CN108883368A - 用于处理生物分子的溶液的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于对含生物分子的液体进行管线内液体交换的仪器。所述仪器包括用于混合至少两种液体的装置(3)，所述装置(3)包括多入口流量控制器(2)，用于混合的所述装置还包括与以单程模式构造的切向流过滤设备(1)流体连接的出口。

Description

用于处理生物分子的溶液的方法
本发明涉及一种用于处理生物分子、尤其是重组多肽和核酸的溶液的方法，以及用于实施这种方法的仪器。
多种生物分子，尤其是重组多肽和核酸、诸如质粒(pDNA)，已特别地在治疗性应用上引起了许多关注。这类生物分子一般是通过培养已被工程化以表达期望生物分子的重组宿主细胞来产生的。然后通过通常包括离心、过滤和层析纯化的方法从培养基中回收生物分子。生物分子的回收一般包括调整生物分子所溶解或悬浮于其中的液体介质的性质和特性。这种调整可促进生物分子从杂质中纯化和/或将生物分子配制成可例如被存储等待使用或最终转化成备用制剂的介质。这种调整一般包括将通常为缓冲液的一种液体介质用另一种液体介质替换，并且可涉及或可不涉及体积的变化，在任一情况下潜在地还涉及生物分子浓度的变化。
常规液体交换涉及使包含生物分子的初始介质通过具有适当大小的截留分子量多孔过滤器的切向流过滤设备，截留经选择以使得生物分子保留在滞留物中，但介质的更小组分的一部分，例如缓冲液、溶剂和分子量小于截留的溶质通过过滤器至透过物中。滞留物再循环至收集槽，在该处滞留物与替换物混合，并且继续再循环过程直至包含生物分子的介质具有期望的组成。这种方法的缺点在于，随着生物分子制造的规模增大，因此所需要液体的体积以及存储和混合槽的规模增加至设备的大小和/或成本被限制的程度。作为替代方案，可采用透析，其中将具有所需截留分子量的多孔袋存储于大体积的替换液体介质中，但此举有类似的缺点。
常规方法的其他缺点在于，所述方法相对较慢，并因此使生物分子的处理减缓。另外，由于生物分子随着处理进行重复地通过泵压头并在宽范围的溶质和缓冲液浓度上经受剪切力，可能出现生物分子不稳定性和/或不溶解性，诸如聚集和变性。
根据本发明的第一方面，提供用于对含生物分子的液体进行管线内液体交换的仪器，所述仪器包括用于混合的装置，所述装置包括多入口流量控制器，进一步包括用于混合至少两种液体的两个或更多个可变流量入口阀，流量控制器还包括与以单程模式构造的切向流过滤设备(TFF设备)流体连接的出口。
用于混合的装置优选直接附接至TFF设备，即两者间不并入中间处理阶段。
在本发明的第一方面的某些实施方案中，来自TFF设备的滞留物与用于混合至少两种液体的第二装置流体连接。在其他实施方案中，多入口流量控制器中多个入口中的一个与来自TFF设备的滞留物流体连接，TFF设备任选地由来自用于混合至少两种液体的第二装置的出口供应。在任一实施方案中，用于混合的第二装置可与用于混合的第一装置属于不同的类型，或可为相同类型。
在本发明的第一方面的另外的实施方案中，用于混合的第二装置包括与第二TFF设备流体连接的出口。第二TFF设备可与第一TFF设备属于不同的类型，但在许多实施方案中，第一和第二TFF设备属于相同类型。
在本发明的第一方面的又另外的实施方案中，来自第二TFF设备的滞留物与用于混合至少两种液体的第三装置流体连接。用于混合的第三装置可与用于混合的第一和第二装置属于不同的类型，或者可与任一者或两者相同。用于混合的第三装置可包括与第三TFF设备流体连接的出口。第三TFF设备可与第一和第二TFF设备属于不同的类型，但在许多实施方案中，第一、第二和第三TFF设备属于相同类型。
将意识到还可并入用于混合至少两种液体、任选地具有与TFF设备流体连接的出口的另外的装置。
在许多实施方案中，所采用的每个TFF设备以单程模式构造，其中滞留物均未再循环。
在某些实施方案中，仪器包括用于使滞留物经受再循环切向流过滤步骤的装置。这种装置可包括收集容器和构造以再循环模式运行的单独的TFF设备。在一些实施方案中，采用具有构造以再循环模式运行的单独的TFF设备的两个或更多个收集容器。在一些实施方案中，提供装置以使得在根据本发明的仪器中采用的TFF设备中的一个或更多个能够以再循环切向流过滤模式运行，作为单程模式的替代方案。这种再循环切向流过滤步骤可能在限定分立批次上有利，这在所生产的产品经受诸如cGMP的严格监管要求时可能有利。
当采用两个或更多个TFF设备时，每个TFF设备优选串联定位。
包括多入口流量控制器的用于混合的装置优选包括两个或更多个可变流量、优选间歇流量入口阀，所述入口阀调控液体通过流量控制器的流量。
可采用的用于混合的第二和另外的装置包括管线内混合器，包括两个管之间的简单汇合，其中所述管可具有相同或不同的直径。用于混合的装置可包括折流或涡流混合器。每个管可装配有用于赋予流动的装置，诸如泵。用于赋予流动的装置可结合管的尺寸而可操作的，以使得可实现至少两种液体的不同流速。在许多实施方案中，用于混合的第二和后续装置包括多入口流量控制器，并且优选包括两个或更多个可变流量、优选间歇流量入口阀，所述入口阀调控液体通过流量控制器的流量。
根据本发明的第二方面，提供用于对含生物分子的液体进行液体交换的仪器，所述仪器包括：
a)多入口流量控制器，其包括：
i)用于包含生物分子的第一液体介质的第一入口；
ii)用于第二液体介质的至少一第二入口；
iii)与切向流过滤设备(TFF设备)流体连接的出口；以及
b)用于赋予液体流动通过流量控制器和切向流过滤设备的装置。
用于赋予液体流动的装置是本领域众所周知的，并且包括对液体施加气体压力，尤其是惰性气体，诸如氮气或氦气。优选用于赋予液体流动的装置是泵。可采用的泵包括蠕动泵、隔膜泵、凸轮泵和离心泵。可采用一次性和回用性泵设计。当采用泵时，在多个优选实施方案中，泵位于多入口流量控制器的出口与TFF设备之间。可采用两个或更多个泵，所述泵可以相同或不同的流速运行。在某些实施方案中，由每个泵实现的相同流速可通过物理上连接泵压头并使用相同管内径，或通过经由外部控制使泵同步以输送相同流速来实现。
可在仪器中采用的TFF设备是本领域众所周知的(参见例如Filtration in theBiopharmaceutical Industry，T.H. Meltzer和M.W. Jornitz编，1998年)，并且包括平片材、中空纤维和环形缠绕设备。优选地，TFF设备是中空纤维过滤设备。
TFF设备经选择以具有对生物分子的性质适当的截留，以使得生物分子不通过屏障，而液体的更小组分可通过屏障至透过物中。
多入口流量控制器包括两个或更多个可变流量、优选间歇流量入口阀，所述入口阀调控液体流动通过流量控制器。多入口流量控制器包括至少2个入口阀，并且在多种情况下包括至最多8个，诸如3个、4个、5个、6个或7个入口阀。入口阀可各自具有相同的尺寸，或者入口阀中的一个或更多个可具有不同的尺寸。在某些优选实施方案中，从每个入口阀至流量控制器的出口测得的体积对于每个入口是相同的，并且高度优选的是，从每个入口阀至流量控制器的出口测得的体积和路径长度对于每个入口是相同的。
在本发明中采用的流量控制器还包括至少一个出口，并且当可存在两个或更多个出口时，优选采用单一出口。
可变流量阀可调控在其中液体保持能够流动的相对低的第一流速与至少一更高的第二流速之间的流动。在优选实施方案中，可变流量阀是间歇流量阀，其阻止在第一位置中流动，但容许在至少一第二位置中流动。最优选地，所有阀都是间歇流量阀。
优选可变流量阀是受控的，最优选受可编程控制单元控制，以调控阀的打开和关闭，以便实现流过多入口流量控制器的输入液体的所需相对量。这优选通过循环实现，利用预定时间段或循环速率，通过流量控制器中的入口阀，并且根据循环时间的所需比例调控阀的打开或关闭以产生期望的组成。循环速率可恒定或有所变化。最优选地，采用间歇流量入口阀，并且是受控的以使得在运行中任何给定时间仅一个阀是打开的。在许多实施方案中，多入口流量控制器的循环速率维持为恒值，并且输入液体的期望相对量保持一致。
在许多实施方案中，采用多个循环。采用的循环数将取决于众多因素，诸如过程的持续期、被浓缩液体的体积、流速、仪器的最大运行压力、TFF设备的长度和/或面积以及TFF设备的截留分子量。在某些实施方案中，可采用至少10个循环，诸如至少50个、100个、500个、750个、1000个、1500个、2000个、3000个、5000个、7500个、10000个或更多个循环。
将意识到可采用一定范围的循环频率。在多种情况下，频率低于100 Hz，通常低于50 Hz，一般低于10 Hz，并优选低于5 Hz。在某些优选实施方案中，频率是2 Hz或更低，最优选1 Hz或更低，诸如0.05至0.5 Hz。
在TFF设备的运行期间，常见的是包含生物分子的凝胶层在过滤器表面的滞留侧上形成。通常通过在运行结束时包括冲洗来从TFF设备去除这种凝胶层，并且这种冲洗步骤可在本发明的方法中采用。在运行结束时的冲洗步骤可导致生物分子浓度的显著峰值，并且因此可导致高于预期的生物分子浓度。在本发明的某些实施方案中，在整个过程期间每隔一段时间包括冲洗阶段。冲洗阶段可包括延长在较低压力下液体通过TFF设备的时段，并且可另外包括阻止透过物流动以使得所有流量通至滞留物，诸如通过关闭透过物管线上的阀，优选持续冲洗的持续期。冲洗阶段的持续期往往经选择以实现大致上所有凝胶层转移至滞留物中。在运行结束时的冲洗阶段可包括通过至最多五个TFF设备体积。在过程中每隔一段时间所包括的冲洗阶段可包括通过较低的TFF设备体积，诸如0.25、0.5、0.75或1个TFF设备体积。在一些实施方案中，在运行循环以通过1个TFF设备体积、2个TFF设备体积、5个TFF设备体积、10个TFF设备体积或更多之后采用冲洗阶段，接着返回运行循环。在其中在浓缩过程中每隔一段时间并入一个或更多个冲洗阶段的许多实施方案中，冲洗阶段伴随着阻止透过物流动，诸如通过关闭透过物管线上的阀，优选持续冲洗的持续期。
仪器一般包括在TFF设备下游的限流器，诸如限流孔板或管夹阀。限流器构造用以提供流量限制并因此提供背压以使得具有小于TFF设备的截留分子量的分子量的液体和溶质通过膜至透过物中。优选地，限流器包括管夹阀，所述管夹阀根据本发明的一个方面可为可控制的。在某些实施方案中，限流器包括第二多入口流量控制器，优选包括可变流量阀。在一些实施方案中，限流器包括在TFF设备下游的泵，所述泵构造用以在比进入TFF设备的流速更低的流速下运行，进而产生背压。
当限流器包括了包括可变流量阀的第二多入口流量控制器时，优选采用循环。可如上文对包括可变流量阀的第一多入口流量控制器所描述的采用循环时间和频率。
根据本发明的第二方面的仪器任选地包括管线内混合器，所述混合器可位于阀与浓缩器之间，并且优选位于阀与泵之间。管线内混合器的实例是本领域众所周知的。优选的管线内混合器是静态混合器，诸如折流混合器和涡流混合器。混合器的尺寸优选经选择以使得输入液体在进入TFF设备之前被充分混合。
将意识到通过流量控制器的液体的组合稀释了第一液体中生物分子的浓度。这种稀释的程度受通过入口的液体的相对体积控制，并且这又受入口的相对尺寸和/或入口保持在其较高流速和其较低流速下的相对时间控制。通过混合液体实现的生物分子稀释可通过使组合液体通过TFF设备至少部分补偿(off-set)，并且可完全补偿，或甚至不只是补偿。仪器可被构造以使得作为滞留物通过TFF设备的组合液体的相对部分大于、等于或小于通过而进入透过物的部分。当通入透过物中的液体的体积与作为滞留物通过的体积之比等于组合的第二和另外的液体的体积与包含生物分子的第一液体的体积之比时，滞留物中生物分子的浓度将与第一液体中的初始浓度相同。将透过物与滞留物的体积比增加至高于第二和另外的液体与第一液体的体积比将相对于第一液体中的浓度升高滞留物中生物分子的浓度，而将透过物与滞留物的体积比减少至低于第二和另外的液体与第一液体的体积比将相对于第一液体中的浓度降低生物分子的浓度。例如，在通过使用1:9比率的第一与第二液体来用第二液体将包含生物分子的第一液体稀释10倍，并且然后透过物与滞留物的体积比为9:1的情况下，生物分子回到其原始浓度，其中实现了第一液体的90%清除率[(10-1)/10×100]。在第二步交换中重复这一过程将给出第一液体的99%清除率[9((10×10)-1)]/(10×10)×100]但保持原始生物分子浓度。然而，如果浓缩器上透过物与滞留物的体积比为19:1并且稀释保持在1:9，则通过第一步骤生物分子的浓度将升高两倍，具有相同的第一液体的90%清除率，以及通过第二步骤升高四倍，具有相同的第一液体的99%清除率；而如果浓缩器上透过物与滞留物的体积比为4:1并且稀释保持在1:9，则通过第一步骤生物分子的浓度将降低两倍，具有相同的第一液体的90%清除率，以及通过第二步骤降低四倍，具有相同的第一液体的99%清除率。
在许多实施方案中，第一液体与第二和流过流量控制器的后续液体的体积比通过控制调控相关液体流量的可控间歇流量阀的打开时间来控制。优选位于流量控制器下游的泵控制通过流量控制器的流速，并且其中阀至出口的流动路径具有相等的体积，相对体积受阀的打开时间支配。在所有其他条件相等的情况下，第一液体阀相对于其他阀打开的时间越少，则第二和另外的液体的交换越高。
在某些实施方案中，优选根据本发明构造的第二TFF设备位于第一TFF设备的下游。在许多这类情况下，用于第二TFF设备的多入口流量控制器充当用于第一TFF设备的限流器。优选根据本发明构造的其他TFF设备可位于第二TFF设备的下游。当采用根据本发明构造的第二或其他TFF设备时，多入口流量控制器的入口与来自上游TFF设备的滞留物流体连接，优选直接连接。对于根据本发明构造的第二或其他TFF设备而言，用于对应第二液体介质的入口可包括用于与第一TFF设备相同的液体介质的入口，或可包括用于不同液体介质的入口。
可采用根据本发明的仪器来调节生物分子的溶液或悬浮液、例如进料流，诸如改变电导率和/或pH、缓冲液交换，改变组成溶质，和改变体积，以改变且优选减少下游单元运行的处理时间、例如层析上样时间。在某些情况下，根据本发明的仪器可用于多肽的重折叠，或用于pDNA提取。
使用根据本发明的仪器，可在不需要使滞留物再循环的情况下实现液体交换。
在本发明中采用的液体可为来自纯化方法(例如层析柱、常规TFF步骤、过滤和澄清步骤、离心上清液/离心分离液(centrate)或浆液、调节/稀释步骤)的洗脱液，来自生物反应器和发酵罐的输出，和来自细胞破碎过程的输出。
通过本发明的仪器和方法生产的液体可“照原样”使用而无需进一步处理，或可经受更进一步的处理步骤中的一种，诸如纯化或处理步骤，例如层析步骤，诸如亲和层析、阴离子和/或阳离子交换层析、疏水作用层析、尺寸排阻层析、亲和层析；和/或进一步过滤、澄清、调节、稀释或其他配制步骤。
根据本发明的仪器可用于浓缩包含生物分子的液体，所述生物分子例如pDNA、包涵体，特别是包含多肽和尤其是重组多肽的包涵体。
pDNA可呈多种形式中的一种或更多种，诸如超螺旋、线性和开环(即，带切口或松弛的)同种型。超螺旋pDNA同种型具有共价闭环形式，并且通过宿主酶体系的作用pDNA在宿主细胞中为负超螺旋的。在开环同种型中，pDNA双链体的一条链在一个或更多个位置处断裂。
用于产生pDNA的方法是本领域众所周知的。pDNA可为天然或人工的，例如，携带外源DNA插入片段的克隆载体。在许多实施方案中，pDNA处于1千碱基至50千碱基的大小范围内。例如，编码表达的干扰RNA的pDNA通常处于3千碱基至4千碱基的大小范围内。
多肽、尤其是重组多肽包括治疗性蛋白和肽，包括细胞因子，生长因子，抗体，抗体片段，免疫球蛋白样多肽，酶，疫苗，肽激素，趋化因子，受体，受体片段，激酶，磷酸酶，异构酶，水解酶，转录因子和融合多肽。
抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体和具有生物活性的抗体片段，包括前述任何者的多价和/或多特异性形式。
天然存在的抗体通常包含四条多肽链——由二硫键互连的两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链。每条重链包含可变区(VH)和恒定区(CH)，CH区在其天然形式中包含三个结构域——CH1、CH2和CH3。每条轻链包含可变区(VL)和包含一个结构域的恒定区CL。
VH和VL区可进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，与称为框架区(FR)的的更保守区域相交替。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
可表达的抗体片段包含完整抗体的一部分，所述部分具有期望的生物活性。抗体片段通常包括至少一个抗原结合位点。抗体片段的实例包括：(i)具有VL、CL、VH和CH1结构域的Fab片段；(ii) Fab衍生物，诸如在CH1结构域的C末端具有一个或更多个半胱氨酸残基的Fab'片段，其可通过两个Fab衍生物之间的二硫键桥接形成二价片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv) Fd衍生物，诸如在CH1结构域的C末端具有一个或更多个半胱氨酸残基的Fd衍生物；(v)具有抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vi)单链抗体分子，诸如其中VL和VH结构域共价连接的单链Fv (scFv)抗体；(vii)连接至具有或不具有恒定区结构域的另一个可变结构域(VH或VL结构域多肽)的不具有恒定区结构域的VH或VL结构域多肽(例如，VH-VH、VH-VL或VL-VL)，(viii) 结构域抗体片段，诸如由VH结构域或VL结构域组成的片段，和VH或VL结构域的抗原结合片段，诸如分离的CDR区；(ix)包含两个抗原结合位点的所谓的“双价抗体(diabodies)”，例如在相同多肽链中连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；以及(x)包含一对串联Fd区段的所谓的线性抗体，所述区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。
包涵体包括在诸如大肠杆菌(E. coli)的细菌细胞的细胞质中形成的不溶性聚集体，最常见地包含多肽和尤其是重组多肽。
除靶标生物分子以外，含生物分子的液体的其他组分可包括盐、包括缓冲盐，培养基和进料组分，溶剂、一般是水，共溶剂、诸如C1-6多元醇、诸如丙二醇和山梨醇，离子液体，两性洗涤剂(zwittergen)，表面活性剂，咪唑或其他竞争性配体结合剂，氨基酸，离液剂、诸如尿素，还原剂，氧化剂，聚乙二醇化共轭反应物(底物、副产物和活化剂)，糖，脂质，核酸，代谢物和小多肽。与含生物分子的第一液体混合的液体不含靶标生物分子，并且在许多实施方案中不含蛋白质和核酸。与含生物分子的液体混合的液体的组分一般包括盐、包括缓冲盐，培养基和进料组分，溶剂、一般是水，共溶剂、诸如C1-6多元醇、诸如丙二醇和山梨醇，离子液体，两性洗涤剂，表面活性剂，咪唑或其他竞争性配体结合剂，氨基酸，离液剂、诸如尿素，还原剂，氧化剂和糖。
根据本发明的仪器的一个实例示于图1中。TFF设备1位于多入口可变流量控制器2、静态混合器3和泵4的下游，泵4向TFF设备1供应液体进料。多入口可变流量控制器2控制包含生物分子的第一液体5和第二液体6进料至TFF设备1中。限流器7位于来自TFF设备1的滞留物管线上。在多入口可变流量控制器2中每个间歇流量阀在关闭和打开位置之间的循环导致生物分子稀释。在通过TFF设备1时，由泵4和限流器7的作用造成的压力使低于TFF设备1的截留分子量的液体的一部分通入透过物8中，从而导致滞留物9中生物分子的浓度升高。
根据本发明的仪器的另一个实例示于图2中。TFF设备10位于向TFF设备10供应液体进料的泵11的下游，且位于多入口可变流量控制器12、静态混合器13和第二泵14的上游。在通过TFF设备10时，由泵11和多入口可变流量控制器12的作用造成的压力使低于TFF设备10的截留分子量的液体的一部分通入透过物15中，从而导致进入多入口可变流量控制器12的生物分子的浓度升高。多入口可变流量控制器12中的间歇流量阀控制包含生物分子的第一液体16和第二液体17的进料。在多入口可变流量控制器12中每个间歇流量阀在关闭和打开位置之间的循环导致已浓缩生物分子通过第二泵14的作用而稀释，第二泵14位于来自TFF设备10的滞留物管线18上。在第二泵14的上游的静态混合器13确保滞留物18在组成上对于第二液体和生物分子是均匀的。
使用两个TFF设备的本发明的另一个实例示于图3中。第一TFF设备19位于第一多入口可变流量控制器20、静态混合器21和泵22的下游，泵22向第一TFF设备19供应液体进料。第二多入口可变流量控制器23位于来自第一TFF设备19的滞留物管线上的下游。第一多入口可变流量控制器20控制包含生物分子的第一液体24和第二液体25进料至TFF设备19中。在多入口可变流量控制器20中每个间歇流量阀在关闭和打开位置之间的循环导致生物分子稀释。在通过第一TFF设备19时，由泵22和第二多入口可变流量控制器23的作用造成的压力使低于第一TFF设备19的截留分子量的液体的一部分通入透过物26中，从而导致进入第二多入口可变流量控制器23的生物分子的浓度升高。多入口可变流量控制器23中的第二间歇流量阀控制来自第一TFF设备19的已浓缩生物分子和第三液体27的进料。在第二多入口可变流量控制器23中每个间歇流量阀在关闭和打开位置之间的循环导致已浓缩生物分子通过第二泵28的作用而稀释，第二泵28位于第二静态混合器29和第二多入口可变流量控制器23出口的下游。第二泵28向下游第二TFF设备30供应液体进料。限流器31位于来自该第二TFF设备30的滞留物管线上。在通过第二TFF设备30时，由第二泵28和限流器31的作用造成的压力使低于TFF设备30的截留分子量的液体的一部分通入透过物32中，从而导致滞留物33中生物分子的浓度升高。
使用两个TFF设备的本发明的又另一个实例示于图4中。第一TFF设备34位于两个进料泵35和36以及静态混合器37的下游，静态混合器37向第一TFF设备34供应液体进料。第一泵35控制包含生物分子的第一液体38进料、并且第二泵36控制第二液体39进料至第一TFF设备34中。两个泵35和36的作用导致生物分子稀释。多入口可变流量控制器40位于来自第一TFF设备34的滞留物管线上的下游。在通过第一TFF设备34时，由泵35和36以及多入口可变流量控制器40的作用造成的压力使低于第一TFF设备34的截留分子量的液体的一部分通入透过物41中，从而导致进入多入口可变流量控制器40的生物分子的浓度升高。多入口可变流量控制器40中的间歇流量阀控制来自第一TFF设备34的已浓缩生物分子和第三液体42的进料。在第二多入口可变流量控制器40中每个间歇流量阀在关闭和打开位置之间的循环导致已浓缩生物分子通过第三泵43的作用而稀释，第三泵43位于第二静态混合器44和多入口可变流量控制器40出口的下游。第三泵43向下游第二TFF设备45供应液体进料。限流器46位于来自该第二TFF设备45的滞留物管线上。在通过第二TFF设备45时，由第二泵43和限流器46的作用造成的压力使低于TFF设备45的截留分子量的液体的一部分通入透过物47中，从而导致滞留物48中生物分子的浓度升高。
通过以下实施例非限制性地说明本申请。
缩写
DV 透析体积
mPES 改性聚醚砜(Polyethylenesulfone)
rh乳铁蛋白 重组人乳铁蛋白
TFF 切向流过滤
蛋白质模型：
在实验研究中使用pH 7.5，于50 mM磷酸钠中的1 mg/mL初始浓度的纯化rh乳铁蛋白。
缓冲液(A) 50 mM磷酸钠，0.1 M NaCl，pH 7.0
缓冲液(B) 50 mM磷酸钠，pH 7.5
缓冲液(C) 50 mM磷酸钠，0.1 M NaCl，10%山梨醇，pH 7.0
缓冲液(D) 50 mM磷酸钠，0.1 M NaCl，10%山梨醇，6%丙-1,2-二醇，pH 7.0
实施例1
通过在GE Healthcare ÄKTATM Explorer系统的B1泵上使用25%梯度的rh乳铁蛋白，同时以15 mL/min的恒定流速使缓冲液(A)通过A1泵进料(75%)，用缓冲液(A)对至少400 mL的pH 7.5下1 mg/mL rh乳铁蛋白原料进行4倍体积稀释。然后以下流模式通过ÄKTATMExplorer V2阀上的位置2将稀释的rh乳铁蛋白引导至具有370 cm2表面积的65 cm长、10kDa mPES Spectrum Labs MidiKrosTM中空纤维中。中空纤维滞留物管线又直接连接至下游多入口可变流量控制器。多入口可变流量控制器由定制的(Gemü)具有2 mm内径的单一出口的塑料两阀歧管构成，具有在Raspberry Pi小型计算机控制下快速作用的螺线管致动器，其控制通过歧管的液体流量。歧管构造以具有从阀至出口相同的流动路径体积。多入口可变流量控制器的循环时间被设定至2秒，并且滞留物控制阀打开持续循环的25%以实现获得rh乳铁蛋白溶液的最初起始体积所需的4倍体积浓缩系数。多入口流量控制器上的第二阀位置在第一阀关闭时打开持续循环的75%，以允许用缓冲液(B)第二次4倍稀释中空纤维滞留物。多入口可变流量控制器的出口通过长度10 cm且直径5 mm的静态混合器，之后返回到ÄKTATM Explorer上的位置2的阀V3以收集电导率、pH和280 nm吸光度数据。ÄKTATMExplorer阀V4的F8出口管线连接至同样以15 mL/min运行的第二GE Healthcare ÄKTATMExplorer系统的A1泵的A11进料管线。该系统又通过ÄKTATM Explorer柱阀V2、再次在位置2上连接至具有370 cm2表面积的第二65 cm长、10 kDa mPES Spectrum Labs MidiKrosTM中空纤维。中空纤维的滞留物直接进料至第二10 mm内径大小的多入口可变流量控制器中。该阀使用10秒的循环时间，其中滞留物控制阀打开持续循环的4%以获得4倍体积浓缩系数，以便再一次获得rh乳铁蛋白溶液的最初起始体积。多入口可变流量控制器的出口被引导通过长度10 cm且直径5 mm的第二静态混合器，之后在阀V3、位置2上返回到ÄKTATM Explorer以收集电导率、pH和280 nm吸光度数据。通过ÄKTATM Explorer阀V4上的出口管线F8收集管线内缓冲液交换的rh乳铁蛋白溶液。来自第一ÄKTATM Explorer系统的数据展示出使用管线内系统成功快速的缓冲液交换，而来自第二ÄKTATM Explorer系统的迹线显示出相对于进料的蛋白质浓度得以维持。
管线内缓冲液交换的rh乳铁蛋白的吸光度、电导率和pH迹线展示出使用两次4倍稀释和浓缩导致缓冲液(A)约95%交换为缓冲液(B)。电导率6.9 mS/cm且pH 7.47的缓冲液(B)与具有7.2 mS/cm电导率和pH 7.43的最终缓冲液交换的乳铁蛋白相比较好。蛋白质浓度维持在大约45 mAU。
实施例2至8
重复实施例1的方法，但其中条件如表1中规定的变化以研究逆转缓冲液交换或添加改变运行时间上缓冲液粘度的缓冲组分(10%山梨醇和/或6%丙-1,2-二醇)和第1与第2浓缩器之间不同浓缩/稀释比的效果。实施例2和3使用缓冲液(A)为稀释剂，实施例4使用缓冲液(B)，实施例5、6和7使用缓冲液(C)且实施例8使用缓冲液(D)。
从表1中给出的结果中可见，连续稀释和浓缩实现了等同于常规再循环批TFF系统上至最多3个透析体积的缓冲液交换。可通过以更大稀释速率运行来实现更高的缓冲液交换效率，如实施例6和7中所见。
表1

Claims (15)

1.用于对含生物分子的液体进行管线内液体交换的仪器，所述仪器包括用于混合的装置，所述装置包括多入口流量控制器，进一步包括用于混合至少两种液体的两个或更多个可变流量入口阀，用于混合的所述装置还包括与以单程模式构造的切向流过滤设备流体连接的出口。
2.根据权利要求1所述的仪器，其中来自所述切向流过滤设备的滞留物与用于混合至少两种液体的第二装置流体连接，并且用于混合的所述第二装置包括与以单程模式构造的第二切向流过滤设备流体连接的出口。
3.根据权利要求1或2所述的仪器，其中所述可变流量入口阀是间歇流量阀。
4.用于对含生物分子的液体进行液体交换的仪器，所述仪器包括：
a)多入口流量控制器，其包括：
i)用于包含生物分子的第一液体介质的第一入口；
ii)用于第二液体介质的至少一第二入口；
iii)与切向流过滤设备流体连接的出口；以及
b)用于赋予所述液体流动通过所述流量控制器和所述切向流过滤设备的装置。
5.根据权利要求4所述的仪器，其中用于赋予流动的所述装置包括位于所述多入口流量控制器的出口与所述切向流过滤设备之间的泵。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的仪器，其进一步包括在所述切向流过滤设备的下游的限流器。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的仪器，其进一步包括第二多入口流量控制器，所述第二多入口流量控制器包括：
i)与来自所述切向流过滤设备的滞留物流体连接的第一入口；
ii)用于第三液体介质的第二入口；和
iii)与第二切向流过滤设备流体连接的出口。
8.根据权利要求7所述的仪器，其中所述第二多入口流量控制器起限流器的作用。
9.根据权利要求7或8所述的仪器，其中所述第二多入口流量控制器进一步包括两个或更多个可变流量入口阀。
10.一种用于制备生物分子的方法，所述方法包括采用根据权利要求1至9中任一项所述的仪器，通过液体交换来处理包含所述生物分子的液体介质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述可变流量入口阀在实现其中所述液体保持能够流动或流动被阻止的相对低的第一流速的位置与至少一更高的第二流速之间循环。
12.根据权利要求11所述的方法，其中采用至少10个循环。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述循环频率低于100 Hz，且优选0.05至0.5 Hz。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述处理包括缓冲液交换。
15.一种用于生产生物分子的方法，所述方法包括根据权利要求10至14中任一项所述的方法。
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