CN114072497A

CN114072497A - 用于调控酶表达和使酶表达自失活的组合物以及用于调节酶的脱靶活性的方法

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Publication number: CN114072497A
Application number: CN202080045061.3A
Authority: CN
Inventors: J·M·威尔逊; C·布雷顿
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-04-15
Publication date: 2022-02-18
Also published as: JP2022529650A; KR20220009950A; EP3969577A4; EP3969577A1; WO2020214724A1; US20220298500A1

Abstract

本公开提供一种基因编辑核酸酶表达盒，其包括核酸序列，所述核酸序列包括可操作地连接到调控序列的核酸酶编码序列，所述调控序列在递送到具有所述核酸酶所靶向的序列的宿主细胞后引导所述核酸酶的表达，以及至少一个核酸酶调节序列，其选自所述核酸酶的靶序列或由所述核酸酶在其表达后识别的突变靶序列。提供一种载体，其包括所述基因编辑核酸酶表达盒。还提供含有所述载体的组合物和使用方法。

Description

用于调控酶表达和使酶表达自失活的组合物以及用于调节酶的脱靶活性的方法

背景技术

已描述使用工程化核酸酶来编辑功能失常的基因。也描述了AAV介导的此类核酸酶的递送。然而，虽然AAV介导的核酸酶的递送避免对重复再施用的需求，但所得核酸酶在载体转导后持续在靶组织中表达，这可能诱导免疫反应和细胞毒性。

此外，试管内和活体内研究都已显示，无论递送媒剂如何，核酸酶在基因组的其它区域中产生插入缺失(indel)(插入和缺失)，从而表明脱靶活性。

需要用于基因编辑的改进组合物和方法。

发明内容

提供一种酶的递送系统，其提供脱靶活性的降低，因此提高了所递送酶的安全性。所述系统尤其较适用于基因编辑疗法和/或由基因在细胞中持续存在的系统递送的酶，如AAV介导的递送。

一方面，提供一种自调节基因编辑核酸酶表达盒。表达盒包括(a)核酸序列，其包括可操作地连接到调控序列的核酸酶编码序列，所述调控序列在递送到具有核酸酶所靶向的序列的宿主细胞后引导核酸酶的表达；和(b)至少一个核酸酶调节序列，其选自核酸酶的靶序列或由核酸酶在其表达后识别的突变靶序列。任选地，编码序列编码融合蛋白，所述融合蛋白包括与核酸酶编码序列同框的至少一个肽降解信号。在某些实施例中，蛋白质降解信号的长度是10个氨基酸至50个氨基酸。在某些实施例中，蛋白质降解序列是长度为约42个氨基酸的PEST序列。在某些实施例中，表达盒包括超过一个蛋白质降解信号。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列，其可位于核酸酶编码序列的上游、下游或核酸酶编码序列内。在其中表达盒具有两个或更多个核酸酶调节序列的实施例中，其可独立地定位并且可以是相同或不同的序列。在某些实施例中，自调节核酸酶表达盒可具有超过一个蛋白质降解信号。

在某些实施例中，提供一种自失活大范围核酸酶表达盒，其包括核酸序列，所述核酸序列包括编码与至少一个蛋白质降解序列融合的大范围核酸酶的序列，以及调控序列，所述调控序列引导大范围核酸酶和蛋白质降解信号在宿主细胞中作为融合蛋白的表达。在某些实施例中，蛋白质降解信号的长度是10个氨基酸至50个氨基酸。在某些实施例中，蛋白质降解序列是长度为约42个氨基酸的PEST序列。在某些实施例中，表达盒包括超过一个蛋白质降解信号。

在某些实施例中，一种适用于基因编辑的重组AAV，其包括AAV衣壳和包装于AAV衣壳中的载体基因组，所述载体基因组包括如前述段落中所描述的表达盒和将表达盒包装到衣壳中所需的AAV反向末端重复(ITR)序列。

提供一种药物组合物，其包括如本文中所描述的表达盒，以及载剂、稀释剂和/或赋形剂中的一种或多种。在某些实施例中，表达盒在基于非载体的递送系统中，例如脂质纳米颗粒(LNP)。在某些实施例中，表达盒被工程化成非病毒载体(例如，质粒或其它基因元件)，所述重组载体与载剂、稀释剂和/或赋形剂掺合以形成药物组合物。在某些实施例中，表达盒被工程化成病毒载体，所述重组载体与载剂、稀释剂和/或赋形剂掺混以形成药物组合物。在某些实施例中，表达盒被工程化成载体基因组，且包装到AAV衣壳中以形成重组腺相关病毒(rAAV)，所述rAAV与载剂、稀释剂和/或赋形剂掺混以形成药物组合物。

在某些实施例中，如本文中所描述的核酸酶表达盒、非病毒载体(例如，DNA或RNA)或病毒载体(例如，rAAV或慢病毒)可施用用于患者中的基因编辑。在某些实施例中，所述方法适用于非胚胎基因编辑。在某些实施例中，患者是婴儿(例如，出生到约9个月)。在某些实施例中，患者比婴儿更大，例如12个月或更大。

在某些实施例中，如本文中所描述的药物组合物可施用用于患者中的基因编辑。在某些实施例中，所述方法适用于非胚胎基因编辑。在某些实施例中，患者是婴儿(例如，出生到约9个月)。在某些实施例中，患者比婴儿更大，例如12个月或更大。

根据本发明的以下详细描述，本发明的其它方面和优点将显而易见。

附图说明

图1是AAV“自杀(suicide)”载体的示意图。AAV载体通过插入大范围核酸酶(M2PCSK9)与靶序列(带*的黑条)、含有8个错配(带*mut的黑条)的突变靶序列和PEST序列(带线的黑条)的组合来构建。

图2A显示活体内实验的时间线。小鼠研究。将表达人类PCSK9(hPCSK9)的AAV静脉内(IV)注射于RAG KO小鼠中。两周后，将单次剂量的AAV自杀载体或相应的对照(AAV8.M2PCSK9)IV注射到经处理小鼠中。非人类灵长类动物研究。将AAV.突变靶标.M2PCSK9-PEST或AAV.M2PCSK9施用到恒河猕猴中。在处理后第18天或第128天收集肝脏活检。

图2B显示纯化的AAV载体中的靶区域中的插入缺失。

图3A(左侧)和图3B(右侧)显示hPCSK9基因和AAV自杀载体中的大范围核酸酶诱导的插入缺失。用所指示的AAV载体处理小鼠并在AAV9.hPCSK9施用后的所指示时间处安乐死。每个靶的插入缺失％显示为总读数的百分比。

图4A(左侧)和图4B(右侧)显示大范围核酸酶自杀系统的活体内脱靶活性。在AAV9.hPCSK9施用后4周和9周时获得的肝脏DNA样品中鉴定且定量宿主基因组中独特AAV整合位点的数量(左侧)。从所获得的列表中，选择九个最常见的脱靶位置，并且通过NGS来计算这些基因座中的插入缺失％并绘制为相对于仅大范围核酸酶对照(右侧)。

图5A至5I显示将AAV自杀载体施用于恒河猕猴时的结果。在载体施用后的不同时间处的血清样品中的PCSK9(图5A)和LDL蛋白质水平(图5B)。如通过Amplicon-Seq(图5C)或AMP-Seq法(图5D)所检测的PCSK9基因内的靶序列中的插入缺失％和在载体施用后第18天(d18)时的独特脱靶位点(图5E)的数量。在d18时NHP肝脏中的AAV基因组复本数量和大范围核酸酶mRNA水平(图5F)。使用对大范围核酸酶DNA/mRNA具有特异性的探针在d18时从肝脏活检获得的肝脏切片中进行的原位杂交(图5G)。PCSK9靶标区域中的编辑诱导如先前所观测到的PCSK9减少(《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》2018年9月；36(8):717-725)，这也引起在载体注射后的不同时间处的LDL水平降低(分别为图5H和图5I)。

图6是AAV.TTR“自杀”载体的示意图。AAV载体通过插入大范围核酸酶与靶序列、含有8个错配的突变靶序列和PEST序列的组合来构建。

图7A至7C提供整合到基因组DNA中的AAV ITR的序列分析。图7A是针对所有经AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9处理的肝脏样品(SRR6343442)的中靶AMP-Seq数据的元分析。我们的目标是鉴定载体ITR内的最频繁ITR整合起始位点。图7B显示AAV2 5'ITR(NC_001401.2)的二级结构。显示最频繁整合的起始位点位置。ITR-Seq引物GSP_ITR3.AAV2结合位点以红色突出显示。A-A'、B-B'和C-C'，回文臂；RBE，rep结合元件；TRS，末端解析位点。图7C是用于ITR整合位点的全基因组鉴定的ITR-Seq方案的示意图。

图8A至8C显示AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9在活体内的靶向和脱靶活性的分析。图8A是在载体施用之后17天和128天时收集的经AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9处理的肝脏样品的ITR-Seq鉴定的整合位点。图8B是ITR鉴定的ITR整合位点的功能注释，其显示外显子、内含子、基因间的转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TTS)内的位点数量。图8C显示在第17/18天时，根据匹配预期靶序列的核苷酸数量，用M1PCSK9或M2PCSK9(条形)或以计算方式生成的随机DNA序列(虚线)处理的2只动物的ITR整合位点分布，表示为所鉴定位点总数的百分比

图9A至9D显示GUIDE-Seq与ITR-Seq鉴定的脱靶的比较。在AAV施用后第17天时从AAV8-M1PCSK9以3×10¹³GC/kg(图9A)、以6×10¹²GC/kg(图9B)或从AAV8-M2PCSK9以6×10¹²GC/kg(图9C和图9D)的活体内ITR-Seq(左侧部分)和M1PCSK9或M2PCSK9的试管内GUIDE-Seq(右侧部分)获得的所鉴定靶位点的样品组交叉点。通过ITR-Seq而非GUIDE-Seq鉴定的脱靶(左侧部分)指示为通过活体内ITR-Seq鉴定的脱靶总数的百分比。通过ITR-Seq和GUIDE-Seq两者鉴定的脱靶显示为维恩图(Venn diagram)的白色部分。

图10A至10B显示其中将靶序列或突变靶序列插入酶编码序列中的实施例。图10A是氨基酸比对，显示10个氨基酸核定位信号(NLS)，随后是由靶序列表达的蛋白质(氨基酸10至20，随后是核酸酶的活性部分。第一氨基酸序列M2PCSK9显示具有其NLS的参考大范围核酸酶的片段、提到其它构建体将在何处具有插入的空间和在位置18处开始的核酸酶的序列。M2PCSK9[反向靶标#1]显示当靶序列插入NLS与酶之间的反义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[靶标#1]显示当靶序列插入NLS与酶之间的有义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[靶标#2]显示当不同靶序列插入NLS与酶之间的有义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[反向靶标#2]显示当(突变)靶序列插入NLS与酶之间的反义链上时编码的蛋白质。[靶标]M2PCSK9显示当22bp靶序列替换NLS之后的编码序列，从而使得酶的六个氨基酸被取代时编码的蛋白质。[反向靶标]M2PCSK9显示当22bp靶序列替换相反链上的NLS之后的编码序列，从而使得酶的七个氨基酸被替换时编码的蛋白质。图10B显示具有单一蛋白质降解信号(降解决定子(degron))(其为泛素非依赖性的(AR-6))的PCSK9大范围核酸酶融合蛋白以及具有两个蛋白质降解信号AR-6和PEST的PCSK9大范围核酸酶融合蛋白的设计。

具体实施方式

本文中所提供的组合物和方法被设计成最小化持续表达酶的脱靶活性(例如，在递送表达盒之后)和/或调节表达酶的活性。尤其需要将这些组合物和方法与可积聚在细胞中的非分泌酶和/或在分泌前以比所需水平更高的水平积聚的酶一起使用。本发明的组合物和方法较适用于与基因编辑酶，尤其大范围核酸酶一起使用。然而，其它应用将对本领域的技术人员显而易见。

如本文中所使用，合适的酶可选自大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样(TAL)效应核酸酶(TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/核酸内切酶(Cas9、Cpf1等)。合适的大范围核酸酶的实例例如描述于美国专利8,445,251；US 9,340,777；US 9,434,931；US 9,683,257和WO 2018/195449中。其它合适的酶包含可以核酸程序化方式结合RNA的核酸酶失活化脓链球菌(S.pyogenes)CRISPR/Cas9(Nelles等人,《用CRISPR/Cas9在活细胞中进行可程序化RNA追踪(Programmable RNA Tracking in LiveCells with CRISPR/Cas9)》,《细胞(Cell)》,165(2):P488-96(2016年4月))和碱基编辑器(base editor)(例如Levy等人,《经由腺相关病毒进行小鼠的大脑、肝脏、视网膜、心脏和骨骼肌的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑(Cytosine and adenine base editing of the brain,liver,retina,heart and skeletal muscle of mice via adeno-associatedviruses)》,《自然生物医学工程(Nature Biomedical Engineering)》,4,97-110(2020年1月))。在某些实施例中，核酸酶不是锌指核酸酶。在某些实施例中，核酸酶不是CRISPR相关核酸酶。在某些实施例中，核酸酶不是TALEN。

在某些实施例中，核酸酶是归巢核酸内切酶的LAGLIDADG(SEQ ID NO:1)家族的成员。在某些实施例中，核酸酶是识别并切割22个碱基对识别序列SEQ ID NO:2-CAAAACGTCGTGAGACAGTTTG的归巢核酸内切酶的I-CreI家族的成员。参见例如WO 2009/059195。描述用于合理设计单LAGLIDADG归巢核酸内切酶的方法，其能够全面地重新设计ICreI和其它归巢核酸内切酶以靶向广泛发散的DNA位点，包含哺乳动物、酵母、植物、细菌和病毒基因组中的位点(WO 2007/047859)。

适当地，本文中所描述的核酸酶的编码序列被工程化成表达盒，其进一步含有可操作地连接到调控元件的自失活组分、自调节组分或两者，所述调控元件引导酶或酶-蛋白质降解信号(降解决定子)在含有酶的靶位点的细胞中的表达。

自失活核酸酶融合蛋白

在一个实施例中，自失活核酸酶表达盒含有与蛋白质降解信号框内融合的核酸酶的编码序列，使得产生包括核酸酶和至少一个蛋白质降解信号的融合蛋白。在一个实施例中，自失活核酸酶表达盒含有与蛋白质降解信号框内融合的大范围核酸酶的编码序列，使得产生包括大范围核酸酶和至少一个蛋白质降解信号的融合蛋白。为方便起见，带连字符的短语术语“酶-蛋白质降解信号”用于指此类融合蛋白。这并不意图将融合蛋白限于位于羧基末端处的蛋白质降解信号，或限于存在于融合蛋白中的仅一个此类蛋白质降解信号。类似地，将理解，特定类型的酶指定可在上述短语中指定，例如“核酸酶”、“大范围核酸酶”、“核酸内切酶”等，并且在蛋白质降解信号的位置和数量方面经受相同的解释而不受限制，除非另外指定。

如本文中所描述，蛋白质降解信号是介导酶降解的蛋白质的一部分，其也可被称为降解决定子。不希望受理论所束缚，据信当其天然底物(靶序列)的存在由融合蛋白的酶促活性降低时，含有酶(例如，核酸酶)和至少一个蛋白质降解信号的融合蛋白通过促进从细胞中移除酶而在不损害中靶效力的情况下降低脱靶活性。蛋白质降解信号缩短了蛋白质的半衰期且因此也降低了所积聚蛋白质的水平。据信这种蛋白质水平降低有助于降低核酸酶脱靶活性。肽降解信号独立于靶序列中的酶(例如，核酸酶)的活性起作用。

合适的蛋白质降解信号可包含例如PEST信号、破坏盒(destruction box)或另一种不稳定肽。

“PEST”序列是富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)的肽序列。已显示这个序列缩短了蛋白质的胞内半衰期，即充当蛋白质降解信号。本文中所提供的实例利用具有42个氨基酸的PEST序列(SEQ ID NO:4KLSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV；编码序列SEQ ID NO:3)。然而，在某些实施例中，可选择含有这个序列的较长氨基酸序列或这个序列的较短氨基酸片段片段，例如序列可在氨基末端和/或羧基末端处截短，长度为约10、15、20、25、30、35、40或41个氨基酸。

在某些实施例中，可选择另一个蛋白质降解信号序列。此类蛋白质降解信号序列的长度可以是约10个氨基酸至约50个氨基酸，或其间的值。

在某些实施例中，可选择鸟氨酸脱羧酶(ODC)降解决定子作为合适的蛋白质降解信号序列的来源。[J Erales和P.Coffino,《生物化学与生物物理学学报(Biochimca etBiophsyica Acta)》,1843(2014)216-221。在另一实施例中，可选择泛素降解决定子作为蛋白质降解信号[KT Fortmann等人,《分子生物学杂志(J Mol Biol.)》2015年8月28日；427(17):2748-2756]。可选择又其它降解决定子。

可在核酸酶编码序列的氨基(N-)末端处进行工程化蛋白质降解信号。任选地，可存在多个蛋白质降解信号。在两个或更多个蛋白质降解信号存在的情况下，其可相同或不同。此外，在提供含有两个或更多个蛋白质降解信号的融合蛋白的情况下，信号中的一个或多个可位于N末端处，信号中的一个或多个可位于羧基末端处，或其组合(例如，一个信号可位于N末端处且一个可位于单一融合蛋白的羧基末端处；一个信号可位于N末端处且两个信号可位于单一融合蛋白的羧基末端处，两个蛋白质降解信号可位于N末端处且一个信号可位于单一融合蛋白的羧基末端处等)。

本文中的实例说明在载体基因组中含有PEST序列的AAV载体的用途。在某些实施例中，载体基因组可包装到不同载体(例如，重组博卡病毒(bocavirus))中。在某些实施例中，表达盒可包装到不同病毒载体中、包装到非病毒载体中和/或包装到不同递送系统中。

如本文中所使用，“表达盒”是指包括编码序列、启动子且可包含其的其它调控序列的核酸分子，所述盒可被工程化成基因元件和/或包装到病毒载体(例如，病毒颗粒)的衣壳中。通常，用于产生病毒载体的此表达盒含有本文中所描述的侧接病毒基因组的包装信号的序列和其它表达控制序列，如本文中所描述的那些表达控制序列。

表达盒通常含有启动子序列作为表达控制序列或调控序列的部分。在一个实施例中，可选择组织特异性启动子。例如，如果需要肝脏特异性启动子，那么肝脏特异性启动子可选自甲状腺素结合球蛋白(TBG)，或其它肝脏特定性启动子[参见例如，肝脏特异性基因启动子数据库(The Liver Specific Gene Promoter Database),冷泉港(Cold SpringHarbor),rulai.schl.edu/LSPD]，如例如α1抗胰蛋白酶(A1AT)；人类白蛋白(Miyatake等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,71:5124 32(1997),humAlb)；B型肝炎病毒核心启动子(Sandig等人,《基因疗法(Gene Ther.)》,3:1002 9(1996))；TTR最小增强子/启动子；α-抗胰蛋白酶启动子；T7启动子；和LSP(845nt)25(需要无内含子的scAAV)。可在本文中所描述的载体中使用其它启动子，如病毒启动子、组成型启动子、调控型启动子[参见例如WO2011/126808和WO 2013/049493]或对生理信号起反应的启动子。在一些实施例中，启动子或启动子/增强子是SEQ ID NO:11-16中的任一个中所示的启动子或启动子/增强子。

除启动子以外，表达盒和/或载体还可含有其它适当的“调控元件”或“调控序列”，其包括但不限于增强子；转录因子；转录终止子；高效RNA处理信号，如剪接和聚腺苷酸化信号(polyA)；稳定胞质mRNA的序列，例如土拔鼠肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus；WHP)转录后调控元件(WPRE)；增强翻译效率的序列(即，克扎克共有序列(Kozak consensussequence))；增强蛋白质稳定性的序列；和在需要时，增强所编码产物的分泌的序列。合适的polyA序列的实例包含例如SV40、牛生长激素(bGH)和TK polyA。合适的增强子的实例包含例如α胎蛋白增强子、TTR最小启动子/增强子、LSP(TH结合球蛋白启动子/α1-微球蛋白/比库蛋白(bikunin)增强子)以及其它增强子。在一个实施例中，内含子是SEQ ID NO:11-16中的任一个中所示的内含子。在一个实施例中，polyA是SEQ ID NO:11-16中的任一个中所示的polyA。

这些控制序列或调控序列可操作地连接到蛋白质和肽编码序列。

自调节核酸酶表达盒

在某些实施例中，提供一种自调节基因编辑核酸酶表达盒，其含有可操作地连接到调控序列的核酸酶编码序列，所述调控序列在递送到具有核酸酶所靶向的序列的宿主细胞后引导核酸酶表达；和至少一个核酸酶调节序列，其选自核酸酶的靶序列或由核酸酶在其表达后识别的突变靶序列。任选地，在这些实施例中，核酸酶可呈融合蛋白的形式，所述融合蛋白具有如通过引用并入的前述章节中所描述的蛋白质降解信号。

术语“识别序列”或“识别位点”是指通过核酸内切酶结合和裂解的核酸序列(例如，DNA，包含例如cDNA)。对于某些大范围核酸酶，识别序列的长度是22个碱基对，并且包括通过四个碱基对隔开的一对反向的9个碱基对“半位点(half site)”。在单链大范围核酸酶的情况下，蛋白质的N末端结构域接触第一半位点，且蛋白质的C末端结构域接触第二半位点。然而，其它核酸酶和大范围核酸酶可具有如本文中所描述的较短或较长识别位点(例如，约10个碱基对至约40个碱基对)。

如本文中所使用，术语“靶位点”或“靶序列”是指包括核酸酶的识别序列的细胞的DNA的区域。在某些实施例中，靶位点或靶序列在细胞的染色体DNA中。

在某些实施例中，核酸酶调节序列具有在细胞中的识别位点的全长内与细胞中的核酸酶识别位点的序列相同(100％相同)的序列。在某些实施例中，核酸酶调节序列与靶序列100％相同，但在长度方面短最多5％至10％(例如，对于22bp识别位点，长度为约18至20bp)。

在某些实施例中，核酸酶调节序列具有与细胞中的识别位点相比具有突变序列的序列。此类序列被设计成在一个或多个碱基对中具有错配。

在下述实例中，所说明的大范围核酸酶识别22bp序列，且因此，在这些表达盒中选择的每个酶调节序列是22bp。这些22bp序列的突变靶序列含有最多35％至37％错配，即与靶序列不同的8bp。然而，其它变化将对本领域的技术人员显而易见。

可选择更少或更高百分比的错配。在某些实施例中，仅存在1个错配。在其它实施例中，存在2至12个错配。在某些实施例中，错配是非连续的。在某些实施例中，错配中的两个或三个可以是连续的核苷酸。任选地，单一错配与连续错配(例如，2个或3个)的组合可通过单一突变靶标中的未突变序列隔开。在某些实施例中，其它对错配敏感的核酸酶可识别较短或较长序列，例如长度为约12个碱基对至40个碱基对。突变靶序列可能与靶细胞中的酶的预期靶序列具有0.5％至45％错配(即发散的核苷酸序列)。在某些实施例中，突变靶序列例如通过以下工程化：使用脱靶预测/鉴定方法(如GUIDE-Seq或ITR-Seq)，且根据其等级(这些序列中的插入缺失％，或GUIDE-Seq读数、ITR-Seq读数的数量)，选择可以不同水平起作用或甚至比预期靶序列更好的那些突变靶序列。

在某些实施例中，例如突变靶序列或靶序列的酶调节序列可位于引导酶的表达的启动子序列的下游。

在某些实施例中，例如突变靶序列或靶序列的酶调节序列可位于酶编码序列的下游。

在某些实施例中，例如突变靶序列或靶序列的酶调节序列可位于核酸酶编码序列内。

在某些实施例中，核酸酶表达盒(或含有其的载体基因组)具有可彼此相同或不同的多个酶调节序列。酶调节序列可串联定位，或可通过以下中的一个或多个彼此隔开：非编码间隔子、内含子之间或另一调控元件或酶编码序列。例如，至少第一酶调节序列可位于酶编码序列的上游且第二酶调节序列可位于酶编码序列的下游(例如，在polyA之前)。在存在多个不同的酶调节序列的情况下，至少一个酶调节序列是突变靶序列。在此类实施例中，两个或更多个不同突变靶序列可在核酸酶表达盒中工程化。在某些实施例中，酶调节序列位于核酸酶编码序列内(例如，在其5'或3'末端处)。在一个实施例中，靶序列是SEQ ID NO:5-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA。在一个实施例中，突变靶序列是SEQ ID NO:6-TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括PCSK9大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列的融合蛋白。在某些实施例中，大范围核酸酶可选自WO2018/195449A1中所描述的那些大范围核酸酶。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括TTR大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列的融合蛋白。在某些实施例中，TTR-靶标是SEQ ID NO:7:GCTGGACTGGTATTTGTGTCTG。在某些实施例中，TTR-突变靶标具有序列SEQ ID NO:8:TCGGGACTTTTGTTTGCCTCTT。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括HOA大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列的融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括BCKDC大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列的融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括APOC3大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列的融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码PCSK9大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种核酸分子，其编码包括TTR大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列的融合蛋白。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

任选地，表达盒可包含非翻译区中的miRNA靶序列。miRNA靶序列被设计成由存在于不需要转基因表达和/或需要降低转基因表达水平的细胞中的miRNA特异性识别。在某些实施例中，表达盒包含特异性降低核酸酶在背根神经节中的表达的miRNA靶序列。在某些实施例中，miRNA靶序列位于3'UTR、5'UTR中和/或3'UTR和5'UTR两者中，在一些实施例中，miRNA靶序列可操作地连接到表达盒中的调控序列。在某些实施例中，表达盒包括drg特异性miRNA靶序列的至少两个串联重复序列，其中至少两个串联重复序列包括可相同或不同的至少一个第一miRNA靶序列和至少一个第二miRNA靶序列。在某些实施例中，串联miRNA靶序列是连续的，或通过具有1至10个核酸的间隔子隔开，其中所述间隔子不是miRNA靶序列。对miRNA DRG特异性序列的论述提供于2019年12月20日提交的名称为“用于转基因表达的DRG特异性降低的组合物(Compositions for DRG-Specific Reduction of TransgeneExpression)”的国际专利申请第PCT/US19/67872号中，所述文献特别地通过引用并入本文中。

病毒和非病毒载体

含有核酸酶编码序列和至少一个蛋白质降解信号和/或至少一个靶或突变靶位点的本文中所描述的表达盒可被工程化成用于递送到靶细胞的任何合适的基因元件。

如本文中所使用的“载体”是包括核酸序列的生物或化学部分，所述核酸序列可引入适当宿主细胞中以用于复制或表达所述核酸序列。共同载体包含非病毒载体和病毒载体。如本文中所使用，非病毒系统可选自纳米颗粒、电穿孔系统和新颖生物材料、裸DNA、噬菌体、转座子、质粒、粘粒(Phillip McClean,www.ndsu.edu/pubweb/～mcclean/-plsc731/cloning/cloning4.htm)和人工染色体(Gong,Shiaoching等人“基于细菌性人工染色体的中枢神经系统的基因表达图谱(A gene expression atlas of the central nervoussystem based on bacterial artificial chromosomes)”.《自然(Nature)》425.6961(2003):917-925)。

“质粒”或“质粒载体”在本文中一般通过在载体名称之前和/或之后的小写p来指定。质粒、其它克隆和表达载体、其特性以及可根据本发明使用的构建/其操纵方法对本领域的技术人员显而易见。在一个实施例中，如本文中所描述的核酸序列或如本文中所描述的表达盒被工程化成适用于产生病毒载体和/或递送到宿主细胞的合适基因元件(载体)，例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、游离基因体(episome)等，所述基因元件转移其上所携载的核酸酶序列。所选载体可通过任何合适的方法来递送，包含转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法对核酸操纵技术人员来说是已知的且包含基因工程、重组工程以及合成技术。参见例如Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),纽约冷泉港(Cold Spring Harbor,NY)。

在某些实施例中，表达盒位于用于包装到病毒衣壳中的载体基因组中。例如，对于AAV载体基因组，表达盒的组分通过AAV反向末端重复序列侧接在5'最末端和3'最末端处。例如，5'AAV ITR、表达盒、3'AAV ITR。在其它实施例中，可选择自互补AAV。在其它实施例中，可使用反转录病毒系统、慢病毒载体系统或腺病毒系统。在一个实施例中，载体基因组是SEQ ID NO:11-16中的任一个中所示的载体基因组。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括PCSK9大范围核酸酶和PEST序列。在某些实施例中，大范围核酸酶可选自WO 2018/195449A1中所描述的那些大范围核酸酶。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括TTR大范围核酸酶和PEST序列。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括HOA1-2或HOA3-4大范围核酸酶和PEST序列。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括BCKDC大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括APOC3大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST)序列。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括提供一种核酸分子，所述核酸分子编码PCSK9大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括TTR大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括HOA1-2或HOA3-4大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括APOC3大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

在一个实施例中，提供一种病毒或非病毒载体，其包括编码融合蛋白的核酸分子，所述融合蛋白包括BCKDC大范围核酸酶和至少一个靶序列或突变靶序列。在某些实施例中，大范围核酸酶表达为大范围核酸酶-PEST融合蛋白。

可选择任何合适的非病毒载体(例如，质粒或其它基因元件)或病毒载体。病毒载体可以是重组博卡病毒、重组慢病毒、重组腺病毒或重组腺相关病毒。

AAV载体

在某些实施例中，提供一种重组AAV。“重组AAV”或“rAAV”是含有两个元件的DNA酶抗性病毒颗粒、所述两个元件即AAV衣壳和至少含有包装在AAV衣壳内的非AAV编码序列的载体基因组。除非另外指定，否则此术语可以与短语“rAAV载体”互换使用。rAAV是“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”，因为其缺少任何功能性AAV rep基因或功能性AAV cap基因且不能产生子代。在某些实施例中，仅AAV序列是AAV反向末端重复序列(ITR)，通常位于载体基因组的5'和3'最末端处，以便允许位于ITR之间的基因和调控序列包装在AAV衣壳内。

AAV衣壳的来源可以是几十种天然存在且可获得的腺相关病毒中的任一种中的一种以及工程化的AAV。腺相关病毒(AAV)病毒载体是具有AAV蛋白质衣壳的AAV DNA酶抗性颗粒，所述AAV蛋白质衣壳中包装有用于递送到靶细胞的核酸序列。AAV衣壳由60个衣壳(cap)蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成，取决于所选AAV，所述衣壳蛋白亚基以大约1:1:10到1:1:20的比率以二十面体对称排列。可选择各种AAV作为如上文所鉴定的AAV病毒载体的衣壳的来源。参见例如美国公开专利申请第2007-0036760-A1号；美国公开专利申请第2009-0197338-A1号；EP 1310571。还参见WO 2003/042397(AAV7和其它猿猴AAV)、美国专利7790449和美国专利7282199(AAV8)、WO 2005/033321和US 7,906,111(AAV9)和WO 2006/110689、WO 2003/042397(rh.10)以及WO 2018/160582(AAVhu68)。这些文档还描述了可以选择用于产生AAV的其它AAV，且通过引用并入。除非另外指定，否则本文中所描述的AAV衣壳、ITR和其它所选AAV组分可容易地选自任何AAV，包含但不限于通常鉴定为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV8bp、AAV7M8、AAVAnc80、AAVrh10和AAVPHP.B以及已知或所提及的AAV中的任一种的变体或尚未发现的AAV或其变体或混合物。参见例如WO2005/033321，其通过引用并入本文。在一个实施例中，AAV衣壳是AAV1衣壳或其变体、AAV8衣壳或其变体、AAV9衣壳或其变体、AAVrh.10衣壳或其变体、AAVrh64R1衣壳或其变体、AAVhu.37衣壳或其变体或AAV3B或其变体。还参见各自名称为“新颖腺相关病毒(AAV)载体、具有减少的衣壳脱酰胺的AAV载体和其用途(NOVEL ADENO-ASSOCIATED VIRUS(AAV)VECTORS,AAV VECTORS HAVING REDUCED CAPSID DEAMIDATION AND USES THEREFOR)”且在2019年2月27日提交的PCT/US19/19804和PCT/US19/19861，所述文献通过引用整体并入本文中。

如本文中所使用，“载体基因组”是指包装在形成病毒颗粒的rAAV衣壳内部的核酸序列。此核酸序列含有AAV反向末端重复序列(ITR)。在本文中的实例中，载体基因组从5'到3'至少含有AAV 5'ITR、编码序列和AAV 3'ITR。可选择来自AAV2、与衣壳不同的源AAV或全长ITR以外的ITR。在某些实施例中，ITR来自与在产生或反补AAV期间提供rep功能的AAV相同的AAV来源。此外，可使用其它ITR。此外，载体基因组含有引导基因产物的表达的调控序列。在本文中更详细地论述载体基因组的合适组分。

供产生AAV病毒载体(例如，重组(r)AAV)之用，表达盒可以携载于递送到包装宿主细胞的任何合适的载体(例如，质粒)上。适用于本发明中的质粒可被工程化，使得其适合于在试管内在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及其它细胞中进行复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可易于由本领域的技术人员设计。

用于产生和分离适合用作载体的AAV的方法在本领域中是已知的。一般参见例如Grieger&Samulski,2005,“作为基因疗法载体的腺相关病毒：载体研发、产生及临床应用(Adeno-associated virus as a gene therapy vector:Vector development,production and clinical applications)”,《生物化学工程/生物技术进展(Adv.Biochem.Engin/Biotechnol)》,99:119-145；Buning等人,2008,“腺相关病毒载体技术的最新进展(Recent developments in adeno-associated virus vectortechnology)”,《基因医学杂志(J.Gene Med)》10:717-733；和下文引用的参考文献，所述参考文献中的每一个通过引用整体并入本文中。为了将转基因包装到病毒粒子中，ITR是在与含有表达盒的核酸分子相同的构建体中需要的呈顺式的唯一AAV组分。cap和rep基因可以反式供应。

术语“AAV中间体”或“AAV载体中间体”是指缺少包装于其中的所需基因组序列的组装的rAAV衣壳。其也可称为“空”衣壳。此衣壳可不含有表达盒的可检测基因组序列，或仅含有不足以实现基因产物的表达的部分包装的基因组序列。这些空衣壳是非功能性的，以将所关注基因转移到宿主细胞。

可使用已知的技术来产生本文中所描述的重组腺相关病毒(AAV)。参见例如WO2003/042397；WO 2005/033321、WO 2006/110689；US 7588772 B2。此方法涉及培养含有编码AAV衣壳蛋白的核酸序列的宿主细胞；功能性rep基因；至少由AAV反向末端重复序列(ITR)和转基因构成的表达盒；以及准许将表达盒包装到AAV衣壳蛋白中的足够的辅助功能。已描述了产生衣壳的方法、其编码序列和用于产生rAAV病毒载体的方法。参见例如Gao等人,《美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》100(10),6081-6086(2003)和US2013/0045186A1。

在一个实施例中，提供一种适用于产生重组AAV的生产细胞培养物。此细胞培养物含有在宿主细胞中表达AAV衣壳蛋白的核酸；适合于包装到AAV衣壳中的核酸分子，例如含有AAV ITR和编码基因产物的非AAV核酸序列的载体基因组，所述基因产物可操作地连接到引导产物在宿主细胞中的表达的序列；以及准许将核酸分子包装到重组AAV衣壳中的足够的AAV rep功能和腺病毒辅助功能。在一个实施例中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，人类胚肾293细胞以及其它细胞)或昆虫细胞(例如，杆状病毒)构成。

任选地，rep功能由除提供衣壳的AAV以外的AAV提供。例如，rep可以是但不限于AAV1 rep蛋白、AAV2 rep蛋白、AAV3 rep蛋白、AAV4 rep蛋白、AAV5 rep蛋白、AAV6 rep蛋白、AAV7 rep蛋白、AAV8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78和rep40/52；或其片段；或另一来源。任选地，rep和cap序列在细胞培养物中的同一基因元件上。rep序列与cap基因之间可以存在间隔子。这些AAV或突变AAV衣壳序列中的任一种都可以处于引导其在宿主细胞中的表达的外源性调控控制序列的控制下。

在一个实施例中，在合适的细胞培养物(例如，HEK 293)细胞中制造细胞。用于制造本文中所描述的基因疗法载体的方法包含本领域中所熟知的方法，如用于基因疗法载体生产的质粒DNA的产生、载体的产生以及载体的纯化。在一些实施例中，基因疗法载体是AAV载体，且所产生的质粒是编码AAV基因组和所关注基因的AAV顺式质粒、含有AAV rep和cap基因的AAV反式质粒以及腺病毒辅助质粒。载体产生过程可包含例如以下方法步骤：细胞培养的开始、细胞传代、细胞接种、用质粒DNA转染细胞、将转染后培养基更换成无血清培养基以及采集含载体的细胞和培养基。所采集的含载体细胞和培养基在本文中称为粗细胞采集物。在又另一系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染而将基因疗法载体引入昆虫细胞中。对于这些生产系统的综述，一般参见例如Zhang等人,2009,“用于大规模重组腺相关病毒生产的腺病毒-腺相关病毒杂合体(Adenovirus-adeno-associated virus hybrid forlarge-scale recombinant adeno-associated virus production)”,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》20:922-929，所述文献中的每一个的内容通过引用整体并入本文中。制备和使用这些和其它AAV生产系统的方法也描述于以下美国专利中，所述美国专利中的每一个的内容通过引用整体并入本文中：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。

其后，粗细胞采集物可以是本主题的方法步骤，如浓缩载体采集物、透滤载体采集物、微流化载体采集物、核酸酶消化载体采集物、过滤微流化的中间体、通过色谱粗纯化、通过超速离心粗纯化、通过切向流过滤进行缓冲液交换和/或调配和过滤以制备大量载体。

在高盐浓度下进行两步亲和色谱纯化，随后使用阴离子交换树脂色谱来纯化载体药物产物且移除空衣壳。这些方法更详细地描述于2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US2016/065970号和其优先权文档、2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,071号以及2015年12月11日提交且名称为“AAV9的可分级纯化方法(Scalable PurificationMethod for AAV9)”的第62/226,357号中，所述申请通过引用并入本文中。对于AAV8的纯化方法，参见2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US2016/065976号和其优先权文档、2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,098号以及2015年12月11日提交的第62/266,341号，且对于rh10的纯化方法，参见2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US16/66013号和其优先权文档、2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,055号以及也在2015年12月11日提交的名称为“AAVrh10的可分级纯化方法(Scalable PurificationMethod for AAVrh10)”的第62/266,347号，且对于AAV1的纯化方法，参见2016年12月9日提交的国际专利申请第PCT/US2016/065974号和其优先权文档、2016年4月13日提交的美国专利申请第62/322,083号以及2015年12月11日提交的名称为“AAV1的可分级纯化方法(Scalable Purification Method for AAV1)”的第62/26,351号，所述申请全部通过引用并入本文中。

为了计算空颗粒和全颗粒含量，针对加载的GC颗粒绘制所选样品(例如，在本文中的实例中，经碘克沙醇(iodixanol)梯度纯化的制剂，其中GC#＝颗粒#)的VP3带体积。所得线性等式(y＝mx+c)用于计算测试品峰的带体积中的颗粒数量。随后将加载的每20μL的颗粒数量(pt)乘以50以得到颗粒(pt)/mL。将Pt/mL除以GC/mL得到颗粒与基因组复本的比率(pt/GC)。Pt/mL-GC/mL得到空pt/mL。空pt/mL除以pt/mL且×100得到空颗粒的百分比。

一般来说，用于测定具有包装基因组的空衣壳和AAV载体颗粒的方法在本领域中已知。参见例如Grimm等人,《基因疗法》(1999)6:1322-1330；Sommer等人,《分子疗法(Molec.Ther.)》(2003)7:122-128。为了测试变性衣壳，所述方法包含使处理的AAV原液经受SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如在缓冲液中含有3％至8％Tris-乙酸盐的梯度凝胶)，随后运行凝胶直到分离出样品材料，且将凝胶印迹到尼龙或硝化纤维素膜(优选地，尼龙)上。随后，将抗AAV衣壳抗体用作与变性衣壳蛋白结合的初级抗体，优选地是抗AAV衣壳单克隆抗体，最优选地是B1抗AAV-2单克隆抗体(Wobus等人,《病毒学杂志》(2000)74:9281-9293)。随后使用次级抗体，所述次级抗体与初级抗体结合且含有用于检测与初级抗体的结合的构件，更优选地是含有与其共价结合的检测分子的抗IgG抗体，最优选地是与辣根过氧化酶共价连接的绵羊抗小鼠IgG抗体。一种用于检测结合的方法用于半定量地确定初级抗体与次级抗体之间的结合，优选地是能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选地是化学发光检测试剂盒。举例而言，对于SDS-PAGE，可获取来自柱级分的样品，且在含有还原剂(例如，DTT)的SDS-PAGE加载缓冲液中加热，且在预制梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如，Novex)上解析衣壳蛋白。可根据制造商的说明书使用SilverXpress(加利福尼亚州英杰公司(Invitrogen,CA))或其它合适的染色方法(即，SYPRO红宝石色或考马斯染色)进行银染色。在一个实施例中，可通过定量实时PCR(Q-PCR)测量柱级分中AAV载体基因组(vg)的浓度。将样品稀释且用DNA酶I(或另一合适的核酸酶)消化以移除外源性DNA。在核酸酶失活后，使用引物和对引物之间的DNA序列具有特异性的TaqMan^TM荧光探针进一步稀释且扩增样品。在Applied Biosystems Prism7700序列检测系统上测量每种样品达到限定荧光水平所需的循环数量(阈值循环，Ct)。含有与AAV载体中所含有的序列相同的序列的质粒DNA用于在Q-PCR反应中生成标准曲线。从样品获得的循环阈值(Ct)值用于通过将其归一化为针对质粒标准曲线的Ct值来确定载体基因组效价。也可使用基于数字PCR的端点测定。

一方面，使用优化的q-PCR方法，其利用广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶K(如可商购自凯杰公司(Qiagen))。更具体地说，除在DNA酶I消化之后，将样品用蛋白酶K缓冲液稀释且用蛋白酶K处理，随后进行热失活之外，优化的qPCR基因组效价测定与标准测定类似。合适的，以等于样品大小的量用蛋白酶K缓冲液稀释样品。蛋白酶K缓冲液可浓缩到2倍或更高。通常，蛋白酶K处理为约0.2mg/mL，但可在0.1g/mL至约1mg/mL之间变化。处理步骤一般在约55℃下进行约15分钟，但可在更低温度(例如，约37℃至约50℃)下进行更长时间段(例如，约20分钟至约30分钟)，或在更高温度(例如，最高约60℃)下进行更短时间段(例如，约5到10分钟)。类似地，热失活一般在约95℃下持续约15分钟，但温度可降低(例如，约70℃至约90℃)，且时间可延长(例如，约20分钟至约30分钟)。随后将样品稀释(例如，1000倍)，且如标准测定中所描述进行TaqMan分析。

另外或替代地，可使用液滴数字PCR(ddPCR)。例如，已描述用于通过ddPCR确定单链和自互补AAV载体基因组效价的方法。参见例如M.Lock等人,《人类基因疗法方法(HumGene Ther Methods)》2014年4月；25(2):115-25.数字对象识别码：10.1089/hgtb.2013.131.电子出版2014年2月14日。

简单来说，用于从基因组缺陷型AAV中间体分离具有包装的基因组序列的rAAV颗粒的方法涉及使包括重组AAV病毒颗粒和AAV衣壳中间体的悬浮液经受高效液相色谱，其中AAV病毒颗粒和AAV中间体与在高pH下平衡的强阴离子交换树脂结合，并且经受盐梯度，同时监测洗脱液在约260和约280下的紫外线吸光度。可根据所选AAV而调整pH。参见例如WO2017/160360(AAV9)、WO2017/100704(AAVrh10)、WO2017/100676(例如AAV8)和WO 2017/100674(AAV1)，所述文献通过引用并入本文中。在此方法中，当A260/A280的比率达到拐点时，从洗脱的级分中收集AAV完整衣壳。在一个实例中，对于亲和色谱步骤，可将透滤的产物施加到有效捕获AAV2血清型的Capture Select^TM Poros-AAV2/9亲和树脂(生命科技公司(Life Technologies))上。在这些离子条件下，显著百分比的残余细胞DNA和蛋白质流过柱，同时有效捕获AAV颗粒。

药物组合物

一种药物组合物包括以下中的一种或多种：表达盒、含有表达盒的载体(病毒或非病毒)，或含有表达盒的另一系统以及载剂、悬浮剂和/或赋形剂中的一种或多种。

在某些实施例中，组合物含有至少一种rAAV原液(例如，rAAV原液)和任选的载剂、赋形剂和/或防腐剂。rAAV原液是指多个rAAV载体，所述多个rAAV载体的量与例如在下文关于浓度和剂量单位的论述中所描述的量相同。可将rAAV载体递送的转基因调配成用于递送，或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒或类似物中。

在某些实施例中，表达盒经由脂质纳米颗粒递送。术语“脂质纳米颗粒”是指具有的平均直径为10至1000纳米，例如75nm至750nm，或100nm和350nm，或250nm至约500nm的典型球面结构的脂质组合物。在一些调配物中，脂质纳米颗粒可包括至少一种阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质和至少一种结合脂质。可使用本领域中已知的适合于包封核酸(如mRNA)的脂质纳米颗粒。“平均直径”是包括亲脂相和亲水相的纳米颗粒的群体的平均大小。这些系统的平均大小可通过本领域技术人员所已知的标准方法来测量。用于基因疗法的合适的脂质纳米颗粒的实例描述于例如L.Battaglia和E.Ugazio,《纳米材料杂志(JNanomaterials)》,第2019卷,文章编号283441,第1-22页；US2012/0183589A1；以及WO2012/170930中，所述文献通过引用整体并入本文中。

在某些实施例中，提供一种组合物，其包括编码核酸酶降解肽信号融合蛋白的核酸分子以及药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂。

rAAV原液是指多个rAAV载体，所述多个rAAV载体的量与例如在下文关于浓度和剂量单位的论述中所描述的量相同。

如本文中所使用，“载剂”包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载剂溶液、悬浮液、胶质物等。此类培养基和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是熟知的。还可将补充性活性成分并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当向宿主施用时不会产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒剂(如脂质体、纳米胶囊、微颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡和类似物)可用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞中。具体地说，可将rAAV载体递送的载体基因组调配成用于递送，或包封在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒或类似物中。

在一个实施例中，组合物包含适合于递送到个体的最终调配物，所述组合物例如是缓冲到生理兼容pH和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，一种或多种表面活性剂存在于调配物中。在另一实施例中，可将组合物作为被稀释以用于施用于个体的浓缩物输送。在其它实施例中，可以在施用时将组合物冻干且重构。

本领域中所熟知的用于制备调配物的方法和药剂例如描述于“雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)”,马克出版公司(Mack Publishing Company),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa)中。调配物可例如含有赋形剂、载剂、稳定剂或稀释剂，如无菌水；生理盐水；聚亚烷基二醇，如聚乙二醇；植物来源油或氢化萘；防腐剂(如十八烷基二甲基苯甲基、氯化铵、氯化六羟季铵、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苄索氯铵(benzethonium chloride)、酚、丁基或苄醇、对羟苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚(catechol)、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸和赖氨酸；单糖；二糖以及其它碳水化合物，包含葡糖、甘露糖和糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属错合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

还可将活性成分包覆在微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备，例如分别在胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于《雷明顿氏药物科学》第16版,Osol,A.编(1980)中。

合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可从无毒的非离子表面活性剂当中选择。在一个实施例中，选择以伯羟基为末端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如

F68[巴斯夫(BASF)]，也称为泊洛沙姆(Poloxamer)188，其具有中性pH，具有8400的平均分子量。可选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即非离子性三嵌段共聚物，所述非离子型三嵌段共聚物由侧接聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两个亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链、SOLUTOL HS 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、LABRASOL(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油醚、TWEEN(聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇构成。在一个实施例中，调配物含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“P”(针对泊洛沙姆)后跟三位数字命名：前两位数字×100给出聚氧丙烯核的大致分子质量，且最后一位数字×10给出聚氧乙烯含量的百分比。在一个实施例中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂可以悬浮液的最多约0.0005％到约0.001％的量存在。

以充足的量施用载体以转染细胞且提供足够水平的基因转移和表达，以提供治疗益处，而没有过度的副作用或具有医学上可接受的生理作用，这可以由医学领域的技术人员来确定。常规和药学上可接受的施用途径包含但不限于直接递送到所需器官(例如，肝脏(任选地经由肝动脉)、肺、心脏、眼睛、肾脏)、口服、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内和其它亲本施用途径。视需要，可组合施用途径。

病毒载体的剂量主要取决于如所治疗的病状、患者的年龄、体重和健康状况的因素，且因此可在患者之间变化。例如，病毒载体的治疗有效人类剂量一般在约25至约1000微升至约100mL溶液的范围内，所述溶液含有浓度为约1×10⁹至1×10¹⁶个基因组病毒载体。调整剂量以平衡治疗益处与任何副作用，且此类剂量可取决于所采用重组载体的治疗应用而变化。可监测转基因产物的表达水平以确定产生病毒载体，优选地含有小基因(minigene)的AAV载体的剂量频率。任选地，与出于治疗目的描述的剂量方案类似的剂量方案可用于使用本发明的组合物进行免疫。

复制缺陷型病毒组合物可以剂量单位调配，以含有在约1.0×10⁹GC至约1.0×10¹⁶GC的范围内的复制缺陷型病毒量(以治疗平均体重为70kg的个体)，包含所述范围内的所有整数或分数量，且对于人类患者优选地为1.0×10¹²GC到1.0×10¹⁴GC。在一个实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10⁹、2×10⁹、3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹或9×10⁹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹¹、2×10¹¹、3×10¹¹、4×10¹¹、5×10¹¹、6×10¹¹、7×10¹¹、8×10¹¹或9×10¹¹GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹²、2×10¹²、3×10¹²、4×10¹²、5×10¹²、6×10¹²、7×10¹²、8×10¹²或9×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹³、2×10¹³、3×10¹³、4×10¹³、5×10¹³、6×10¹³、7×10¹³、8×10¹³或9×10¹³GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁴、2×10¹⁴、3×10¹⁴、4×10¹⁴、5×10¹⁴、6×10¹⁴、7×10¹⁴、8×10¹⁴或9×10¹⁴GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在另一实施例中，将组合物调配成每剂量含有至少1×10¹⁵、2×10¹⁵、3×10¹⁵、4×10¹⁵、5×10¹⁵、6×10¹⁵、7×10¹⁵、8×10¹⁵或9×10¹⁵GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。在一个实施例中，对于人类应用，剂量可范围介于每剂量1×10¹⁰到约1×10¹²GC，包含所述范围内的所有整数或分数量。

这些上述剂量可以各种体积的载剂、赋形剂或缓冲剂调配物形式施用，范围介于约25到约1000微升或更大的体积，包含所述范围内的所有数字，这取决于待治疗区域的大小、所使用的病毒效价、施用途径和方法的所期望效果。

可选择任何合适的施用途径(例如，口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、腹膜内和其它亲本途径)。因此，可将药物组合物调配成用于任何适当施用途径，例如呈液体溶液或悬浮液的形式(如例如以用于静脉内施用、用于口服施用等)。可替代地，药物组合物可呈固体形式(例如，呈片剂或胶囊的形式，例如以用于口服施用)。在一些实施例中，药物组合物可呈粉剂、滴剂、喷雾剂等的形式。

方法

本文中所提供的组合物适用于降低活体内递送的酶的脱靶活性。在某些实施例中，组合物适用于在非病毒介导的表达盒的递送后降低所表达的酶的脱靶活性，所述表达盒包括酶编码序列、酶-PEST编码序列和/或具有一个或多个酶调节(靶或突变靶)序列的酶-PEST编码序列。在某些实施例中，组合物适用于在AAV介导的载体基因组的递送后降低所表达的酶的脱靶活性。

在某些实施例中，可在试管内评估蛋白质降解信号(例如，PEST、盒或其它降解决定子)的效力。例如，可通过处理细胞以停止蛋白质的翻译(例如，使用环己酰亚胺(CHX))且随后在处理后的不同时间处进行蛋白质印迹(western blot)而在试管内(在所培养细胞中)评估含有酶(例如，核酸酶)和蛋白质降解信号的融合蛋白的半衰期。用于评估核酸酶降解的其它合适的方法可易于由本领域的技术人员确定。

可使用已描述于文献中的多种方法来确定脱靶核酸酶活性的降低(或核酸酶特异性的增加)。用于确定核酸酶特异性的此类方法包含无细胞方法，如Site-Seq[Cameron,P.等人(2017)《绘制CRISPR-Cas9裂解的基因组图谱(Mapping the genomic landscapeofCRISPR-Cas9 cleavage)》.《自然方法(Nat Methods)》,14,600-606]、Digenome-seq[Kim,D.等人,(2015)《Digenome-seq:人类细胞中CRISPR-Cas9脱靶效应的全基因组分析(genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells)》.《自然方法》,12,237-243,第231页后面是第243页]和Circle-Seq[Tsai,S.Q.等人,(2017)《CIRCLE-seq:用于全基因组CRISPR-Cas9核酸酶脱靶的高度敏感性试管内筛选(CIRCLE-seq:a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nucleaseoff-targets)》.《自然方法》,14,607-614]和基于试管内的方法，如例如GUIDE-Seq[Tsai(2017)《自然方法》,14,607-614]以及整合缺陷型慢病毒载体捕获(IDLV)[Gabriel,R.等人(2011)《锌指核酸酶特异性的无偏见全基因组分析(An unbiased genome-wideanalysisof zinc-finger nuclease specificity)》.《自然生物技术(Nat Biotechnol)》,29,816-823；Wang,X.等人，(2015)《通过CRISPR-Cas9和TALEN使用整合酶缺陷型慢病毒载体对脱靶裂解进行无偏见检测(Unbiased detection of off-target cleavage byCRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors)》.《自然生物技术》,33,175-178]。

本文中提供且通过引用并入改进的测定，其更准确地预测活体内脱靶活性的数量和比率。

我们所研发的ITR-seq方法提供对ITR整合位点的无偏见全基因组鉴定。下述实例使用AAV ITR作为用于鉴定DSB的标签，我们可以在活体内测量基因组编辑核酸酶的脱靶活性。然而，将易于理解，可使用任何末端重复序列(trs)(例如，慢病毒末端重复序列)或其它共同整合位点，例如位于表达盒的5'和3'的重复序列。类似地，非病毒表达盒可被工程化以含有此共同整合位点，以便允许使用此测定进行检测(例如，trs可被工程化到通过非病毒或非载体递送系统递送的DNA表达盒中)。

ITR-Seq方案是锚定PCR反应的修改版本，其中单一引物被设计成与ITR序列退火且从ITR序列朝外扩增(例如，图7C)。在DNA中进行ITR整合后，引物可用于扩增宿主基因组与所插入载体ITR序列的接合(例如，图7B、7C)。为了使整合的ITR的有序二级结构充分变性，使用高退火温度(例如，69℃)和更长衔接子特异性引物。在某些实施例中，“高退火温度”可以是PCR聚合酶起作用且引物与靶序列退火的任何温度，例如在60℃到75℃或约68℃到72℃下。在某些实施例中，引物序列的长度可以是18至约42个核苷酸，如果保留特异性，那么可能更长。在某些实施例中，引物的长度为至少20个核苷酸至40个核苷酸、至少30个核苷酸至40个核苷酸、至少35个核苷酸至40个核苷酸或约37个核苷酸。

为使用ITR-Seq测定进行样品分析，从样品(例如，来自用表达核酸酶的AAV载体处理的动物的组织)分离DNA。剪切DNA且将其接合到Y衔接子，如前述报道[Tsai,S.Q.等人,(2015)《GUIDE-seq能够通过CRISPR-Cas核酸酶进行脱靶裂解的全基因组分析(GUIDE-seqenables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Casnucleases)》.《自然生物技术》,33,187-197]中所描述。在使用上文所描述的ITR特异性引物和衔接子特异性引物进行两轮PCR后，产生NGS兼容库。在测序之后，计算确定含有扩增的ITR序列和相邻基因组DNA序列的所得扩增子。还确定全基因组ITR整合位点的位置和频率。通过要求ITR在正向链和反向链定向两者上整合，我们进一步减少假阳性的数量且鉴定高置信度ITR整合位点。对于每种样品，产生核酸酶靶位点的排序列表(ITR-Seq等级)，且按照每个基因座(ITR-Seq读数)观测到的ITR整合事件的总数以降序分选位点。ITR-Seq报告是在计算分析结束时使用最可能的脱靶序列(基于与预期靶序列的同源性)、基因组位置和ITR-Seq等级(根据映射到对应基因座的NGS读数的数量)生成的。实例3提供测定的额外细节且说明测定的用途。

一方面，提供一种用于编辑靶向基因的方法，其包括递送如本文中所描述的自调节核酸酶表达盒。

一方面，提供一种用于编辑靶向基因的方法，其包括递送如本文中所描述的组合物。

一方面，提供一种用于编辑靶向基因的方法，其包括递送如本文中所描述的病毒或非病毒载体。

一方面，提供一种用于编辑靶向基因的方法，其包括递送如本文中所描述的rAAV。

一方面，一种方法，其用于使用自调节核酸酶表达盒治疗患有胆固醇相关病症(如高胆固醇血症)的患者，所述自调节核酸酶表达盒包括识别如本文中所描述的人类PCSK9基因内的位点的大范围核酸酶。在某些实施例中，表达盒编码包括PCSK9大范围核酸酶和蛋白质降解信号(例如，PEST序列)的融合蛋白。在一个实施例中，融合蛋白具有SEQ ID NO:18中所示的序列。在某些实施例中，表达盒编码PCSK9大范围核酸酶和至少一个靶序列。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列。在某些实施例中，表达盒包括融合蛋白，所述融合蛋白包括PCSK9大范围核酸酶和蛋白质降解信号以及至少一个靶序列。此类表达盒可经由病毒或非病毒载体递送。在某些实施例中，表达盒可使用LNP递送。

一方面，提供一种方法，其用于使用自调节核酸酶表达盒治疗患有与丙氨酸乙醛酸转氨酶基因缺陷相关的病症(如原发性高草酸尿症1型)的患者，所述自调节核酸酶表达盒包括识别如本文中所描述的人类HAO基因内的位点的大范围核酸酶。在某些实施例中，表达盒编码融合蛋白，所述融合蛋白包括HOA大范围核酸酶和蛋白质降解信号，例如PEST序列。在某些实施例中，表达盒编码HOA大范围核酸酶和至少一个靶序列。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列。在某些实施例中，表达盒包括融合蛋白，所述融合蛋白包括HOA大范围核酸酶和蛋白质降解信号以及至少一个靶序列。此类表达盒可经由病毒或非病毒载体递送。在某些实施例中，表达盒可使用LNP递送。在某些实施例中，病症是原发性高草酸尿症(PH1)。

一方面，提供一种方法，其用于使用自调节核酸酶表达盒治疗患有与甲状腺素运载蛋白(TTR)基因缺陷相关的病症的患者，所述自调节核酸酶表达盒包括识别如本文中所描述的人类TTR基因内的位点的大范围核酸酶。在某些实施例中，表达盒编码融合蛋白，所述融合蛋白包括TTR大范围核酸酶和蛋白质降解信号，例如PEST序列。在某些实施例中，表达盒编码TTR大范围核酸酶和至少一个靶序列。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列。在某些实施例中，表达盒包括融合蛋白，所述融合蛋白包括TTR大范围核酸酶和蛋白质降解信号以及至少一个靶序列。此类表达盒可经由病毒或非病毒载体递送。在某些实施例中，表达盒可使用LNP递送。在某些实施例中，病症是TTR相关遗传性淀粉样变性。

另一方面，提供一种方法，其用于使用自调节核酸酶表达盒治疗患有与载脂蛋白C-II(APOC3)基因缺陷相关的病症的患者，所述自调节核酸酶表达盒包括识别如本文中所描述的人类APOC3基因内的位点的大范围核酸酶。在某些实施例中，表达盒编码融合蛋白，所述融合蛋白包括APOC3大范围核酸酶和蛋白质降解信号，例如PEST序列。在某些实施例中，表达盒编码APOC3大范围核酸酶和至少一个靶序列。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列。在某些实施例中，表达盒包括融合蛋白，所述融合蛋白包括APOC3大范围核酸酶和蛋白质降解信号以及至少一个靶序列。此类表达盒可经由病毒或非病毒载体递送。在某些实施例中，表达盒可使用LNP递送。

一方面，提供一种方法，其用于使用自调节核酸酶表达盒治疗患有与分支链a-酮酸脱氢酶复合物(BCKDC)E1α基因缺陷相关的病症的患者，所述自调节核酸酶表达盒包括识别人类BCKDC E1α基因内的位点的大范围核酸酶。在某些实施例中，表达盒编码融合蛋白，所述融合蛋白包括BCKDC大范围核酸酶和蛋白质降解信号，例如PEST序列。参见WO 2020/056155A2。在某些实施例中，表达盒编码BCKDC大范围核酸酶和至少一个靶序列。在某些实施例中，表达盒包括突变靶序列。在某些实施例中，表达盒包括融合蛋白，所述融合蛋白包括BCKDC大范围核酸酶和蛋白质降解信号以及至少一个靶序列。此类表达盒可经由病毒或非病毒载体递送。在某些实施例中，表达盒可使用LNP递送。在某些实施例中，病症是枫糖尿病。

在某些实施例中，涵盖除靶向上述基因中的任一种的大范围核酸酶以外的核酸酶。

在某些实施例中，如本文中所描述的核酸酶表达盒、非病毒载体、病毒载体(例如，rAAV)可施用用于患者中的基因编辑。在某些实施例中，所述方法适用于非胚胎基因编辑。在某些实施例中，患者是婴儿(例如，出生到约9个月)。在某些实施例中，患者比婴儿更大，例如12个月或更大。

如本文中所使用，“一(a/an)”或“所述”可意指一个(种)或超过一个(种)。例如，“一种”细胞可意指单一细胞或多个细胞。

在某些实施例中，术语“大范围核酸酶”是指在大于12个碱基对的识别序列处结合双链DNA的核酸内切酶。优选地，本发明的大范围核酸酶的识别序列是22个碱基对。大范围核酸酶可以是衍生自I-CreI的核酸内切酶，且可指相对于天然I-CreI关于例如DNA结合特异性、DNA裂解活性、DNA结合亲和力或二聚特性进行修饰的I-CreI的工程化变体。用于产生此类I-CreI修饰变体的方法在本领域中已知。参见例如WO2007/047859)。如本文中所使用的大范围核酸酶与双链DNA结合作为杂二聚体。大范围核酸酶还可以是“单链大范围核酸酶”，其中一对DNA结合结构域使用肽接头接合到单一多肽中。术语“归巢核酸内切酶”与术语“大范围核酸酶”同义。参见整体并入本文中的WO 2018/195449，其描述某些PCSK9大范围核酸酶。

如本文中所使用，术语“特异性”意指大范围核酸酶仅在被称为识别序列的碱基对的特定序列处或仅在一组特定识别序列处识别且裂解双链DNA分子的能力。所述组识别序列将共享某些保守位置或序列模体，但可在一个或多个位置处简并。高度特异性大范围核酸酶能够裂解仅一个或极少的识别序列。可通过本领域中所已知的任何方法来确定特异性。

缩写“Sc”是指自互补。“自互补AAV”是指其中由重组AAV核酸序列所携载的编码区已被设计成形成分子内双链DNA模板的构建体。感染后，scAAV的两个互补两等份将缔合以形成一个双链DNA(dsDNA)单元，准备立即复制和转录，而不是等待细胞介导的第二条链的合成。参见例如D M McCarty等人,“自互补重组腺相关病毒(scAAV)载体独立于DNA合成而促进高效转导(Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis)”,《基因疗法》,(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自互补AAV描述于例如美国专利第6,596,535号；第7,125,717号；和第7,456,683号中，所述美国专利中的每一个通过引用整体并入本文中。

如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指与所关注基因邻接的表达控制序列和以反式或在远处起作用以控制所关注基因的表达控制序列两者。

如用于描述核酸序列或蛋白质的术语“外源性”意指核酸或蛋白质并非天然存在于其在染色体或宿主细胞中的存在位置中。外源性核酸序列也指衍生自相同表达盒或宿主细胞且插入相同表达盒或宿主细胞中的序列，但其以非天然状态(例如，不同复本数目)存在或处于不同调控元件的控制下。

当参考蛋白质或核酸使用时，术语“异源性”指示蛋白质或核酸包括在自然界中未发现彼此具有相同关系的两个或更多个序列或子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有来自不相关基因的排列成形成新的功能性核酸的两个或更多个序列。例如，在一个实施例中，核酸具有来自一种基因的排列成引导编码序列从不同基因表达的启动子。

如本文中所使用，术语“宿主细胞”可指包装细胞系，其中载体(例如，重组AAV)由生产质粒产生。在替代方案中，术语“宿主细胞”可以指其中需要转基因表达的任何靶细胞。因此，“宿主细胞”是指含有已经以任何手段，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、微注射、转化、病毒感染、转染、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包被的团粒、病毒感染和原生质体融合引入细胞中的外源性或异源性核酸序列的原核或真核细胞。在本文中的某些实施例中，术语“宿主细胞”是指用于试管内评估本文中所描述的组合物的各种哺乳动物物种的细胞的培养物。在本文中的其它实施例中，术语“宿主细胞”是指用于产生和包装病毒载体或重组病毒的细胞又在另一实施例中，术语“宿主细胞”意图指针对如本文中所描述的疾病或病状在活体内治疗的个体的靶细胞。在某些实施例中，术语“宿主细胞”是肝脏细胞或肝细胞。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指其中含有所关注基因的表达盒包装于病毒衣壳或包膜中的合成或人工病毒颗粒，其中也包装于病毒衣壳或包膜内的任何病毒基因组序列是复制缺陷型；即，其不能产生子代病毒粒子，但保留了感染靶细胞的能力。在一个实施例中，病毒载体的基因组不包含编码复制所需的酶的基因(基因组可被工程化成“无肠的(gutless)”-仅含有所关注的基因，其侧接扩增和包装人工基因组所需的信号)，但是这些基因可以在产生期间供应。因此，其被认为可以安全地用于基因疗法中，因为除存在复制所需的病毒酶之外，不会发生通过子代病毒粒子进行的复制和感染。

在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“相同性百分比”是指两个序列中的残基在比对以获得最大对应性时是相同的。序列同一性比较的长度可超过基因组的全长、基因编码序列的全长，或至少约500至5000个核苷酸的片段是合乎需要的。然而，较小片段当中的同一性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸也是合乎需要的。类似地，可容易地确定氨基酸序列、蛋白质全长或其片段的“序列同一性百分比”。适当地，片段的长度为至少约8个氨基酸，且可最多为约700个氨基酸。本文中描述合适片段的实例。

当提及氨基酸或其片段时，术语“基本同源性”或“基本类似性”指示当与另一氨基酸(或其互补链)的适当氨基酸插入或缺失进行最优比对时，在至少约95％至99％的比对序列中存在氨基酸序列同一性。优选地，同源性超过全长序列或其蛋白质，例如cap蛋白、rep蛋白或其长度为至少8个氨基酸，或更合乎需要地至少15个氨基酸的片段。本文中描述合适片段的实例。

术语“高度保守”意指至少80％同一性，优选地至少90％同一性，且更优选地超过97％同一性。本领域的技术人员可通过借助本领域的技术人员所已知的算法和计算机程序容易地确定同一性。

一般来说，当提及两种不同腺相关病毒之间的“同一性”、“同源性”或“类似性”时，参考“比对”序列来确定“同一性”、“同源性”或“类似性”。“比对”序列或“比对”是指与参考序列相比，通常含有用于丢失的或额外的碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。在实例中，使用公开的AAV9序列作为参考点进行AAV比对。使用多种公开或可商购的多序列比对程序中的任一种进行比对。此类程序的实例包含“ClustalΩ”、“Clustal W”、“CAP序列组装”、“MAP”和“MEME”，其可通过因特网上的网站服务器进行访问。此类程序的其它来源是本领域的技术人员已知的。可替代地，也使用Vector NTI实用程序。还存在本领域中所已知的可用于测量核苷酸序列同一性的许多算法，包含上文所描述的程序中所含有的那些算法。作为另一实例，可使用GCG版本6.1中的程序Fasta^TM来比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供查询序列与搜索序列之间的最佳重叠区的比对和序列同一性百分比。例如，可使用如通过引用并入本文中的GCG版本6.1中所提供的Fasta^TM和其默认参数(字长6和计分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的序列同一性百分比。多个序列比对程序也可用于氨基酸序列，例如“ClustalΩ”、“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。一般来说，以默认设置使用这些程序中的任一个，但本领域的技术人员可视需要改变这些设置。可替代地，本领域的技术人员可利用另一种算法或计算机程序，其至少提供与所引用算法和程序所提供相同的同一性或比对水平。参见例如J.D.Thomson等人,《核酸研究(Nucl.Acids.Res.)》,“多个序列比对的全面比较(Acomprehensive comparison of multiple sequence alignments)”,27(13):2682-2690(1999)。

如本文中所使用，术语“约”是指从参考整数和其间的值±10％的变化。举例而言，“约”40个碱基对包含±4(即36至44，其包含整数36、37、38、39、40、41、42、43、44)。对于其它值，尤其在指百分比(例如，90％同一性、约10％差异或约36％错配)时，术语“约”包含在包含整数和分数两者的范围内的所有值。

如本说明书和权利要求书通篇所使用，术语“包括”、“含有”、“包含”和其变体包含其它组分、元件、整数、步骤等。相反，术语“由……组成”和其变体不包含其它组分、元件、整数、步骤等。

除非在本说明书中另外定义，否则本文中所使用的技术和科学术语具有与本领域的普通技术人员和参照公开文本所通常所理解相同的含义，这为本领域的技术人员提供了本申请中使用的许多术语的通用指南。

实例

我们假设大范围核酸酶的低细胞内水平足以进行中靶基因组编辑，且超过此阈值会增加脱靶编辑的可能性。为了测试此假设，我们研发出自失活或“自杀”系统来限制大范围核酸酶的表达。

总之，通过插入靶序列和/或添加蛋白质降解信号而通过自失活来限制大范围核酸酶表达降低了脱靶活性，而不损害中靶效力。在基因编辑方法中包含此自杀系统增加了AAV递送基因组编辑核酸酶的安全概况。

实例1-

在此实例中，描述于WO2018/195449中的工程化大范围核酸酶用于说明本发明。这些大范围核酸酶被工程化以识别且裂解PCS 7-8识别序列。PCS 7-8识别序列定位于PCSK9基因内。这些工程化大范围核酸酶包括：第一亚基，其包括第一高变(HVR1)区；和第二亚基，其包括第二高变(HVR2)区。此外，第一亚基与识别序列中的第一识别半位点(例如，PCS7半位点)结合，且第二亚基与识别序列中的第二识别半位点(例如，PCS7半位点)结合。在其中工程化大范围核酸酶是单链大范围核酸酶的实施例中，第一和第二亚基可定向以使得包括HVR1区且结合第一半位点的第一亚基定位为N末端亚基，且包括HVR2区且结合第二半位点的第二亚基定位为C末端亚基。在替代实施例中，第一和第二亚基可定向以使得包括HVR1区且结合第一半位点的第一亚基定位为C末端亚基，且包括HVR2区且结合第二半位点的第二亚基定位为N末端亚基。参见例如WO 2018/195449的表1。

我们通过在启动子之后插入22bp大范围核酸酶靶序列而研发出表达M2PCSK9的AAV载体。利用这种设计，所表达M2PCSK9应编辑PCSK9基因且裂解紧接在启动子之后的AAV载体基因组，从而阻止大范围核酸酶转基因的进一步转录。我们通过在polyA序列之前插入额外靶序列或通过在启动子之后插入突变靶序列来构建替代载体。我们也包含了与M2PCSK9大范围核酸酶同框的PEST序列，因为此序列应靶向供蛋白酶体降解的转基因蛋白。

我们使免疫缺陷型RAG基因敲除小鼠静脉内施用表达人类PCSK9的AAV9载体。两周后，我们使小鼠再施用自杀系统载体。所有型式的自杀系统都降低了血清中的PCSK9水平，尽管程度不同且载体施用后的时间进程不同。如所预期，M2PCSK9在PSCK9基因中的靶序列中以及当存在于AAV基因组中时在靶序列处产生插入缺失。对于自杀系统载体中的一些，中靶编辑效力与用亲本AAV-M2PCSK9载体获得的中靶编辑效力相当，其中通过蛋白质印迹确定蛋白质表达降低，且在载体施用后9周时脱靶活性降低20倍。

质粒

所有构建体基于AAV质粒，所述AAV质粒含有：AAV反向末端重复序列(ITR)、人类甲状腺激素结合球蛋白(TBG)启动子、普洛麦格(Promega)内含子、PCS7-8L.197(也称为ARCUS2或M2PCSK9)基因、土拔鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)、牛生长激素(bGH)polyA信号和第二AAV ITR序列(此质粒已描述于前述公开案(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)中。

用于AAV生产的质粒：

·pAAV.TBG.PI.PCS7-8L.197.bGH(AAV.M2PCSK9)：从先前描述的质粒(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)移除WPRE序列。最终质粒含有TBG启动子、合成内含子、M2PCSK9的编码序列(I-Cre-I工程化大范围核酸酶)和牛生长激素聚腺苷酸化序列。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:9中。M2PCSK9的氨基酸序列示于SEQ ID NO:10中。

·pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197.bGH(AAV.靶标.M2PCSK9)：M2PCSK9靶序列(SEQ ID NO:5：

5'-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA-3')在启动子序列之后进行克隆。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:11中。

·pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH(AAV.靶标.M2PCSK9+PEST)：含有如上靶序列以及来自小鼠鸟氨酸脱羧酶的富含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)的序列的载体与M2PCSK9编码序列框内克隆。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:12中。

·pAAV.TBG.AP-T0.PI.PCS 7-8L.197-PEST.AP-T0.bGH(AAV.2x靶标.M2PCSK9+PEST)：与前述载体(含有在启动子之后的靶序列和与M2PCSK9同框的PEST序列)加上在polyA信号之前克隆的额外M2PCSK9靶序列。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:13中。

·pAAV.TBG.AP-T8VL.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH(AAV.突变靶标.M2PCSK9+PEST)：突变靶序列(5'-TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA-3')紧接在启动子之后进行克隆(与AAV8.靶标.M2PCSK9+PEST构建体类似)，从而替换亲本靶序列(5'-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA-3')。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:14中。

·pAAV.TBG.PI.PCS 7-8L.197-PEST.bGH(AAV.M2PCSK9+PEST):PEST序列与M2PCSK9编码序列框内克隆。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:15中。

·pAAV.TBG.AP-T8VL.PI.PCS7-8L.197.bGH(AAV.突变靶标.M2PCSK9):突变靶序列紧接在启动子之后进行克隆。来自此质粒的表达盒的序列示于SEQ ID NO:16中。

为了构建且产生AAV自杀载体，除去WPRE元件。PCS7-8L.197靶序列(SEQ ID NO:5-TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA)在TBG启动子之后且在普洛麦格内含子元件之前进行克隆。额外靶序列在M2PCSK9基因之后且在polyA信号之前进行克隆。突变靶标序列(SEQ ID NO:6：TTGCCCTTTTTATTCCCAGGGA)在GUIDE-Seq实验中在LLC-MK2细胞(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)中鉴定为M2PCSK9的低级脱靶序列。

鸟氨酸脱羧酶(ODC)富含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PEST)的序列：SEQ IDNO:3：aagcttagcc atggcttccc gccggaggtg gaggagcagg atgatggcac gctgcccatgtcttgtgccc aggagagcgg gatggaccgt caccctgcag cctgtgcttc tgctaggatcaatgtgtagtaa)编码氨基酸序列：KLSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV(SEQ IDNO:4)。此PEST序列获自小鼠细胞且与载体中的M2PCSK9基因序列框内克隆。

使用如先前描述的三重转染技术生产AAV载体。

小鼠实验

经由单静脉尾部注射向雄性6至8周大的Rag1 KO小鼠(杰克逊实验室(TheJackson Laboratory))施用编码人类前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型酶(AAV9.hPCSK9)的AAV血清型9的3.5×10¹⁰个基因组复本(GC)。两周后，通过单静脉尾部注射来注射1×10¹¹或1×10¹²GC的编码M2PCSK9核酸酶或AAV自杀载体的AAV血清型8。每周收集血清样品直到研究结束。将一子组小鼠安乐死且在AAV9.hPCSK9后4周或9周时收集肝脏。

非人类灵长类动物(NHP)实验

向恒河猕猴静脉内施用6×10¹²GC/Kg的AAV.M2PCSK9、AAV.靶标.M2PCSK9和AAV.突变靶标.M2PCSK9-PEST或3×10¹³GC/Kg的AAV.突变靶标.M2PCSK9。在载体施用之前和在载体施用之后的不同时间处获得外周血单核细胞(PBMC)和血清样品。在载体施用后第18天收集肝脏活检。如先前所描述(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)进行包含hPCSK9测量的所有血液测试。

插入缺失分析

存在于小鼠实验中的AAV9.hPCSK9中和AAV自杀载体中以及PCSK9基因、AAV.靶标.M2PCSK9和AAV.突变靶标.M2PCSK9-PEST载体中的靶标区域中的插入缺失如先前所描述(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)进行定量。用于此测定的引物显示于表1中。

AMP-Seq分析

NHP实验中的PCSK9靶标区域中的插入缺失和ITR整合通过如先前描述(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)的AMP-Seq分析来确定。

脱靶鉴定和表征

在来自小鼠和NHP的肝脏中进行ITR-Seq，如下述实例3中所描述。

所指示脱靶位置的引物被设计成用于如先前描述(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)的插入缺失％计算。

结果

我们评估表达M2PCSK9的AAV载体中的突变靶序列、PEST信号或这些元件的组合是否引起核酸酶的脱靶活性降低而不损害其中靶活性。图1显示所测试AAV载体的示意性图示。图2A显示本文中所描述的小鼠和NHP研究的时间线。图2B显示在自杀载体的AAV生产期间发生AAV基因组中的低编辑。

为了测试这些载体的活体内效力，首先使Rag1 KO小鼠注射有表达hPCSK9的AAV载体(因为小鼠基因组不含有M2PCSK9靶序列)，两周后，使这些小鼠施用AAV自杀载体以1×10¹¹GC/小鼠。两周后(从首次载体注射起4周)或七周后(总共9周)，将小鼠安乐死且收集肝脏。

通过PCR扩增AAV.hPCSK9载体中涵盖M2PCSK9靶序列的区域，通过下一代测序和生物信息分析来分析扩增子，以确定在靶标区域中含有插入或缺失(插入缺失)的AAV.hPCSK9衍生的扩增子的百分比(图3A)。所有所测试的AAV自杀载体在第4周和第9周时诱导AAV.hPCSK9基因座中的插入缺失。另外，我们评估M2PCSK9核酸酶是否也诱导存在于表达M2PCSK9核酸酶的AAV载体中的靶或突变靶序列中的插入缺失。我们发现了含有靶序列的所有载体的靶标区域中的插入缺失的证据。在含有突变靶序列和PEST序列两者的载体中存在插入缺失，且含有突变靶序列但无PEST序列的载体中的百分比较低(图3B)。

在评估AAV自杀载体保留中靶活性之后，我们确定M2PCSK9在由这些载体介导其表达时的脱靶活性。我们使用被称为ITR-Seq的技术来确定衍生自M2PCSK9核酸酶的靶向和脱靶活性的双链断裂的基因组(《BMC基因组学(BMC Genomics.)》2020年3月17；21(1):239)。肝脏DNA的ITR-Seq分析(图4A)鉴定了用AAV.M2PCSK9处理的小鼠中的大约160个脱靶位点，但对于AAV自杀构建体，除了AAV.M2PCKS9+PEST(平均52个脱靶)和AAV.突变靶标.M2PCSK9(128个脱靶)之外，脱靶数量降低至26。

我们从所鉴定的脱靶中选择一子组高级脱靶进行进一步分析。我们设计对扩增涵盖这些脱靶的DNA区具有特异性的引物且计算插入缺失％(图4B)。与用AAV.M2PCSK9载体处理的小鼠相比，用AAV自杀载体处理的小鼠中的脱靶位点的插入缺失％减少。与在所鉴定脱靶数量中所观测到的类似，所选脱靶的插入缺失％对于经AAV.M2PCSK9和AAV.突变靶标.M2PCSK9处理的小鼠类似(图4B)，从而表明突变靶序列本身并不足以介导M2PCSK9脱靶活性的降低。

对于非人类灵长类动物(NHP)中的进一步测试，除亲本AAV M2PCSK9载体之外，我们还选择具有高中靶活性且脱靶活性降低的两种AAV自杀载体：AAV.靶标.M2PCSK9和AAV.突变靶标.M2PCSK9+PEST。这些载体的示意性表示示于图1中。

向NHP静脉内施用6×10¹²GC/kg剂量的各AAV和较高剂量(3×10¹³GC/kg)的AAV.突变靶标.M2PCSK9+PEST。收集经处理的NHP的第18天和第128天肝脏活检。一些NHP的研究正在进行中且因而尚未收集第128天的活检。

所有所测试的AAV载体诱导PCSK9基因中的预期靶标区域中的插入缺失，如通过Amplicon-Seq或AMP-Seq方法所检测(分别为图5C和图5D)。PCSK9靶标区域中的编辑诱导如先前所观测到的PCSK9减少(《自然生物技术》2018年9月；36(8):717-725)，这也导致LDL水平在载体注射后的不同时间处降低(分别为图7和图8)。

因为存在于AAV自杀载体中的靶序列中的编辑有可能促进AAV载体降解，从而导致转基因RNA水平的后续降低，所以我们在d18时定量肝脏活检样品中的AAV基因组复本(GC)和M2CPSK9 RNA(图9)。如所预期，AAV GC在用3×10¹³GC/kg剂量的AAV.突变靶标+PEST处理的NHP中比用6×10¹²GC/kg处理的其余部分更高；GC的量与用相同剂量处理的NHP类似。即使在用3×10¹³GC/kg处理的NHP中，RNA的量在所有所测试的剂量之间类似。

尽管中靶编辑类似(图6)，但通过ITR-Seq鉴定的脱靶位点的数量在所述组当中不同。对于AAV.M2PCSk9组，范围在41个与263个脱靶位点之间(平均132)。在相同剂量下，AAV.突变靶标.M2PCSK9+PEST组的脱靶是34个，且对于AAV.靶标.M2PCSK9，范围在34个与62个脱靶之间(平均48)。

在小鼠和NHP实验中获得的基本结果指示，AAV自杀系统降低了M2PCSK9脱靶活性(图5E)，同时保留中靶活性。

实例2-TTR

使用实例1中所描述的技术，利用识别以下位点的TTR大范围核酸酶或TTR大范围核酸酶-PEST融合蛋白：SEQ ID NO:7-GCTGGACTGGTATTTGTGTCTG。参见图6。

实例3-ITR-Seq：下一代测序测定，在基因组编辑后鉴定活体内全基因组DNA编辑位点

出版物Breton等人,《ITR-Seq，下一代测序测定鉴定在腺相关病毒载体介导性基因组编辑之后的活体内全基因组DNA编辑位点(ITR-Seq,a next-generation sequencingassay,identifies genome-wide DNA editing sites in vivo following adeno-associated viral vector-mediated genome editing)》,《BMC基因组学》,(2020):21:239通过引用整体并入本文中。

材料和方法

动物研究

所有动物手术都根据宾夕法尼亚大学机构动物护理及使用委员会(theInstitutional Animal Care and Use Committee of the University ofPennsylvania)审批通过的方案来进行。

恒河猕猴研究

来自先前所公开研究¹⁵的DNA样品用于ITR-Seq分析。简单来说，驱动大范围核酸酶M1PCSK9(AAV8.TBG.M1PCSK9.WPRE)或M2PCSK9(AAV8.TBG.M2PCSK9.WPRE)的表达的AAV8载体经由外周静脉施用于恒河猕猴(对于经M1PCSK9处理的动物，n＝4，且对于经M2PCSK9处理的动物，n＝2)。在载体施用后的17天和129天(对于AAV8-M1PCSK9)或18天和128天(对于AAV8-M2PCSK9)时进行肝脏活检¹⁵。作为未处理对照组，我们使用从在载体施用之前收集的外周血单核细胞(PBMC)样品提取的DNA¹⁵。

为了测量核酸酶非依赖性AAV整合事件，我们分析来自先前公开的研究的肝脏DNA样品¹⁷。简单来说，一周或一个月大的雄性恒河猕猴以3×10¹²个基因组复本(GC)/kg的剂量施用AAV8.TBG.EGFP。在载体施用后将动物安乐死且收集肝脏。

小鼠研究

通过颞静脉注射以向初生(0至2天大，n＝2只/组)C57BL/6J小鼠共施用呈3×10¹¹GC/小鼠的剂量的表达SaCas9(AAV8.TBG.hSaCas9.bGH)、LbCpf1(AAV8.ABP2.TBG-S1.hLbCpf1.bGH)或AsCpf1(AAV8.ABPS2.TBG-S1.hAsCpf1.PA75)的AAV，以及呈2×10¹²GC/小鼠的剂量的表达特异性sgRNA(AAV8.U6.sgRNA.mASS1.donor(mASS1))或作为对照的非靶向sgRNA(AAV8.U6.sgRNA-ctrl.mASS1.donor(mASS1))的载体。在载体施用后21天时，将小鼠安乐死且收集肝脏。

向额外初生小鼠(每组n＝2)共施用呈10¹¹或3×10¹¹GC/小鼠的剂量的如上文所描述的表达SaCas9或LbCpf1的载体，以及呈10¹²GC/小鼠的剂量的表达ASS1特异性sgRNA和人类凝血因子IX(hFIX)转基因(AAV8.U6.sgRNA.mASS1.TBG.hFIX)的第二载体。在载体施用后70天时收集肝脏。

ITR-Seq

所研发的ITR-Seq方案是锚定PCR反应的修改版本^18、19，其中单一引物被设计成与ITR序列退火且从ITR序列朝外扩增(图7C)。在DNA中进行ITR整合之后，引物可用于扩增宿主基因组与所插入载体ITR序列的接合(图7B、7C)。为了使整合的ITR的有序二级结构充分变性，设计69℃的高退火温度和较长衔接子特异性引物。

扩增子由从肝脏组织样品分离的纯化的基因组DNA产生。使用ME220聚焦超声发生器(科瓦里斯(Covaris)，马萨诸塞州沃本(Woburn,MA))将DNA剪切到500bp的平均大小，使用AMPure珠粒(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，印第安纳州印第安纳波利斯(Indianapolis,IN))以0.8×比率纯化，且在15μl的洗脱缓冲液(凯杰公司，德国希尔登(Hilden,Germany))中洗脱。随后在含有以下的22.5μl总体积中进行末端修复：1μl的5mMdNTP混合物(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))、2.5μl的10×SLOW接合缓冲液(酶公司(Enzymatics)，马萨诸塞州贝弗利(Beverly,MA))、2μl的末端修复混合物(低浓度；酶公司，马萨诸塞州贝弗利)、2μl的10×Taq聚合酶缓冲液(新英格兰生物实验室(New England BioLabs)，马萨诸塞州伊普威治(Ipswich,MA))、0.5μl的非热起始Taq聚合酶(无MgCl₂；英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))、0.5μl的无核酸酶水(生命技术公司(LifeTechnologies)，马萨诸塞州沃尔瑟姆)和14μl的400ng剪切的基因组DNA。将混合物在12℃下培育15min，在37℃下培育15min，在72℃下培育15min，且保持处于4℃。将其中分子索引标签与MiSeq通用衔接子(启迪公司(Illumina)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))退火的独特Y衔接子接合到以下混合物中的末端修复的DNA：1μl的10μM退火的A01-A16 Y衔接子、2μl的T4 DNA接合酶(酶公司，马萨诸塞州贝弗利)和22.5μl的预先末端修复的DNA。接合程序是16℃持续30min，22℃持续30min；使反应保持处于4℃。随后通过AMPure珠粒(贝克曼库尔特公司，印第安纳州印第安纳波利斯)以0.7×比率来纯化DNA。末端修复的Y衔接子接合的DNA片段通过PCR使用ITR特异性引物和衔接子特异性引物(A01-A16_P5_FWD引物)在以下混合物(每样品的量)中扩增：11.9μl的无核酸酶水；3μl的10×Taq聚合酶缓冲液(无MgCl₂，英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；0.6μl的10mMd NTP混合物(赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆)；1.2μl的50mM MgCl₂(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；0.3μl的5U/μl铂Taq聚合酶(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；1μl的10μM GSP_ITR3.AAV2引物；1.5μl的0.5M TMAC(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)；密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))；0.5μl的10μMA01-A16_P5_FWD引物，其中引物数量与衔接子数量匹配(例如，A01_P5_FWD引物与A01 Y衔接子一起使用)；和10μl的预先纯化的DNA。PCR程序是95℃持续5min的1次循环，95℃持续30s、69℃持续1min和72℃持续30s的30次循环，72℃持续5min的1次循环；4℃保持。将PCR产物使用0.7×AMPure珠粒(贝克曼库尔特公司，印第安纳州印第安纳波利斯)纯化，且再悬浮于15μl的洗脱缓冲液(凯杰公司，德国希尔登)中。

通过PCR在以下混合物(每样品的量)中制备NGS库：5.4μl的无核酸酶水(生命技术公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)；3μl的10×Taq聚合酶缓冲液(无MgCl₂；英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；0.6μl的10mM dNTP混合物(赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆)；1.2μl的50mM MgCl₂(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；0.3μl的5U/μl铂Taq聚合酶(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)；1μl的10μM GSP_ITR3引物；1.5μl的0.5M TMAC(西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)；0.5μl的10μMA01-A16_P5_FWD引物，其中引物数量与衔接子数量匹配；1.5μl的10μM p701-16引物；和15μl的预先纯化的DNA(包含用于前述PCR纯化步骤中的AMPure珠粒)。PCR程序是95℃持续5min的1次循环；95℃持续30秒、75℃持续2min(-1℃/循环)和72℃持续30s的10次循环；95℃持续30s、69℃持续1min和72℃持续30s的15次循环；72℃持续5min的1次循环；4℃保持。将PCR产物使用0.7×AMPure珠粒(贝克曼库尔特公司，印第安纳州印第安纳波利斯)纯化，且再悬浮于25μl的洗脱缓冲液中。将双索引测序库在Illumina MiSeq滤筒(

v2 RGT试剂盒300cyc PE-Bx 1/2；加利福尼亚圣地亚哥)上测序，从而生成2×150bp双端读数。

使用Je²⁰对原始fastq文件进行样品解复用和唯一分子识别符(UMI)标记，从而允许任一索引上的最多一个错配。使用FASTX条码切割器(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/，允许最多五个错配)、fastq-pair(https://github.com/linsalrob/EdwardsLab/)和FASTP²¹鉴定读数对，其中读数2以所设计引物序列开始，加上AAV2 ITR序列的额外侧接20bp(图7A到图7C)。使用NovoAlign(诺夫克拉夫特(Novocraft)，马来西亚雪兰莪)将所选读数对映射到每种样品的参考基因组(小鼠的MM10和恒河猕猴样品的RheMac8)。随后使用Je²⁰进行UMI读数合并，从而产生UMI合并的BAM文件。跨ITR基因组DNA插入位点的嵌合读数通过使用SE-MEI(https://github.com/dpryan79/SE-MEI)确定每个读数的拆分读数接合来鉴定。随后使用NovoAlign(诺夫克拉夫特，马来西亚雪兰莪)将读数的软剪切部分映射到AAV2参考基因组。仅使用被发现含有映射到AAV2ITR且映射质量值大于或等于30的软剪切读数部分的那些原始映射读数，以通过使用BEDtools^22、23将在50bp窗内发现的ITR整合位点合并到单一ITR整合位点中来鉴定ITR整合位点。仅在正向链和反向链定向两者上含有ITR整合的那些位点被认为是所鉴定的脱靶位点。使用用于半全域比对的EMBOSS程序²⁴，使在每个所鉴定ITR整合位点下方的基因组DNA序列与来自反向链和正向链定向两者的中靶DNA序列模体进行成对比对；这允许评估序列同源性和由所关注核酸酶识别的精确ITR整合位点。

结果和论述

研发ITR-Seq测定以评估非人类灵长类动物中的大范围核酸酶活性

对可在活体内基因编辑之后对核酸酶诱导的DSB进行鉴定和分级的基于NGS的测定的研发显著推进我们评估基因组编辑疗法对转化到人类临床试验中的安全性和效力的能力。研究人员已研发多种方法来鉴定且定量基因组编辑核酸酶的靶向和脱靶活性，以更好地理解管控核酸酶的特异性的元件，且改善这些疗法的安全概况²⁵。人们可以通过首先在培养细胞中或在所创建动物模型中鉴定DSB作为其核酸酶活性的结果来研究核酸酶特异性和活性^26、27。用于确定此核酸酶特异性的一些方法包含无细胞方法，如Site-Seq²⁸、Digenome-seq²⁹和Circle-Seq³⁰。一些基于试管内的方法包含GUIDE-Seq¹⁹和整合缺陷型慢病毒载体捕获(IDLV)^31、32。然而，这些试管内分析可能无法准确预测活体内脱靶活性的数量和比率，这是因为用于试管内分析的条件不能代表动物模型的靶器官中存在的DNA可获取性和核酸酶浓度。

因此，我们试图研发一种用于对ITR整合的位点进行无偏见全基因组鉴定的方法。通过使用AAV ITR作为用于鉴定DSB的标签，我们可以活体内测量基因组编辑核酸酶的脱靶活性。我们的方法是基于证实AAV ITR序列在DSB发生之后整合到宿主的基因组DNA中的前述研究^{10-14、16、33-36}。

最近，我们组使用AAV8载体表征靶向递送到恒河猕猴肝脏的PCSK9基因的大范围核酸酶的基因组编辑效率。本研究显示，PCSK9的稳定剂量依赖性降低，以及对于较高和中等水平剂量的第一代大范围核酸酶M1PCSK9或中等剂量的第二代大范围核酸酶M2PCSK9的30％到40％的中靶插入缺失百分比¹⁵。我们从预先输注有第一代和第二代大范围核酸酶构建体(分别为AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9)两者的恒河猕猴的肝脏活检样品中分离所编辑的PCSK9等位基因¹⁵。当使用AMP-Seq和扩增子测序测定分析这些等位基因时，我们注意到，ITR序列的基因组整合以较高频率发生¹⁵。

此处，我们重新分析在表征AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9中靶区域¹⁵时产生的NGS读数。我们的目标是鉴定最常见的AAV ITR序列，所述AAV ITR序列整合到PCSK9基因中的大范围核酸酶中靶基因座中。基于在AAV2参考基因组第82位处的绝对频率峰值(图7A)，我们确定ITR整合的最常见的碱基位置发生在rep结合元件(RBE)上游的5'。我们使用此信息来设计在所观测ITR整合起始位点上游的5'杂交的ITR特异性引物(在图7B中以红色显示)。在基于锚定多路复用PCR的修改版本的新颖NGS测定中使用这种引物，以鉴定在插入诱变后的ITR-基因组DNA接合(图7C)。我们将此方法称为ITR-Seq。

为了使用ITR-Seq测定进行样品分析，我们首先从用表达核酸酶的AAV载体处理的动物组织中分离DNA。我们剪切DNA，且将其接合到Y衔接子，如前述报道中所描述¹⁹。在使用上文所描述的ITR特异性引物和衔接子特异性引物进行两轮PCR后，我们产生了NGS兼容库。在测序之后，我们以计算方式鉴定含有扩增ITR序列和相邻基因组DNA序列两者的所得扩增子。我们也测定了全基因组ITR整合位点的位置和频率。通过要求ITR在正向链和反向链定向两者上在任何特定所鉴定ITR整合位点处整合，我们旨在进一步减少假阳性结果的数量且鉴定高置信度ITR整合位点。对于每种样品，我们产生核酸酶靶位点的排序列表(ITR-Seq等级)，且按照每个基因座(ITR-Seq读数)观测到的ITR整合事件的总数分选位点(以降序)。

ITR-Seq鉴定恒河猕猴中的核酸酶脱靶位点

在ITR-Seq测定研发后，我们使用此技术来进一步分析先前已施用AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9的恒河猕猴中的大范围核酸酶的靶向和脱靶效应(图8A到8C)。如先前所描述，恒河猕猴接受三个剂量的AAV8-M1PCSK9(3×10¹³GC/kg、6×10¹²GC/kg或2×10¹²GC/kg)中的任一个或单次剂量的AAV8-M2PCSK9(6×10¹²GC/kg)¹⁵。我们在载体施用后第17天和第128天获取所有猕猴的肝脏活检以评估靶向和脱靶编辑。在对NGS数据的计算分析结束时生成的ITR-Seq报道包含最可能的脱靶序列(基于与既定靶序列的同源性)；基因组位置；和ITR-Seq等级(根据映射到对应基因座的NGS读数的数量)。在来自经大范围核酸酶处理的猕猴的所有样品中，顶部ITR-Seq分级位点是中靶基因座(PCSK9靶位点序列TGGACCTCTTTGCCCCAGGGGA，chr1:54708864-54708885)¹⁵。对于两代大范围核酸酶(即AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9)，通过ITR-Seq鉴定的脱靶位点数量取决于所施用载体剂量和采样时间点两者。脱靶位点的数量以剂量依赖性方式且随时间减少(例如，第17天具有比第128天更多的脱靶位点；参见图8A)。在相同剂量下，接受第二代工程化大范围核酸酶M2PCSK9的动物具有比用第一代大范围核酸酶M1PCSK9处理的动物更少的鉴定的脱靶位点。总的来说，在以6×10¹²GC/kg的剂量施用AAV8-M1PCSK9之后，我们观测到1,170个不同的脱靶。相比之下，我们在以6×10¹²GC/kg的剂量接受AAV8-M2PCSK9的两只猕猴中仅观测到194个和105个脱靶(图8A)。

从来自以3×10¹³和6×10¹²GC/kg的剂量用AAV8-M1PCSK9处理的猕猴的d18肝脏样品的结果中任意地选择一子组ITR-Seq鉴定的脱靶。随后通过如先前描述的AMP-Seq^15、18，使用侧接鉴定的脱靶序列的基因特异性引物在这些所选基因座中研究ITR序列的存在。获得通过分析来自d18(来自以与上文所指定相同的剂量用AAV8-M1PCSK9处理的猕猴)的肝脏DNA样品所获得的AMP-Seq结果(数据未显示)。对于所分析DNA，在27个所研究基因座中的24个中(对于3×10¹³GC/kg剂量)或21个中(对于6×10¹²GC/kg剂量)发现含有ITR序列的读数，其中最高ITR整合百分比(含有ITR的读数)对应于具有高ITR-Seq等级的那些脱靶。重要的是，由于在两种动物中，最高水平的编辑显示于具有最高ITR-Seq等级的那些基因座中，因此在ITR-Seq等级、ITR整合百分比和插入缺失％之间也存在明显相关性。对于这些基因座中的一些，我们不能检测通过AMP-Seq测定整合的ITR序列，这可能是由于当ITR-Seq方法使用实际ITR序列作为扩增的起始点时，AMP-Seq测定对检测ITR整合的灵敏度较低。类似地，我们能够在ITR-Seq结果中未显示的几个位点中观测到ITR序列(例如，对于以3×10¹³GC/kg的剂量用AAV8-M1PCSK9处理的肝脏样品，20:359062-359285和7:165269225-165269449)。然而，这些位点发现于以6×10¹²GC/kg的剂量用AAV8-M1PCSK9处理的动物的ITR-Seq结果中，从而表明我们的当前方案并未捕获100％的ITR整合位点，且因此ITR-Seq方法的灵敏度可得到改善。

我们随后基于DNA区的功能来标注鉴定的ITR整合位点(图7B)。无论鉴定的核酸酶靶位点的数量如何，靶位点的基因组分布(基因间、内含子或外显子区)都可在施用大范围核酸酶的猕猴当中再现。一般来说，大部分靶位点存在于内含子内，随后是基因组的基因间区(图8B)。我们此处所评估的大范围核酸酶在PCSK9基因内具有22个核苷酸靶位点。因此，我们评估在靶DNA序列与每个脱靶位点的DNA序列之间的保守核苷酸的数量(图8C)。与中靶序列的匹配的分布似乎遵循平均为15至16个核苷酸的高斯分布(Gaussiandistribution)。这指示大部分ITR-Seq鉴定的脱靶位点在靶向DNA序列模体与每个靶位点的基因组DNA序列之间具有6个与7个之间的错配(图8C)。为了评估这种水平的同源性是由与大范围核酸酶靶序列类似的序列中发生的编辑引起，还是仅仅归因于偶然，我们在恒河猕猴基因组内产生1千万个随机DNA区(长度为40bp)。我们随后尝试使用在ITR-Seq方案中使用的相同算法来鉴定与大范围核酸酶靶位点最相似的序列(虚线，图8C)。不同于ITR-Seq鉴定的序列，随机序列与预期靶序列共享平均11至12个错配。这指示ITR主要整合于与预期靶序列具有某一程度的同源性的靶标中。

比较脱靶位点的GUIDE-Seq与ITR-Seq鉴定

试管内鉴定核酸酶靶向和脱靶的工具依赖于外源性DNA在发生DSB的位点中的整合。此外源性DNA可以是双链寡脱氧核苷酸(dsODN；对于GUIDE-Seq¹⁹)或慢病毒基因组(对于整合缺陷型慢病毒载体捕获或IDLV^31、32)。扩增子库可由PCR或LAM-PCR(线性扩增介导的PCR)使用衔接子接合和对这些外源性序列具有特异性的引物来构建。此DSB的位置可稍后通过使用NGS对所构建库进行测序，随后进行生物信息分析且映射到参考基因组来鉴定。用于表征核酸酶的脱靶活性的当前优选方法中的一种是GUIDE-Seq，因为1)其需要最小数量的组分；2)此软件可易于用以鉴定脱靶；以及3)其可检测低丰度脱靶。如之前所提及，考虑到用于GUIDE-Seq中的剂量、实验时长和细胞类型不同于动物模型的特性，试管内核酸酶活性可能无法预测活体内核酸酶活性。GUIDE-Seq允许我们快速比较多种sgRNA或向导RNA非依赖性核酸酶，如大范围核酸酶。然而，虽然有可能使用扩增子测序来验证所预测的脱靶，但如果试管内未鉴定出新颖的活体内产生的脱靶未，那么人们不能鉴定出新颖的活体内产生的脱靶。此外，这些方法需要活体内验证步骤，其中由涵盖试管内预测的脱靶区的引物产生的PCR扩增子稍后通过NGS进行测序，以通过插入缺失鉴定来计算编辑比率。

对于每种大范围核酸酶(M1PCSK9和M2PCSK9)，我们先前已对经质粒转染以表达核酸酶的LLC-MK2细胞进行GUIDE-Seq分析，以便试管内鉴定脱靶位点¹⁵。我们从试管内GUIDE-Seq鉴定的脱靶的列表中选择M1PCSK9和M2PCSK9脱靶位置。使用恒河猕猴，我们随后使用对脱靶基因座进行扩增子测序来进行对这些所预测脱靶的活体内验证¹⁵。扩增子测序¹⁵和ITR-Seq(图8A)都展现脱靶编辑效率的剂量和时间依赖性降低。我们使用ITR-Seq将这些前述结果与我们对活体内脱靶位点的评估进行比较(图9A至9D)。通过鉴定与预期靶序列不具有同源性的脱靶位点，我们能够在两个非依赖性实验中使用M1PCSK9(分别为1093和1499，对于GUIDE-Seq实验1和2)或M2PCSK9(分别为568和651，对于GUIDE-Seq实验1和2)发现大致相同数量的脱靶位点。我们比较了通过两种Guide-Seq试管内实验鉴定的位点与通过ITR-Seq鉴定的脱靶位点。对于在恒河猕猴中的本研究，我们对来自在核酸酶使用后第17天时获取的肝脏活检的DNA样品进行ITR-Seq。我们比较了接受3×10¹³GC/kg的AAV8-M1PCSK9(图9A)、6×10¹²GC/kg的AAV8-M1PCSK9(图9B)的剂量的猕猴以及施用6×10¹²GC/kg的AAV8-M2PCSK9(图9C和图9D)的两只动物中的GUIDE-Seq和ITR-Seq鉴定的脱靶。大多数(71.9％至82.9％)脱靶位点仅通过ITR-Seq而非通过Guide-Seq来鉴定(参见图9A至图9D的彩色部分)。有趣的是，在接受第二代核酸酶(M2PCSK9)的动物当中，ITR-Seq和Guide-Seq都鉴定出较少的脱靶位点(参见图9A至图9D的白色部分)。

我们先前已验证根据读数的数量进行分级的一组GUIDE-Seq鉴定的高等级和低等级脱靶¹⁵。我们通过定量插入缺失百分比来进行此操作，我们使用对在第17/18天和第128/129天时从施用大范围核酸酶的猕猴获取的样品中的脱靶基因座的扩增子进行测序来测定所述插入缺失百分比¹⁵。将展现比未处理的PBMC DNA对照样品显著更高的插入缺失百分比的脱靶位点计为阳性。

此处，我们评估ITR-Seq是否可以鉴定阳性GUIDE-Seq脱靶。鉴于重新分析用于验证GUIDE-Seq脱靶的相同DNA，我们能够评估我们的方法在检测阳性脱靶基因座时的灵敏度。在施用3×10¹³GC/kg和6×10¹²GC/kg的AAV8-M1PCSK9的猕猴当中，ITR-Seq未能仅鉴定两个高等级和两个低等级阳性GUIDE-Seq脱靶。在施用AAV8-M2PCSK9的猕猴当中，ITR-Seq正确地鉴定大多数阳性脱靶，且仅在一只动物中遗漏三个低等级阳性脱靶且在其它猕猴中遗漏三个高等级阳性脱靶。结合在一起，这些结果明确指示活体内脱靶中的绝大部分仅通过ITR-Seq而非通过GUIDE-Seq来鉴定。这表明不同于GUIDE-Seq预测的脱靶的扩增子测序，ITR-Seq提供对AAV递送的核酸酶的活体内活性的更准确检查。

对来自施用AAV8-M1PCSK9和AAV8-M2PCSK9的猕猴的DNA样品的ITR-Seq分析揭露，有可能活体内表征向导RNA非依赖性核酸酶的脱靶位点。ITR-Seq有可能提供基因组编辑核酸酶的详细表征。此外，试管内脱靶数据并不全面了解活体内基因组编辑核酸酶脱靶活性。实际上，ITR-Seq不仅鉴定出我们在我们的前述研究中表征的大多数GUIDE-Seq鉴定的最高等级脱靶位点¹⁵，而且还鉴定出未通过试管内GUIDE-Seq测定捕获的其它脱靶(图9A至图9D)。通过使用AAV ITR作为用于鉴定DSB的标签，我们相信ITR-Seq方法捕获到真的脱靶，这是因为先前通过Guide-Seq和扩增子测序鉴定出若干位点。此外，通过ITR-Seq鉴定的序列与预期靶序列类似。因此，ITR-Seq可鉴定先前未通过Guide-Seq与后续扩增子测序的组合方法检测到的新颖脱靶。

与Guide-Seq对比，ITR-Seq不是用于预测脱靶的工具。实际上，ITR-Seq鉴定基因组中发生靶向和脱靶核酸酶活性的新颖位点。实际上，此方法直接从用表达核酸酶的AAV处理的动物的DNA样品中鉴定出AAV ITR整合位点。所鉴定的脱靶可进一步使用扩增子测序进行分析以1)准确地测定编辑和ITR整合的百分比；和2)获得临床相关剂量和动物模型中核酸酶活性的详细全景。

评估ITR-Seq测定作为用于鉴定小鼠中的向导RNA依赖性核酸酶脱靶位点的工具

我们测试了ITR-Seq是否可检测出常用于临床前研究中的多种向导RNA依赖性核酸酶(即SaCas9、LbCpf1和AsCpf1)的靶向和脱靶活性。我们也想评估ITR-Seq分析是否与由这些核酸酶形成的相异类型的DSB末端(SaCas9的钝端和Cpf1的5'突出端)兼容。

向初生C57BL6/J小鼠共施用呈3×10¹¹GC/小鼠的剂量的表达SaCas9、LbCpf1或AsCpf1核酸酶的载体以及呈2×10¹²GC/小鼠的剂量的表达对应向导RNA的载体(sgRNA，表2)。在载体施用后第21天将小鼠安乐死。采集肝脏且提取DNA以进行ITR-Seq分析，以便评估核酸酶介导的DNA裂解位点的频率和位置。向额外组的初生小鼠共施用呈10¹¹或3×10¹¹GC/小鼠的剂量的表达如上SaCas9或LbCpf1的载体。第二载体以1×10¹²GC/小鼠的剂量表达sgRNA和hFIX转基因(而非用于第一实验中的供体DNA序列)。我们的目标是评估载体剂量对ITR整合的影响。在载体施用后第70天将这些小鼠安乐死。随后对来自肝脏的DNA样品进行ITR-Seq分析(下表)。

除用AsCpf1-sgRNA2处理的一只动物以外，中靶基因座(mASS1)是在ITR-Seq分析中具有最高读数数量的靶标。另外，所有所评估的sgRNA引导的核酸酶对具有最多33％的中靶插入缺失百分比的靶向基因座展现高特异性(表2)。重要的是，在所有处理的样品中，用AAV8-SaCas9处理的小鼠展现最高频率的中靶ITR整合事件(下表2)。尽管展现相当的中靶编辑，但对比AAV8-SaCas9，我们在用AAV8-LbCpf1处理的肝脏中观测到更低的中靶ITR整合事件。AAV8-AsCpf1在中靶基因座处具有极低编辑效率，其中最大插入缺失百分比为1.22％，如通过靶向扩增子测序所评估(下表2)。

CRISPR核酸酶的所有ITR-Seq鉴定的脱靶位点都驻留在所标注的小鼠基因内，其中最常见位点是中靶基因座(数据未显示)。我们鉴定出所测试sgRNA的一些低频脱靶，其中大多数与靶序列具有较低同源性。针对AAV8-SaCas9 sgRNA鉴定的脱靶位点位于已知癌基因NOTCH2的基因座内(数据未显示)。重要的是，此脱靶发现于施用呈3×10¹¹GC/小鼠的剂量的AAV8-SaCas9和呈2×10¹²GC/小鼠的剂量的AAV-sgRNA1的小鼠中。然而，此脱靶在施用10¹²GC/小鼠的AAV-sgRNA(低两倍的剂量)后不存在。我们需要较高剂量的AAV8-sgRNA1来观测此低丰度脱靶处的编辑(表2)。AAV ITR整合的速率可受以下影响：1)靶序列之间的同源性；或2)归因于核酸酶切割的DNA末端的钝端或突出端性质。我们未来需要进行详细研究来彻底了解ITR整合的动力学。

分析小鼠和非人类灵长类动物中的核酸酶非依赖性事件

在用表达CRISPR相关核酸酶和sgRNA的AAV8注射的小鼠当中，ITR整合发生于由sgRNA靶向的基因座中。有趣的是，ITR整合也以貌似sgRNA非依赖性的方式发生，这是因为我们在不存在功能性sgRNA的对照样品中观测到AAV ITR整合。在小鼠中，最常见的核酸酶非依赖性ITR整合事件发生在Gm10800和白蛋白基因中。白蛋白基因中的ITR整合与前述报道一致，这显示白蛋白基因对AAV整合非常敏感³⁷。已报道在肝脏中具有转录活性的基因的AAV整合³⁸。

为了评估非人类灵长类动物中的核酸酶非依赖性ITR整合的频率和范围，我们评估施用呈3×10¹²GC/kg的剂量的AAV-eGFP的恒河猕猴的肝脏DNA。我们检测到核酸酶非依赖性整合事件(但并不在所鉴定的基因中)作为阳性ITR插入。重要的是，我们的方法似乎仅鉴定出归因于活体内事件的整合ITR序列。我们已基于以下发现得出此结论：分析从未处理的恒河猕猴的PBMC中分离的DNA外加AAV.eGFP DNA并未产生脱靶的鉴定(数据未显示)。

虽然所观测ITR整合是核酸酶诱导的DSB的结果，但其它研究人员已显示，由限制酶、药物或γ辐射诱导的DSB也可以在这些断裂点处产生AAV-ITR插入¹⁶。不仅对于基因组编辑，而且对于基因疗法研究，鉴定和表征核酸酶非依赖性AAV整合位点对形成更完整的AAV安全概况尤其重要。

如BLISS⁶、BLESS^39、40和End-Seq⁷的替代方法可通过捕获由核酸酶的活性形成的DSB末端来鉴定DSB的位点。这些方法可准确鉴定活体内核酸酶诱导的DSB。然而，这些方法具有其仅可捕获存在于单一时间点处的DSB的限制。此限制可部分通过分析多个时间点处的DSB来克服。与NGS耦合的非限制性LAM-PCR⁴¹(一种与ITR-Seq类似的方法)可检测AAV-ITR整合位点。在此技术中，首先使用ITR特异性生物素化引物来进行线性扩增。此单链DNA通过抗生蛋白链菌素珠粒分离且接合到已知衔接子。使用二级LTR特异性和衔接子特异性引物，人们可以对LTR整合的区域进行扩增、测序和鉴定⁴¹。此方法用于鉴定AAV1-LPLS447X载体的整合位点，其经研发以用于治疗小鼠和人类DNA样品的脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)³⁴。尽管在理论上，nrLAM-PCR可检测核酸酶的脱靶活性，但研究人员尚未进行ITR-Seq与nrLAM-PCR的直接比较来理解这两种技术的优点和限制。

结论

总之，我们已研发出NGS测定来评估任何表达AAV的核酸酶的活体内特异性。ITR-Seq测定可用于在基因编辑研究中鉴定活体内AAV插入位点。如果需要基因座特异性分析，如计算所鉴定脱靶区中的插入缺失百分比或表征整合的ITR序列，那么推荐深度测序分析。然而，重要的是牢记通过ITR-Seq对ITR整合事件进行检测比其它基于NGS的方法(如AMP-Seq)更灵敏。

鉴于仅需要使用AAV作为递送载体，ITR-Seq可用于测量具有所标注参考基因组的几乎任何生物中的核酸酶的特异性。ITR-Seq可用作临床前和临床研究中的伴随诊断，以在具有不同剂量和/或施用途径的纵向动物研究中评估核酸酶靶位点。此技术可对基因编辑疗法的安全性和效力中产生宝贵的见解，且最终更好地了解基因编辑疗法的设计。

此相同方法可评估传统AAV基因疗法研究中的AAV整合事件。虽然来自AAV基因疗法的插入诱变的风险被视为较低^8、42，但将其用于治疗罕见的致残性和致死性疾病是合理的，随着所述领域演变到治疗不太严重的获得性疾病时，这些潜在风险可能更相关。

以下文献列表对应于实例3中的文献。

实例4-AAV.PCSK9自失活载体

图10A至10B显示其中将靶序列或突变靶序列插入酶编码序列中的实施例。图10A是氨基酸比对，显示10个氨基酸核定位信号(NLS)，随后是由靶序列表达的蛋白质(氨基酸10至20，随后是核酸酶的活性部分。第一氨基酸序列M2PCSK9显示具有其NLS的参考大范围核酸酶的片段、提到其它构建体将在何处具有插入的空间和在位置18处开始的核酸酶的序列。M2PCSK9[反向靶标#1]显示当靶序列插入NLS与酶之间的反义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[靶标#1]显示当靶序列插入NLS与酶之间的有义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[靶标#2]显示当不同靶序列插入NLS与酶之间的有义链上时编码的蛋白质。M2PCSK9[反向靶标#2]显示当(突变)靶序列插入NLS与酶之间的反义链上时编码的蛋白质。[靶标]M2PCSK9显示当22bp靶序列替换NLS之后的编码序列，从而使得酶的六个氨基酸被取代时编码的蛋白质。[反向靶标]M2PCSK9显示当22bp靶序列替换相反链上的NLS之后的编码序列，从而使得酶的七个氨基酸被替换时编码的蛋白质。图10B显示具有单一蛋白质降解信号(降解决定子)(其为泛素非依赖性的(AR-6))的PCSK9大范围核酸酶融合蛋白以及具有两个蛋白质降解信号AR-6和PEST的PCSK9大范围核酸酶融合蛋白的设计。

本说明书中所引用的所有文献通过引用并入本文中，正如特此提交的序列表的序列和文本通过引用并入一样。虽然已经参照特定实施例描述了本发明，但将了解，可以在不脱离本发明的精神的情况下进行修改。此类修改意图在所附权利要求的范围内。

序列表特征：

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