CN101706507A

CN101706507A - 用异硫氰酸荧光素标记的抗人cd45ra单抗的应用

Info

Publication number: CN101706507A
Application number: CN 200910246034
Authority: CN
Inventors: 汤永民; 李思思
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Hangzhou Yongshen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2009-07-27
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2010-05-12
Anticipated expiration: 2029-11-20
Also published as: CN101706507B

Abstract

本发明提供一种用异硫氰酸荧光素直接标记的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体的应用。研究表明，CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体具有良好的识别人CD45RA抗原的能力，能够有效识别白血病病人骨髓细胞及白血病细胞株中的CD34+CD38-CD123+白血病干细胞及CD34+CD38+CD123+的子代白血病细胞，因此，本发明提供的用异硫氰酸荧光素直接标记的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体可在制备白细胞和白血病干细胞检测试剂中应用，该抗体在白血病干细胞的鉴定和研究中具有极为重要的应用价值。

Description

用异硫氰酸荧光素标记的抗人CD45RA单抗的应用

技术领域

本发明属生物技术，主要涉及鼠免疫球蛋白，尤其涉及用异硫氰酸荧光素(FITC)直接标记的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单抗[克隆名：ZCH(ZhejiangChildren’s Hospital)-6-3A4]在制备白细胞和白血病干细胞检测试剂中的应用。

背景技术

人类白细胞分化抗原(cluster of differentiation，简称CD分子)是位于细胞表面的糖蛋白或者糖脂分子，通过与组织基质、细胞因子及其它细胞的相互作用发挥机体正常的免疫功能。而针对CD分子的抗体是分析CD分子结构、功能和分布不可或缺的有力工具。CD分子抗体已经广泛地应用于血液学、免疫学、病理学等领域的研究。随着多色流式细胞仪(flow cytometry，FCM)技术的日新月异，利用FCM结合CD类抗体可以实现对大部分血液系统疾病快速而准确地诊断和鉴别诊断，同时以单克隆抗体为导向分子的靶向药物的研究也取得了令人鼓舞的成就。因此，CD分子及其单抗成为诸多学者研究的热点，从1982年巴黎的第1届国际人类白细胞分化抗原工作组会议(1^st InternationalWorkshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens，HLDA1)开始，至2004年澳大利亚阿德莱德召开的第8届HLDA8会议，已有339种CD分子被鉴定和命名。

血液系统恶性肿瘤疾病的治疗方案与预后判断中，疾病的类型是重要因素，及时而准确地对疾病进行诊断和分型是有效治疗的前提条件。利用FCM技术和CD分子，白血病的免疫分型和鉴别诊断较以往更为准确、快速^[1]。而在血液系统恶性肿瘤治疗中，随着抗肿瘤药物的不断问世和造血干细胞移植的实施，白血病的预后已经有了明显的改善。虽然白血病的诊断和治疗已经有了明显的进步，复发和耐药仍然是白血病治疗中难以攻克的难题。已有越来越多的临床和实验研究资料显示，白血病患者体内存在着一群比例极少的白血病干细胞(Leukemia stem cells，LSCs)，在启动白血病发生和发展中起着决定性的作用，被认为是白血病耐药和复发的根源，细胞毒性药物可以杀死大部分的白血病细胞，骨髓常规甚至流式细胞仪均不能检测到白血病细胞。但是此时病人体内仍可能存在白血病干细胞，后者是白血病细胞中极微量的一群细胞，往往处于细胞周期之外(G0期)，不能被常规的细胞毒性药物杀死，成为复发的根源。从理论上讲，如果能够捕获并彻底清除白血病干细胞，白血病就能被彻底治愈。Bonnet等通过对大量临床样本的研究发现，急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia，AML)中CD34+CD38-细胞亚群具有长期增殖能力，该类亚群虽然在AML患者中所占的比例很少(约0.12％)，但它们却可将人类AML转移至非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷病(NOD/SCID)小鼠的唯一细胞，这些白血病细胞被称为“白血病干细胞”。应用白血病干细胞移植于NOD/SCID小鼠的实验显示，大部分的AML亚型(除急性早幼粒细胞白血病M3外)的白血病细胞均表达CD34+CD38-或者CD34+CD38+/low表型^[2]。而CD123表达于白血病干细胞但不表达于正常造血干细胞^[3]。Dean等进一步研究表明由CD34+CD38-CD123+标记的白血病干细胞96％处于细胞分裂周期的G0期，处于静止期的LSC避免受到常规细胞周期特异性药物的攻击^[4，5]。因此，CD34+CD38-CD123+是比较公认的髓系白血病干细胞的标志。如果能够识别此类细胞群对于白血病的诊断、治疗和预后判断都是极为重要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种用异硫氰酸荧光素(FITC)直接标记的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体[克隆名：ZCH-6-3A4，该克隆名为本研究室自行命名，已经第7国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA7)鉴定并命名]在制备白细胞和白血病干细胞检测试剂中的应用。研究表明，CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体能够有效识别白血病病人骨髓细胞及白血病细胞株中的CD34+CD38-CD123+白血病干细胞及CD34+CD38+CD123+的子代白血病细胞。

本发明所述的用异硫氰酸荧光素(FITC)直接标记的单抗(3A4-FITC)的制备方法为：将纯化的3A4单抗，通过改良Marshall法^[6]，用FITC进行标记，多余FITC经PBS充分透析除去。

本发明提供的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白新克隆ZCH-6-3A4单抗是以小儿未分化型急性淋巴细胞白血病细胞作为免疫原，致敏Balb/C纯种小白鼠，通过鼠-鼠杂交瘤单抗技术研制成功的鼠抗人CD45RA膜抗原[国际分化簇(CD)命名为CD45RA]的单抗，该抗体已在第7届国际人类白细胞分化抗原协作组会议(HLDA7)上进行了全面鉴定并获得了分化簇(CD)命名。所述的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。

当纯化3A4单抗直接用于流式检测时是采用间接免疫荧光标记法，即需要荧光素标记的羊抗鼠Fc段抗体作为二抗与其结合才能被流式细胞仪检测到，操作步骤比较繁琐，非特异性结合较高。因此，本实验室采用改良Marshall法，用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记纯化的3A4单抗，制备FITC直接标记的3A4荧光抗体3A4-FITC。3A4-FITC使流式检测步骤简化并且大大减少了非特异性结合，并可以与其他不同荧光素偶合的抗体联合进行多色荧光分析，使白血病亚群及白血病干细胞分析检测结果更为准确、可靠。

由于鼠抗人CD45RA抗体ZCH-6-3A4及其荧光抗体3A4-FITC并非天然存在，而是需要刻意应用特定的抗原进行免疫致敏动物，然后通过细胞融合、筛选、鉴定等一系列繁琐而复杂的技术过程研制而成，本发明完成了对该抗人CD45RA抗体(ZCH-6-3A4)制备、纯化，完成了该抗人CD45RA抗体(ZCH-6-3A4)直接标记抗体3A4-FITC的制备。尤其是3A4-FITC能够识别CD34+CD38-CD123+白血病细胞，对于白血病干细胞的研究具有极为重要的应用价值。

附图说明

图1.3A4与KG1a细胞株反应流式图，3A4对美国Becton-Dickinson(BD)公司的抗CD45RA单抗(克隆名L48)行阻滞实验流式图。

图2.鉴定3A4蛋白亚类流式图。

图3.

-T Easy/VH_3A4和

-T Easy/VL_3A4酶切鉴定电泳图。

图4.抗人CD45RA抗原单抗ZCH-6-3A4的可变区重链基因(VH_3A4)序列(两个黑色箭头之间的序列)。

图5.抗人CD45RA抗原单抗ZCH-6-3A4的可变区重链基因(VH_3A4)序列(两个黑色箭头之间的序列)。

图6.亲和层析纯化3A4腹水紫外监测图。

图7.SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯化的3A4纯度及重轻链分子量。

图8.3A4对3A4-FITC基础阻滞实验流式图。

图9.3A4-FITC抗体活性滴定流式图。

图10.3A4识别CD34+CD38-CD123+KG1a细胞株(10A)和初发髓系白血病患者骨髓CD34+CD38-CD123+细胞(10B)的能力。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一

流式细胞仪间标法检测3A4识别抗原能力及检测其对BD公司的抗CD45RA单抗(克隆名L48)阻滞作用(图1)。步骤如下：

1、计数KG1a细胞，调整浓度至1×10⁷/ml，每个流式管取100μl细胞悬液；实验设4个反应管，依次为A.阴性对照管；B.3A4识别抗原能力检测管；C.抗CD45RA单抗管；D.3A4阻滞抗CD45RA单抗管。

2、B管和D管加入3A4培养上清50μl，4℃孵育30min；

3、加PBS 1000g离心10分钟，洗去未结合的3A4；

4、A管和B管分别加入2μl GAM-FITC，C管和D管分别加入和2μlCD45RA-FITC；

5、加PBS 1000g离心10分钟，洗去未结合的抗体；

6、流式细胞仪检测、分析。

图1为3A4与KG1a细胞株反应流式检测图(1B)，与BD公司的抗CD45RA单抗比较流式图(1C)，并行3A4对抗CD45RA抗体的阻滞实验流式图(1D)。结果发现，3A4与KG1a细胞反应阳性率为99.51％，MFI为432.63，表明3A4抗体活性佳。图1E中峰1为阴性对照，峰2为阻滞后图，峰3为未阻滞图，表明3A4能完全阻滞BD公司的抗CD45RA抗体与KG1a的反应，提示抗CD45RA抗体和3A4识别的为同一抗原表位。

实施例二

3A4免疫球蛋白亚类的鉴定：采用流式细胞仪间标法，KG1a细胞株为反应细胞，以3A4为一抗，免疫球蛋白亚类鉴定试剂盒为二抗，检测不同免疫球蛋白为二抗时阳性率和平均荧光强度(图2)。步骤如下：

1、计数KG1a细胞，调整浓度至1×10⁷/ml，每个流式管取100μl细胞悬液；

2、每管加3A4培养上清50μl，4℃孵育30min；

3、加PBS 1000g离心10分钟，洗去为结合的3A4；

4、加入免疫球蛋白试剂盒中的二抗，分别为FITC标记的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、Igκ、Igλ，4℃避光孵育30min；

5、加PBS 1000g离心10分钟，洗去未结合的二抗；

6、流式细胞仪检测、分析。

图2是采用流式细胞术间标法，以KG1a细胞株为反应细胞，3A4为一抗，以FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白亚类抗体为二抗，检测不同二抗时的阳性率和平均荧光强度(MFI)。结果发现IgG1 FITC为二抗时阳性率为98.48％，MFI 332.85，，Kapper FITC为二抗时，阳性率为99.02％，MFI为252.20，表明3A4抗体属于IgG1κ。

实施例三

本发明提供的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白及其重链和轻链可变区基因通过下列步骤获得：

1、ZCH-6-3A4单抗的研制：基本按Koller&Milstein报告的鼠-鼠杂交瘤经典方法进行，以小儿急性未分化型淋巴细胞性白血病(uALL)细胞(其免疫表型为HLA-DR+，CD19+，CD10-，CD33-，TdT+，CD7-，CD41a-)作为免疫原，将107白血病细胞给8周龄雌性Balb/C小鼠作腹腔注射，每周一次，共4次，于第4次注射后第3天，脱臼杀死小鼠，无菌取脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株NS-1细胞(美国ATCC产品)按6∶1混合，以50％聚乙二醇(PEG，美国Sigma公司，分子量3350道尔顿)溶液作为融合媒介进行细胞融合，于96孔板(美国Falcon公司)中进行选择性培养。于融合后第9～20天，隔日用免疫原细胞对培养上清进行间接免疫荧光法(IIF)筛选。阳性孔细胞经3次克隆化并连续2次100％孔达到阳性，即建立了能持续分泌3A4单抗的杂交瘤细胞系(克隆名：ZCH-6-3A4，简称3A4)。经8个多月的连续传代培养和反复冻融，其分泌3A4单抗的能力稳定。以其腹水(荧光法效价1∶3200)或培养上清(荧光法效价1∶16)作为3A4单抗的来源。

2、3A4重、轻链基因(VH_3A4、VL_3A4)的扩增和克隆

2.1总RNA的抽提和处理：

收集3A4杂交瘤细胞8×10⁶，以核糖核酸(RNA)抽提试剂盒(TRIZOL液)按说明书步骤抽提总RNA。最后溶于25μl DEPC(diethyl-pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水中，并加入(核糖核苷酸酶抑制剂)至终浓度为1U/μl(单位/微升)。紫外分光光度计测定A260、A280及其比值，1％琼脂糖电泳观察总RNA。进行逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)前，取2μl3A4总RNA，按照RQ1(无RNA酶的DNA酶试剂盒)说明的方法，消化总RNA中污染的基因组DNA。

2.2总RNA的抽提：

(1)计数细胞，共8×10⁶个活细胞；

(2)常温下1000转/分钟(rpm)离心15分钟，弃上清；

(3)沉淀中加入无菌生理盐水后在1000rpm条件下离心15分钟，重复洗涤2次；

(4)向沉淀中加入8ml TRIZOL(1ml/10⁶细胞)，立即用5ml无菌针筒反复抽打剪切数分钟；

(5)将上述TRIZOL溶液按1ml/管转入1.5ml带盖小塑料(eppendorf)管中，室温下静置5分钟；

(6)每管加入0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温下静置10分钟；

(7)4℃下12000g离心15分钟，将水相转入新的1.5ml的eppendorf管中，每管加入0.5ml异丙醇，立即摇匀，室温下静置10分钟；

(8)4℃下，12000g离心10分钟；

(9)弃上清，每管加入1.5ml 75％乙醇，混匀，4℃下，7500g离心5分钟，弃上清；

(10)真空干燥机中晾干，每管加入25μl无RNA酶的DEPC水溶解沉淀，-80℃冰箱保存。

2.3总RNA浓度的测定：

取出2μl新抽提的总RNA，加入98μl DEPC水混匀，紫外分光光度计(GeneQuant II)测定260吸光值(A260)及280吸光值(A280)，RNA实际浓度用如下公式计算：

2.4总RNA凝胶电泳：

取新抽提的总RNA 3μl加入电泳上样缓冲液5μl，1％琼脂糖凝胶内含溴乙啶(EB)浓度0.5μg/ml，经100V直流电压下电泳5分钟，凝胶成像系统观测结果并摄像保存。

2.5总RNA的处理：取总RNA 1μl+无RNA酶的DNA酶(RNase-freeDnase)(1U/μl)10μl+RNasin(40U/μl)1μl，总量达12μl，经37℃×1小时，90℃×5分钟孵浴后立即置冰上待用。

2.6RT-PCR：

按照说明书，将RQ1无RNA酶的DNA酶处理过的总RNA进行逆转录(25μl体系)，并用DNA纯化试剂盒(QIAquick)纯化mRNA/cDNA杂交双链。取纯化的cDNA 2.5μl进行PCR。

2.6.1RT反应体系：取RQ1处理过的总RNA 13μl+寡聚脱氧胸苷[Oligo(dT)]1.5μl，总量达14.5μL，经65℃预变性5分钟，立即置冰上，加入以下试剂：DEPC水2.5μl+5倍缓冲液5μl+25mM dNTP(脱氧核苷混合物)0.5μl+RNA酶抑制剂1.5μl+逆转录酶(200U/μL)1μl至总体积25μl，经37℃，30分钟孵浴以合成互补脱氧核糖核苷酸(cDNA)，置95℃5分钟，然后移至4℃冰浴备用。

2.6.2PCR体系

(1)50μl的PCR反应体系：2.5μl纯化的3A4，10pmol的轻链或重链可变区上下游引物各1μl，0.5μl 25mM的dNTP，5μl 10×高保真PCR缓冲液，0.2μl高保真Taq聚合酶(

Taq High Fidelity)；引物序列如下：

重链可变区5′引物序列(SEQ ID NO 5)：

CAG GTG CAG CTGAAG CAG TC

重链可变区3′引物序列(SEQ ID NO 6)：

CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACAAGC TTG GGT GTC GTT TT轻链可变区5′引物序列(SEQ ID NO 7)：

CAAATT GTT CTC ACC CAG TCT

轻链可变区3′引物序列(SEQ ID NO 8)：

GGATAC AGT TGG TGC AGC ATC

(2)反应条件：94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸30秒，共38个循环；

(3)最后一个循环完成后，加入1μl Taq DNA Polymerase(Taq DNA聚合酶)72℃延伸7分钟；

(4)取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，同时加标准分子量标志物，鉴定PCR产物片断大小，分别命名为VH_3A4和VL_3A4基因。结果可观察到350碱基对(bp)左右的VH_3A4条带和325bp左右的VL_3A4条带。将前述阳性条带切胶回收纯化得到VH_3A4和VL_3A4基因。

3.VH_3A4、VL_3A4基因扩增产物的克隆和鉴定将纯化的VH_3A4和VL_3A4基因片段通过连接酶分别与克隆载体

-T Easy连接，获得的连接产物

-T Easy/VH和

-T Easy/VL，通过转化DH5α感受态细菌，得到数十个白色菌落和数个蓝色菌落，分别挑取3个白色菌落进行质粒扩增，抽提后进行核酸限制性内切酶EcoRI酶切鉴定，1％琼脂糖电泳结果均可见350bp和325bp左右的目的片段(图3)。其中，M：低核糖核苷酸(DNA)标准分子量标志物；1～3：重组质粒

-T Easy/VH_3A4的EcoRI酶切；4～6：重组质粒

-T Easy/VL_3A4的EcoRI酶切，所切出的基因片断大小与目的基因相同，重链长度为351bp，轻链长度327bp，说明VH_3A4基因和VL_3A4基因已分别被成功克隆入TA载体中；7～8：空质粒

-T Easy的EcoRI酶切。

4.VH_3A4、VL_3A4基因序列测定和分析

对阳性重组质粒纯化后进行测序，VH_3A4(参见图4)和VL_3A4(参见图5)基因均符合小鼠Ig可变区框架结构。VH_3A4基因全长351bp(见序列SEQ ID NO 1)，编码117个氨基酸(见序列SEQ ID NO 3)，在美国国家生物技术信息中心(NCBI)上进行检索，发现此重链可变区基因与小鼠免疫球蛋白重链可变区基因的同源性达95.83％，氨基酸序列与小鼠Ig重链的同源性达87％，归属于小鼠Ig的VH基因。氨基酸序列分析结果显示，重链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，在第21位和第96位为特征性Cys(半胱氨酸)。VH_3A4氨基酸序列结构框架如下：

1～25 FR1

26～33 CDR1

34～50 FR2

51～58 CDR2

59～96 FR3

97～105 CDR3

106～117 FR4

VL_3A4基因全长327bp(见序列SEQ ID NO 2)，编码109个氨基酸(见序列SEQ ID NO 4)，在NCBI上进行检索，发现此轻链可变区基因与小鼠Igκ链的同源性达98.58％，氨基酸序列与小鼠Igκ链的同源性达88％，归属于小鼠Ig的Vκ基因。氨基酸序列分析结果显示，轻链可变区含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR)，在第23位和第89位为特征性半胱氨酸(Cys)。VL_3A4氨基酸序列框架如下：

1～26 FR1

27～33 CDR1

34～50 FR2

51～53 CDR2

54～89 FR3

90～98 CDR3

99～10 9FR4

实施例四

3A4直标抗体3A4-FITC的制备：在清洁级BALB/c小鼠腹腔注射3A4细胞，制备大量腹水。硫酸铵初步纯化后采用Econo-Pac蛋白A柱进行亲和层析(图6)，SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度(图7)。将获得的纯化3A4单抗，通过改良Marshall法^[6]，用FITC进行标记，多余FITC经PBS充分透析除去。图6为3A4腹水通过亲和层析纯化柱Econo-

Protein A Cartridge纯化时的紫外监测图，前峰为腹水过柱时全蛋白峰，后者为洗脱时的目的蛋白峰。图7为亲和层析纯化的目的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白纯度，可见目的条带清晰，没有杂带，重链分子量为57.9KDa，轻链分子量为30.3KDa。

具体步骤如下：

1、抗体的准备：用盐水(0.15mol/l NaCl)及缓冲液(0.15mol/l NaHCO3-Na2CO3PH9.0)稀释使每毫升内含蛋白10mg，缓冲液为总量的10％，降温至4℃，电磁搅拌5～10min；

2、荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光素，用分析天平准确称所取所需的异硫氰酸荧光素粉末；

3、结合(或称标记)：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入蛋白溶液中，避免将荧光素粘于搅拌玻棒上(大约5～10min内加完)，加毕后，继续搅拌12～18h。结合期间应保持蛋白溶液于4℃左右；

4、透析：结合完毕后，将球蛋白的溶液以2500r/min速度离心20min，除去其中少量之沉淀物，pH8.0缓冲盐水4℃透析72小时。

5、保存：将制备好的荧光抗体加叠氮钠0.01％，分装。于4℃可以保存半年，-20℃保存可达2年以上。

用紫外分光光度计测定3A4-FITC A495值和A280值，结果分别为0.283和0.3，A495/A280比值为0.94，介于FITC荧光抗体的理想比值0.3～1.0之间^[7]。阻滞试验显示，在CD45RA抗原表位被3A4基础单抗封闭的情况下，3A4-FITC的阳性细胞百分数由98.46％下降到10.06％，下降了89.8％(图8)。图8为3A4对自身抗体3A4-FITC基础阻滞流式图，CD45RA抗原表位被3A4基础单抗封闭的情况下，3A4-FITC的阳性细胞百分数由98.46％(8B)下降到10.06％(8C)，下降了89.8％，图8D中的峰1为阴性对照，峰2为阻滞后图，峰3为未阻滞图，表明3A4-FITC能被自身的3A4单抗阻滞。

实施例五

3A4-FITC活性鉴定：取KG1a细胞株为反应细胞，固定细胞量，逐渐增加3A4-FITC量，流式细胞仪检测不同3A4-FITC浓度时阳性率和平均荧光强度(MFI)，结果表明阳性率和MFI随3A4-FITC增多而增加，但是0.4μg的3A4-FITC即可饱和1×10⁶个KG1a细胞，继续增加3A4-FITC阳性率和MFI增加不明显，参见图9。其中图9A是3A4-FITC滴定流式图，图9B是阳性率变化折线图，图显示0.4μg的3A4-FITC即可饱和1*10⁶个KG1a细胞，其阳性率为99.5％，平均荧光强度(MFI)为194.63，表明该直标抗体识别能力强，活性佳。

实施例六

为证实3A4能捕获白血病干细胞，流式细胞仪检测3A4识别白血病细胞株和初发白血病患者骨髓中CD34+CD38-CD123+白血病干细胞的能力。结果发现3A4在CD34+CD38-CD123+KG1a细胞株上阳性率为99.05％(图10A)，在初发白血病患者骨髓CD34+CD38-CD123+细胞上阳性率可高达90.3％(图10B)。

无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

本发明涉及的序列

1.汤永民，CD分子及其单克隆抗体在小儿血液肿瘤诊疗中的应用，国外医学输血与血液学分册.2005，28(1)：8-10.

2.Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originatesfrom a primitive hematopoietic cell.Nat Med，1997，3：730-737.

3.Jordan CT，Upchurch D，Szilvassy SJ，et al.The interleukin-3 receptor a chain is a uniquemarker for human acute myelogenous leukemia stem cells.Leukemia，2000，14：1777-1784.

4.Dean M，Fojo T，Bates S.Tumour stem cells and drug resistance.Nat Rev Cancer，2005，5：275-284.

5.Countouriotis A，Moore TB，Sakamoto KM.Cell surface antigen and molecular targeting inthe treatment of hematologic malignancies.Stem Cells.2002，20(3)：215-29.

6.蔡文琴，王伯沄.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.四川科学技术出版社，1994，45-60.

7.沈关心，龚非力.抗体技术实验指南.科学出版社，2002.58.

本发明涉及的序列

<120>用异硫氰酸荧光素标记的抗人CD45RA单抗的应用

<160>8

<170>Patent In Version 2.1

<210>1

<211>351

<213>人工序列

<220>

<223>94a 88c 91g 78t

<400>1

1 CAGGTGCAGC TGAAGCAGTC TGGGGCTGAA CTGGCAAAAC CTGGGGCCTC AGTGAAGATG

61 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTC CACCTTTACT ACCTACTGGA TACACTGGGT AAAACAGAGG

121 CCTGGACAGG GTCTGGAATG GATTGGATAC ATTAATCCTA ACACTGGTTA TACTGAGTAC

181 AATCAGAAGT TCAAGGCCAA GGCCACATTG ACTGCAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC

241 ATGCAACTGA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGT AAGATTTATT

301 ACGGTAGTAG GGGGGTGGGG CCAAGGCACC ACTCTCACAG TCTCCTCAGC C

<210>2

<211>327

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>75a 99c 75g 78t

<400>2

1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT ATCTAGGGGA ACGGGTCACC

61 ATGACCTGCA CTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TCCAGTCACT TGCACTGGTA CCAGCAGAAG

121 CCAGGATCCT CCCCCAAACT CTGGATTTAT AGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCA

181 GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG

241 ACTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAC CAGTATCATC GTTCCCCGCT CACGTTCGGT

301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGG

<210>3

<211>117

<212>

<213>人工序列

<220>

<400>3

1 QVQLKQSGAE LAKPGASVKM SCKASGSTFT TYWIHWVKQR PGQGLEWIGY

61 INPNTGYTEY NQKFKAKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCVRFI

101 TVVGGWGQGT TLTVSSA

<210>4

<211>109

<212>

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

1 QIVLTQSPAI MSAYLGERVT MTCTASSSVS SSHLHWYQQK PGSSPKLWIY

51 STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSME TEDAATYYCH QYHRSPLTFG

101 AGTKLELKR

<210>5

<211>20

<212>

<213>人工序列

<220>

<223>重链可变区5’引物序列

<400>5

CAG GTG CAG CTG AAG CAG TC

<210>6

<211>38

<212>

<213>人工序列

<220>

<223>重链可变区3’引物序列

<400>6

CCA GGG GCC AGT GGA TAG ACA AGC TTG GGT GTC GTT TT

<210>7

<211>21

<212>

<213>人工序列

<220>

<223>轻链可变区5’引物序列

<400>7

CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT

<210>8

<211>21

<212>

<213>人工序列

<220>

<223>轻链可变区3’引物序列

<400>8

GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC

Claims

1.一种用异硫氰酸荧光素标记的抗人CD45RA鼠免疫球蛋白单克隆抗体在制备白细胞和白血病干细胞检测试剂中的应用，所述的抗人CD45RA单克隆抗体具有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列。

2.根据权利要1所述的应用，其特征在于，所述的抗人CD45RA单克隆抗体编码的氨基酸序列为SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。