또는 부형제를 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 적어도 하나의 rAAV 스톡 (예를 들면, rAAV 스톡) 및 임의적으로 담체, 부형제 및/또는 보존제를 함유한다. rAAV 스톡은 동일한, 예를 들면, 예컨대 농도 및 복용 단위의 논의에서 아래 기재된 양인 복수의 rAAV 벡터를 지칭한다. rAAV 벡터 전달된 트랜스진은 액체 입자, 리포좀, 소포, 나노구, 또는 나노입자 또는 기타 등등에서 어느 한쪽 캡슐화된 전달을 위하여 제형화될 수 있다.
특정 구현예에서, 발현 카세트는 액체 나노입자를 통해 전달된다. 용어 "액체 나노입자"는 10 내지 1000 나노미터, 예를 들면 75 nm 내지 750 nm, 또는 100 nm 및 350 nm, 또는 250 nm 내지 약 500 nm의 산술평균 직경으로 전형적으로 구형 구조를 갖는 액체 조성물을 지칭한다. 일부 제형에서, 액체 나노입자는 적어도 하나의 양이온성 액체, 적어도 하나의 비양이온성 액체, 및 적어도 하나의 컨쥬게이션된 액체를 포함할 수 있다. 핵산, 예컨대 mRNA를 캡슐화하기에 적당한 당업계에서 알려진 액체 나노입자가 사용될 수 있다. "산술평균 직경"은 친유상과 친수상을 포함하는 나노입자의 집단의 산술평균 크기이다. 이들 시스템의 평균 크기는 당업자에 의해 알려진 표준 방법에 의해 측정될 수 있다. 유전자 요법에 대하여 적당한 액체 나노입자의 예는, 예를 들면, 그들 전체가 본원에 참고로 편입되는 L. Battaglia and E. Ugazio, J Nanomaterials, Vol 2019, Article ID 283441, pp. 1-22; US2012/0183589A1; 및 WO 2012/170930에서 기재된다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 - 분해 펩타이드 신호 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 분자 그리고 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 및/또는 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다.
rAAV 스톡은 동일한, 예를 들면, 예컨대 농도 및 복용 단위의 논의에서 아래 기재된 양으로 복수의 rAAV 벡터를 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매체, 비히클, 코팅물, 희석제, 항균성 및 항진균성 제제, 등장성 및 흡수 지연 제제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드, 및 기타 등등을 포함한다. 약학적 활성 서브스턴스에 대하여 상기 매체 및 제제의 용도는 당업계에서 널리 알려진다. 보조 활성 성분은 조성물에 또한 편입될 수 있다. 문구 "약학적으로-허용가능한"은 숙주에 투여된 때 알러지성 또는 유사한 이상 반응을 생산하지 않는 분자적 실체 및 조성물을 지칭한다. 전달 비히클 예컨대 리포좀, 나노캡슐, 미소입자, 미소구, 액체 입자, 소포, 및 기타 등등은 적당한 숙주 세포에 본 발명의 조성물의 도입을 위하여 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 전달된 벡터 게놈은 액체 입자, 리포좀, 소포, 나노구, 또는 나노입자 또는 기타 등등에서 어느 한쪽 캡슐화된 전달을 위하여 제형화될 수 있다.
일 구현예에서, 조성물은 대상체에게 전달에 적당한 최종 제형을 포함하고, 예를 들면, 생리학적으로 호환성 pH 및 염 농도로 완충된 수성 액체 현탁액이다. 임의로, 1개 이상의 계면활성제는 제형에서 존재한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 대상체에게 투여를 위하여 희석되는 농축물로서 운송될 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 동결건조될 수 있고 투여의 시간에 재구성될 수 있다.
제형 제조를 위하여 당업계에서 널리 알려진 방법 및 제제는, 예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Company, Easton, Pa에서 기재된다. 제형은, 예를 들어, 부형제, 담체, 안정제, 또는 희석제 예컨대 멸균수, 식염수, 폴리알킬렌 글리콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원의 오일, 또는 수소화된 나프탈렌, 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질, 염화암모늄, 염화헥사메토늄, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올, 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올, 및 m-크레졸), 저 분자량 폴리펩타이드, 단백질 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린, 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 및 리신, 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 및 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, 킬레이트화 제제 예컨대 EDTA, 당류 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면 Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 TWEEN™, PLURONICS™, 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 함유할 수 있다.
활성 성분은 또한 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 미소유탁액, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 거대유탁액에서, 예를 들어, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면성 중합에 의해 제조된 미소캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐, 각각에 포획될 수 있다. 상기 기법은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
적당한 계면활성제, 또는 계면활성제들의 조합은 비독성인 비-이온성 걔면활성제들 중으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 일차 히드록실기에서 종결하는 2작용적 블록 공중합체 계면활성제, 예를 들면, Poloxamer 188로서도 알려진, 예컨대 Pluronic® F68 [BASF]이 선택되고, 이는 중성 pH를 갖고, 8400의 평균 분자량을 갖는다. 다른 계면활성제 및 다른 폴록사머, 즉, 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드)), SOLUTOL HS 15 (마크로골-15 히드록시스테아레이트), LABRASOL (폴리옥시 카프릴성 글리세리드), 폴리옥시 10 올레일 에테르, TWEEN (폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르), 에탄올 및 폴리에틸렌 글리콜의 2개 친수성 쇄에 의해 측접된 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중앙 소수성 쇄로 구성된 비이온성 트리블록 공중합체가 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 제형은 폴록사머를 함유한다. 이들 공중합체는 문자 "P" (폴록사머 경우) 이어서 3 자릿수로 흔히 명명된다: 첫 2 자릿수 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적 분자 질량을 제공하고, 마지막 자릿수 x 10은 백분율 폴리옥시에틸렌 함량을 제공한다. 일 구현예에서 폴록사머 188이 선택된다. 계면활성제는 현탁액의 최고 약 0.0005 % 내지 약 0.001% 양으로 존재할 수 있다.
벡터는 세포를 형질감염시키는데 그리고 유전자 이동 및 발현의 충분한 수준을 제공하여 과도한 역효과 없이, 또는 의료적으로 허용가능한 생리학적 효과로 치료적 이익을 제공하는데 충분한 양으로 투여되고, 이는 의료 분야에서 숙련된 이들에 의해 결정될 수 있다. 종래 및 약학적으로 허용가능한 투여의 루트는, 비제한적으로, 원하는 기관 (예를 들면, 간 (임의로 간 동맥을 통해), 폐, 심장, 눈, 신장,)에 직접 전달, 경구, 흡입, 비강내, 척수강내, 기관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 및 다른 비경구 투여의 루트를 포함한다. 투여의 루트는, 원한다면, 조합될 수 있다.
바이러스성 벡터의 복용량은 주로 요인 예컨대 환자의 치료 중인 병태, 연령, 체중 및 건강에 의존하고, 그래서 환자들 중에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 벡터의 치료적으로 효과적 인간 복용량은 일반적으로 약 1 x 109 내지 1 x 1016 게놈 바이러스 벡터의 농도를 함유하는 약 25 내지 약 1000 마이크로리터 내지 약 100 mL의 용액의 범위이다. 복용량은 임의의 부작용에 대해 치료적 효과의 균형을 맞추기 위해 조정되고 상기 복용량은 재조합성 벡터가 이용되는 치료적 적용에 의존하여 다양할 수 있다. 트랜스진 산물의 발현의 수준은 바이러스성 벡터, 바람직하게는 미니진을 함유하는 AAV 벡터를 초래하는 복용량의 빈도를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 임의로, 치료적 목적에 대하여 기재된 것들과 유사한 복용 용법은 본 발명의 조성물을 사용하는 면역화에 활용될 수 있다.
복제-결함성 바이러스 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 (70 kg 체중의 평균 대상체를 치료하기 위해) 약 1.0 x 109 GC 내지 약 1.0 x 1016 GC, 및 바람직하게는 인간 환자에 대하여 1.0 x 1012 GC 내지 1.0 x 1014 GC의 범위인 복제-결함성 바이러스의 양을 함유하도록 복용 단위로 제형화될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x109, 2x109, 3x109, 4x109, 5x109, 6x109, 7x109, 8x109, 또는 9x109 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1010, 2x1010, 3x1010, 4x1010, 5x1010, 6x1010, 7x1010, 8x1010, 또는 9x1010 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1011, 2x1011, 3x1011, 4x1011, 5x1011, 6x1011, 7x1011, 8x1011, 또는 9x1011 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1012, 2x1012, 3x1012, 4x1012, 5x1012, 6x1012, 7x1012, 8x1012, 또는 9x1012 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1013, 2x1013, 3x1013, 4x1013, 5x1013, 6x1013, 7x1013, 8x1013, 또는 9x1013 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1014, 2x1014, 3x1014, 4x1014, 5x1014, 6x1014, 7x1014, 8x1014, 또는 9x1014 GC를 함유하도록 제형화된다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 적어도 1x1015, 2x1015, 3x1015, 4x1015, 5x1015, 6x1015, 7x1015, 8x1015, 또는 9x1015 GC를 함유하도록 제형화된다. 일 구현예에서, 인간 적용 경우 용량은 범위 내에서 모든 정수 또는 분수적 양을 포함하는 용량 당 1x1010 내지 약 1x1012 GC 범위일 수 있다.
이들 상기 용량은, 치료되어야 하는 구역의 크기, 사용된 바이러스성 역가, 투여의 루트, 및 방법의 원하는 효과에 의존하여, 범위 내에서 모든 수를 포함하는, 약 25 내지 약 1000 마이크로리터, 또는 더 높은 부피 범위의, 담체, 부형제 또는 완충액 제형의 다양한 부피로 투여될 수 있다.
임의의 적당한 투여의 루트는 선택될 수 있다 (예를 들면, 경구, 흡입, 비강내, 기관내, 동맥내, 안구내, 정맥내, 근육내, 복강내, 및 다른 비경구 루트). 따라서, 약학적 조성물은 임의의 적절한 투여의 루트에 대하여, 예를 들어, 액체 용액 또는 현탁액의 형태로 (예를 들어, 정맥내 투여의 경우, 경구 투여의 경우, 등으로서) 제형화될 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 고체 형태 (예를 들어 경구 투여 경우, 예를 들면, 정제 또는 캡슐의 형태)일 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 분말, 드롭, 에어로졸, 등의 형태일 수 있다.
방법
본원에 제공된 조성물은 생체내 전달된 효소의 오프-타깃 활동성 감소시키기에 유용하다. 특정 구현예에서, 조성물은 효소 코딩 서열, 효소-PEST 코딩 서열, 및/또는 효소-PEST 코딩 서열을 1개 이상의 효소 조정 (표적 또는 돌연변이체 표적) 서열과 포함하는 발현 카세트의 비-바이러스성 매개된 전달 이후 발현된 효소의 오프-타깃 활동성 감소시키기에서 유용하다. 특정 구현예에서, 조성물은 벡터 게놈의 AAV-매개된 전달 이후 발현된 효소의 오프-타깃 활동성 감소시키기에서 유용하다.
특정 구현예에서, 단백질 분해 신호 (예를 들면, PEST, Box, 또는 다른 데그론)의 유효성은 시험관내 사정될 수 있다. 예를 들어, 효소 (예를 들면, 뉴클레아제) 및 단백질 분해 신호를 함유하는 융합 단백질의 반감기는 (예를 들면, 사이클로헥시미드 (CHX)로) 단백질의 번역을 중단시키기 위해 세포를 처리하고 그 다음 처리후 상이한 시간에 웨스턴 블랏을 수행함으로써 (배양된 세포에서) 시험관내 사정될 수 있다. 뉴클레아제의 분해를 사정하기 위한 다른 적당한 방법은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
오프-타깃 뉴클레아제 활동성에서의 감소 (또는 뉴클레아제 특이성에서의 증가)는 문헌에서 기재된 다양한 접근법을 사용하여 결정될 수 있다. 뉴클레아제 특이성의 상기 결정 방법은 무세포 방법 예컨대 Site-Seq [Cameron, P., 등, (2017) Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage. Nat Methods, 14, 600-606], Digenome-seq [Kim, D., 등, (2015) Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells. Nat Methods, 12, 237-243, 231 p following 243], 및 Circle-Seq [Tsai, S.Q., 등, (2017) CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets. Nat Methods, 14, 607-614] 그리고 시험관내-기반된 방법 예컨대, 예를 들면, GUIDE-Seq [Tsai (2017) Nat Methods, 14, 607-614] 및 Integrative-Deficient Lentiviral Vectors Capture (IDLV) [Gabriel, R., 등. (2011) An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol, 29, 816-823;Wang, X., 등, (2015) Unbiased detection of off-target 절단 by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors. Nat Biotechnol, 33, 175-178]을 포함한다.
생체내 오프-타깃 활동성의 수 및 속도를 더욱 정확하게 예측하는, 개선된 검정이 본원에 제공되고 참고로 편입된다.
우리가 개발하였던 ITR-seq 방법은 ITR 통합의 부위의 편향되지 않은, 게놈식 식별을 제공한다. 아래 예는 DSB를 식별하기 위한 태그로서 AAV ITR을 사용하고, 우리는 생체내 게놈-편집 뉴클레아제의 오프-타깃 활동성을 측정할 수 있다. 하지만, 임의의 말단 반복부 서열 (trs) (예를 들면, 렌티바이러스 말단 반복부) 또는 다른 공통 통합 부위, 예를 들면, 발현 카세트의 5' 및 3' 정착되는 반복부 서열이 사용될 수 있음이 용이하게 이해될 것이다. 유사하게, 비-바이러스성 발현 카세트는 이 검정을 사용하여 검출하기 위해 상기 공통 통합 부위를 함유하도록 조작될 수 있다 (예를 들면, trs는 비-바이러스성 또는 비-벡터 전달 시스템에 의해 전달되는 DNA 발현 카세트로 조작될 수 있다).
ITR-Seq 프로토콜은 앵커링된 PCR 반응의 변형된 버전이고, 여기에서 단일 프라이머는 ITR 서열에 어닐링하도록 그리고 상기 서열로부터 외부로 증폭하도록 설계된다 (예를 들면, 도 7c). DNA에서 ITR 통합 이후, 프라이머는 숙주 게놈 및 삽입된 벡터 ITR 서열의 접합부를 증폭시키는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 도 7b, 7c). 통합된 ITR의 정돈된 이차 구조를 적절히 변성시키기 위해, 높은 어닐링 온도 (예를 들면, 69℃) 및 더 긴 어댑터-특이적 프라이머가 사용된다. 특정 구현예에서, "높은 어닐링 온도"는 PCR 폴리머라제가 기능하고 프라이머가 표적 서열에 어닐링하는 임의의 온도, 예를 들면, 60 ℃ 내지 75 ℃, 또는 약 68 ℃ 내지 72 ℃일 수 있다. 특정 구현예에서, 프라이머 서열은 특이성이 유지된다면 18 내지 약 42개 뉴클레오타이드 길이, 또는 더 길 수 있다. 특정 구현예에서, 프라이머는 적어도 20개 뉴클레오타이드 내지 40개 뉴클레오타이드, 적어도 30개 뉴클레오타이드 내지 40개 뉴클레오타이드, 적어도 35개 뉴클레오타이드 내지 40개 뉴클레오타이드, 또는 약 37개 뉴클레오타이드 길이이다.
샘플 분석을 위하여 ITR-Seq 검정을 사용하기 위해, DNA는 샘플로부터 (예를 들면, 뉴클레아제-발현 AAV 벡터로 처리된 동물의 조직으로부터) 단리된다. DNA는, 이전의 보고서에서 기재된 대로, 전단되고 Y-어댑터에 결찰된다 [Tsai, S.Q., 등, (2015) GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol, 33, 187-197]. 상기 기재된 ITR-특이적 프라이머 및 어댑터-특이적 프라이머를 사용하는 PCR의 2개 라운드 이후, NGS-호환성 라이브러리가 생산된다. 시컨싱 후, 양쪽 증폭된 ITR 서열 및 인접한 게놈성 DNA 서열을 함유하는 생성된 앰플리콘은 컴퓨터로 결정된다. 게놈식 ITR 통합 부위의 자리 및 빈도가 또한 결정된다. ITR이 양쪽 정방향 및 역방향 가닥 배향에서 통합함을 요구함으로써, 우리는 위양성의 수를 추가로 감소시켰고 고-신뢰 ITR-통합 부위를 식별한다. 각 샘플 경우, 좌위 당 관찰된 ITR-통합 이벤트의 총 수 (ITR-Seq 판독)의 정도 저감에서 선별된 부위 그리고 뉴클레아제 표적 부위의 순위-매겨진 목록 (ITR-Seq 순위)이 생산된다. ITR-Seq 보고서는 (의도된 표적 서열과의 상동성에 기반된) 가장 유망한 오프-타깃 서열, 게놈성 자리, 및 (상응하는 좌위에 맵핑하는 NGS 판독의 수에 따라) ITR-Seq 순위의 컴퓨터 분석의 끝에 생성된다. 실시예 3은 검정의 추가의 상세를 제공하고 검정의 사용을 예시한다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 전달하는 단계를 포함하는 표적된 유전자의 편집 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 조성물을 전달하는 단계를 포함하는 표적된 유전자의 편집 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 전달하는 단계를 포함하는 표적된 유전자의 편집 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 rAAV를 전달하는 단계를 포함하는 표적된 유전자의 편집 방법이 제공된다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 인간 PCSK9 유전자 안에서 부위를 인식하는 메가뉴클레아제를 포함하는 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하는, 콜레스테롤-관련된 장애, 예컨대 고콜레스테롤혈증이 있는 환자의 치료 방법. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 PCSK9 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호, 예를 들면, PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호: 18에 표시된 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 PCSK9 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 돌연변이체 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 PCSK9 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 및 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 발현 카세트는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 인간 HAO 유전자 안에서 부위를 인식하는 메가뉴클레아제를 포함하는 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하는, 알라닌 글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 유전자에서의 결함과 관련된 장애, 예컨대 일차 고옥살산뇨 유형 1이 있는 환자의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 HOA 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호, 예를 들면, PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 HOA 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 돌연변이체 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 HOA 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 및 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 발현 카세트는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 장애는 일차 고옥살산뇨 (PH1)이다.
일 양태에서, 본원에 기재된 경우에 인간 TTR 유전자 안에서 부위를 인식하는 메가뉴클레아제를 포함하는 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하는, 트란스티레틴 (TTR) 유전자에서 결함과 연관된 장애가 있는 환자의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 TTR 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호, 예를 들면, PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 TTR 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 돌연변이체 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 TTR 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 및 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 발현 카세트는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 장애는 TTR-관련된 유전성 아밀로이드증이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 경우에 인간 APOC3 유전자 안에서 부위를 인식하는 메가뉴클레아제를 포함하는 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하는, 아폴리포단백질 C-II (APOC3) 유전자에서 결함과 연관된 장애가 있는 환자의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 APOC3 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호, 예를 들면, PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 APOC3 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 돌연변이체 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 APOC3 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 및 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 발현 카세트는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다.
일 양태에서, 인간 BCKDC E1α 유전자 안에서 부위를 인식하는 메가뉴클레아제를 포함하는 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하는, 분지-쇄 a-케토산 탈수소효소 복합체 (BCKDC) E1α 유전자에서의 결함과 연관된 장애가 있는 환자의 치료 방법이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 BCKDC 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호, 예를 들면, PEST 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. WO 2020/056155A2, 참고. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 BCKDC 메가뉴클레아제 및 적어도 하나의 표적 서열을 인코딩한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 돌연변이체 표적 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 BCKDC 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호 및 적어도 하나의 표적 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 상기 발현 카세트는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터를 통해 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 LNP를 사용하여 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 장애는 단풍당뇨증이다.
특정 구현예에서, 상기-기재된 유전자들 중 임의의 것을 표적하는 메가뉴클레아제 이외 뉴클레아제가 고려된다.
특정 구현예에서, 뉴클레아제 발현 카세트, 비-바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터 (예를 들면,rAAV)는, 본원에 기재된 경우에 환자에서 유전자 편집을 위하여 투여가능하다. 특정 구현예에서, 본 방법은 비-배아성 유전자 편집에 유용하다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 (예를 들면, 출생 내지 약 9 개월)이다. 특정 구현예에서, 환자는 유아보다 나이가 많은, 예를 들면, 12 개월 이상이다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 경우에 약학적 조성물은 환자에서 유전자 편집을 위하여 투여가능하다. 특정 구현예에서, 본 방법은 비-배아성 유전자 편집에 유용하다. 특정 구현예에서, 환자는 유아 (예를 들면, 출생 내지 약 9 개월)이다. 특정 구현예에서, 환자는 유아보다 나이가 많은, 예를 들면, 12 개월 이상이다.
본원에 사용된 경우에, "한", "하나", 또는 "상기"는 1개 또는 1개 초과를 의미할 수 있다. 예를 들어, "한" 세포는 단일 세포 또는 다수의 세포를 의미할 수 있다.
특정 구현예에서, 용어 "메가뉴클레아제"는 12개 염기 쌍 초과인 인식 서열에서 이중-가닥 DNA를 결합시키는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 메가뉴클레아제에 대하여 인식 서열은 22개 염기 쌍이다. 메가뉴클레아제는 I-CreI에서 유래되는 엔도뉴클레아제일 수 있고, 예를 들어, DNA-결합 특이성, DNA 분열 활동성, DNA-결합 친화도, 또는 이량체화 특성에 관해서 천연 I-CreI에 비해 변형된 I-CreI의 조작된 변이체를 지칭할 수 있다. I-CreI의 상기 변형된 변이체의 생산 방법은 당업계에서 알려진다. 예를 들면, WO 2007/047859, 참고). 본원에 사용된 경우에 메가뉴클레아제는 이중-가닥 DNA에 이종이량체로서 결합한다. 메가뉴클레아제는 또한 DNA-결합 도메인의 쌍이 펩타이드 링커를 사용하여 단일 폴리펩타이드로 결합되는 "단일-쇄 메가뉴클레아제"일 수 있다. 용어 "귀소 엔도뉴클레아제"는 용어 "메가뉴클레아제"와 동의어이다. 이 전체가 본원에 편입되는, 특정 PCSK9 메가뉴클레아제를 설명하는, WO 2018/195449, 참고.
본원에 사용된 경우에, 용어 "특이성"은 인식 서열로서 지칭된 염기 쌍의 특정한 서열에서만, 또는 인식 서열의 특정한 세트에서만 이중-가닥 DNA 분자를 인식하고 분열시키는 메가뉴클레아제의 능력을 의미한다. 인식 서열의 세트는 특정 보존된 위치 또는 서열 모티프를 공유할 것이지만, 1개 이상의 위치에서 퇴화될 수 있다. 고도로-특이적 메가뉴클레아제는 단 1개 또는 극소수 인식 서열을 분열시킬 수 있다. 특이성은 당업계에서 알려진 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다.
약어 "sc"는 자가-상보적을 지칭한다. "자가-상보적 AAV"는 재조합성 AAV 핵산 서열에 의해 운반된 코딩 영역이 분자내 이중-가닥 DNA 템플레이트를 형성하도록 설계된 작제물을 지칭한다. 감염시, 제2 가닥의 세포 매개된 합성을 기다리기 보다 오히려, scAAV의 2개 상보적 절반은 즉시 복제 및 전사에 용이한 1개 이중 가닥 DNA (dsDNA) 유닛을 형성하도록 회합할 것이다. 예를 들면, D M McCarty 등, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254, 참고. 자가-상보적 AAV는, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,596,535; 7,125,717; 및 7,456,683에서 기재되고, 이들 각각은 이들 전체가 본원에 참고로 편입된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "작동가능하게 링크된"은 관심 유전자와 이웃하는 발현 대조군 서열 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스로 또는 거리에서 작용하는 발현 대조군 서열 양쪽을 지칭한다.
핵산 서열 또는 단백질을 기재하는데 사용된 경우에 용어 "외인성"은 핵산 또는 단백질이 염색체, 또는 숙주 세포에서 실재하지 않는 위치에서 자연적으로 발생하지 않는 것을 의미한다. 외인성 핵산 서열은 또한 동일한 발현 카세트 또는 숙주 세포에서 유래되고 상기에 삽입된 서열을 지칭하지만, 이는 비-천연 상태, 예를 들면 상이한 카피 수에서, 또는 상이한 조절 요소의 제어 하에서 존재한다.
단백질 또는 핵산과 관련하여 사용된 때 용어 "이종성"은 단백질 또는 핵산이 자연에서 서로에 동일한 관계에서 발견되지 않는 2개 이상 서열 또는 하위서열을 포함하는 것을 나타낸다. 가령, 새로운 기능적 핵산을 만들기 위해 배열된 관련되지 않은 유전자들로부터 2개 이상 서열을 갖는 핵산이 전형적으로 재조합으로 생산된다. 예를 들어, 일 구현예에서, 핵산은 상이한 유전자로부터 코딩 서열의 발현을 지시하도록 배열된 1개 유전자로부터 프로모터를 갖는다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "숙주 세포"는 벡터 (예를 들면, 재조합성 AAV)가 생산 플라스미드로부터 생산되는 패키징 세포주를 지칭할 수 있다. 대안에서, 용어 "숙주 세포"는 트랜스진의 발현을 원하는 임의의 표적 세포를 지칭할 수 있다. 그래서, "숙주 세포"는 임의의 수단, 예를 들면, 전기천공, 인산칼슘 침전, 미세주사, 형질전환, 바이러스성 감염, 형질감염, 리포좀 전달, 막 융합 기법, 고속 DNA-코팅된 펠렛, 바이러스성 감염 및 원형질체 융합에 의해 세포에 도입된 외인성 또는 이종성 핵산 서열을 함유하는 원핵 또는 진핵 세포를 지칭한다. 본원에 특정 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 본원에 기재된 조성물의 시험관내 사정을 위하여 다양한 포유류 종의 세포의 배양물을 지칭한다. 본원에 다른 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 바이러스성 벡터 또는 재조합성 바이러스를 생성하고 패키징하는데 이용된 세포를 지칭한다. 더욱 다른 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 본원에 기재된 경우에 질환 또는 병태에 대하여 생체내 처리되는 중인 대상체의 표적 세포를 지칭하기 위한 것이다. 특정 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 간 세포 또는 간세포이다.
"복제-결함성 바이러스" 또는 "바이러스성 벡터"는 관심 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스성 캡시드 또는 엔벨로프에서 패키징되는 합성 또는 인공 바이러스성 입자를 지칭하고, 여기에서 바이러스성 캡시드 또는 엔벨로프 안에서 또한 패키징된 임의의 바이러스성 게놈성 서열은 복제-결핍이고; 즉, 이들은 자손 비리온을 생성할 수 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 구현예에서, 바이러스성 벡터의 게놈은 복제하기 위해 요구된 효소를 인코딩하는 유전자를 포함하지 않지만 (게놈은 인공 게놈의 증폭 및 패키징을 위하여 요구된 신호에 의해 측접된 관심 유전자만을 함유하는 - "실질없음"인 것으로 조작될 수 있음), 이들 유전자는 생산 동안 공급될 수 있다. 그러므로, 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 복제를 위하여 요구된 바이러스성 효소의 존재 하를 제외하고 발생할 수 없기 때문에 유전자 요법에서 사용에 안전한 것으로 간주된다.
핵산 서열의 문맥에서 용어들 "서열 동일성" "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일한"은 최대 일치를 위하여 정렬된 경우 똑같은 2개 서열에서 잔기를 지칭한다. 서열 동일성 비교의 길이는 게놈의 전장 초과일 수 있고, 유전자 코딩 서열의 전장, 또는 적어도 약 500 내지 5000 뉴클레오타이드의 단편이 요구된다. 하지만, 예를 들면 적어도 약 9개 뉴클레오타이드, 보통 적어도 약 20 내지 24개 뉴클레오타이드, 적어도 약 28 내지 32개 뉴클레오타이드, 적어도 약 36개 이상 뉴클레오타이드의 더 작은 단편 중에서 동일성은 또한 요구될 수 있다. 유사하게, "퍼센트 서열 동일성"은 단백질의 전장, 또는 이의 단편 보다, 아미노산 서열에 대하여 용이하게 결정될 수 있다. 적당히, 단편은 적어도 약 8개 아미노산 길이이고 최고 약 700개 아미노산일 수 있다. 적당한 단편의 예는 본원에 기재된다.
용어 "실질적 상동성" 또는 "실질적 유사성"은, 아미노산 또는 이의 단편을 지칭하는 경우, 또 다른 아미노산 (또는 이의 상보적 가닥)과 적절한 아미노산 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬된 때, 정렬된 서열의 적어도 약 95 내지 99%에서 아미노산 서열 동일성이 있다는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 상동성은 전장 서열, 또는 이의 단백질, 예를 들면, 적어도 8개 아미노산, 또는 더욱 바람직하게는, 적어도 15개 아미노산 길이인 cap 단백질, rep 단백질, 또는 이의 단편에 걸쳐 있다. 적당한 단편의 예는 본원에 기재된다.
용어 "고도로 보존된"은 적어도 80% 동일성, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 및 더욱 바람직하게는, 97% 초과 동일성을 의미한다. 동일성은 당업자에 의해 알려진 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램에 의지하여 당업자에 의해 용이하게 결정된다.
일반적으로, 2개 상이한 아데노-연관된 바이러스들 사이 "동일성", "상동성", 또는 "유사성"을 지칭하는 경우, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열과 관련하여 결정된다. "정렬된" 서열 또는 "정렬"은, 참조 서열과 비교된 경우 누락 또는 추가의 염기 또는 아미노산에 대하여 수정을 종종 함유하는, 다중 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 지칭한다. 예에서, AAV 정렬은 기준점으로서 공표된 AAV9 서열을 사용하여 수행된다. 정렬은 다양한 공공으로 또는 상업적으로 이용가능한 다중 서열 정렬 프로그램 중 임의의 것을 사용하여 수행된다. 상기 프로그램의 예는 "Clustal Omega", "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "MAP", 및 "MEME"를 포함하고, 이들은 인터넷에서 웹 서버를 통해서 접근가능하다. 상기 프로그램의 다른 공급원은 당업자에게 알려진다. 대안적으로, Vector NTI 유틸리티가 또한 사용된다. 상기 기재된 프로그램에 들어있던 것들을 포함하는, 뉴클레오타이드 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에서 알려진 다수의 알고리즘도 있다. 또 다른 예로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인, Fasta™을 사용하여 비교될 수 있다. Fasta™은 쿼리 및 검색 서열 사이 최상 중첩의 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다. 가령, 핵산 서열 사이 퍼센트 서열 동일성은, 참고로 본원에 편입된, GCG 버전 6.1에서 제공된 경우에 이의 디폴트 파라미터 (단어 크기 6 그리고 스코어링 매트릭스를 위한 NOPAM 인자)를 가진 Fasta™을 사용하여 결정될 수 있다. 다중 서열 정렬 프로그램, 예를 들면, "Clustal Omega", "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램은 아미노산 서열에 대하여 또한 이용가능하다. 일반적으로, 당업자들 중 한명이 필요에 따라 이들 세팅을 변경할 수 있어도, 이들 프로그램 중 임의의 것은 디폴트 세팅에 사용된다. 대안적으로, 당업자들 중 한명은 참조된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공된 것으로서 동일성 또는 정렬의 수준을 적어도 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 활용할 수 있다. 예를 들면, J. D. Thomson 등, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999), 참고.
본원에 사용된 경우에, 용어 "약"은 기준 정수 및 이들 사이 값으로부터 ±10%의 이형을 지칭한다. 예를 들어 "약" 40개 염기 쌍은 ±4 (즉, 정수 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44를 포함하는, 36 - 44)를 포함한다. 다른 값에 대하여, 특히 백분율 (예를 들면, 90% 동일성, 약 10% 가변성, 또는 약 36% 미스매치)을 지칭하는 경우, 용어 "약"은 양쪽 정수 및 분수를 포함하는 범위 안에서 모든 값들을 포함한다.
본 명세서 및 청구항 전반에 걸쳐 사용된 경우에, 용어들 "포함하는", "함유하는", "포함한", 및 이의 이형은 다른 구성요소, 요소, 정수, 단계 및 기타 등등을 포함한다. 반대로, 용어 "이루어지는" 및 이의 이형은 다른 구성요소, 요소, 정수, 단계 및 기타 등등을 배제한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어들은 당업자들 중 한명에 의해 그리고 출판된 텍스트를 참조하여 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖고, 이들은 당업자에게 본원에서 사용된 많은 용어들에 대한 일반 지침을 제공한다.
실시예
우리는 메가뉴클레아제의 낮은 세포내 수준이 온-타깃 게놈 편집에 충분하다는 것, 그리고 이 임계값 능가하기가 오프-타깃 편집의 기회를 증가시킨다는 것을 강조하였다. 이 강조를 테스트하기 위해, 우리는 자가-불활성화 또는 "자살" 시스템을 개발하여 메가뉴클레아제의 발현을 제한하였다.
결론적으로, 표적 서열을 삽입시키고/거나 단백질 분해 신호를 부가시킴으로써 자가-불활성화를 통해서 메가뉴클레아제 발현을 제한시키는 것은 온-타깃 효능 손상 없이 오프-타깃 활동성을 감소시킨다. 유전자 편집 접근법에서 이 자살 시스템을 포함하는 것은 AAV-전달된 게놈 편집 뉴클레아제의 안전성 프로파일을 증가시킨다.
실시예 1 -
본 예에서, WO2018/195449에 기재된 조작된 메가뉴클레아제는 본 발명을 예시하는데 사용되었다. 이들 메가뉴클레아제는 PCS 7-8 인식 서열을 인식하고 분열하기 위해 조작되었다. PCS 7-8 인식 서열은 PCSK9 유전자 안에서 위치된다. 이들 조작된 메가뉴클레아제는 제1 초가변 (HVR1) 영역을 포함하는 제1 서브유닛, 그리고 제2 초가변 (HVR2) 영역을 포함하는 제2 서브유닛을 포함한다. 추가로, 제1 서브유닛은 인식 서열에서 제1 인식 절반-부위 (예를 들면, PCS7 절반-부위)에 결합하고, 제2 서브유닛은 인식 서열에서 제2 인식 절반-부위 (예를 들면, PCS7 절반-부위)에 결합한다. 조작된 메가뉴클레아제가 단일-쇄 메가뉴클레아제인 구현예에서, 제1 및 제2 서브유닛은, HVR1 영역을 포함하고 제1 절반-부위를 결합시키는 제1 서브유닛이 N-말단 서브유닛으로서 위치되고, HVR2 영역을 포함하고 제2 절반-부위를 결합시키는 제2 서브유닛이 C-말단 서브유닛으로서 위치되도록 배향될 수 있다. 대안적 구현예에서, 제1 및 제2 서브유닛은, HVR1 영역을 포함하고 제1 절반-부위를 결합시키는 제1 서브유닛이 C-말단 서브유닛으로서 위치되고, HVR2 영역을 포함하고 제2 절반-부위를 결합시키는 제2 서브유닛이 N-말단 서브유닛으로서 위치되도록 배향될 수 있다. 예를 들면, WO 2018/195449의 표 1, 참고.
우리는 프로모터 뒤에 22 bp 메가뉴클레아제 표적 서열을 삽입시킴으로써 M2PCSK9를 발현시키는 AAV 벡터를 개발하였다. 이 설계로, 발현된 M2PCSK9는 PCSK9 유전자를 편집할 수도 있고 프로모터 바로 뒤에 AAV 벡터 게놈을 분열시킬 수 있어서, 메가뉴클레아제 트랜스진의 추가 전사를 방지한다. 우리는 polyA 서열 앞에 추가의 표적 서열을 삽입시킴으로써 또는 프로모터 뒤에 돌연변이체 표적 서열을 삽입시킴으로써 대안적 벡터를 작제하였다. 우리는 또한, 이 서열이 프로테아좀에 의한 분해를 위하여 트랜스진 단백질을 표적해야 하기 때문에, M2PCSK9 메가뉴클레아제와 프레임내 PEST 서열을 포함하였다.
우리는 인간 PCSK9를 발현시키는 AAV9 벡터로 면역결핍 RAG 녹아웃 마우스를 정맥내로 투여하였다. 2 주후, 우리는 자살 시스템 벡터로 마우스를 재투여하였다. 자살 시스템의 모든 버전은, 상이한 정도에도 불구하고 벡터-투여 후 다른 시간 과정으로, 혈청에서 PCSK9의 수준을 감소시켰다. 예상된 대로, M2PCSK9는 PSCK9 유전자에서 표적 서열 뿐만 아니라 AAV 게놈에서 존재하는 때 표적 서열 양쪽에서 인델을 창출하였다. 일부 자살 시스템 벡터의 경우, 온-타깃 편집 효능은 웨스턴 블랏에 의해 결정된 단백질 발현에서의 감소 그리고 벡터 투여후 9 주에 오프-타깃 활동성에서 20-배 감소가 있는 모 AAV-M2PCSK9 벡터로 수득된 것과 비슷하였다.
플라스미드
모든 작제물은 AAV 역위된 말단 반복부 (ITR), 인간 갑상선 호르몬-결합 글로불린 (TBG) 프로모터, Promega 인트론, PCS7-8L.197 (ARCUS2 또는 M2PCSK9로서도 알려진) 유전자, 우드처크 간염 바이러스 (WHP) 전사후 조절 요소 (WPRE), 소 성장 호르몬 (bGH) polyA 신호, 및 제2 AAV ITR 서열 (이 플라스미드는 이전의 간행물 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725)에서 기재되었음을 함유하는 AAV 플라스미드에 기반된다.
AAV 생산에 사용된 플라스미드:
· pAAV.TBG.PI.PCS 7-8L.197.bGH (AAV.M2PCSK9): WPRE 서열은 이전에 기재된 플라스미드로부터 제거되었다 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725). 최종 플라스미드는 TBG 프로모터, 합성 인트론, M2PCSK9 (I-Cre-I 조작된 메가뉴클레아제)를 위한 코딩 서열, 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 9에서 표시된다. M2PCSK9의 아미노산 서열은 서열번호: 10에서 표시된다.
· pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197.bGH (AAV.Target.M2PCSK9): M2PCSK9 표적 서열 (서열번호: 5: 5'-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA-3')은 프로모터 서열 뒤에 클로닝되었다. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 11에서 표시된다.
· pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH (AAV.Target.M2PCSK9+PEST): M2PCSK9 코딩 서열로 프레임내 클로닝된, 마우스 오르니틴 데카복실라제로부터 프롤린-글루타메이트-세린-트레오닌-풍부 (PEST) 서열 및, 상기 대로 표적 서열을 함유하는 벡터. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 12에서 표시된다.
· pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197-PEST.AP-T0.bGH (AAV.2xTarget.M2PCSK9+PEST): polyA 신호 앞에 클로닝된 추가의 M2PCSK9 표적 서열 더하기 (프로모터 뒤에 표적 서열 및 프레임내 PEST 서열을 M2PCSK9와 함유하는) 이전의 벡터와 유사. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 13에서 표시된다.
· pAAV.TBG.AP-T8VL.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH (AAV.MutTarget.M2PCSK9+PEST): 돌연변이체 표적 서열 (5'-TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA-3')은 (AAV8.Target.M2PCSK9+PEST 작제물과 유사한) 프로모터 바로 뒤에 클로닝되어, 모 표적 서열 (5'-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA-3')을 대체하였다. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 14에서 표시된다.
· pAAV.TBG.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH (AAV.M2PCSK9+PEST): PEST 서열은 M2PCSK9 코딩 서열과 프레임내 클로닝되었다. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 15에서 표시된다.
· pAAV.TBG.AP-T8VL.PI.PCS 7-8L.197.bGH (AAV.MutTarget.M2PCSK9): 돌연변이체 표적 서열은 프로모터 직후 클로닝되었다. 이 플라스미드로부터 발현 카세트의 서열은 서열번호: 16에서 표시된다.
AAV 자살 벡터를 작제하고 생산하기 위해 WPRE 요소는 제거되었다. PCS7-8L.197 표적 서열 (서열번호: 5 - TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA)은 TBG 프로모터 뒤에 그리고 Promega 인트론 요소 앞에 클로닝되었다. 추가의 표적 서열은 M2PCSK9 유전자 뒤에 그리고 polyA 신호 앞에 클로닝되었다. MutTarget 서열 (서열번호: 6: TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA)은 M2PCSK9에 대하여 낮은 순위 오프-타깃 서열로서 LLC-MK2 세포 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725)에서 GUIDE-Seq 실험으로 식별되었다.
오르니틴 데카복실라제 (ODC) 프롤린-글루타메이트-세린-트레오닌-풍부 (PEST) 서열: 서열번호: 3: aagcttagcc atggcttccc gccggaggtg gaggagcagg atgatggcac gctgcccatg tcttgtgccc aggagagcgg gatggaccgt caccctgcag cctgtgcttc tgctaggatca atgtgtagtaa)은 아미노산 서열: KLSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (서열번호: 4)를 인코딩한다. 이 PEST 서열은 마우스 세포로부터 수득되었고 벡터에서 M2PCSK9 유전자 서열과 인-프레임 클로닝되었다.
AAV 벡터는 이전에 기재된 대로 삼중 형질감염 기법을 사용하여 생산되었다.
마우스 실험
인간 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 유형 9 효소 (AAV9.hPCSK9)를 인코딩하는 AAV 혈청형 9의 3.5x1010 게놈 카피 (GC)는 단일 정맥 꼬리 주사를 통해 숫컷 6- 내지 8-주령 Rag1 KO 마우스 (The Jackson Laboratory)에 투여되었다. 2 주후, M2PCSK9 뉴클레아제 또는 AAV 자살 벡터를 인코딩하는 AAV 혈청형 8의 1x1011 또는 1x1012 GC는 단일 정맥 꼬리 주사를 통해서 주사되었다. 혈청 샘플은 연구의 끝까지 주마다 수집되었다. 마우스의 서브세트는 안락사되었고 AAV9.hPCSK9 후 4 또는 9 주에 간 수집되었다.
비-인간 영장류 (NHP) 실험
6x1012 GC /Kg의 AAV.M2PCSK9, AAV.Target.M2PCSK9, 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9-PEST 또는 3x1013 GC/Kg의 AAV.MutTarget.M2PCSK9는 붉은털 원숭이에 정맥내로 투여되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 혈청 샘플은 벡터 투여 전 그리고 투여 후 상이한 시간에 수득되었다. 간 생검은 벡터 투여후 18 일차에 수집되었다. hPCSK9 측정을 포함하는, 모든 혈액 테스트는 이전에 기재된 대로 수행되었다 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725).
인델 분석
마우스 실험의 AAV9.hPCSK9에서 그리고 AAV 자살 벡터, 뿐만 아니라 PCSK9 유전자, AAV.Target.M2PCSK9 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9-PEST 벡터에서 존재하는 표적 영역에서의 인델은 이전에 기재된 대로 정량화되었다 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725). 이 검정에 사용된 프라이머는 표 1에 표시된다.
표 1
Figure pct00001
AMP-Seq 분석
NHP 실험의 PCSK9 표적 영역에서 인델 및 ITR 통합은 이전에 기재된 대로 AMP-Seq 분석에 의해 결정되었다 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725).
오프-타깃 식별 및 특성규명
ITR-Seq는 아래 실시예 3에서 기재된 대로 NHP 및 마우스로부터 간에서 수행되었다.
지시된 오프-타깃 자리를 위한 프라이머는 이전에 기재된 대로 인델% 계산을 위하여 설계되었다 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725).
결과
우리는 M2PCSK9-발현 AAV 벡터에서 돌연변이체 표적 서열, PEST 신호 또는 이들 요소들의 조합이 이의 온-타깃 활동성 손상 없이 뉴클레아제의 오프-타깃 활동성에서 저감을 초래하는지를 평가하였다. 도 1은 테스트된 AAV 벡터의 도식적 표현을 도시한다. 도 2a는 본원에 기재된 마우스 및 NHP 연구의 시간선을 도시한다. 도 2b는 자살 벡터의 AAV 생산 동안 발생된 AAV 게놈에서 하위 편집을 도시한다.
이들 벡터의 생체내 효능을 테스트하기 위해, Rag1 KO 마우스는 (마우스 게놈이 M2PCSK9 표적 서열을 함유하지 않기 때문에) hPCSK9를 발현시키는 AAV 벡터로 먼저 주사되었고, 2 주후 이들 마우스는 1x1011 GC/마우스에서 AAV 자살 벡터로 투여되었다. 2 주후 (제1 벡터 주사 이래 4 주) 또는 7 주후 (총 9 주) 마우스는 안락사되었고 간은 수집되었다.
AAV.hPCSK9 벡터에서 M2PCSK9 표적 서열을 포괄하는 영역은 PCR에 의해 증폭되었고, 앰플리콘은 차세대 시컨싱 및 생물정보학 분석에 의해 분석되어 표적 구역에서 삽입 또는 결실 (인델)을 함유하는 AAV.hPCSK9-유래된 앰플리콘의 백분율을 결정하였다 (도 3a). 모든 테스트된 AAV 자살 벡터는 4 주차 및 9 주차에 AAV.hPCSK9 좌위에서 인델을 유도하였다. 추가적으로, 우리는 M2PCSK9 뉴클레아제가 또한 M2PCSK9 뉴클레아제를 발현시키는 AAV 벡터에서 존재하는 표적 또는 돌연변이체 표적 서열에서 인델을 유도하였는지를 평가하였다. 우리는 표적 서열을 함유하는 모든 벡터의 표적 영역에서 인델의 증거를 찾았다. 양쪽 돌연변이체 표적 및 PEST 서열을 함유하는 벡터에서 인델이 그리고 PEST 서열이 없지만 돌연변이체 표적 서열을 함유하는 벡터에서 더 낮은 백분율이 있었다 (도 3b).
AAV 자살 벡터가 온-타깃 활동성을 유지하였는지 사정 후 우리는 이의 발현이 이들 벡터에 의해 매개된 때 M2PCSK9의 오프-타깃 활동성을 결정하였다. 우리는 ITR-Seq로 불리는 기법을 사용하여 M2PCSK9 뉴클레아제 (BMC Genomics. 2020 Mar 17;21(1):239)의 온- 및 오프-타깃 활동성에서 유래된 이중-가닥 파괴의 게놈성을 결정하였다. 간 DNA의 ITR-Seq 분석 (도 4a)은 AAV.M2PCSK9로 처리된 마우스에서 대략적으로 160개 오프-타깃 부위를 식별하였고, 반면 AAV 자살 작제물 경우 오프-타깃의 수는, AAV.M2PCKS9+PEST (평균으로 52개 오프-타깃) 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9 (128개 오프-타깃)을 제외하고, 26으로 감소되었다.
식별된 오프-타깃으로부터 우리는 추가 분석을 위하여 고-순위 오프-타깃의 서브세트를 선택하였다. 우리는 이들 오프-타깃을 포괄하는 DNA 영역을 증폭시키는데 특이적인 프라이머를 설계하였고 인델%는 계산되었다 (도 4b). AAV.M2PCSK9 벡터로 처리된 마우스와 비교해서 AAV 자살 벡터로 처리된 마우스내 오프-타깃 부위에서 인델%는 감소되었다. 식별된 오프-타깃의 수에서 관찰된 것과 유사한, 선택된 오프-타깃에서 인델%는 어느 한쪽 AAV.M2PCSK9 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9 처리된 마우스에 대하여 유사하여 (도 4b), 그 자체로 돌연변이체 표적 서열이 M2PCSK9 오프-타깃 활동성에서 감소를 매개하는데 충분하지 않다는 것을 시사하였다.
비-인간 영장류 (NHP)에서 추가 테스팅 경우, 모 AAV M2PCSK9 벡터 외에, 우리는 높은 온-타깃 활동성 및 감소된 오프-타깃 활동성을 가진 2개 AAV 자살 벡터: AAV.Target.M2PCSK9 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9+PEST를 선택하였다. 이들 벡터의 도식적 표현은 도 1에서 도시된다.
각 AAV의 6x1012 GC/kg 용량, 및 AAV.MutTarget.M2PCSK9+PEST 경우 더욱 고 용량 (3x1013 GC/kg)은 NHP에 정맥내로 투여되었다. 18 일차 및 128일차 간 생검은 처리된 NHP에 대하여 수집되었다. 연구는 일부 NHP에 대하여 진행중이고 그러므로 128 일차 생검은 아직 수집되지 않는다.
모든 테스트된 AAV 벡터는, 앰플리콘-Seq 또는 AMP-Seq 방법에 의해 검출된 경우에, PCSK9 유전자의 의도된 표적 영역에서 인델을 유도하였다 (도 5c 및 도 5d, 각각). PCSK9 표적 영역에서 편집은 이전에 관찰된 대로 PCSK9에서 저감을 유도하였고 (Nat Biotechnol. 2018 Sep;36(8):717-725), 이는 또한 벡터 주사후 상이한 시간에 LDL 수준에서 감소로 이어진다 (도 7 및 도 8, 각각).
AAV 자살 벡터에 존재하는 표적 서열에서 편집이 AAV 벡터의 분해를 촉진시켜, 트랜스진 RNA 수준에서 후속 감소로 이어지는 것이 가능하기 때문에, 우리는 d18에 간 생검 샘플에서 AAV 게놈 카피 (GC) 및 M2CPSK9 RNA를 정량화시켰다 (도 9). 예상된 대로, AAV GC는 6x1012 GC/kg으로 처리된 NHP의 나머지보다 AAV.MutTarget+PEST의 3x1013 GC/kg 용량으로 처리된 NHP에서 더 높았고; GC의 양은 동일한 용량으로 처리된 NHP에서 유사하였다. RNA의 양은, 3x1013 GC/kg으로 처리된 NHP에서 조차, 모든 테스트된 용량들 사이 유사하였다.
유사한 온-타깃 편집 (도 6)에도 불구하고, ITR-Seq에 의해 식별된 오프-타깃 부위의 수는 그룹들 중에서 상이하였다. AAV.M2PCSk9 그룹에 대하여 범위는 41 내지 263개 오프-타깃 부위 (평균 132개)이었다. 동일한 용량에, AAV.MutTarget.M2PCSK9+PEST 그룹에 대하여 오프-타깃은 34개이었고 AAV.Target.M2PCSK9에 대하여 범위는 34 내지 62개 오프-타깃 (평균 48개)이었다.
마우스 및 NHP 실험에서 수득된 예비 결과는 AAV 자살 시스템이 온-타깃 활동성을 유지하면서 M2PCSK9 오프-타깃 활동성 (도 5e)을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 2 - TTR
하기 부위: 서열번호: 7 -GCTGGACTGGTATTTGTGTCTG를 인식하는 TTR 메가뉴클레아제 또는 TTR 메가뉴클레아제 - PEST 융합 단백질과, 실시예 1에서 기재된 기법을 사용함. 도 6, 참고.
실시예 3 - ITR-Seq: 차세대 시컨싱 검정은 게놈 편집 이후 생체내 게놈식 DNA 편집 부위를 식별한다
간행물 Breton 등, ITR-Seq, 차세대 시컨싱 검정은, 이 전체가 본원에 참고로 편입되는, 아데노-연관된 바이러스성 벡터-매개된 게놈 편집, BMC Genomics, (2020):21:239 이후 생체내 게놈식 DNA 편집 부위를 식별한다.
재료 및 방법
동물 연구
모든 동물 절차는 펜실베니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다.
붉은털 원숭이 연구
이전에 공표된 연구로부터 DNA 샘플은 ITR-Seq 분석에 사용되었다15. 간단히, 메가뉴클레아제 M1PCSK9 (AAV8.TBG.M1PCSK9.WPRE) 또는 M2PCSK9 (AAV8.TBG.M2PCSK9.WPRE)의 발현을 구동시키는 AAV8 벡터는 붉은털 원숭이에 (M1PCSK9-처리된 동물 경우 n=4 그리고 M2PCSK9-처리된 동물 경우 n=2) 말초 정맥을 통해 투여되었다. 간 생검은 벡터 투여후 17 및 129 일 (AAV8-M1PCSK9 경우) 또는 18 및 128 일 (AAV8-M2PCSK9 경우)에 수행되었다15. 처리되지 않은 대조군으로서, 우리는 벡터 투여에 앞서 수집된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 샘플로부터 추출된 DNA를 사용하였다15.
뉴클레아제-독립적 AAV 통합 이벤트를 측정하기 위해, 우리는 이전의 공표된 연구로부터 간 DNA 샘플을 분석하였다17. 간단히, 1 주령 또는 1 개월령 숫컷 붉은털 원숭이는 3x1012 게놈 카피 (GC)/kg의 용량에 AAV8.TBG.EGFP로 투여되었다. 동물은 벡터 투여후 안락사되었고, 간은 수집되었다.
마우스 연구
신생 (0-2 일령, 그룹 당 n=2) C57BL/6J 마우스는 3x1011 GC/마우스의 용량으로 어느 한쪽 SaCas9 (AAV8.TBG.hSaCas9.bGH), LbCpf1 (AAV8.ABP2.TBG-S1.hLbCpf1.bGH), 또는 AsCpf1 (AAV8.ABPS2.TBG-S1.hAsCpf1.PA75)을 발현시키는 측두 정맥 주사 AAV, 및 2x1012 GC/마우스의 용량으로 대조군으로서 표적되지 않은 sgRNA (AAV8.U6.sgRNA-ctrl.mASS1.donor(mASS1)) 또는 특이적 sgRNA (AAV8.U6.sgRNA.mASS1.donor(mASS1))를 발현시키는 벡터에 의해 공-투여되었다. 벡터 투여후 21 일에, 마우스는 안락사되었고 간은 수집되었다.
추가의 신생 마우스 (그룹 당 n=2)는, 1012 GC/마우스의 용량으로 ASS1-특이적-sgRNA 및 인간 응고 인자 IX (hFIX) 트랜스진 (AAV8.U6.sgRNA.mASS1.TBG.hFIX)을 발현시키는 제2 벡터와, 1011 또는 3x1011 GC/마우스의 용량으로 상기 기재된 대로 SaCas9 또는 LbCpf1을 발현시키는 벡터로 공-투여되었다. 간은 벡터 투여후 70 일에 수집되었다.
ITR-Seq
개발된 ITR-Seq 프로토콜은 앵커링된 PCR 반응의 변형된 버전이고18, 19, 여기에서 단일 프라이머는 ITR 서열에 어닐링하도록 그리고 상기 서열로부터 밖으로 증폭하도록 설계된다 (도 7c). DNA에서 ITR 통합 이후, 프라이머는 숙주 게놈 및 삽입된 벡터 ITR 서열의 접합부를 증폭시키는데 사용될 수 있다 (도 7b, 7c). 통합된 ITR의 정돈된 이차 구조를 적절히 변성시키기 위해, 69℃의 높은 어닐링 온도 및 더 긴 어댑터-특이적 프라이머는 설계되었다.
앰플리콘은 간 조직 샘플로부터 단리된 정제된 게놈성 DNA로부터 생성되었다. DNA는 ME220 집속된-초음파분쇄기 (Covaris, Woburn, MA)를 사용하여 500 bp의 평균 크기로 전단되었고, 0.8x 비율로 AMPure 비드 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 사용하여 정제되었고, 15 μl의 용출 완충액 (Qiagen, Hilden, Germany)에서 용출되었다. 말단 복구는 1 μl의 5 mM dNTP 믹스 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 2.5 μl의 10x SLOW 결찰 완충액 (Enzymatics, Beverly, MA), 2 μl의 End-Repair Mix (Low Concentration; Enzymatics, Beverly, MA), Taq 폴리머라제 경우 2 μl의 10x 완충액 (MgCl2-없음; Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.5 μl의 비-핫 스타트 Taq 폴리머라제 (New England BioLabs, Ipswich, MA), 0.5 μl의 무뉴클레아제 수 (Life Technologies, Waltham, MA), 및 14 μl의 400 ng 전단된 게놈성 DNA를 함유하는 22.5 μl의 총 부피에서 후속적으로 수행되었다. 믹스는 12℃에 15 분 동안, 37℃에 15 분 동안, 72℃에 15 분 동안 인큐베이션되었고, 4℃에 유지되었다. MiSeq Common Adapters (Illumina, San Diego, CA)에 어닐링된 분자성 지수 태그를 가진, 고유 Y-어댑터는 하기 믹스: 1 μl의 10 μM 어닐링된 A01-A16 Y-어댑터, 2 μl의 T4 DNA 리가제 (Enzymatics, Beverly, MA), 및 22.5 μl의 이전의 말단-복구된 DNA에서 말단-복구된 DNA에 결찰되었다. 결찰 프로그램은 30 분 동안 16℃, 30 분 동안 22℃이었고; 반응은 4℃에 유지되었다. DNA는 그 다음 0.7x 비율로 AMPure 비드 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)에 의해 정제되었다. 말단-복구된 Y-어댑터-결찰된 DNA 단편은 하기 믹스 (샘플 당 양): 11.9 μl의 무뉴클레아제 수, Taq 폴리머라제 경우 3 μl의 10x 완충액 (MgCl2-없음, Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.6 μl의 10 mM dNTP 믹스 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 1.2 μl의 50 mM MgCl2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.3 μl의 5 U/μl 플래티넘 Taq 폴리머라제 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 μl의 10 μM GSP_ITR3.AAV2 프라이머, 1.5 μl의 0.5M TMAC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 어댑터 수를 매칭하는 프라이머 수를 가진 0.5 μl의 10 μM A01-A16_P5_FWD 프라이머 (예를 들면, A01 Y-어댑터와 사용되어야 하는 A01_P5_FWD 프라이머), 및 10 μl의 이전에 정제된 DNA에서 ITR-특이적 프라이머 및 어댑터-특이적 프라이머 (A01-A16_P5_FWD 프라이머)를 사용하는 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 프로그램은 5 분 동안 95℃의 1 주기 30 초 동안 95℃, 1 분 동안 69℃, 및 30 초 동안 72℃의 30 주기; 5 분 동안 72℃에 1 주기; 4℃ 유지이었다. PCR 산물은 0.7x AMPure 비드 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 사용하여 정제되었고 15 μl의 용출 완충액 (Qiagen, Hilden, Germany)에서 재현탁되었다.
NGS 라이브러리는 하기 믹스 (샘플 당 양): 5.4 μl의 무뉴클레아제 수 (Life Technologies, Waltham, MA),, Taq 폴리머라제 경우 3 μl의 10x 완충액 (MgCl2-없음; Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.6 μl의 10 mM dNTP 믹스 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), 1.2 μl의 50 mM MgCl2 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0.3 μl의 5 U/μl 플래티넘 Taq 폴리머라제 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 μl의 10 μM GSP_ITR3 프라이머, 1.5 μl의 0.5M TMAC (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 어댑터 수를 매칭하는 프라이머 수를 가진 0.5 μl의 10 μM A01-A16_P5_FWD 프라이머, 1.5 μl의 10 μM p701-16 프라이머, 및 (이전의 PCR 정제 단계에서 사용된 AMPure 비드를 포함하는) 15 μl의 이전에 정제된 DNA에서 PCR에 의해 제조되었다 PCR 프로그램은 5 분 동안 95℃의 1 주기; 30 초 동안 95℃, 2 분 (-1℃/주기) 동안 75℃, 및 30 초 동안 72℃의 10 주기; 30 초 동안 95℃, 1 분 동안 69℃, 및 30 초 동안 72℃의 15 주기; 5 분 동안 72℃에 1 주기; 4℃ 유지이었다. PCR 산물은 0.7x AMPure 비드 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN)를 사용하여 정제되었고 25 μl의 용출 완충액에서 재현탁되었다. 이중-지수화된 시컨싱 라이브러리는 Illumina MiSeq 카트리지 (MiSeq® v2 RGT Kit 300 cyc PE-Bx 1 of 2; San Diego, CA)에서 시컨싱되어, 2x150 bp 짝짓기된-말단 판독을 생성하였다.
샘플 역다중화 및 고유 분자 식별자 (UMI) 태깅은, 어느 한쪽 지수에서 최고 1개 미스매치를 허용하는, Je20을 사용하여 원시 fastq 파일에서 수행되었다. 판독 2가 설계된 프라이머 서열, 더하기 추가의 측접하는 20 bp의 AAV2 ITR 서열로 시작하는 판독 쌍 (도 7a-7c)은 FASTX 바코드 슬리터 (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/, 최고 5개 미스매치 허용), fastq-쌍 (https://github.com/linsalrob/EdwardsLab/), 및 FASTP을 사용하여 식별되었다21. 선택된 판독 쌍은 NovoAlign (Novocraft, Selangor, Malaysia)을 사용하여 각 샘플에 대하여 참조 게놈 (마우스에 대하여 MM10 및 붉은털 원숭이 샘플에 대하여 RheMac8)에 맵핑되었다. UMI 판독 합병은 Je20을 사용하여 후속적으로 수행되어, UMI 합병된 BAM 파일을 초래하였다. ITR-게놈성 DNA 삽입 부위에 미치는 키메라 판독은 SE-MEI (https://github.com/dpryan79/SE-MEI)를 사용해서 각 판독에 대하여 분할-판독 접합을 결정함으로써 식별되었다. 판독의 소프트-클리핑된 부문은 그 다음 NovoAlign (Novocraft, Selangor, Malaysia)을 사용하여 AAV2 참조 게놈에 맵핑되었다. 30 초과 또는 이에 맞먹는 맵핑 품질 값으로 AAV2 ITR에 맵핑하는 소프트-클리핑된 판독 부문을 함유하는 것으로 밝혀진 본래 맵핑된 판독들만이 50 bp 윈도우 안에서 발견된 ITR 통합 부위를 BED툴을 사용하여 단일 ITR 통합 부위로 병합시킴으로써 ITR 통합 부위를 식별하는데 사용되었다22, 23. 양쪽 정방향 및 음성 가닥 배향에서 ITR 통합을 함유하는 그들 부위만이 식별된 오프-타깃 부위인 것으로 간주되었다. 각 식별된 ITR 통합 부위의 기초가 되는 게놈성 DNA 서열은 절반-전체적 정렬에 대하여 EMBOSS 프로그램24을 사용하는 양쪽 음성 및 양성 가닥 배향으로부터 온-타깃 DNA 서열 모티프와 쌍별로 정렬되었고; 이것은 관심 뉴클레아제에 의해 인식된 정밀한 ITR 통합 부위 및 서열 상동성을 사정하였다.
결과 및 논의
비-인간 영장류에서 메가뉴클레아제 활동성을 평가하기 위한 ITR-Seq 검정 개발하기
생체내 유전자 편집 후 뉴클레아제-유도된 DSB를 식별 및 순위화할 수 있는 NGS-기반된 검정의 개발은 인간 임상 시험으로의 번역을 위한 게놈 편집 요법의 안전성 및 효능을 평가하는 우리의 능력을 상당히 진전시킨다. 연구원들은 뉴클레아제의 특이성을 지배하는 요소를 더욱 양호하게 이해하기 위해 그리고 이들 요법의 안전성 프로파일을 개선하기 위해 게놈 편집 뉴클레아제의 온- 및 오프-타깃 활동성을 식별 및 정량화하는 다양한 접근법을 개발하였다25. 어느 한쪽 배양된 세포에서 또는 그들의 뉴클레아제 활동성의 결과로서 창출된 동물 모델에서, DSB를 먼저 식별함으로써 뉴클레아제 특이성 및 활동성을 연구할 수 있다26, 27. 이 뉴클레아제 특이성을 결정하기 위한 접근법들 중 일부는 무세포 방법 예컨대 Site-Seq28, Digenome-seq29, 및 Circle-Seq30을 포함한다. 시험관내-기반된 방법들 중 일부는 GUIDE-Seq19 및 통합적-결핍 렌티바이러스성 벡터 포착 (IDLV)을 포함한다31, 32. 이들 시험관내 분석은, 하지만, 시험관내 분석에 사용된 조건이 동물 모델의 표적 기관에서 존재하는 뉴클레아제 농도 및 DNA 접근가능성을 대표하지 않으므로, 생체내 오프-타깃 활동성의 수 및 속도를 정확하게 예측할 수 없다.
우리는 그러므로 ITR 통합의 부위의 편향되지 않은, 게놈식 식별을 위한 방법론을 개발하고자 하였다. DSB를 식별하기 위한 태그로서 AAV ITR을 사용함으로써, 우리는 생체내 게놈-편집 뉴클레아제의 오프-타깃 활동성을 측정할 수 있다. 우리의 방법은 DSB가 발생한 후 숙주의 게놈성 DNA로의 AAV ITR 서열 통합을 입증하였던 이전의 조사에 기반되었다10-14, 16, 33-36.
최근, 우리 그룹은 AAV8 벡터를 사용하여 붉은털 원숭이의 간에 전달된 PCSK9 유전자를 표적하였던 메가뉴클레아제의 게놈-편집 효율을 특성규명하였다. 이 연구는 PCSK9의 안정한, 용량-의존적 감소 그리고 1세대 메가뉴클레아제, M1PCSK9의 높은 및 중간-수준 용량, 또는 2세대 메가뉴클레아제, M2PCSK9의 중간-용량에 대하여 30-40%의 온-타깃 인델 백분율을 보여주었다15. 우리는 양쪽 1세대 및 2세대 메가뉴클레아제 작제물 (AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9, 각각)과 이전에 융합된 붉은털 원숭이의 간 생검 샘플로부터 편집된 PCSK9 대립유전자를 단리시켰다15. AMP-Seq 및 앰플리콘 시컨싱 검정을 사용하여 이들 대립유전자를 분석하는 동안, 우리는 ITR 서열의 게놈성 통합이 고 빈도로 발생하였다는 것을 주목하였다15.
여기에서, 우리는 AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9 온-타깃 영역을 특성규명하는 동안 생성된 NGS 판독을 재-분석하였다15. 우리의 목표는 PCSK9 유전자에서 메가뉴클레아제 온-타깃 좌위에 통합되었던 대부분의 공통 AAV ITR 서열을 식별하는 것이었다. AAV2 참조 게놈의 위치 82에 절대 빈도로 피크에 기반하여 (도 7a), 우리는 ITR 통합의 가장 빈번한 염기 위치가 rep-결합 요소 (RBE)의 5' 업스트림에서 발생한다고 결정하였다. 우리는 이 정보를 사용하여 (도 7b에서 도시된) 관찰된 ITR-통합 시작 부위의 5' 업스트림을 하이브리드화시키는 ITR-특이적 프라이머를 설계하였다. 이 프라이머는, 앵커링된 다중화된 PCR의 변형된 버전에 기반된, 신규 NGS 검정에서 사용되어, 삽입성 돌연변이유발 이후 ITR-게놈성 DNA 접합을 식별한다 (도 7c). 우리는 이 방법을 ITR-Seq로 불렀다.
샘플 분석을 위하여 ITR-Seq 검정을 사용하기 위해, 우리는 뉴클레아제-발현 AAV 벡터로 처리된 동물의 조직으로부터 DNA를 먼저 단리시켰다. 우리는, 이전의 보고서에서 기재된 대로, DNA를 전단하였고 이것을 Y-어댑터에 결찰시켰다19. 상기 기재된 ITR-특이적 프라이머 및 어댑터-특이적 프라이머를 사용하는 2개 라운드의 PCR 이후, 우리는 NGS-호환성 라이브러리를 생산하였다. 시컨싱 후, 우리는 양쪽 증폭된 ITR 서열 및 인접한 게놈성 DNA 서열을 함유하는 생성된 앰플리콘을 컴퓨터로 식별하였다. 우리는 또한 게놈식 ITR 통합 부위의 자리 및 빈도를 결정하였다. ITR이 양쪽 정방향 및 역방향 가닥 배향에서 임의의 특정한 식별된-ITR 통합 부위에 통합하는 것을 요구함으로써, 우리는 위양성 결과의 수를 추가로 감소시키고 고-신뢰 ITR-통합 부위를 식별하는 것을 목표하였다. 각 샘플에 대하여, 우리는 뉴클레아제 표적 부위의 순위-차례된 목록 (ITR-Seq 순위)을 생산하였고 좌위 (ITR-Seq 판독) 당 관찰된 ITR-통합 이벤트의 총 수에 의해 (내림 차순으로) 부위를 선별하였다.
ITR-Seq는 붉은털 원숭이에서 뉴클레아제 오프-타깃 부위를 식별한다
ITR-Seq 검정의 개발 이후, 우리는 AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9가 이전에 투여된 붉은털 원숭이에서 메가뉴클레아제의 온- 및 오프-타깃 효과를 추가로 분석하기 위해 이 기법을 사용하였다 (도 8a-8c). 이전에 기재된 대로, 붉은털 원숭이는 AAV8-M1PCSK9의 3개 용량 (3x1013 GC/kg, 6x1012 GC/kg, 또는 2x1012 GC/kg) 중 하나 또는 AAV8-M2PCSK9의 단일 용량 (6x1012 GC/kg) 어느 한쪽을 받았다15. 우리는 벡터 투여 후 17 및 128 일차에 모든 마카크의 간을 생검하여 온- 및 오프-타깃 편집을 평가하였다. NGS 데이터의 컴퓨터 분석의 끝에 생성되었던, ITR-Seq 보고서는 (의도된 표적 서열에 대한 상동성에 기반된) 가장 유망한 오프-타깃 서열; 게놈성 자리; 및 (상응하는 좌위로 맵핑하는 NGS 판독의 수에 따라) ITR-Seq 순위를 포함한다. 메가뉴클레아제-처리된 마카크로부터 모든 샘플에 걸쳐서, 최상부 ITR-Seq 순위된 부위는 온-타깃 좌위 (PCSK9 표적 부위 서열 TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA, chr1:54708864-54708885)이었다15. 메가뉴클레아제 (즉, AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9)의 양쪽 세대 경우, ITR-Seq에 의해 식별된 오프-타깃 부위 수는 양쪽 투여된 벡터 용량 및 샘플 시점에 의존하였다. 오프-타깃 부위의 수는 용량-의존적 방식으로 그리고 시간의 함수로서 저감하였다 (예를 들면, 17 일차는 128 일차보다 더 많은 오프-타깃 부위를 가졌다; 도 8a 참고). 2세대 조작된 메가뉴클레아제, M2PCSK9를 받았던 동물은, 동일한 용량에, 메가뉴클레아제의 1세대, M1PCSK9로 처리된 동물보다 더 적은 식별된 오프-타깃 부위를 가졌다. 종합하여, 우리는 6x1012 GC/kg의 용량으로 AAV8-M1PCSK9 투여 후 1,170개 상이한 오프-타깃을 관찰하였다. 대조로 우리는 6x1012 GC/kg의 용량으로 AAV8-M2PCSK9를 받았던 2마리 마카크에서 194개 및 105개 오프-타깃을 관찰할 뿐이었다 (도 8a).
ITR-Seq 식별된 오프-타깃의 서브세트는 3x1013 및 6x1012 GC/kg의 용량에 AAV8-M1PCSK9로 처리된 마카크로부터 d18 간 샘플의 결과로부터 무작위로 선정되었다. ITR 서열의 존재는 그 다음, 식별된 오프-타깃 서열을 측접하는 유전자-특이적 프라이머를 사용하여, 이전에 기재된 대로, AMP-Seq에 의해 이들 선택된 좌위에서 조사되었다15, 18. (상기 특정된 바와 동일한 용량에 AAV8-M1PCSK9로 처리된 마카크로부터) d18로부터 간 DNA 샘플을 분석함으로써 수득된 AMP-Seq 결과는 수득된다 (데이터 나타나지 않음). 분석된 DNA 경우, ITR 서열이 들어있는 판독은, 고 ITR-Seq 순위를 가진 그들 오프-타깃에 상응하는 ITR 통합 (ITR-함유 판독)의 최고 백분율로, 27개 심문된 좌위 중에서 (3x1013 GC/kg 용량 경우) 24개에서 또는 (6x1012 GC/kg 용량 경우) 21개에서 찾아졌다. 중요하게, 양쪽 동물에서 편집의 최고 수준이 최고 ITR-Seq 순위를 가진 그들 좌위에서 보여졌기 때문에, ITR-Seq 순위, ITR 통합의 백분율 및 인델% 사이 분명한 상관관계가 또한 있다. 이들 좌위의 일부 경우 우리는 AMP-Seq 검정에 의해 통합된 ITR 서열을 검출할 수 없었고, 이것은 ITR-Seq 방법이 증폭을 위한 출발점으로서 실제 ITR 서열을 사용함에 따라 AMP-Seq 검정이 ITR 통합을 검출하기 위한 감수성이 더 낮기 때문일 수 있다. 유사하게, 우리는 ITR-Seq 결과 (예를 들면 3x1013 GC/kg의 용량에 AAV8-M1PCSK9로 처리된 간 샘플에 대하여 20:359062-359285 및 7:165269225-165269449)에서 나타나지 않은 몇개의 부위에서 ITR 서열을 관찰할 수 있었다. 이들 부위는, 하지만, 6x1012 GC/kg의 용량에 AAV8-M1PCSK9로 처리된 동물들의 ITR-Seq 결과에서 찾아져서, 우리의 현행 프로토콜이 ITR 통합 부위의 100%를 포착하지 못하고, 그러므로 ITR-Seq 방법의 감수성이 개선될 수 있음을 시사하였다.
우리는 그 다음 DNA 영역의 기능에 기반된 ITR 통합의 식별된 부위에 주석을 달았다 (도 7b). 식별된 뉴클레아제 표적 부위의 수와 무관하게, 표적 부위 (유전자간, 인트론 또는 엑손 영역)의 게놈성 분포는 메가뉴클레아제-투여된 마카크 중에서 재현가능하였다. 일반적으로, 대부분의 표적 부위, 이어서 게놈의 인트론 영역이 인트론 안에서 상주한다 (도 8b). 우리가 여기에서 평가하였던 메가뉴클레아제는 PCSK9 유전자 안에서 22개 뉴클레오타이드 표적 부위를 갖는다. 그러므로, 우리는 표적 DNA 서열과 각 오프-타깃 부위의 DNA 서열 사이 보존된 뉴클레오타이드의 수를 평가하였다 (도 8c). 온-타깃 서열에 대한 매치의 분포는 15-16개 뉴클레오타이드의 평균으로 가우시안 분포를 따르는 것으로 보였다. 이것은 대부분의 ITR-Seq-식별된 오프-타깃 부위가 표적된 DNA 서열 모티프와 각 표적 부위의 게놈성 DNA 서열 사이 6-7 미스매치를 갖는다는 것을 나타낸다 (도 8c). 상동성의 이러한 수준이 메가뉴클레아제 표적 서열과 유사한 서열에서 편집 해프닝에서 비롯하거나 단순히 우연인지를 사정하기 위해, 우리는 붉은털 원숭이 게놈 안에서 1000만 랜덤 DNA 영역 (40 bp 길이)을 생성하였다. 우리는 그 다음 ITR-Seq 프로토콜에서 사용된 동일한 알고리즘을 사용하여 메가뉴클레아제 표적 부위와 가장 유사하였던 서열을 식별하려고 시도했다 (점선, 도 8c). ITR-Seq-식별된 서열과 달리, 랜덤 서열은 의도된 표적 서열과 평균 11-12개 미스매치를 공유한다. 이것은 ITR이 의도된 표적 서열에 대한 어느 정도의 상동성으로 표적에서 대부분 통합된다는 것을 나타낸다.
오프-타깃 부위의 GUIDE-Seq 및 ITR-Seq 식별 비교하기
시험관내 뉴클레아제 온- 및 오프-타깃을 식별하는 도구는 DSB가 발생하였던 부위에서 외인성 DNA의 통합에 의지한다. 이 외인성 DNA는 (dsODN; GUIDE-Seq19의 경우) 이중-가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 (통합적-결핍 렌티바이러스성 벡터 포착, 또는 IDLV31, 32 경우) 렌티바이러스 게놈일 수 있다. 앰플리콘 라이브러리는 이들 외인성 서열에 특이적인 프라이머 및 어댑터 결찰을 사용하는 PCR 또는 LAM-PCR (선형-증폭 매개된 PCR)에 의해 작제될 수 있다. 이 DSB의 자리는 NGS를 사용하여 작제된 라이브러리를 시컨싱하고 이어서 생물정보공학 분석하고 참조 게놈에 맵핑시킴으로써 나중 시간에 식별될 수 있다. 뉴클레아제의 오프-타깃 활동성을 특성규명하기 위하여 현재 바람직한 방법들 중 하나가 GUIDE-Seq인 것은 1) 구성요소의 최소 수를 요구하고; 2) 이 소프트웨어가 오프-타깃을 식별하는데 용이하게 이용가능하고; 3) 저 풍부도 오프-타깃을 검출할 수 있기 때문이다. 이전에 언급된 대로, 시험관내 뉴클레아제 활동성은, GUIDE-Seq에서 사용된 용량, 실험의 기간, 및 세포 유형이 동물 모델의 종과 상이하다는 것을 고려하여, 생체내 뉴클레아제 활동성을 예측하지 못할 수 있다. GUIDE-Seq는 우리가 다중 sgRNA 또는 가이드 RNA-독립적 뉴클레아제, 예컨대 메가뉴클레아제를 빨리 비교할 수 있게 한다. 하지만, 앰플리콘 시컨싱을 사용하여 예측된 오프-타깃을 검증하는 것이 가능하여도, 이들이 시험관내 식별되지 않았다면 신규한, 생체내 생성된 오프-타깃을 식별할 수 없다. 게다가, 이들 방법은 생체내 검증 단계를 요구하고, 여기에서 시험관내 예측된 오프-타깃 영역을 포괄하는 프라이머에 의해 생성된 PCR 앰플리콘은 NGS에 의해 나중에 시컨싱되어 인델 식별에 의해 편집의 속도를 계산한다.
각 메가뉴클레아제 (M1PCSK9 및 M2PCSK9) 경우, 우리는 시험관내 오프-타깃 부위를 식별하기 위해 뉴클레아제를 발현시키도록 플라스미드로 형질감염된 LLC-MK2 세포에서 GUIDE-Seq 분석을 이전에 수행하였다15. 우리는 시험관내 GUIDE-Seq-식별된 오프-타깃의 목록으로부터 M1PCSK9 및 M2PCSK9 오프-타깃 자리를 선택하였다. 붉은털 원숭이를 사용하여, 우리는 그 다음 오프-타깃 좌위의 앰플리콘 시컨싱을 사용하는 이들 예측된 오프-타깃의 생체내 검증을 수행하였다15. 양쪽 앰플리콘 시컨싱15 및 ITR-Seq (도 8a)는 오프-타깃 편집 효율에서 용량- 및 시간-의존적 감소를 나타냈다. 우리는 ITR-Seq를 사용하여 생체내 오프-타깃 부위의 우리의 평가와 이들 이전의 결과를 비교하였다 (도 9a-d). 의도된 표적 서열에 대한 상동성 없이 오프-타깃 부위를 식별함으로써, 우리는 어느 한쪽 M1PCSK9 (1093 및 1499, GUIDE-Seq 실험 1 및 2, 각각 경우) 또는 M2PCSK9 (568 및 651, GUIDE-Seq 실험 1 및 2, 각각 경우)를 사용하는 2개, 독립적 실험에 걸쳐서 오프-타깃 부위의 동일한 수를 대략적으로 찾을 수 있었다. 우리는 양쪽 Guide-Seq 시험관내 실험에 의해 식별되었던 부위를 ITR-Seq에 의해 식별된 오프-타깃 부위와 비교하였다. 붉은털 원숭이에 이 연구 경우, 우리는 뉴클레아제 투여후 17 일차에 취득된 간 생검으로부터 DNA 샘플에서 ITR-Seq를 수행하였다. 우리는 3x1013 GC/kg의 AAV8-M1PCSK9 (도 9a), 6x1012 GC/kg의 AAV8-M1PCSK9 (도 9b)의 용량을 받았던 마카크, 그리고 6x1012 GC/kg의 AAV8-M2PCSK9 (도 9c 및 9d)로 투여된 2마리 동물에서 GUIDE-Seq 및 ITR-Seq-식별된 오프-타깃을 비교하였다. 대부분 (71.9-82.9%) 오프-타깃 부위는 ITR-Seq에 의해 배타적으로 식별하였고, Guide-Seq에 의해 식별하지 않았다 (도 9a-d의 유색 섹션 참고). 흥미롭게, 2세대 뉴클레아제 (M2PCSK9)를 받았던 동물 중에서 양쪽 ITR-Seq 및 Guide-Seq는 더 적은 오프-타깃 부위를 식별하였다 ((도 9a-d의 백색 섹션 참고).
우리는 GUIDE-Seq-식별된 고- 및 저-순위 오프-타깃의 세트를 이전에 검증하였고, 이는 판독의 수에 따라 순위화되었다15. 우리는, 17/18 및 128/129 일차에 메가뉴클레아제로 투여된 마카크로부터 취득된 샘플에서 오프-타깃 좌위의 앰플리콘 시컨싱을 사용하여 우리가 결정하였던, 인델 백분율을 정량화시킴으로써 이것을 하였다15. 처리되지 않은 PBMC DNA 대조군 샘플보다 상당히 더 높은 인델 백분율을 나타냈던 오프-타깃 부위는 양성으로 계수되었다.
여기에서, 우리는 ITR-Seq가 양성 GUIDE-Seq 오프-타깃을 식별할 수 있는지를 평가하였다. 우리가 GUIDE-Seq 오프-타깃을 검증하는데 사용된 동일한 DNA를 재-분석하였다는 것을 감안하면, 우리는 양성 오프-타깃 좌위 검출하기에서 우리의 방법의 감수성을 사정할 수 있다. 3x1013 GC/kg 및 6x1012 GC/kg의 AAV8-M1PCSK9로 투여된 마카크 중에서, ITR-Seq는 2개 고-순위 및 2개 저-순위 양성 GUIDE-Seq 오프-타깃만을 식별하는데 실패하였다. AAV8-M2PCSK9로 투여된 마카크 중에서, ITR-Seq는 양성 오프-타깃의 대부분을 올바르게 식별하였고 1마리 동물에서 3개 저-순위 양성 오프-타깃 그리고 다른 마카크에서 3개 고-순위 양성 오프-타깃을 누락시켰을 뿐이었다. 종합하면, 이들 결과는 생체내 오프-타깃의 대다수가 GUIDE-Seq가 아니고 ITR-Seq에 의해 식별되었을 뿐이라는 것을 분명히 나타낸다. 이것은 GUIDE-Seq-예측된 오프-타깃의 앰플리콘 시컨싱과 달리, ITR-Seq가 생체내 AAV-전달된 뉴클레아제의 활동성의 더욱 정확한 시험을 제공한다는 것을 시사한다.
AAV8-M1PCSK9 및 AAV8-M2PCSK9로 투여된 마카크로부터 DNA 샘플에서 ITR-Seq 분석은 생체내 가이드 RNA-독립적 뉴클레아제의 오프-타깃 부위를 특성규명하는 것이 가능하다는 것을 드러냈다. ITR-Seq는 게놈-편집 뉴클레아제의 세부 특성규명을 제공하는 잠재성을 갖는다. 더욱이, 시험관내 오프-타깃 데이터는 생체내 게놈-편집 뉴클레아제 오프-타깃 활동성을 포괄하지 않는다. 실제로, ITR-Seq는 우리의 이전 연구에서 특성규명하였던 GUIDE-Seq-식별된 최상부 순위 오프-타깃 부위의 대부분을 식별하였고15, 뿐만 아니라 시험관내 GUIDE-Seq 검정에 의해 포착되지 않았던 다른 오프-타깃을 식별하였다 (도 9a-9d). DSB를 식별하기 위한 태그로서 AAV ITR을 사용함으로써, 우리는 몇몇 부위가 Guide-Seq 및 앰플리콘 시컨싱에 의해 이전에 식별되었기 때문에 ITR-Seq 방법이 진정한 오프-타깃을 포착한다고 믿는다. 게다가, ITR-Seq에 의해 식별된 서열은 의도된 표적 서열과 유사하다. 그러므로, ITR-Seq는 Guide-Seq 및 후속 앰플리콘 시컨싱의 조합된 접근법에 의해 이전에 검출되지 않았던 신규한 오프-타깃을 식별할 수 있다.
Guide-Seq와 대조로, ITR-Seq는 오프-타깃을 예측하기 위한 도구가 아니다. 오히려, ITR-Seq는 온- 및 오프-타깃 뉴클레아제 활동성이 발생하였던 게놈에서 신규한 부위를 식별한다. 실제로, 이 방법은 뉴클레아제-발현 AAV로 처리된 동물의 DNA 샘플로부터 직접적으로 AAV ITR 통합 부위를 식별한다. 식별된 오프-타깃은 앰플리콘 시컨싱을 사용하여 추가로 분석되어 1) 편집 및 ITR 통합의 퍼센트를 정확하게 결정할 수 있고; 2) 임상적으로 관련한 용량 및 동물 모델에서 뉴클레아제 활동성의 세부 파노라마를 수득할 수 있다.
마우스에서 가이드 RNA-의존적 뉴클레아제 오프-타깃 부위를 식별하기 위한 도구로서 ITR-Seq 검정 평가하기
우리는 ITR-Seq가 전임상 연구에서 흔히 사용되는 다양한 가이드 RNA-의존적 뉴클레아제 (즉, SaCas9, LbCpf1, 및 AsCpf1)의 온- 및 오프-타깃 활동성을 검출할 수 있는지를 테스트하였다. 우리는 또한 ITR-Seq 분석이 (SaCas9 경우 둔탁하고 Cpf1 경우 5' 돌출된) 이들 뉴클레아제에 의해 창출된 DSB 말단의 뚜렷한 유형과 호환성인지를 평가하고 싶었다.
신생 C57BL6/J 마우스에는 2x1012 GC/마우스의 용량으로 상응하는 가이드 RNA (sgRNA, 표 2)를 발현시키는 벡터와 함께 3x1011 GC/마우스의 용량으로 SaCas9, LbCpf1, 또는 AsCpf1 뉴클레아제를 발현시키는 벡터가 공-투여되었다. 마우스는 벡터 투여후 21 일차에 안락사되었다. 간은 수확되었고 DNA는 뉴클레아제-매개된 DNA 분열 부위의 빈도 및 자리를 평가하기 위해 ITR-Seq 분석을 위하여 추출되었다. 신생 마우스의 추가의 그룹에는 1011 또는 3x1011 GC/마우스의 용량으로 상기 대로 SaCas9 또는 LbCpf1을 발현시키는 벡터가 공-투여되었다. 제2 벡터는 1x1012 GC/마우스의 용량으로 (제1 실험에서 사용된 기증자 DNA 서열 대신) sgRNA 및 hFIX 트랜스진을 발현시켰다. 우리의 목적은 ITR 통합에서 벡터 용량의 효과를 평가하는 것이었다. 이들 마우스는 벡터 투여후 70 일차에 안락사되었다. 간으로부터 DNA 샘플은 그 다음 ITR-Seq 분석에 적용되었다 (아래 표).
AsCpf1-sgRNA2로 처리된 1마리 동물을 제외하고, 온-타깃 좌위 (mASS1)는 ITR-Seq 분석에서 판독의 최고 수를 가진 표적이었다. 이 밖에도, 평가된 sgRNA-지향된 뉴클레아제의 모두가 최고 33%의 온-타깃 인델 백분율로 표적된 좌위에 대하여 높은 특이성을 나타냈다 (표 2). 중요하게, AAV8-SaCas9로 처리된 마우스는 모든 처리된 샘플에 걸쳐서 온-타깃 ITR 통합 이벤트의 최고 빈도를 나타냈다 (아래 표 2). 호환성 온-타깃 편집을 나타남에도 불구하고, 우리는 AAV8-LbCpf1 대 AAV8-SaCas9로 처리된 간에서 더 낮은 온-타깃 ITR 통합 이벤트를 관찰하였다. AAV8-AsCpf1은, 표적된 앰플리콘 시컨싱에 의해 사정된 경우, 1.22%의 최대 인델 백분율로 온-타깃 좌위에서 매우 낮은 편집 효율을 가졌다 (아래 표 2).
표 2
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CRISPR 뉴클레아제에 대하여 ITR-Seq-식별된 오프-타깃 부위의 모두는 주석이 달린 마우스 유전자 안에서 상주하였고, 가장 공통 부위는 온-타깃 좌위이었다 (데이터 나타나지 않음). 우리는 테스트된 sgRNA에 대하여 일부 저-빈도 오프-타깃을 식별하였고, 이들 중 대부분은 표적 서열과 상동성이 낮았다. AAV8-SaCas9 sgRNA에 대하여 식별된 오프-타깃 부위는 알려진 종양유전자, NOTCH2의 좌위 안에서 정착되었다 (데이터 나타나지 않음). 중요하게, 이 오프-타깃은 3x1011 GC/마우스의 용량에 AAV8-SaCas9 그리고 2x1012 GC/마우스의 용량에 AAV-sgRNA1로 투여된 마우스에서 찾아졌다. 하지만, 이 오프-타깃은, 2-배 더 낮은 용량인, AAV-sgRNA의 1012 GC/마우스의 투여 이후 없었다. 우리는 이 낮은 풍부도 오프-타깃에서 편집을 관찰하기 위해 AAV8-sgRNA1의 더욱 고 용량을 필요로 하였다 (표 2). AAV ITR 통합의 속도는 1) 표적 서열들 사이 상동성; 또는 2) 뉴클레아제 컷트의 결과로서 DNA 말단의 둔탁하거나 돌출된 성질에 의해 영향받을 수 있다. 우리는 ITR 통합의 역학을 충분히 이해하기 위해 미래에 세부 연구를 수행해야 한다.
마우스 및 비-인간 영장류에서 뉴클레아제-독립적 이벤트 분석하기
CRISPR-관련된 뉴클레아제 및 sgRNA를 발현시키는 AAV8로 주사된 마우스 중에서, ITR 통합은 sgRNA에 의해 표적된 좌위에서 발생하였다. 흥미롭게, ITR 통합은 기능적 sgRNA가 없었던 대조군 샘플에서 우리가 AAV ITR 통합을 관찰하였을 때 겉보기에 sgRNA-독립적 방식으로 또한 발생하였다. 마우스에서, 가장 공통 뉴클레아제-독립적 ITR 통합 이벤트는 Gm10800 및 알부민 유전자에서 발생하였다. 알부민 유전자에서 ITR 통합은 이전의 보고서와 일치하고, 이는 알부민 유전자가 AAV 통합에 상당히 취약하다는 것을 보여준다37. AAV 통합은 간에서 전사적으로 활성인 유전자에 대하여 보고되었다38.
비-인간 영장류에서 뉴클레아제-독립적 ITR-통합의 빈도 및 범위를 평가하기 위해, 우리는 3x1012 GC/kg의 용량에 AAV-eGFP로 투여된 붉은털 원숭이의 간 DNA를 평가하였다. 우리는, 양성 ITR 삽입으로서, 식별된 유전자에서가 아니어도, 뉴클레아제-독립적 통합 이벤트를 검출하였다. 중요하게, 우리의 방법은 생체내 이벤트의 결과로서 통합된 ITR 서열을 배타적으로 식별하는 것으로 보인다. 우리는 AAV.eGFP DNA로 스파이킹된 처리되지 않은 붉은털 원숭이의 PBMC로부터 단리된 DNA를 분석하는 것이 오프-타깃의 식별을 초래하지 않았다는 성과를 기반으로 이러한 결론에 도달했다 (데이터 나타나지 않음).
관찰된 ITR 통합이 뉴클레아제-유도된 DSB의 결과인 반면, 다른 연구원들은 제한 효소, 약물, 또는 감마-조사에 의해 유도된 DSB가 또한 이들 파괴점에서 AAV-ITR 삽입을 초래할 수 있다는 것을 보여주었다16. 뉴클레아제-독립적 AAV 통합 부위 식별하기 및 특성규명하기는, 게놈 편집을 위하여, 뿐만 아니라 유전자-요법 연구를 위하여, 더욱 완전한 AAV 안전성 프로파일을 창출하는데 특히 중요하다.
대안적 방법 예컨대 BLISS6, BLESS39, 40, 및 End-Seq7는 뉴클레아제의 활동성에 의해 창출된 DSB 말단을 포착함으로써 DSB의 부위를 식별할 수 있다. 이들 방법은 생체내 뉴클레아제-유도된 DSB를 정확하게 식별할 수 있다. 하지만, 이들 방법은 이들이 단일 시점에 존재하는 DSB를 포착할 수 있을 뿐이라는 한계가 있다. 이 한계는 여러 시점에 DSB를 분석함으로써 부분적으로 극복될 수 있다. ITR-Seq와 유사한 방법인, NGS41와 커플링된 비-제한적 LAM-PCR은 AAV-ITR 통합 부위를 검출할 수 있다. 이 기법에서, 선형 증폭은 ITR-특이적 비오틴화된 프라이머를 사용하여 먼저 수행된다. 이 단일-가닥 DNA는 스트렙타비딘 비드에 의해 단리되고 알려진 어댑터에 결찰된다. 이차 LTR-특이적 및 어댑터-특이적 프라이머를 사용하여, LTR 통합의 영역을 증폭, 시컨싱, 및 식별할 수 있다41. 이 방법은 AAV1-LPLS447X 벡터의 통합 부위를 식별하는데 사용되었고, 이는 마우스 및 인간 DNA 샘플에서 리포단백질 리파제 결핍 (LPLD)을 치료하기 위하여 개발되었다34. 이론적으로 nrLAM-PCR이 뉴클레아제의 오프-타깃 활동성을 검출할 수 있어도, 연구원들은 이들 2개 기법의 이점 및 한계를 이해하기 위해 ITR-Seq 및 nrLAM-PCR의 직접 비교를 아직 착수하지 않았다.
결론
결론적으로, 우리는 생체내 임의의 AAV-발현된 뉴클레아제의 특이성을 사정하기 위해 NGS 검정을 개발하였다. ITR-Seq 검정은 유전자-편집 연구에서 생체내 AAV 삽입 부위를 식별하는데 사용될 수 있다. 좌위-특이적 분석, 예컨대 식별된 오프-타깃 영역에서 인델 백분율 계산하기 또는 통합된 ITR 서열 특성규명하기가 필요하면, 심층-시컨싱 분석이 권장된다. 하지만, ITR-Seq에 의한 ITR 통합 이벤트의 검출이 다른 NGS-기반된 방법 예컨대 AMP-Seq보다 더욱 민감하다는 것을 명심하는 것이 중요하다.
유일한 요건이 AAV를 전달 벡터로서 사용하는 것임을 감안하면, ITR-Seq는 주석이 달린 참조 게놈을 가진 거의 모든 유기체에서 뉴클레아제의 특이성을 측정하는데 사용될 수 있다. ITR-Seq는 가변하는 복용량 및/또는 투여 루트를 갖는 종단적 동물 연구에서 뉴클레아제 표적 부위를 평가하기 위한 전임상 및 임상 연구의 동반 진단으로서 사용될 수 있다. 이 기법은 유전자-편집 요법의 안전성 및 효능에 귀중한 통찰력을 산출할 수 있고 궁극적으로 유전자-편집 요법의 설계에 더 나은 정보를 제공할 수 있다.
이 동일한 접근법은 전통적 AAV 유전자-요법 연구에서 AAV-통합 이벤트를 평가할 수 있다. AAV 유전자 요법으로부터 삽입적 돌연변이유발의 위험이 낮은 것으로 간주되고8, 42 이의 용도가 희귀 장애 및 치명적 질환을 치료하는데 정당한 반면, 이들 잠재적 위험은 그 분야가 덜 심각한 후천적 질환 치료하기로 진전함에 따라 더욱 적절할 수 있다.
하기 참고문헌의 목록은 실시예 3에서의 문헌에 상응한다.
실시예 4 - AAV.PCSK9 자가-불활성화 벡터
도 10a-10b는 표적 서열 또는 돌연변이체 표적 서열이 효소 코딩 서열에서 삽입되는 구현예를 도시한다. 도 10a는 10-아미노산 핵 국재화 신호 (NLS) 이어서 표적 서열 (아미노산 10-20로부터 발현된 단백질, 이어서 뉴클레아제의 활성 부문을 도시하는 아미노산 정렬이다. 제1 아미노산 서열 M2PCSK9는 이의 NLS가 있는 참조 메가뉴클레아제의 단편, 다른 작제물이 삽입할 장소를 언급하는 공간, 그리고 위치 18에서 시작하는 뉴클레아제의 서열을 보여준다. M2PCSK9[역위된 표적 #1]은 표적 서열이 NLS와 효소 사이 안티-센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9[표적 #1]은 표적 서열이 NLS와 효소 사이 센스 가닥에서 삽입하였던 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9 [표적 #2]는 상이한 표적 서열이 NLS와 효소 사이 센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. M2PCSK9 [역위된 표적 #2]는 (mut)표적 서열이 NLS와 효소 사이 안티-센스 가닥에서 삽입되는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. [표적]M2PCSK9는 22 bp 표적 서열이 NLS 뒤에 코딩 서열을 대체하여, 효소의 6개 아미노산의 치환을 초래하는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. [역위된표적]M2PCSK9는 22 bp 표적 서열이 반대편 가닥에서 NLS 뒤에 코딩 서열을 대체하여, 효소의 7개 아미노산의 대체를 초래하는 때 인코딩된 단백질을 보여준다. 도 10b는, 유비퀴틴-독립적 (AR-6)인 단일 단백질 분해 신호 (데그론)를 갖는 것인, PCSK9 메가뉴클레아제 융합 단백질, 그리고 2개 단백질 분해 신호, AR-6 및 PEST를 갖는 PCSK9 메가뉴클레아제 융합 단백질의 설계를 도시한다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌은, 이와 함께 제출된 서열 및 서열 목록의 텍스트가 참고로 편입되는 것처럼, 본원에 참고로 편입된다. 본 발명이 특정한 구현예를 참고하여 기재된 동안, 본 발명의 사상에서 이탈 없이 수정될 수 있음이 인지될 것이다. 상기 수정은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당하기 위한 것이다.
서열 목록 특성:
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ctctgcgaat gcatgtataa 480 tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta 540 aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct 600 tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagtggacct ctttgcccca ggggaaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 960 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 1020 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 1080 tttctctcca caggtgtcca gcggccgcca tggcaccgaa gaagaagcgc aaggtgcata 1140 tgaatacaaa atataataaa gagttcttac tctacttagc agggtttgta gacggtgacg 1200 gttccatctt tgccaggatc aagcctagtc aacgtagtaa gttcaagcac aagctgcatc 1260 tcgttttcgc tgtctatcag aagacacagc gccgttggtt cctcgacaag ctggtggacg 1320 agatcggtgt gggttacgtg ctggactctg gcagcgtctc cttttactcg ctgtccgaga 1380 tcaagccttt gcataatttt ttaacacaac tacaaccttt tctaaaacta aaacaaaaac 1440 aagcaaattt agttttaaaa attattgaac aacttccgtc agcaaaagaa tccccggaca 1500 aattcttaga agtttgtaca tgggtggatc aaattgcagc tctgaatgat tcgaagacgc 1560 gtaaaacaac ttctgaaacc gttcgtgctg tgctagacag tttaccagga tccgtgggag 1620 gtctatcgcc atctcaggca tccagcgccg catcctcggc ttcctcaagc ccgggttcag 1680 ggatctccga agcactcaga gctggagcag gttccggcac tggatacaac aaggaattcc 1740 tgctctacct ggcgggcttc gtcgacgggg acggctccat ctatgcccgt atcaagccgg 1800 ttcagcgggc taagttcaag cacgagctgg ttctcgggtt cgatgtcact cagaagacac 1860 agcgccgttg gttcctcgac aagctggtgg acgagatcgg tgtgggttac gtgtatgaca 1920 agggcagcgt ctccgcgtac cgtctgtccc agatcaagcc tctgcacaac ttcctgaccc 1980 agctccagcc cttcctgaag ctcaagcaga agcaggccaa cctcgtgctg aagatcatcg 2040 agcagctgcc ctccgccaag gaatccccgg acaagttcct ggaggtgtgc acctgggtgg 2100 accagatcgc cgctctgaac gactccaaga cccgcaagac cacttccgaa accgtccgcg 2160 ccgttctaga cagtctctcc gagaagaaga agtcgtcccc ctaaggatct gcctcgactg 2220 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2280 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2340 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2400 aagacaatag caggcatgct ggggactcga gttaagggcg aattcccgat aaggatcttc 2460 ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc 2520 ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga 2580 ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc 2640 ag 2642 <210> 12 <211> 2764 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TBG.Target.PI.PCS9 Nuclease-PEST <220> <221> misc_feature <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> misc_feature <222> (211)..(907) <223> promoter/enhancer <220> <221> misc_feature <222> (914)..(935) <223> target <220> <221> misc_feature <222> (961)..(1093) <223> intron <220> <221> misc_feature <222> (1109)..(2200) <223> M2PCSK9 CDS <220> <221> misc_feature <222> (2201)..(2332) <223> PEST <220> <221> misc_feature <222> (2333)..(2547) <223> bovine growth hormone (bGH) polyA <220> <221> misc_feature <222> (2597)..(2764) <223> ITR <400> 12 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc 240 caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca 300 caaacattcc agatccaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg 360 cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat 420 ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa 480 tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta 540 aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct 600 tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagtggacct ctttgcccca ggggaaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 960 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 1020 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 1080 tttctctcca caggtgtcca cggccgccat ggcaccgaag aagaagcgca aggtgcatat 1140 gaatacaaaa tataataaag agttcttact ctacttagca gggtttgtag acggtgacgg 1200 ttccatcttt gccaggatca agcctagtca acgtagtaag ttcaagcaca agctgcatct 1260 cgttttcgct gtctatcaga agacacagcg ccgttggttc ctcgacaagc tggtggacga 1320 gatcggtgtg ggttacgtgc tggactctgg cagcgtctcc ttttactcgc tgtccgagat 1380 caagcctttg cataattttt taacacaact acaacctttt ctaaaactaa aacaaaaaca 1440 agcaaattta gttttaaaaa ttattgaaca acttccgtca gcaaaagaat ccccggacaa 1500 attcttagaa gtttgtacat gggtggatca aattgcagct ctgaatgatt cgaagacgcg 1560 taaaacaact tctgaaaccg ttcgtgctgt gctagacagt ttaccaggat ccgtgggagg 1620 tctatcgcca tctcaggcat ccagcgccgc atcctcggct tcctcaagcc cgggttcagg 1680 gatctccgaa gcactcagag ctggagcagg ttccggcact ggatacaaca aggaattcct 1740 gctctacctg gcgggcttcg tcgacgggga cggctccatc tatgcccgta tcaagccggt 1800 tcagcgggct aagttcaagc acgagctggt tctcgggttc gatgtcactc agaagacaca 1860 gcgccgttgg ttcctcgaca agctggtgga cgagatcggt gtgggttacg tgtatgacaa 1920 gggcagcgtc tccgcgtacc gtctgtccca gatcaagcct ctgcacaact tcctgaccca 1980 gctccagccc ttcctgaagc tcaagcagaa gcaggccaac ctcgtgctga agatcatcga 2040 gcagctgccc tccgccaagg aatccccgga caagttcctg gaggtgtgca cctgggtgga 2100 ccagatcgcc gctctgaacg actccaagac ccgcaagacc acttccgaaa ccgtccgcgc 2160 cgttctagac agtctctccg agaagaagaa gtcgtccccc aagcttagcc atggcttccc 2220 gccggaggtg gaggagcagg atgatggcac gctgcccatg tcttgtgccc aggagagcgg 2280 gatggaccgt caccctgcag cctgtgcttc tgctaggatc aatgtgtagt aagcctcgac 2340 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 2400 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 2460 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 2520 ggaagacaat agcaggcatg ctggggactc gagttaaggg cgaattcccg ataaggatct 2580 tcctagagca tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 2640 ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 2700 gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 2760 gcag 2764 <210> 13 <211> 2792 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TBG.Target.PI.PCS9 Nuclease-PEST.Target.bGH <220> <221> repeat_region <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> promoter <222> (211)..(907) <223> TBG promoter <220> <221> enhancer <222> (211)..(310) <223> alpha/mic/bik enhancer <220> <221> enhancer <222> (317)..(416) <223> enhancer 2 <220> <221> misc_feature <222> (914)..(935) <223> Target sequence <220> <221> Intron <222> (961)..(1093) <220> <221> misc_feature <222> (1110)..(2201) <223> PCSK7-8L.197 coding 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cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagtggacct ctttgcccca ggggaaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 960 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 1020 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 1080 tttctctcca caggtgtcca gcggccgcca tggcaccgaa gaagaagcgc aaggtgcata 1140 tgaatacaaa atataataaa gagttcttac tctacttagc agggtttgta gacggtgacg 1200 gttccatctt tgccaggatc aagcctagtc aacgtagtaa gttcaagcac aagctgcatc 1260 tcgttttcgc tgtctatcag aagacacagc gccgttggtt cctcgacaag ctggtggacg 1320 agatcggtgt gggttacgtg ctggactctg gcagcgtctc cttttactcg ctgtccgaga 1380 tcaagccttt gcataatttt ttaacacaac tacaaccttt tctaaaacta aaacaaaaac 1440 aagcaaattt agttttaaaa attattgaac aacttccgtc agcaaaagaa tccccggaca 1500 aattcttaga agtttgtaca tgggtggatc aaattgcagc tctgaatgat tcgaagacgc 1560 gtaaaacaac ttctgaaacc gttcgtgctg tgctagacag tttaccagga tccgtgggag 1620 gtctatcgcc atctcaggca tccagcgccg catcctcggc ttcctcaagc ccgggttcag 1680 ggatctccga agcactcaga gctggagcag gttccggcac tggatacaac aaggaattcc 1740 tgctctacct ggcgggcttc gtcgacgggg acggctccat ctatgcccgt atcaagccgg 1800 ttcagcgggc taagttcaag cacgagctgg ttctcgggtt cgatgtcact cagaagacac 1860 agcgccgttg gttcctcgac aagctggtgg acgagatcgg tgtgggttac gtgtatgaca 1920 agggcagcgt ctccgcgtac cgtctgtccc agatcaagcc tctgcacaac ttcctgaccc 1980 agctccagcc cttcctgaag ctcaagcaga agcaggccaa cctcgtgctg aagatcatcg 2040 agcagctgcc ctccgccaag gaatccccgg acaagttcct ggaggtgtgc acctgggtgg 2100 accagatcgc cgctctgaac gactccaaga cccgcaagac cacttccgaa accgtccgcg 2160 ccgttctaga cagtctctcc gagaagaaga agtcgtcccc caagcttagc catggcttcc 2220 cgccggaggt ggaggagcag gatgatggca cgctgcccat gtcttgtgcc caggagagcg 2280 ggatggaccg tcaccctgca gcctgtgctt ctgctaggat caatgtgtag taatggacct 2340 ctttgcccca ggggagatct gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2400 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2460 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2520 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggactcga 2580 gttaagggcg aattcccgat aaggatcttc ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat 2640 ggcgggttaa tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 2700 cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc 2760 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc ag 2792 <210> 14 <211> 2765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TBG.MutTarget.PI.Nuclease-PEST.bGH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> misc_feature <222> (211)..(907) <223> Promoter/enhancer <220> <221> misc_feature <222> (914)..(935) <223> mutant target <220> <221> misc_feature <222> (961)..(1093) <223> intron <220> <221> misc_feature <222> (1110)..(2201) <223> M2PSCK9 CDS <220> <221> misc_feature <222> (2202)..(2333) <223> PEST CDS <220> <221> misc_feature <222> (2334)..(2548) <223> bGH Poly A <220> <221> misc_feature <222> (2598)..(2765) <223> ITR <400> 14 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc 240 caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca 300 caaacattcc agatccaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg 360 cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat 420 ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa 480 tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta 540 aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct 600 tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagttgccct ttttattccc agggaaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 960 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 1020 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 1080 tttctctcca caggtgtcca gcggccgcca tggcaccgaa gaagaagcgc aaggtgcata 1140 tgaatacaaa atataataaa gagttcttac tctacttagc agggtttgta gacggtgacg 1200 gttccatctt tgccaggatc aagcctagtc aacgtagtaa gttcaagcac aagctgcatc 1260 tcgttttcgc tgtctatcag aagacacagc gccgttggtt cctcgacaag ctggtggacg 1320 agatcggtgt gggttacgtg ctggactctg gcagcgtctc cttttactcg ctgtccgaga 1380 tcaagccttt gcataatttt ttaacacaac tacaaccttt tctaaaacta aaacaaaaac 1440 aagcaaattt agttttaaaa attattgaac aacttccgtc agcaaaagaa tccccggaca 1500 aattcttaga agtttgtaca tgggtggatc aaattgcagc tctgaatgat tcgaagacgc 1560 gtaaaacaac ttctgaaacc gttcgtgctg tgctagacag tttaccagga tccgtgggag 1620 gtctatcgcc atctcaggca tccagcgccg catcctcggc ttcctcaagc ccgggttcag 1680 ggatctccga agcactcaga gctggagcag gttccggcac tggatacaac aaggaattcc 1740 tgctctacct ggcgggcttc gtcgacgggg acggctccat ctatgcccgt atcaagccgg 1800 ttcagcgggc taagttcaag cacgagctgg ttctcgggtt cgatgtcact cagaagacac 1860 agcgccgttg gttcctcgac aagctggtgg acgagatcgg tgtgggttac gtgtatgaca 1920 agggcagcgt ctccgcgtac cgtctgtccc agatcaagcc tctgcacaac ttcctgaccc 1980 agctccagcc cttcctgaag ctcaagcaga agcaggccaa cctcgtgctg aagatcatcg 2040 agcagctgcc ctccgccaag gaatccccgg acaagttcct ggaggtgtgc acctgggtgg 2100 accagatcgc cgctctgaac gactccaaga cccgcaagac cacttccgaa accgtccgcg 2160 ccgttctaga cagtctctcc gagaagaaga agtcgtcccc caagcttagc catggcttcc 2220 cgccggaggt ggaggagcag gatgatggca cgctgcccat gtcttgtgcc caggagagcg 2280 ggatggaccg tcaccctgca gcctgtgctt ctgctaggat caatgtgtag taagcctcga 2340 ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 2400 tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 2460 tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 2520 gggaagacaa tagcaggcat gctggggact cgagttaagg gcgaattccc gataaggatc 2580 ttcctagagc atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa 2640 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg 2700 cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg 2760 cgcag 2765 <210> 15 <211> 2744 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> TBG.PI.PCSK9 Nuclease-PEST <220> <221> misc_feature <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> misc_feature <222> (211)..(907) <223> Promoter/enhancer <220> <221> misc_feature <222> (939)..(1071) <223> intron <220> <221> misc_feature <222> (1089)..(2180) <223> M2PCSK9 CDS <220> <221> misc_feature <222> (2181)..(2312) <223> PEST CDS <220> <221> misc_feature <222> (2313)..(2527) <223> bGH Poly A <220> <221> misc_feature <222> (2577)..(2744) <223> ITR <400> 15 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc 240 caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca 300 caaacattcc agatccaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg 360 cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat 420 ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa 480 tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta 540 aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct 600 tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagaagttgg tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcaag gttacaagac 960 aggtttaagg agaccaatag aaactgggct tgtcgagaca gagaagactc ttgcgtttct 1020 gataggcacc tattggtctt actgacatcc actttgcctt tctctccaca ggtgtccagg 1080 cggccgccat ggcaccgaag aagaagcgca aggtgcatat gaatacaaaa tataataaag 1140 agttcttact ctacttagca gggtttgtag acggtgacgg ttccatcttt gccaggatca 1200 agcctagtca acgtagtaag ttcaagcaca agctgcatct cgttttcgct gtctatcaga 1260 agacacagcg ccgttggttc ctcgacaagc tggtggacga gatcggtgtg ggttacgtgc 1320 tggactctgg cagcgtctcc ttttactcgc tgtccgagat caagcctttg cataattttt 1380 taacacaact acaacctttt ctaaaactaa aacaaaaaca agcaaattta gttttaaaaa 1440 ttattgaaca acttccgtca gcaaaagaat ccccggacaa attcttagaa gtttgtacat 1500 gggtggatca aattgcagct ctgaatgatt cgaagacgcg taaaacaact tctgaaaccg 1560 ttcgtgctgt gctagacagt ttaccaggat ccgtgggagg tctatcgcca tctcaggcat 1620 ccagcgccgc atcctcggct tcctcaagcc cgggttcagg gatctccgaa gcactcagag 1680 ctggagcagg ttccggcact ggatacaaca aggaattcct gctctacctg gcgggcttcg 1740 tcgacgggga cggctccatc tatgcccgta tcaagccggt tcagcgggct aagttcaagc 1800 acgagctggt tctcgggttc gatgtcactc agaagacaca gcgccgttgg ttcctcgaca 1860 agctggtgga cgagatcggt gtgggttacg tgtatgacaa gggcagcgtc tccgcgtacc 1920 gtctgtccca gatcaagcct ctgcacaact tcctgaccca gctccagccc ttcctgaagc 1980 tcaagcagaa gcaggccaac ctcgtgctga agatcatcga gcagctgccc tccgccaagg 2040 aatccccgga caagttcctg gaggtgtgca cctgggtgga ccagatcgcc gctctgaacg 2100 actccaagac ccgcaagacc acttccgaaa ccgtccgcgc cgttctagac agtctctccg 2160 agaagaagaa gtcgtccccc aagcttagcc atggcttccc gccggaggtg gaggagcagg 2220 atgatggcac gctgcccatg tcttgtgccc aggagagcgg gatggaccgt caccctgcag 2280 cctgtgcttc tgctaggatc aatgtgtagt aagcctcgac tgtgccttct agttgccagc 2340 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 2400 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 2460 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 2520 ctggggactc gagttaaggg cgaattcccg ataaggatct tcctagagca tggctacgta 2580 gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat ggagttggcc 2640 actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc 2700 ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcag 2744 <210> 16 <211> 2646 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Vector genome: TBG.MutTarget.PI.PCS9 Nuclease.bGH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(168) <223> ITR <220> <221> misc_feature <222> (211)..(907) <223> promoter/enhancer <220> <221> misc_feature <222> (914)..(935) <223> mutant target <220> <221> misc_feature <222> (961)..(1093) <223> intron <220> <221> misc_feature <222> (1110)..(2204) <223> M2PCSK9 CDS <220> <221> misc_feature <222> (2215)..(2429) <223> bGH Poly A <220> <221> misc_feature <222> (2479)..(2646) <223> ITR <400> 16 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180 aggaagatcg gaattcgccc ttaagctagc aggttaattt ttaaaaagca gtcaaaagtc 240 caagtggccc ttggcagcat ttactctctc tgtttgctct ggttaataat ctcaggagca 300 caaacattcc agatccaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg 360 cagcatttac tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat 420 ccggcgcgcc agggctggaa gctacctttg acatcatttc ctctgcgaat gcatgtataa 480 tttctacaga acctattaga aaggatcacc cagcctctgc ttttgtacaa ctttccctta 540 aaaaactgcc aattccactg ctgtttggcc caatagtgag aactttttcc tgctgcctct 600 tggtgctttt gcctatggcc cctattctgc ctgctgaaga cactcttgcc agcatggact 660 taaacccctc cagctctgac aatcctcttt ctcttttgtt ttacatgaag ggtctggcag 720 ccaaagcaat cactcaaagt tcaaacctta tcattttttg ctttgttcct cttggccttg 780 gttttgtaca tcagctttga aaataccatc ccagggttaa tgctggggtt aatttataac 840 taagagtgct ctagttttgc aatacaggac atgctataaa aatggaaaga tgttgctttc 900 tgagagactg cagttgccct ttttattccc agggaaagtt ggtcgtgagg cactgggcag 960 gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgaga 1020 cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 1080 tttctctcca caggtgtcca gcggccgcca tggcaccgaa gaagaagcgc aaggtgcata 1140 tgaatacaaa atataataaa gagttcttac tctacttagc agggtttgta gacggtgacg 1200 gttccatctt tgccaggatc aagcctagtc aacgtagtaa gttcaagcac aagctgcatc 1260 tcgttttcgc tgtctatcag aagacacagc gccgttggtt cctcgacaag ctggtggacg 1320 agatcggtgt gggttacgtg ctggactctg gcagcgtctc cttttactcg ctgtccgaga 1380 tcaagccttt gcataatttt ttaacacaac tacaaccttt tctaaaacta aaacaaaaac 1440 aagcaaattt agttttaaaa attattgaac aacttccgtc agcaaaagaa tccccggaca 1500 aattcttaga agtttgtaca tgggtggatc aaattgcagc tctgaatgat tcgaagacgc 1560 gtaaaacaac ttctgaaacc gttcgtgctg tgctagacag tttaccagga tccgtgggag 1620 gtctatcgcc atctcaggca tccagcgccg catcctcggc ttcctcaagc ccgggttcag 1680 ggatctccga agcactcaga gctggagcag gttccggcac tggatacaac aaggaattcc 1740 tgctctacct ggcgggcttc gtcgacgggg acggctccat ctatgcccgt atcaagccgg 1800 ttcagcgggc taagttcaag cacgagctgg ttctcgggtt cgatgtcact cagaagacac 1860 agcgccgttg gttcctcgac aagctggtgg acgagatcgg tgtgggttac gtgtatgaca 1920 agggcagcgt ctccgcgtac cgtctgtccc agatcaagcc tctgcacaac ttcctgaccc 1980 agctccagcc cttcctgaag ctcaagcaga agcaggccaa cctcgtgctg aagatcatcg 2040 agcagctgcc ctccgccaag gaatccccgg acaagttcct ggaggtgtgc acctgggtgg 2100 accagatcgc cgctctgaac gactccaaga cccgcaagac cacttccgaa accgtccgcg 2160 ccgttctaga cagtctctcc gagaagaaga agtcgtcccc ctaaggtacg atctgcctcg 2220 actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc 2280 ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt 2340 ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat 2400 tgggaagaca atagcaggca tgctggggac tcgagttaag ggcgaattcc cgataaggat 2460 cttcctagag catggctacg tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacaagga 2520 acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 2580 gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2640 gcgcag 2646 <210> 17 <211> 1224 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCSK9 Meganuclease - PEST fusion <220> <221> CDS <222> (1)..(1224) <400> 17 atg gca ccg aag aag aag cgc aag gtg cat atg aat aca aaa tat aat 48 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 aaa gag ttc tta ctc tac tta gca ggg ttt gta gac ggt gac ggt tcc 96 Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 atc ttt gcc agg atc aag cct agt caa cgt agt aag ttc aag cac aag 144 Ile Phe Ala Arg Ile Lys Pro Ser Gln Arg Ser Lys Phe Lys His Lys 35 40 45 ctg cat ctc gtt ttc gct gtc tat cag aag aca cag cgc cgt tgg ttc 192 Leu His Leu Val Phe Ala Val Tyr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe 50 55 60 ctc gac aag ctg gtg gac gag atc ggt gtg ggt tac gtg ctg gac tct 240 Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Tyr Val Leu Asp Ser 65 70 75 80 ggc agc gtc tcc ttt tac tcg ctg tcc gag atc aag cct ttg cat aat 288 Gly Ser Val Ser Phe Tyr Ser Leu Ser Glu Ile Lys Pro Leu His Asn 85 90 95 ttt tta aca caa cta caa cct ttt cta aaa cta aaa caa aaa caa gca 336 Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala 100 105 110 aat tta gtt tta aaa att att gaa caa ctt ccg tca gca aaa gaa tcc 384 Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser 115 120 125 ccg gac aaa ttc tta gaa gtt tgt aca tgg gtg gat caa att gca gct 432 Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala 130 135 140 ctg aat gat tcg aag acg cgt aaa aca act tct gaa acc gtt cgt gct 480 Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala 145 150 155 160 gtg cta gac agt tta cca gga tcc gtg gga ggt cta tcg cca tct cag 528 Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly Gly Leu Ser Pro Ser Gln 165 170 175 gca tcc agc gcc gca tcc tcg gct tcc tca agc ccg ggt tca ggg atc 576 Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ile 180 185 190 tcc gaa gca ctc aga gct gga gca ggt tcc ggc act gga tac aac aag 624 Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Lys 195 200 205 gaa ttc ctg ctc tac ctg gcg ggc ttc gtc gac ggg gac ggc tcc atc 672 Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile 210 215 220 tat gcc cgt atc aag ccg gtt cag cgg gct aag ttc aag cac gag ctg 720 Tyr Ala Arg Ile Lys Pro Val Gln Arg Ala Lys Phe Lys His Glu Leu 225 230 235 240 gtt ctc ggg ttc gat gtc act cag aag aca cag cgc cgt tgg ttc ctc 768 Val Leu Gly Phe Asp Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu 245 250 255 gac aag ctg gtg gac gag atc ggt gtg ggt tac gtg tat gac aag ggc 816 Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Tyr Val Tyr Asp Lys Gly 260 265 270 agc gtc tcc gcg tac cgt ctg tcc cag atc aag cct ctg cac aac ttc 864 Ser Val Ser Ala Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn Phe 275 280 285 ctg acc cag ctc cag ccc ttc ctg aag ctc aag cag aag cag gcc aac 912 Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn 290 295 300 ctc gtg ctg aag atc atc gag cag ctg ccc tcc gcc aag gaa tcc ccg 960 Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro 305 310 315 320 gac aag ttc ctg gag gtg tgc acc tgg gtg gac cag atc gcc gct ctg 1008 Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu 325 330 335 aac gac tcc aag acc cgc aag acc act tcc gaa acc gtc cgc gcc gtt 1056 Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val 340 345 350 cta gac agt ctc tcc gag aag aag aag tcg tcc ccc aag ctt agc cat 1104 Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro Lys Leu Ser His 355 360 365 ggc ttc ccg ccg gag gtg gag gag cag gat gat ggc acg ctg ccc atg 1152 Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met 370 375 380 tct tgt gcc cag gag agc ggg atg gac cgt cac cct gca gcc tgt gct 1200 Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala 385 390 395 400 tct gct agg atc aat gtg tag taa 1224 Ser Ala Arg Ile Asn Val 405 <210> 18 <211> 406 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val His Met Asn Thr Lys Tyr Asn 1 5 10 15 Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser 20 25 30 Ile Phe Ala Arg Ile Lys Pro Ser Gln Arg Ser Lys Phe Lys His Lys 35 40 45 Leu His Leu Val Phe Ala Val Tyr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe 50 55 60 Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Tyr Val Leu Asp Ser 65 70 75 80 Gly Ser Val Ser Phe Tyr Ser Leu Ser Glu Ile Lys Pro Leu His Asn 85 90 95 Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala 100 105 110 Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser 115 120 125 Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala 130 135 140 Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala 145 150 155 160 Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly Gly Leu Ser Pro Ser Gln 165 170 175 Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Pro Gly Ser Gly Ile 180 185 190 Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser Gly Thr Gly Tyr Asn Lys 195 200 205 Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile 210 215 220 Tyr Ala Arg Ile Lys Pro Val Gln Arg Ala Lys Phe Lys His Glu Leu 225 230 235 240 Val Leu Gly Phe Asp Val Thr Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu 245 250 255 Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Tyr Val Tyr Asp Lys Gly 260 265 270 Ser Val Ser Ala Tyr Arg Leu Ser Gln Ile Lys Pro Leu His Asn Phe 275 280 285 Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn 290 295 300 Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro 305 310 315 320 Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu 325 330 335 Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala Val 340 345 350 Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser Ser Pro Lys Leu Ser His 355 360 365 Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Asp Asp Gly Thr Leu Pro Met 370 375 380 Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala Cys Ala 385 390 395 400 Ser Ala Arg Ile Asn Val 405 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 tgctttgttc ctcttggcct tgg 23 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 tcctggcaaa gatggaaccg tc 22 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gactccaaga cccgcaagac cacttc 26 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ttattaggaa aggacagtgg gagtggcacc 30 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tgccacctac ctcctcacct ttc 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggctgttagc atcacggtgg 20 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 cctcagctcc cgaggtcatc acagttg 27 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tgacatcttt ggcagagaag tggatcagtc 30

Claims (31)

  1. (a) 뉴클레아제가 표적되는 서열을 갖는 숙주 세포에 전달 이후 상기 뉴클레아제의 발현을 지시하는 조절 서열에 작동가능하게 링크되는 뉴클레아제 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열;
    (b) 상기 뉴클레아제에 대한 상기 표적 서열 또는 이의 발현 이후 상기 뉴클레아제에 의해 인식되는 돌연변이된 표적 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레아제 조정 서열
    을 포함하는, 자가-조정 유전자 편집 뉴클레아제 발현 카세트.
  2. 제 1 항에 있어서, (a)의 상기 핵산 서열이 뉴클레아제-펩타이드 분해 신호가 융합 단백질로서 발현되도록 상기 뉴클레아제 코딩 서열과 프레임내에 있는 펩타이드 분해 신호에 대하여 코딩 서열을 추가로 포함하는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 돌연변이된 표적 서열을 포함하는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레아제 조정 서열이 상기 뉴클레아제 코딩 서열의 업스트림 정착되는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 조정 서열이 상기 뉴클레아제 코딩 서열의 다운스트림 정착되는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 조정 서열이 상기 뉴클레아제 코딩 서열 안에서 정착되는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 적어도 2개의 뉴클레아제 조정 서열을 포함하는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 적어도 2개의 상이한 뉴클레아제 조정 서열을 포함하는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 뉴클레아제 조정 서열이 상이한 돌연변이된 표적 서열을 갖는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 각 뉴클레아제 조정 서열이 독립적으로 10 내지 40개 뉴클레오타이드 길이인, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레아제가 메가뉴클레아제이고 각 뉴클레아제 조정 서열이 약 22개 뉴클레오타이드 길이인, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 분해 신호가 10개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 1개 초과의 단백질 분해 신호를 포함하는, 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트 그리고 1개 이상의 담체, 현탁화 제제, 및/또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 발현이 비-바이러스성 전달 시스템에 있는, 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 비-바이러스성 전달 시스템이 액체 나노입자인, 약학적 조성물.
  17. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 포함하는, 바이러스성 벡터.
  18. AAV 캡시드 그리고 상기 AAV 캡시드에서 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집에 유용한 재조합성 AAV로서, 상기 벡터 게놈이
    (a) 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트, 및
    (b) 상기 발현 카세트를 상기 캡시드에 패키징하는데 요구된 AAV 역위된 말단 반복부
    를 포함하는, 재조합성 AAV.
  19. 제 17 항에 따른 바이러스성 벡터 또는 제 18 항에 따른 재조합성 AAV 그리고 1개 이상의 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는, 조성물.
  20. 적어도 하나의 단백질 분해 서열에 융합된 메가뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열 및 숙주 세포에서 융합 단백질로서 상기 메가뉴클레아제 및 단백질 분해 신호의 발현을 지시하는 조절 서열을 포함하는, 자가-불활성화 메가뉴클레아제 발현 카세트.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질 분해 신호가 10개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, 자가-불활성화 메가뉴클레아제 발현 카세트.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질 분해 서열이 약 42개 아미노산 길이의 PEST 서열인, 자가-불활성화 메가뉴클레아제 발현 카세트.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트가 1개 초과의 단백질 분해 신호를 포함하는, 자가-불활성화 뉴클레아제 발현 카세트.
  24. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트 그리고 1개 이상의 담체, 현탁화 제제, 및/또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 발현이 비-바이러스성 전달 시스템에 있는, 약학적 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 비-바이러스성 전달 시스템이 액체 나노입자인, 약학적 조성물.
  27. 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트를 포함하는, 바이러스성 벡터.
  28. AAV 캡시드 그리고 상기 AAV 캡시드에서 패키징된 벡터 게놈을 포함하는 유전자 편집에 유용한 재조합성 AAV로서, 상기 벡터 게놈이
    (a) 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 발현 카세트, 및
    (b) 상기 발현 카세트를 상기 캡시드에 패키징하는데 요구된 AAV 역위된 말단 반복부
    를 포함하는, 재조합성 AAV.
  29. 제 26 항에 따른 바이러스성 벡터 또는 제 28 항에 따른 재조합성 AAV 그리고 1개 이상의 담체, 희석제, 및/또는 부형제를 포함하는, 조성물.
  30. 표적된 유전자의 편집 방법으로서, 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 자가-조정 뉴클레아제 발현 카세트, 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제 17 항에 따른 바이러스성 벡터, 또는 제 28 항에 따른 rAAV를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 표적된 유전자의 편집 방법으로서, 제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 뉴클레아제 발현 카세트, 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 제 27 항에 따른 바이러스성 벡터 또는 제 28 항에 따른 rAAV를 전달하는 단계를 포함하는, 방법.
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