JP2024073618A - 標的物質を含む液体を処理するための装置 - Google Patents

Abstract

【課題】標的物質、好ましくは生体分子を含む液体を処理するための、単純化されかつ広く適用可能な装置を提供する。【解決手段】装置は、単位操作を実施するための少なくとも第１および第２の手段を含み、単位操作を実施するための各手段が、（ｉ）可変流入口弁および出口を含む流れ制御器の入口に流体接続される液体用のフィードと、（ｉｉ）前記流れ制御器の前記出口に流体接続される前記標的物質を含む液体供給材料用のフィードと、（ｉｉｉ）デバイス入口およびデバイス出口を含む、処理操作を実現するためのデバイスと、（ｉｖ）前記流れ制御器を通して、かつ前記液体供給材料用のフィードから前記デバイス入口を介して前記処理デバイスを経て、流れを与えるための手段とを含み、単位操作を実施するための前記第２の手段に関する前記標的物質を含む前記液体供給材料用のフィードは、単位操作を実施するための前記第１の手段の出口を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、標的物質を含む液体、具体的には、生体分子、特に組換えポリペプチドを含む液体を処理するための方法および装置に関する。

多くの生体分子、特に組換えポリペプチドおよび核酸、例えばプラスミド（ｐＤＮＡ）は、特に治療応用に関して多くの関心を引き付けてきた。そのような生体分子は、一般に、所望の生体分子を発現するように操作された組換え宿主細胞を培養することによって生成される。次いで生体分子は、典型的にはいくつかの単位操作を含む方法によって、培地から回収される。これらの単位操作は、一般に、１つまたは複数のクロマトグラフィー精製、ウイルス不活性化、濾過（ウイルス濾過、深層濾過、および絶対濾過を含む）、リフォールディング、および限外濾過／ダイアフィルトレーションを含む。

標的物質を含む溶液を処理するための装置は、当技術分野で公知である。しかし、そのような化合物の商業的製造で使用される装置は、極めて大型であり、広範な床面積およびインフラ構造を必要とする。さらに装置の一部の共通性は、単位操作のいくつかに関して実現することができるが、ウイルス不活性化および／または限外濾過などのある特定の単位操作に関する装置の設計は、例えばクロマトグラフィー精製の場合とは実質的に異なる。このことは、より広い空間が、２組以上の装置を収容するのに必要であること、または各段階に関する装置の相互運用性および制御が過度に複雑であることのいずれかを意味する。さらに操作者は、用いられる種々のタイプの装置のそれぞれに対する訓練を必要とする。したがって、単純化されかつ広く適用可能な装置が望ましいと考えられる。共通の流路を用いて複数の処理ステップを実施することが可能な装置を特定することも、望ましいと考えられる。

本発明の第１の態様によれば、標的物質を含む液体を処理するための装置であって、単位操作を実施するための少なくとも第１および第２の手段を含み、単位操作を実施するための第１および第２の手段の各々が、
（ｉ）可変流入口弁および出口を含む流れ制御器の入口に流体接続される液体用のフィードであって、単位操作を実施するための第１及び第２の手段の少なくとも一方が、少なくとも２つの液体用のフィードを含み、液体用のフィードは、少なくとも２つの液体を投与するための２つ以上の可変流入口弁を含むマルチインレット流れ制御器の入口に流体接続し、流れ制御器は出口を含む、フィードと、
（ｉｉ）流れ制御器の出口に流体接続される標的物質を含む液体供給材料用のフィードであって、それによって、標的物質を含む液体用のフィードと、混合された生体処理液との組合せが、デバイスフィードを生成することを可能にする、フィードと、
（ｉｉｉ）デバイス入口およびデバイス出口を含む、処理操作を実現するためのデバイスであって、デバイス入口がデバイスフィードに流体接続される、デバイスと、
（ｉｖ）流れ制御器を通して、かつ液体供給材料用のフィードからデバイス入口を介して処理デバイスを経て、流れを与えるための手段と
を含み、
単位操作を実施するための第２の手段に関する標的物質を含む液体供給材料用のフィードは、単位操作を実施するための第１の手段の出口を含む、
装置が提供される。

一部の実施形態では、装置は、単位操作を実施するための２つの手段を含む。他の実施形態では、装置は、単位操作を実施するための、３、４、５、６、７、８、９、またはそれよりも多くの手段であって、好ましくはそれぞれが第１および第２の手段に関する上述の特徴を有する、手段を含む。多くの好ましい実施形態では、単位操作を実施するための手段は直列に接続され、単位操作を実施するための後続の手段に関する標的物質を含む液体供給材料用のフィードは、単位操作を実施するための先行する手段の出口を含む。多くの非常に好ましい実施形態では、各単位操作は、他の単位操作とは異なる。

ある特定の実施形態では、単位操作を実施するための各手段は、実質的に同じ流路を含む。
液体の流れを与えるための手段は、当技術分野で周知であり、液体への気圧の印加、特に窒素またはヘリウムなどの不活性ガスの、印加を含む。好ましくは、液体の流れを与えるための手段は、１つまたは複数のポンプを含む。用いることができるポンプには、蠕動、ダイヤフラム、ローブ、および遠心ポンプが含まれる。使い捨てポンプおよび再使用可能なポンプの両方の設計を用いることができる。多くの好ましい実施形態では、単位操作を実施する各手段ごとに単一のポンプが用いられ、供給材料と流れ制御器の出口との間の接続の間の流体接続の下流に位置する。最も好ましくは、ポンプは、生体処理デバイスの上流に位置する。選択されるポンプのタイプおよびサイズは、一般に、装置の規模および設計パラメータに適した流量および圧力プロファイルによって様々となる。ある特定の非常に好ましい実施形態では、ポンプはクウォータナリーダイヤフラムポンプである。

流れ制御器は、流れ制御器を通した液体の流れを調節する、可変流、好ましくは間欠流の入口弁を含む。マルチインレット流れ制御器は、少なくとも２つの入口弁を含み、多くの場合には、最大８つ、例えば３、４、５、６、または７つの入口弁を含む。入口弁は、それぞれ同じ寸法を有していてもよく、または入口弁の１つもしくは複数は、異なる寸法を有していてもよい。ある特定の実施形態では、流れ制御器の各入口弁から出口までで測定された体積は、各入口に関して同じであり、流れ制御器の各入口弁から出口までで測定された体積および経路長の両方が、各入口に関して同じであることが非常に好ましい。多くの実施形態において、単位操作を実施するための各手段は、好ましくはマルチインレット流れ制御器を含む。

本発明で用いられる流れ制御器は、少なくとも１つの出口を含み、一方で２つ以上の出口が存在していてもよく、単一の出口が用いられることが好ましい。
可変流弁は、液体が流れ続けることができる第１の比較的低い流量と、少なくとも第２のより高い流量との間の流れを調節してもよい。好ましい実施形態では、可変流弁は間欠流弁であり、第１の位置で流れを防止するが少なくとも第２の位置では流れを可能にする。最も好ましくは、弁の全てが間欠流弁である。弁は、当技術分野で公知のアクチュエータ、例えば空気圧式または好ましくはソレノイドアクチュエータを含んでいてもよい。

好ましくは、可変流弁は、マルチインレット流れ制御器を通して流れる投入液体の、必要とされる相対量を実現するために、弁の開閉が調節されるよう、最も好ましくはプログラム可能制御ユニットによって制御される。これは好ましくは、流れ制御器での入口弁を通した、所定の期間またはサイクル速度によるサイクリング、および所望の組成物を生成するのに必要なサイクル時間の割合に応じて弁の開閉を調節することによって実現される。サイクル速度は、一定にまたは変化させることができる。最も好ましくは、間欠流入口弁が用いられ、操作中にただ１つの弁が任意の所与の時点で開放されるように制御される。多くの実施形態では、マルチインレット流れ制御器のサイクル速度が一定に維持され、投入液体の所望の相対量は不変のままである。

多くの実施形態では、複数のサイクルが用いられる。用いられるサイクル数は、プロセスの持続時間、処理される液体の体積、流量、および装置の最大動作圧力など、数多くの因子によって様々となる。ある特定の実施形態では、少なくとも１０サイクル、例えば少なくとも５０、１００、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、５０００、７５００、１００００、またはそれよりも多くのサイクル数を用いることができる。

ある範囲のサイクル周波数を用いることができることが理解されよう。多くの場合、周波数は１００Ｈｚ未満であり、典型的には５０Ｈｚ未満であり、一般には１０Ｈｚ未満であり、好ましくは５Ｈｚ未満である。ある特定の好ましい実施形態では、周波数は２Ｈｚ以下、最も好ましくは１Ｈｚ以下、例えば０．０５から０．５Ｈｚである。

混合は、標的フィードの流れと流れ制御器出口の流れとを、任意選択でポンプの作用と組み合せて単に合わせることにより実現されてもよいが、多くの好ましい実施形態では、装置はさらに、インライン混合器、好ましくは混合チャンバーを含み、好ましくは静止型混合器を含み、最も好ましくは時間遅延分割流静止型混合器を含む。多くの実施形態では、インライン混合器は、生体処理操作を実現するために、ポンプの下流でありデバイスの上流に位置する。一部の好ましい実施形態では、インライン混合器は気泡トラップも含む。

処理操作を実現するためのデバイスによって実施することができる単位操作は、最も好ましくは生体処理操作である。生体処理操作は、クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、濾過、リフォールディング、限外濾過、ダイアフィルトレーション、精密濾過、インラインコンディショニングおよびリフォールディングを含む。

本発明の装置を使用して実施することができるクロマトグラフィー操作は、親和性クロマトグラフィー、イオン交換（陰イオン交換および陽イオン交換のいずれかまたは両方）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、逆相クロマトグラフィー、拡張床クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、膜クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む。多くの実施形態において、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーは、単位操作の少なくとも１つを含む。クロマトグラフィー操作を実施するためのデバイスは、膜、繊維モノリス、またはカラムなどの適切なクロマトグラフィー装置を含む。クロマトグラフィー単位操作の数および順序は、標的生体分子の性質に従って選択される。

本発明の装置を使用して実施することができるウイルス不活性化単位操作は、一般に、ウイルスを不活性化するのに十分な滞留時間の条件下で、標的生体分子を含む液体を貯蔵することができる、貯蔵槽を含む。ある特定の実施形態では、デバイスの出口および入口は、再循環ループが発生するように流体接続することができる。１つのそのような実施形態では、装置は、「デバイス」入口と「デバイス」出口との間に流体接続された槽またはバッグと共に設定され、装置出口の１つは、マルチインレット流れ制御器入口の１つに流体接続される。液体供給材料入口に流体接続するデバイス「入口」と「出口」との間の槽またはバッグは、流れを与える手段、典型的にはポンプによって充填され、またはその他のマルチインレット流れ制御器入口の少なくとも１つを通して少なくとも１つのその他の液体で調整される。ある特定の実施形態では、槽またはバッグは、混合槽またはバッグである。プロセス液は、マルチインレット流れ制御器の入口を通して槽またはバッグに再循環され、マルチインレット流れ制御器の入口に戻り、マルチインレット流制御器の少なくとも１つのその他の入口に流体接続された少なくとも１つの追加の液体によって標的物質を含む溶液が調整される。

実施することができる濾過単位操作は、ウイルス濾過、深層濾過、および絶対濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、および精密濾過を含む。多くの実施形態において、濾過単位操作は、デバイス入口とデバイス出口との間にフィルターモジュールを含む。フィルターモジュールは、マルチインレット流れ制御器入口に取り付けられた少なくとも２つの液体フィードを使用してフラッシュされかつ追跡され、標的分子を含む溶液は、供給材料入口に流体接続される。フィルターを通した液体の処理は、マルチインレット流れ制御器出口および供給材料入口の下流でフィルターモジュールの上流に、流体接続されたおよび位置決めされた、流れを与える手段を通して実現される。フィルターモジュールは、一般に、生体処理の分野で周知の構成を用いる。

ウイルス濾過、深層濾過、および絶対濾過は、当技術分野で周知の単位操作であり、生体処理の分野で周知のフィルターデバイスを一般に用いる本発明の装置を使用して実施することができる。多くの実施形態において、１つまたは複数のフィルターデバイスは、特定の単位操作を実行するために、デバイス入口と出口との間に配置される。その他の実施形態では、フィルイターデバイスは装置出口の下流に位置決めされ、これはある特定の実施形態では、この装置によって、クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、十字流濾過、ウイルス濾過、または深層濾過などの主な単位操作と、その後の二次濾過操作とを行なうことが可能になる。

本発明の装置を使用して実施することができる十字流濾過（「ＴＦＦ」）単位操作は、従来の再循環ＴＦＦおよび単回通過ＴＦＦを含む。ある特定の実施形態では、装置の出口および入口は、再循環ループを発生させるように流体接続することができ、その例は、再循環十字流濾過である。一実施形態では、当技術分野で公知のように、装置は、デバイス入口とデバイス出口との間に平膜、中空糸、またはスパイラル型膜のいずれかを含むＴＦＦモジュールと共に設定され、ＴＦＦモジュールからの保持液は、装置出口の１つから、少なくとも１つの入口および１つの出口を含む槽またはバッグの、流体接続された入口へと導かれる。槽またはバッグの出口は、液体供給材料入口に流体接続される。槽またはバッグは、槽またはバッグの第２の入口に流体接続することによって供給材料または液体を槽またはバッグに供給する補助手段を使用して、一定レベルに維持される。別の実施形態では、装置は、デバイス入口とデバイス出口との間に平膜、中空糸、またはスパイラル型膜のいずれかを含むＴＦＦモジュールと共に設定され、ＴＦＦモジュールからの保持液は、装置出口の１つから、マルチインレット流れ制御器弁の入口の１つへと流体接続して戻される。ある特定の実施形態では、装置出口からその入口までの再循環ループは、ブレーク（ｂｒｅａｋ）槽またはバッグを含む。標的物質または液体を含む溶液は、流れを与える手段、典型的にはポンプによって、液体供給材料入口を通して再循環ループに引き込まれる。保持液は、ＴＦＦモジュールを通して、好ましくはマルチインレット流れ制御器入口の１つを通して再循環される。マルチインレット流れ制御器は、保持液と少なくとも１つのその他の液体とを混合するように用いられてもよい。再循環ＴＦＦの操作は、当技術分野で周知であり、クロスフロー速度および膜透過圧力の設定を通して制御される。

ある特定の実施形態では、例えば、ＷＯ２０１７／１１８８３５に記載される単回通過ＴＦＦの場合のように、単回通過ＴＦＦを、デバイス入口とデバイス出口との間に平膜、中空糸、またはスパイラル型膜のいずれかを含むＴＦＦモジュールと共に構成することができる。

一部の実施形態では、単回通過および再循環ＴＦＦの混成を用いることができ、ＴＦＦモジュールの下流で可変流弁を使用して生成した保持液は、フィード槽に戻される。
本発明による装置は、一般的にさらに、気泡トラップ、圧力センサ、温度センサ、ｐＨセンサ、流量センサ、導電率センサ、空気センサ、およびＵＶセンサ、例えばＵＶ／可視多重波長センサの１つまたは複数を含む。前述のそれぞれの１つまたは複数が、存在して
いてもよい。

本発明の、ある特定の実施形態では、標的物質を含む液体を処理するための装置であって、
（ｉ）少なくとも２つの液体用のフィードと、
（ｉｉ）少なくとも２つの液体を混合するための２つ以上の可変流入口弁を含み、単一の出口も含む、マルチインレット流れ制御器と、
（ｉｉｉ）流れ制御器の出口と流体接続される、標的物質を含む液体供給材料用のフィードと、
（ｉｖ）典型的にはポンプを使用することにより、流れ制御器を通して、かつ液体供給材料用のフィードからフィード入口を介して処理装置を経て、流れを与えるための手段と、（ｖ）少なくとも２つの液体を混合するためのデバイスと、
（ｖｉｉ）プロセス液から気泡を捕捉するためのデバイスと、
（ｖｉｉ）デバイス入口およびデバイス出口を含み、デバイス入口が、フィード入口に流体接続される、処理操作を実現するための共通流路とを含み、
（ｖｉｉｉ）デバイス入口および出口は、クロマトグラフィー、濾過（ウイルス濾過を含む）、十字流濾過、単回通過十字流濾過、リフォールド、およびウイルス不活性化に使用されるモジュールと流体接続されており、さらに
（ｉｘ）デバイス入口および出口をバイパスする手段と、
（ｘ）圧力を調節するための、デバイス出口の下流の手段と、
（ｘｉ）デバイス入口およびデバイス出口の上流および下流で処理操作をモニタリングするのに適した複数のセンサと、
（ｘｉｉ）フィード入口に流体接続される、少なくとも１つの出口と
を含む装置が提供される。

本発明による装置は、好ましくは、デバイスの下流に位置する処理デバイスをさらに加圧するための手段を含む。圧力を改善するための手段は、当技術分野で公知であり、ピンチ弁、ダイヤフラム弁、特に可変位置ダイヤフラム弁が含まれる。

多くの実施形態において、液体を混合するためのデバイス、および気泡を捕捉するためのデバイスは、単一のデバイスを含む。
ある特定の実施形態では、装置は、交換が必要とされる前に有意な再使用回数を可能にする、ステンレス鋼などの材料から構成された多使用流路を含む。

ある特定の実施形態では、装置は、限られた寿命で設計されかつ使い捨て可能な消耗品として利用される、プラスチックなどの材料から構成された単回使用流路を含む。
多くの実施形態において、各単位操作は、プログラム可能制御ユニット、好ましくはコンピューターの制御下で操作される。一部の実施形態では、単一の制御ユニットが、２つ以上の単位操作を制御する。他の実施形態では、各ユニット操作は、個別の制御ユニットの制御下にある。これらのその他の実施形態では、好ましくは各制御ユニットは、共通プログラミング言語を用い、これにより制御ユニット間での簡易通信が可能になる。

本発明の第２の態様によれば、液体混合物を調製するための装置であって、
（ｉ）少なくとも２つの液体用のフィードと、
（ｉｉ）少なくとも２つの液体を投与するための、２つ以上の可変流入口弁を含み、出口も含む、マルチインレット流れ制御器と、
（ｉｉｉ）流れ制御器を通して、かつ液体供給材料用のフィードからフィード入口を介して生体処理装置を経て、流れを与えるためのポンプと、
（ｉｖ）少なくとも２つの液体のインライン混合用の静止型混合器と、
（ｖ）液体混合物用の出口と
を含み、ポンプがインライン混合用のデバイスの上流にあり、ポンプとインライン混合用のデバイスとの両方が、マルチインレット流れの下流に位置する、装置が提供される。

第２の態様で用いることができる、液体用のフィード、マルチインレット流れ制御器、ポンプ、および静止型混合器は、本発明の第１の態様に関して上記で記述された通りである。

第２の態様の装置は、一般に処理操作で使用される、特に生体処理操作で使用される、酸および／または塩溶液を混合することなどにより、液体混合物、好ましくは溶液、例えば緩衝溶液の調製に用いることができる。溶液は、例えば処理操作、特に生体処理操作で使用する前に貯蔵されてもよく、または、例えば混合物を使用するデバイスに液体混合物用の出口を流体接続することによって、直接使用されてもよい。

本発明の第２の態様の装置は、本発明の第１の態様に関する上述の追加の要素、特に、気泡トラップ、圧力センサ、温度センサ、ｐＨセンサ、流量センサ、導電率センサ、空気センサ、およびＵＶセンサ、例えばＵＶ／可視多重波長センサの１つまたは複数を含んでいてもよい。前述のそれぞれの１つまたは複数が存在していてもよい。

本発明の第２の態様の装置は、好ましくは、単一のポンプを含む。ある特定の非常に好ましい実施形態では、ポンプは、第４級ダイアフラムポンプである。
本発明の第２の態様の装置に用いられる静止型混合器は、好ましくは時間遅延分割流静止型混合器である。

多くの実施形態において、本発明の第２の態様の装置は、プログラム可能制御ユニット、好ましくはコンピューターの制御下で操作される。
本発明の第２の態様の装置は、有利には、生成される液体の組成物を調節する複雑なフィードバック機構を組み込む必要なしに、操作することができる。

本発明の装置で用いることができる液体は、適切な処理ユニット操作を実施するための当技術分野で公知のものを含む。その例には、ｐＨが２．５から１４の範囲にあるものなどの酸性、中性、および塩基性溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、または水酸化アンモニウム溶液、リン酸、硫酸、塩酸、または酢酸溶液；塩溶液、例えば約３Ｍまでの塩濃度を有する溶液であって、ナトリウム、カルシウム、カリウム、およびアンモニウム塩を含むもの、例えばリン酸塩、塩化物、酢酸塩、クエン酸塩、および硫酸塩；緩衝溶液であって、その例は、当技術分野で周知のもの；還元剤（例えば、ＤＴＴおよびＴＣＥＰ）；アミノ酸（例えば、ヒスチジン、アルギニン、グリシン）；洗浄剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）、および水混和性溶媒、例えばポリオール、例えばグリセロールおよびＰＥＧ；ならびに前述の１つまたは複数の混合物が含まれる。

本発明を使用して処理することができる生体分子には、例えば、ｐＤＮＡ；細胞療法剤、ワクチン、例えばウイルスワクチン、遺伝子療法生成物、糖、封入体、特にポリペプチドを含む封入体；および特に組換えポリペプチドが含まれる。

ｐＤＮＡは、超螺旋、直鎖、および開環（即ち、ニックまたは弛緩型）アイソフォームなど、複数の形態の１つまたは複数であってもよい。超螺旋ｐＤＮＡアイソフォームは、共有結合により閉環した環状であり、ｐＤＮＡは、宿主酵素系の作用によって宿主細胞内で負の超螺旋をとる。開環アイソフォームでは、ｐＤＮＡ二重鎖の１本の鎖が、１つまたは複数の場所で破断されている。

ｐＤＮＡを生成するための方法は、当技術分野で周知である。ｐＤＮＡは、天然であっ
ても人工であってもよく、例えば、外来ＤＮＡインサートを有するクローニングベクターである。多くの実施形態において、ｐＤＮＡは、１キロベースから５０キロベースの範囲のサイズである。例えば、発現した干渉ＲＮＡをコードするｐＤＮＡは、典型的には３キロベースから４キロベースの範囲のサイズである。

ポリペプチド、特に組換えポリペプチドは、サイトカイン、成長因子、抗体、抗体断片、免疫グロブリン様ポリペプチド、酵素、ワクチン、ペプチドホルモン、ケモカイン、受容体、受容体断片、キナーゼ、ホスファターゼ、イソメラーゼ、ヒドロラーゼ、転写因子、および融合ポリペプチドを含めた、治療用タンパク質およびペプチドを含む。

抗体は、前述のいずれかの多価および／または多特異的形態を含めた、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および生物活性を有する抗体断片を含む。
天然に生ずる抗体は、典型的には４つのポリペプチド鎖であって、ジスルフィド結合によって相互に接続された２つの同一の重（Ｈ）鎖と２つの同一の軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、可変領域（Ｖ_Ｈ）および定常領域（Ｃ_Ｈ）を含み、Ｃ_Ｈ領域はその天然形態において３つのドメインＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、可変領域（Ｖ_Ｌ）と、１つのドメインＣ_Ｌを含む定常領域を含む。

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域と、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的な領域が散在する領域とに、さらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとで構成され、下記の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。

発現することができる抗体断片は、インタクトな抗体の一部を含み、上記部分は所望の生物活性を有する。抗体断片は、一般に、少なくとも１つの抗原結合部位を含む。抗体断片の例には：（ｉ）Ｖ_Ｌ、Ｃ_Ｌ、Ｖ_Ｈ、およびＣ_Ｈ１ドメインを有するＦａｂ断片；（ｉｉ）Ｆａｂ派生体、例えばＣ_Ｈ１ドメインのＣ末端で１つまたは複数のシステイン残基を有するＦａｂ’断片であって、２つのＦａｂ派生体の間のジスルフィド架橋によって２価の断片を形成することができるもの；（ｉｉｉ）Ｖ_ＨおよびＣ_Ｈ１ドメインを有するＦｄ断片；（ｉｖ）Ｆｄ派生体、例えばＣ_Ｈ１ドメインのＣ末端に１つまたは複数のシステイン残基を有するＦｄ派生体；（ｖ）抗体の単一アームのＶ_ＬおよびＶ_Ｈドメインを有するＦ_ｖ断片；（ｖｉ）Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈドメインが共有結合した一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などの一本鎖抗体分子；（ｖｉｉ）定常領域があるまたはない、別の可変ドメイン（Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌドメインポリペプチド）に結合した、定常領域ドメインがないＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインポリペプチド（例えば、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｈ、Ｖ_Ｈ－Ｖ_Ｌ、またはＶ_Ｌ－Ｖ_Ｌ）（ｖｉｉｉ）ドメイン抗体断片、例えばＶ_ＨドメインまたはＶ_Ｌドメインからなる断片、およびＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインのいずれかの抗原結合断片、例えば単離されたＣＤＲ領域；（ｉｘ）同じポリペプチド鎖に、２つの抗原結合部位、例えば軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に接続された重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を含む、いわゆる「二重特異性抗体」；および（ｘ）相補的軽鎖ポリペプチドと一緒になって１対の抗原結合領域を形成する、１対のタンデムＦｄセグメントを含む、いわゆる直鎖状抗体が含まれる。

封入体は、最も一般的にはポリペプチドを、特に組換えポリペプチドを含む、大腸菌などの細菌細胞の細胞質中に形成された不溶性凝集体を含む。
組換えポリペプチドなどの生体分子を処理するための、最も特定すると組換えポリペプチドを精製または単離するための方法は、本発明のさらなる態様を形成する。

本発明による装置の一実施形態を示す図である。 実験の結果を示す図であり、カラムをバイパスに配置したときの緩衝剤プライムブロックを含めた実験全体の、導電率、ｐＨ、およびＡ_２８０吸光度に関するセンサの読取りを示す図である。 実験の結果を示す図であり、カラム上にポンプ送出された緩衝剤の導電率を示す図である。 実験の結果を示す図であり、カラム後の導電率、ｐＨ、およびＡ_２８０吸光度を示す図である。

本発明による装置の一実施形態について、図１を参照しながら記述する。生体処理操作を行うための第１のデバイスは、標的生体分子を含む液体用のフィード１と、６つの異なる緩衝剤用のフィード２ａから２ｆに加えて、注射用水のフィード２ｇとを含むものが提供される。各フィードは、ストレートスルーダイアフラム弁３および３ａから３ｇを備え、流れをオンまたはオフに切り換えることができるように取り付けられている。図示される実施形態では、緩衝剤フィード２ａおよび２ｂ、２ｃおよび２ｄ、ならびに２ｅおよび２ｆが、それぞれ弁３ａから３ｆの下流で組み合わされて、３本の緩衝剤供給ラインを形成し、それらが注射用水フィード２ｇと共に、高速作動ソレノイドアクチュエータを有する単一の出口を持つ４弁マニホールドを含むマルチインレット流れ制御器４の、異なる入口に流体接続される。この構成により、かつ弁３ａおよび３ｂ、３ｃおよび３ｄ、ならびに３ｅおよび３ｆの適切な開閉により、緩衝剤２ａおよび２ｂ、２ｃおよび２ｄ、または２ｅおよび２ｆの間での選択が可能になり、それによって、装置の操作の柔軟性が増大する。マルチインレット流れ制御器４からの出口は、標的生体分子を含む液体用のフィード１と、ポンプ６の上流５で流体接続され、気泡トラップを備えた静止型混合器８を通して、第１のクロマトグラフィーカラム１２の入口へと、組み合せたフィードの流れが与えられる。ポンプ６からクロマトグラフィーカラム１２へと、産出物を供給するラインは、圧力センサ７、空気センサ９、流量計１０、例えば超音波流量計、および温度および導電率を組み合せたセンサ１１を備える。一部の実施形態では、ポンプ６は、流量計１０からのフィードバック信号２９に応答して、プログラム可能制御ユニットを介して制御される。一部の実施形態では、任意選択でマルチインレット流れ制御器４は、導電率および温度センサ１１からのフィードバック信号２８に応答して、プログラム可能制御ユニットを介して制御される。クロマトグラフィーカラム１２からの出口ラインには、圧力センサ１３、温度および導電率を組み合せたセンサ１４、ＵＶ検出器、例えばＵＶ／可視多重波長検出器１５、ｐＨ計１６、および可変位置弁３０であって、所望の場合、圧力を調節しかつ背圧を加えるのに用いることができるものが設けられる。好ましくは、ポンプ６および可変位置弁３０の操作、およびそれによる装置の圧力の調節は、圧力センサ７および１３からのフィードバック信号２６および２７に応答して、プログラム可能制御ユニットを介して制御される。出口ラインは、一連の弁１７、１９、および２０を通過し、出口フィード１８、廃棄物用フィード２１、または出口フィード２２の間で流れを制御することが可能になり、例えば収集またはサンプリングが可能になる。装置はさらに、操作中に必要に応じてカラム１２をバイパスするように流れの進路を変えることが可能になる弁２３ａおよび２３ｂと、カラムを通る流れを止めることが可能なさらなる弁２４および２５とを備える。次いで出口フィード１８を、図１に示されるように構成された、生体処理操作を行なうための第２のデバイス内に標的生体分子を含む供給ラインとして用いることができるが、好ましくは、クロマトグラフィーカラム１２は、異なるタイプのクロマトグラフィーまたは非クロマトグラフィー単位操作などの単位操作を行なうための異なる手段で置き換えられ、単位操作を行なうための第２のデバイスでは、フィード１は、単位操作を行なうための第１の手段からの出口フィード１８を含む。

操作の１つの方法では、弁３を開き、一方で弁３ａから３ｇを閉じ、生体分子を含む液体をポンプ６によってカラム１２に供給して、カラムに生体分子を投入し、例えば生体分
子がモノクローナル抗体である場合には、タンパク質Ａ親和性樹脂を含むカラムに投入し、モノクローナル抗体がタンパク質Ａ樹脂に選択的に結合するようにする。所望の投入が終了したら、弁３を閉じ、弁３ａから３ｇの１つまたは複数を開いて、生体処理液２ａから２ｇの１つまたは複数を、カラム１２に通してポンプ送出することが可能になる。一部の実施形態では、最初に弁３ａのみを開き、マルチインレット弁４は、洗浄緩衝剤であってもよい緩衝剤２ａが供給される入口弁を開くように操作し、したがって投入済みのカラムは緩衝剤２ａで洗浄されるようになる。所望の洗浄段階が終了したら、弁３ａが開いたまま、または閉じた状態のいずれかで、弁３ｂから３ｇの１つまたは複数を開いてもよい。マルチインレット弁４の入口弁は、生体処理液２ｂから２ｇまたはこれらの混合物をカラム１２に通してポンプ送出させるために、開放する。マルチインレット弁４の弁、および／または弁３ａから３ｇの開閉を制御することによって、カラムに供給される生体処理液の組成を、所望に応じて変化させ制御することができる。例えば、弁３ｂ、３ｃ、および３ｅが開くと、マルチインレット流れ制御器で開いている入口弁を変更しかつその他を閉じることにより、供給される液体の組成を段階的に変化させることが可能になる。別の実施例では、マルチインレット流れ制御器４の入口弁の２つ以上を、所与の頻度で、かつ生体処理液の所与の混合物をカラム１２に供給することができるよう選択された期間にわたり、開閉することができる。マルチインレット弁４の入口弁が開閉される時間および／または頻度の調節は、カラムに供給される液体の組成を変化させる。時間および／または頻度を段階的に変化させる場合、組成も段階的な様式で変化する。時間および／または頻度が、ある期間にわたって徐々に変化する場合、組成も徐々に変化し、カラム１２に勾配を与えることが可能になる。いずれか望ましい方法により、カラムに供給された液体組成物は、生体分子をカラムから溶出させる組成物に変化する。溶出前に、カラム１２から出て行く液体を、出口２２を介して収集するかまたは廃棄物２１に送るかのいずれかを行い、弁１７、１９、および２０を相応に設定する。生体分子の溶出では、弁１９および２０を閉じ、弁１７を開いて、生体分子を第２の単位操作１８へ通す。

単位操作を行なうための第２の手段の操作は、第１の単位操作に関して実質的に上述の通りとすることができる。単位操作１８を行なうための第１の手段の出口ラインに等しい出口ラインを通して単位操作を行なうために第２の手段から出て行く生体分子は、回収されかつそのまま使用されてもよく、または１つもしくは複数のさらなる単位操作に供されてもよいことが、認識されよう。そのようなさらなる単位操作は、従来の装置、または図１に示される構成によるもしくはそれ以外は本発明による装置を用いてもよい。

本出願は、以下の実施例により限定されることなく例示される。
クロマトグラフィープロセス操作では、タンパク質がクロマトグラフィー樹脂に結合され、種々の塩濃度の緩衝剤で洗浄され、次いで高塩濃度緩衝剤を使用することによって除去（溶出）される。例として、組換えラクトフェリンを、塩化ナトリウム濃度が０から１ＭであるｐＨ７．５のリン酸ナトリウム緩衝液を使用して２．３Ｌ ＰＯＲＯＳ－ＸＳ陽イオン交換樹脂カラムに結合し、そこから溶出した。これを、弁２３ｂを単純な流体接続で置き換えたこと以外、図１に示される特徴を含む完全に使い捨て可能な流路を備える単一の自立型ユニットで行なった。ストック溶液を、下記の順で入口に結合させた：２Ｍの塩化ナトリウムを入口２ａに結合させた；０．１Ｍの二塩基性リン酸ナトリウムを入口２ｃに結合させた；０．０１Ｍの一塩基性リン酸ナトリウムを入口２ｅに結合させた；水を入口２ｇに結合させた；およびタンパク質供給材料を、試料入口１に結合させた。緩衝剤は、マルチインレット流れ制御器４、および下流ポンプ６、および静止型混合器８の動作を通して所望の緩衝剤組成物が生成されるように、ストック溶液のそれぞれを比例的に選択することにより生成した。適正な緩衝剤組成物を確立する間、カラム１２は、弁２４および２５を閉じた状態で弁２３ａを経てバイパスさせ、望ましくない緩衝剤は廃棄物２１に導かれた。緩衝剤が、上流導電率センサ１１から定常的に読み取ることによって示されるように、均質になったら、緩衝剤を、弁２４および２５を開きかつ弁２３ａでバイパス
ラインを閉じることにより、クロマトグラフィーカラム１２に供給した。プロセス条件を、カラム１２の下流の導電率、ＵＶ、およびｐＨセンサ１４、１５、および１６を使用してモニタした。カラムの調整中、カラムへのタンパク質の結合の前および水の濯ぎの使用後に、液体を廃棄物２１に導いた。調整後、クロマトグラフィー樹脂に、ポンプ６の動作によって試料入口１を通して引き入れ、静止型混合器８を通してカラム１２上に押し出されたタンパク質を投入した。カラムからの流通を、出口フィード１８を通して収集し、一方、第１の低塩緩衝剤洗浄物を、出口フィード２２を通して収集し、第２の中塩緩衝剤洗浄物を、出口フィード１８を通して収集した。最後に、タンパク質を、高塩溶出緩衝剤を使用してカラムから回収し、出口フィード２２を通して収集した。

３つの処理緩衝剤を、表１に列挙されるような、特定の比の塩、酸、塩基、および水を使用して、システムに結合された４つのストック溶液から生成した：２５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．５±０．１（低塩）；２５ｍＭのリン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム ｐＨ７．５±０．１（中塩）、および２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１．０Ｍの塩化ナトリウム ｐＨ７．５±０．１（高塩）。４つのストック濃度を使用して、クロマトグラフィーカラムに充填し（高塩）、平衡にし（低塩）、洗浄し（低塩および中塩）、３１Ｌ／時で溶出した（高塩）。２５ｍＭのリン酸ナトリウム ｐＨ７．５に溶解した３Ｌの０．８ｇ／Ｌラクトフェリンを、カラム上に投入し、追って２Ｌの事前に作製された２５ｍＭ リン酸ナトリウムを１５Ｌ／時で投入した。実験の結果を図２から４に示す。図２は、カラムをバイパスに配置したときの緩衝剤プライムブロックを含めた実験全体の、導電率、ｐＨ、およびＡ_２８０吸光度に関するセンサの読取りを示す。図３は、カラム上にポンプ送出された緩衝剤の導電率を示し、インライン緩衝剤調整が首尾良く行なわれたことを示す。図４は、カラム後の導電率、ｐＨ、およびＡ_２８０吸光度を示す。図４は、急峻な導電率の上昇および段階的な下降によって示されるように、バイパスからセンサへの、緩衝剤の、予測された残留フラッシュアウトがあり、新しい緩衝剤がカラムを通過するまでの遅延があることを示す。極めて重要な段階は溶出ステップであり、カラムは洗浄から高塩へと遷移し、結合されたタンパク質を首尾良く除去する。これは、システムの利点を実証する。即ち、システムは、単位操作への供給のためにストック溶液からのリアルタイムでのインライン調整を使用して、正確な緩衝剤を生成することができる。この実施例では、システムは、種々の処理緩衝剤の全てを事前に作製する必要なしに、ストック溶液でタンパク質を精製するのに使用される典型的な結合－溶出クロマトグラフィー実験を、首尾良く実行した。

Claims (14)

1. 標的物質を含む液体を処理するための装置であって、単位操作を実施するための少なくとも第１および第２の手段を含み、単位操作を実施するための前記第１および第２の手段の各々が、
   （ｉ）可変流入口弁および出口を含む流れ制御器の入口に流体接続される液体用のフィードであって、単位操作を実施するための前記第１および第２の手段の少なくとも一方が、少なくとも２つの液体用のフィードを含み、前記液体用のフィードは、前記少なくとも２つの液体を投与するための２つ以上の可変流入口弁を含むマルチインレット流れ制御器の入口に流体接続され、前記流れ制御器は出口を含む、フィードと、
   （ｉｉ）前記流れ制御器の前記出口に流体接続される前記標的物質を含む液体供給材料用のフィードであって、それによって、前記標的物質を含む液体用のフィードと、混合された生体処理液との組合せが、デバイスフィードを生成することを可能にする、フィードと、
   （ｉｉｉ）デバイス入口およびデバイス出口を含む、処理操作を実現するためのデバイスであって、前記デバイス入口が、前記デバイスフィードに流体接続される、デバイスと、（ｉｖ）前記流れ制御器を通して、かつ前記液体供給材料用のフィードから前記デバイス入口を介して前記処理デバイスを経て、流れを与えるための手段と
   を含み、
   単位操作を実施するための前記第２の手段に関する前記標的物質を含む前記液体供給材料用のフィードは、単位操作を実施するための前記第１の手段の出口を含む、装置。
2. 前記単位操作が、クロマトグラフィー、ウイルス不活性化、濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、精密濾過、インラインコンディショニング、およびリフォールディングから選択され、それぞれの場合に、前記標的物質が組換えポリペプチドを含む、請求項１に記載の装置。
3. 流れを与えるための前記手段が、前記供給原料と前記流れ制御器の前記出口との間の接続の間の流体接続の下流に位置する単一のポンプを含む、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記ポンプが、生体処理操作を実現するための前記デバイスの上流に位置する、請求項３に記載の装置。
5. 単位操作を実施するための前記手段は直列に接続され、単位操作を実施するための後続の手段に関する前記標的物質を含む前記液体供給材料用のフィードは、単位操作を実施するための先行する手段の出口を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の装置。
6. 各単位操作が、他の単位操作とは異なる、請求項１から５のいずれか一項に記載の装置。
7. 単位操作を実施するための各手段が、実質的に同じ流路を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
8. （ｉ）少なくとも２つの液体用のフィードと、
   （ｉｉ）少なくとも２つの液体を混合するための２つ以上の可変流入口弁を含むマルチインレット流れ制御器であって、単一の出口を含む、マルチインレット流れ制御器と、
   （ｉｉｉ）前記流れ制御器の前記出口と流体接続される、前記標的物質を含む液体供給材料用のフィードと、
   （ｉｖ）典型的にはポンプを使用することにより、前記流れ制御器を通して、かつ前記
   液体供給材料用のフィードからフィード入口を介して生体処理装置を経て、流れを与えるための手段と、
   （ｖ）前記少なくとも２つの液体の均質混合を確実にするためのデバイスと、
   （ｖｉｉ）プロセス液から気泡を捕捉するためのデバイスと、
   （ｖｉｉ）デバイス入口およびデバイス出口を含み、前記デバイス入口が、前記フィード入口に流体接続される、生体処理操作を実現するための共通流路とを含み、
   （ｖｉｉｉ）前記デバイス入口および出口は、クロマトグラフィー、濾過（ウイルス濾過を含む）、十字流濾過、単回通過十字流濾過、リフォールド、およびウイルス不活性化に使用されるモジュールと流体接続されており、さらに
   （ｉｘ）前記デバイス入口および出口をバイパスする手段と、
   （ｘ）圧力を調節するための、前記デバイス出口の下流の手段と、
   （ｘｉ）前記デバイス入口およびデバイス出口の上流および下流で生体処理操作をモニタリングするのに適した複数のセンサと、
   （ｘｉｉ）前記フィード入口に流体接続される、少なくとも１つの出口と
   を含む、請求項１に記載の装置。
9. 液体混合物を調製するための装置であって、
   （ｉ）少なくとも２つの液体用のフィードと、
   （ｉｉ）少なくとも２つの液体を投与するための、２つ以上の可変流入口弁を含み、出口も含む、マルチインレット流れ制御器と、
   （ｉｉｉ）前記流れ制御器を通して、かつ液体供給材料用のフィードからフィード入口を介して生体処理装置を経て、流れを与えるためのポンプと、
   （ｉｖ）前記少なくとも２つの液体のインライン混合用の静止型混合器と、
   （ｖ）液体混合物用の出口と
   を含み、前記ポンプがインライン混合用のデバイスの上流にあり、前記ポンプと前記インライン混合用のデバイスとの両方が、マルチインレット流れの下流に位置する、装置。
10. 単一のポンプを含む、請求項９に記載の装置。
11. 前記静止型混合器が、時間遅延分割流静止型混合器である、請求項９または１０のいずれかに記載の装置。
12. 請求項９、１０、および１１のいずれか一項に記載の装置を使用して、液体、好ましくは酸および／または塩溶液を混合するステップを含む、緩衝溶液を調製するための方法。
13. 請求項１から１１のいずれか一項に記載の装置を使用して、生体分子を処理するステップを含む、生体分子を調製するための方法。
14. 前記生体分子が組換えポリペプチドである、請求項１３に記載の方法。
    

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