JP2019511453A - 生体分子の溶液を処理するための方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明の第1の態様の特定の実施形態では、TFFデバイスからの保持液は少なくとも2つの液体を混合するための第2の手段と流体連通している。他の実施形態では、多重入口流量制御器の多重入口の1つはTFFデバイスからの保持液と流体連通しており、TFFデバイスは任意選択で少なくとも2つの液体を混合するための第2の手段からの出口によって供給される。いずれの実施形態も、混合のための第2の手段は混合のための第1の手段とは異なった種類でもよく、同じ種類でもよい。
多くの実施形態では、使用されるそれぞれのTFFデバイスは単一流路モードで構成され、保持液は再循環されない。
多重入口流量制御器を含む混合のための手段には、好ましくは流量制御器を通る液体の流れを調節する2つ以上の可変流量、好ましくは間欠流量入口弁が含まれる。
a)i)生体分子を含む第1の液体培地のための第1の入口、
ii)第2の液体培地のための少なくとも第2の入口
iii)タンジェンシャルフロー濾過デバイス(TFFデバイス)と流体連通した出口
を含む多重入口流量制御器、および
b)流量制御器とタンジェンシャルフロー濾過デバイスとを通した液体の流れを付与するための手段
を含む装置が提供される。
可変流量弁は、液体が流れることができるままである第1の比較的低い流量と、少なくとも第2のより高い流量との間で流れを調節することができる。好ましい実施形態では、可変流量弁は間欠流量弁であり、第1の位置では流れを阻止するが、少なくとも第2の位置では流れを許容する。最も好ましくは、全ての弁が間欠流量弁である。
本発明において使用される液体は、精製法(例えばクロマトグラフィーカラム、従来のTFFステップ、濾過および清澄化ステップ、遠心分離上清/遠心分離液またはスラリー、コンディショニング/希釈ステップ)からの溶出液、バイオリアクターおよび発酵槽からの産出物、および細胞破壊プロセスからの産出物であってよい。
pDNAは、スーパーコイル、直鎖状および開環状(すなわち、ニックの入ったまたはほどかれた)アイソフォームなどの複数の形態の1つまたは複数であってよい。スーパーコイルpDNAアイソフォームは、共有結合で閉環した形態を有しており、そのpDNAは、宿主酵素系の作用により、宿主細胞中で負のスーパーコイルとなっている。開環状アイソフォームでは、pDNA二重鎖のうちの1本の鎖が1つまたは複数の箇所で切断されている。
天然に存在する抗体は、典型的には4つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互に連結された2つの同一の重(H)鎖および2つの同一の軽(L)鎖を含む。各重鎖は可変領域(VH)および定常領域(CH)を含み、CH領域はその天然型において3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、可変領域(VL)および1つのドメインを含む定常領域CLを含む。
目標の生体分子に加えて、生体分子を含む液体の他の成分は、緩衝塩を含む塩、培地および供給液成分、溶媒、一般的には水、プロピレングリコールおよびソルビトール等のC1−6ポリオール等の共溶媒、イオン性液体、双性イオン界面活性剤(zwittergen)、界面活性剤、イミダゾールまたは他の競合的リガンド結合剤、アミノ酸、尿素等のカオトロピック剤、還元剤、酸化剤、PEG化コンジュゲーション反応物(基質、副生成物および活性化剤)、糖、脂質、核酸、代謝産物および小さいポリペプチドを含んでもよい。第1の生体分子を含む液体に混合される液体は目標の生体分子を含まず、多くの実施形態ではタンパク質および核酸を含まない。生体分子を含む液体に混合される液体の成分には一般に、緩衝塩を含む塩、培地および供給成分、溶媒、一般的には水、プロピレングリコールおよびソルビトール等のC1−6ポリオール等の共溶媒、イオン性液体、双性イオン界面活性剤、界面活性剤、イミダゾールまたは他の競合的リガンド結合剤、アミノ酸、尿素等のカオトロピック剤、還元剤、酸化剤および糖が含まれる。
DV 透析用量
mPES 変性ポリエチレンスルホン
rhラクトフェリン 組換えヒトラクトフェリン
TFF タンジェンシャルフロー濾過
タンパク質モデル:
pH7.5で50mMのリン酸ナトリウム中、初期濃度1mg/mLの精製されたrhラクトフェリンを実験研究に使用した。
緩衝液(A)50mMリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、pH7.0
緩衝液(B)50mMリン酸ナトリウム、pH7.5
緩衝液(C)50mMリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、10%ソルビトール、pH7.0
緩衝液(D)50mMリン酸ナトリウム、0.1M NaCl、10%ソルビトール、6%プロパン−1,2−ジオール、pH7.0
実施例1
GE Healthcare社のAKTATM ExplorerシステムのB1ポンプで25%勾配のrhラクトフェリンを使用し、A1ポンプ(75%)で15mL/分の一定流量で緩衝液(A)を供給することによって、少なくとも400mLのpH7.5の1mg/mLのrhラクトフェリンのストック液を緩衝液(A)で4倍体積に希釈した。次いで希釈したrhラクトフェリンをAKTATM Explorer V2弁の位置2を通してダウンフローモードで、表面積370cm2、長さ65cm、10kDa mPES Spectrum Labs MidiKrosTM中空繊維に流した。次に中空繊維の保持液ラインは下流の多重入口可変流量制御器に直接連結した。多重入口可変流量制御器は、内径2mmの孔を有する単一の出口を備える特製の(Gemu)プラスチック製2弁マニフォールドを含み、マニフォールドを通る液体の流れを制御するRaspberry Piミニコンピューターに制御される高速作動ソレノイドアクチュエーターを有している。マニフォールドは弁から出口まで同じ流路体積を有するように構成されている。多重入口可変流量制御器のサイクルタイムを2秒に設定し、保持液制御弁をサイクルの25%は開いているようにして、rhラクトフェリン溶液の初期開始体積を得るために必要な4倍の体積濃縮係数が得られるようにした。緩衝液(B)による中空繊維保持液の第2の4倍希釈が可能になるように、第1の弁が閉じているときには多重入口流量制御器の第2の弁の位置がサイクルの75%は開いているようにした。多重入口可変流量制御器からの出口は長さ10cm、直径5mmのスタティックミキサーを通り、その後でAKTATM Explorerの弁V3、位置2に戻り、電導度、pHおよび280nmの吸光度のデータが得られた。AKTATM Explorerの弁V4からのF8出口ラインを、これも15mL/分で運転される第2のGE Healthcare社のAKTATM ExplorerシステムのA1ポンプのA11供給ラインに連結した。次いでこのシステムを、これも位置2にあるAKTATM Explorerカラムの弁V2を通して、表面積370cm2、長さ65cm、10kDa mPES Spectrum Labs MidiKrosTMの第2の中空繊維に連結した。中空繊維の保持液は、第2の内径10mmの多重入口可変流量制御器に直接供給した。この弁は10秒のサイクルタイムを使用し、保持液制御弁をサイクルの4%は開いているようにして、rhラクトフェリン溶液の初期開始体積を再び得るために体積濃縮係数を4倍とした。多重入口可変流量制御器からの出口は長さ10cm、直径5mmの第2のスタティックミキサーを通り、その後でAKTATM Explorerの弁V3、位置2に戻り、電導度、pHおよび280nmの吸光度のデータが得られた。インラインで緩衝液が交換されたrhラクトフェリン溶液を、AKTATM Explorerの弁V4の出口ラインF8を通して収集した。第1のAKTATM Explorerシステムのデータはインラインシステムを使用する迅速な緩衝液交換が成功したことを実証した一方、第2のAKTATM Explorerシステムの記録は供給液に比較してタンパク質濃度が保たれていたことを示した。
実施例1の方法を繰り返したが、表1に記載したように条件を変更して、緩衝液の交換を逆にすること、または緩衝液の粘度を変える緩衝液成分(10%ソルビトールおよび/または6%プロパン−1,2−ジオール)を加えることによる、操作時間および第1と第2の濃縮器の間の異なった濃度/希釈比に対する影響を検討した。実施例2および3では希釈剤として緩衝液(A)を使用し、実施例4では緩衝液(B)、実施例5、6および7では緩衝液(C)、実施例8では緩衝液(D)を使用した。
Claims (15)
- 生体分子を含む液体をインライン液体交換するための装置であって、多重入口流量制御器を含み、少なくとも2つの液体を混合するための2つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、混合のための手段を含み、前記混合のための手段は、単一流路モードで構成されたタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口をも含む、前記装置。
- 前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの保持液が、少なくとも2つの液体を混合するための第2の手段と流体連通しており、前記混合のための第2の手段は、単一流路モードで構成された第2のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口を含む、請求項1に記載の装置。
- 前記可変流量入口弁が間欠流量弁である、請求項1または2に記載の装置。
- 生体分子を含む液体を液体交換するための装置であって、
a)i)生体分子を含む第1の液体培地のための第1の入口、
ii)第2の液体培地のための少なくとも第2の入口
iii)タンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む多重入口流量制御器、および
b)前記流量制御器と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとを通した液体の流れを付与するための手段
を含む、前記装置。 - 前記流れを付与するための手段が、前記多重入口流量制御器の前記出口と前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスとの間に配置されたポンプを含む、請求項4に記載の装置。
- 前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスの下流にリストリクターをさらに含む、請求項4または5に記載の装置。
- i)前記タンジェンシャルフロー濾過デバイスからの前記保持液と流体連通した第1の入口、
ii)第3の液体培地のための第2の入口、および
iii)第2のタンジェンシャルフロー濾過デバイスと流体連通した出口
を含む第2の多重入口流量制御器をさらに含む、請求項4から6のいずれか一項に記載の装置。 - 前記第2の多重入口流量制御器がリストリクターとして機能する、請求項7に記載の装置。
- 前記第2の多重入口流量制御器が2つ以上の可変流量入口弁をさらに含む、請求項7または8に記載の装置。
- 生体分子を調製するための方法であって、請求項1から9のいずれか一項に記載の装置を使用する液体交換によって前記生体分子を含む液体培地を処理することを含む、前記方法。
- 前記可変流量入口弁が、液体が流れることができるままであるかまたは流れが阻止される第1の比較的低い流量と、少なくとも第2のより高い流量とを達成する位置の間でサイクリングされる、請求項10に記載の方法。
- 少なくとも10サイクルが使用される、請求項11に記載の方法。
- サイクル周波数が100Hz未満、好ましくは0.05〜0.5Hzである、請求項11または12に記載の方法。
- 前記処理することが緩衝液交換を含む、請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項10から14のいずれか一項に記載の方法を含む、生体分子の産生のためのプロセス。
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