CN111741966A - 用于处理包括目标物质的液体的设备 - Google Patents

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Abstract

提供用于处理包括目标物质(优选为生物分子)的液体的设备。设备至少包括用于执行单元操作的第一器件和第二器件，用于执行单元操作的每个器件包括：用于液体的供给，其与包括可变流量入口阀和出口的流量控制器的入口流体连接，其中用于执行单元操作的器件中的至少一个包括用于至少两股液体的供给，该供给与多入口流量控制器的入口流体连接，该多入口流量控制器包括用于计量至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，该流量控制器还包括出口；用于包括目标物质的液体给料的供给，其与出自流量控制器的出口流体连接，从而允许用于包括目标物质的液体的供给与混合的生物处理液体组合以产生装置供给；用于实现处理操作的装置，其包括装置入口和装置出口，该装置入口与装置供给流体连接；以及用于给予通过流量控制器的流动和从用于液体给料的供给经由装置入口通过处理装置的流动的器件；且其中对于用于执行单元操作的第二器件的用于包括目标物质的液体给料的供给包括出自用于执行单元操作的第一器件的出口。

Description

用于处理包括目标物质的液体的设备
本发明涉及用于处理包括目标物质的液体(特别是包括生物分子且尤其是重组多肽的液体)的方法和设备。
许多生物分子，尤其是重组多肽和核酸，诸如质粒(pDNA)，已吸引大量关注，特别是对于治疗性应用。此类生物分子通常通过培养重组宿主细胞来产生，该重组宿主细胞经改造以表达期望的生物分子。生物分子然后通过典型地包括多个单元操作的方法来从培养介质回收。这些单元操作通常包括一种或多种层析纯化、病毒灭活、过滤(包括病毒过滤、深度过滤和绝对过滤)、再折叠和超滤/渗滤。
用于处理包括目标物质的溶液的设备在本领域中是已知的。然而，用于此类化合物的商用制造中的设备极其庞大，且需要大量的占地空间和基础设施。另外，虽然对于单元操作中的若干可实现设备的某种通用性，用于某些单元操作(诸如病毒灭活和/或超滤)的设备设计基本不同于用于例如层析纯化的那些。这意味着需要更多空间来容纳两组或更多组设备，或用于阶段的设备的互操作性和控制是异常复杂的。此外，操作者需要对所采用的不同类型的设备中的每种进行训练。因此，将期望简化且广泛适用的设备。还将期望确定允许多个处理步骤采用共同流径来执行的设备。
根据本发明的第一方面，提供用于处理包括目标物质的液体的设备，所述设备至少包括用于执行单元操作的第一器件和第二器件，用于执行单元操作的每个器件包括：
(i)用于液体的供给，该供给与包括可变流量入口阀和出口的流量控制器的入口流体连接，其中用于执行单元操作的器件中的至少一个包括用于至少两股液体的供给，该供给与多入口流量控制器的入口流体连接，该多入口流量控制器包括用于计量至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，该流量控制器还包括出口；
(ii)用于包括目标物质的液体给料的供给，该供给与出自流量控制器的出口流体连接，从而允许用于包括目标物质的液体的供给与混合的生物处理液体组合以产生装置供给；
(iii)用于实现处理操作的装置，该装置包括装置入口和装置出口，该装置入口与装置供给流体连接；以及
(iv)用于给予通过流量控制器的流动和从用于液体给料的供给经由装置入口通过处理装置的流动的器件；
其中对于用于执行单元操作的第二器件的用于包括目标物质的液体给料的供给包括出自用于执行单元操作的第一器件的出口。
在一些实施例中，设备包括用于执行单元操作的两个器件。在其它实施例中，设备包括用于执行单元操作的三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或更多个器件，其优选地各自具有上文关于第一器件和第二器件所描述的特征。在许多优选实施例中，用于执行单元操作的器件与对于用于执行单元操作的后续器件的用于包括目标物质的液体给料的供给串联连接，该供给包括出自用于执行单元操作的前面器件的出口。在许多高度优选的实施例中，每个单元操作不同于其它单元操作。
在某些实施例中，用于执行单元操作的每个器件包括基本相同的流径。
用于给予液体流动的方法在本领域中是众所周知的，且包括对液体施加气体压力，尤其是惰性气体，诸如氮或氦。优选地，用于给予液体流动的器件包括一个或多个泵。可采用的泵包括蠕动泵、隔膜泵、叶片泵和离心泵。可采用一次性和可重复使用的泵设计。在许多优选实施例中，对于执行单元操作的每个器件采用单个泵，其位于给料与出自流量控制器的出口之间的连接之间的流体连接件的下游。最优选地，泵位于生物处理装置的上游。所选泵的类型和尺寸通常取决于适于设备规模和设计参数的流量和压力曲线。在某些高度优选的实施例中，泵为四级隔膜泵。
流量控制器包括可变流量(优选为间歇流量)入口阀，其调节通过流量控制器的液体流量。多入口流量控制器包括至少2个入口阀，且在许多情况下包括最多达8个，诸如3、4、5、6或7个入口阀。入口阀可各自具有相同的尺寸，或者入口阀中的一个或多个可具有不同的尺寸。在某些优选实施例中，从每个入口阀到流量控制器的出口所测量的体积对于每个入口是相同的，且高度优选的是，从每个入口阀到流量控制器的出口所测量的体积和路径长度对于每个入口是相同的。在许多实施例中，用于执行单元操作的每个器件优选地包括多入口流量控制器。
本发明中采用的流量控制器还包括至少一个出口，且虽然可存在两个或更多个出口，优选的是采用单个出口。
可变流量阀可在第一相对低的流速(其中液体仍能够流动)与至少第二较高的流速之间调节流量。在优选实施例中，可变流量阀为间歇流量阀，其在第一位置中防止流动，但在至少第二位置中允许流动。最优选地，所有的阀为间歇流量阀。阀可包括本领域中已知的促动器，诸如气动的或优选为螺线管促动器。
优选地，控制可变流量阀(最优选地通过可编程控制单元)，以调节阀的打开和关闭，以便实现流过多入口流量控制器的输入液体的所需相对量。这优选地通过下者来实现：以预定的时间周期或循环速率通过流量控制器中的入口阀来循环，且根据循环时间的所需比例来调节阀的打开或关闭以生成期望的成分。循环速率可为恒定或变化的。最优选地，采用间歇流量入口阀，且控制它使得在操作中在任何给定时间仅打开一个阀。在许多实施例中，多入口流量控制器的循环速率保持为常量，且输入液体的期望相对量保持一致。
在许多实施例中，采用多个循环。所采用的循环数量将取决于许多因素，诸如过程的持续期、所处理液体的体积、流速和设备的最大操作压力。在某些实施例中，可采用至少10个循环，诸如至少50、100、500、750、1000、1500、2000、3000、5000、7500、10000个或更多个循环。
将认识到，可采用一定范围的循环频率。在许多情况下，频率小于100Hz，典型地小于50Hz，通常小于10Hz，且优选地小于5Hz。在某些优选实施例中，频率为2Hz或更小，最优选为1Hz或更小，诸如从0.05至0.5Hz。
虽然混合可通过简单地组合目标供给和流量控制器出口的流(可选地与泵的作用组合)来实现，在许多优选实施例中，设备还包括在线(in-line)混合器，优选为混合室，优选地包括静态混合器，最优选为延时的分流静态混合器。在许多实施例中，在线混合器位于泵的下游且在用于实现生物处理操作的装置的上游。在一些优选实施例中，在线混合器还包括气泡捕集器。
可由用于实现处理操作的装置来执行的单元操作最优选为生物处理操作。生物处理操作包括层析、病毒灭活、过滤、再折叠、超滤、渗滤、微滤、在线调节和再折叠。
可使用本发明的设备来执行的层析操作包括亲和层析、离子交换(阴离子和阳离子交换中的一种或两种)层析、疏水作用层析(HIC)、反相层析、膨胀床层析、混合模式层析、膜层析和尺寸排阻层析(SEC)。在许多实施例中，蛋白A亲和层析包括单元操作中的至少一个。用于执行层析操作的装置包括适当的层析设备，诸如膜、纤维整体(monolith)或柱。将根据目标生物分子的性质来选择层析单元操作的数量和顺序。
可使用本发明的设备来执行的病毒灭活单元操作通常包括存储容器，其中包括目标生物分子的液体可在有足以使病毒灭活的停留时间的条件下存储。在某些实施例中，装置的出口和入口可流体地连接以生成再循环回路。在一个此类实施例中，设备设置有在“装置”入口与“装置”出口之间流体连接的容器或袋，且设备出口中的一个流体地连接到多入口流量控制器入口中的一个。流体地连接到液体给料入口的装置“入口”与“出口”之间的容器或袋由给予流动的器件(典型为泵)来填充，或用通过其它多入口流量控制器入口中的至少一个的至少一股其它液体来调节。在某些实施例中，容器或袋为混合容器或袋。当包括目标物质的溶液由流体地连接到多入口流量控制器上的至少一个其它入口的至少一股额外液体来调节时，过程液体通过多入口流量控制器的入口再循环到容器或袋且回到多入口流量控制器的入口。
可执行的过滤单元操作包括病毒过滤、深度过滤和绝对过滤、超滤、渗滤以及微滤。在许多实施例中，过滤单元操作包括在装置入口与装置出口之间的过滤器模块。过滤器模块使用附接到多入口流量控制器入口的至少两股液体供给来冲洗和追迹(chase)，且包括目标分子的溶液流体地连接到给料入口。通过过滤器的液体的处理通过给予流动的器件来实现，该器件流体地连接到多入口流量控制器出口和给料入口且定位在多入口流量控制器出口和给料入口的下游和过滤器模块的上游。过滤器模块通常采用生物处理领域中众所周知的构造。
病毒过滤、深度过滤和绝对过滤是本领域中众所周知的单元操作，且可使用本发明的设备(其通常采用生物处理领域中众所周知的过滤器装置)来执行。在许多实施例中，一个或多个过滤器装置置于装置入口与装置出口之间，以便执行特定的单元操作。在其它实施例中，过滤器装置定位在设备出口的下游，其在某些实施例中允许设备执行主要单元操作，诸如层析、病毒灭活、切向流过滤、病毒过滤或深度过滤，随后是二次过滤操作。
可使用本发明的设备来执行的切向流过滤(“TFF”)单元操作包括常规的再循环TFF和单程TFF。在某些实施例中，设备的出口和入口可流体地连接以生成再循环回路，示例为再循环切向流过滤。在一个实施例中，如本领域中已知的，设备设置有TFF模块，该TFF模块包括在装置入口与装置出口之间的平板、中空纤维或螺旋卷绕的膜，且来自TFF模块的渗余物从设备出口中的一个引导到容器或袋(包含至少一个入口和一个出口)上流体连接的入口。容器或袋的出口流体地连接到液体给料入口。使用辅助器件将容器或袋保持在恒定水平处，以将给料或液体通过流体地连接到容器或袋上的第二入口来供应到容器或袋中。在另一实施例中，设备设置有TFF模块，该TFF模块包括在装置入口与装置出口之间的平板、中空纤维或螺旋卷绕的膜，且来自TFF模块的渗余物从设备出口中的一个流体地连接回到多入口流量控制器阀的入口中的一个。在某些实施例中，从设备出口到其入口的再循环回路包含断开的(break)容器或袋。由用于给予流动的器件(典型为泵)来使包括目标物质或液体的溶液通过液体给料入口吸入到再循环回路。渗余物通过TFF模块(优选地通过多入口流量控制器入口中的一个)再循环。可采用多入口流量控制器来将渗余物与至少一股其它液体混合。再循环TFF的操作在本领域中是众所周知的，且通过设置错流速率和跨膜压力来控制。
在某些实施例中，单程TFF可构造有TFF模块，该TFF模块包括在装置入口与装置出口之间的平板、中空纤维或螺旋卷绕的膜(例如，如在单程TFF如WO2017/118835中所描述那样的情况下)。
在一些实施例中，可采用单程TFF和再循环TFF的混合，其中使用TFF模块下游的可变流量阀来生成的渗余物返回到供给容器。
根据本发明的设备通常另外包括气泡捕集器、压力传感器、温度传感器、pH传感器、流速传感器、传导率传感器、空气传感器和uv传感器(诸如uv/可见多波长传感器)中的一种或多种。可存在前述每种中的一个或多个。
在本发明的一个特定实施例中，提供用于处理包括目标物质的液体的设备，所述设备包括：
(i)用于至少两股液体的供给；
(ii)多入口流量控制器，该多入口流量控制器包括用于混合至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，该流量控制器还包括单个出口；
(iii)用于包括目标物质的液体给料的供给，该供给与出自流量控制器的出口流体连接；
(iv)用于(典型地利用泵)给予通过流量控制器的流动和从用于液体给料的供给经由供给入口通过处理设备的流动的器件；
(v)用于混合至少两股液体的装置；
(vii)用于从过程液体中捕集气泡的装置；
(vii)用于实现处理操作的共同流径，该流径包括装置入口和装置出口，该装置入口与供给入口流体连接；
(viii)装置入口和装置出口，其与用于层析、过滤(包括病毒过滤)、切向流过滤、单程切向流过滤、再折叠和病毒灭活的模块流体连接；
(ix)绕过装置入口和装置出口的器件；
(x)在装置出口下游调节压力的器件；
(xi)多个传感器，该多个传感器适于监测装置入口和装置出口上游和下游的处理操作；以及
(xii)至少一个出口，该至少一个出口与供给入口流体连接。
根据本发明的设备优选地包括用于对位于装置下游的处理装置额外加压的器件。用于施加压力的器件在本领域中是已知的，且包括夹紧阀、隔膜阀，尤其是可变位置隔膜阀。
在许多实施例中，用于混合液体的装置和用于捕集气泡的装置包括单个装置。
在某些实施例中，设备包括由诸如不锈钢之类的材料所构造的多次使用的流径，该材料在需要替换之前允许相当多次的重复使用。
在某些实施例中，设备包括由诸如塑料之类的材料所构造的单次使用的流径，该材料设计有有限的寿命且用作一次性消耗品。
在许多实施例中，每个单元操作在可编程控制单元(优选为计算机)的控制下操作。在一些实施例中，单个控制单元控制两个或更多个单元操作。在其它实施例中，每个单元操作在单独的控制单元的控制下。在这些其它实施例中，优选地，每个控制单元采用共同的编程语言，其允许简化控制单元之间的通信。
根据本发明的第二方面，提供用于制备液体混合物的设备，所述设备包括：
(i)用于至少两股液体的供给；
(ii)多入口流量控制器，该多入口流量控制器包括用于计量至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，该流量控制器还包括出口；
(iii)泵，该泵用于给予通过流量控制器的流动和从用于液体给料的供给经由供给入口通过生物处理设备的流动；
(iv)用于在线混合至少两股液体的静态混合器；以及
(v)用于液体混合物的出口；
其中泵在用于在线混合的装置的上游，且泵和用于在线混合的装置两者位于多入口流的下游。
可在第二方面采用的用于液体的供给、多入口流量控制器、泵和静态混合器如上文关于本发明的第一方面所描述的那样。
第二方面的设备可用于制备通常用于处理操作且尤其是生物处理操作中的液体混合物，优选为溶液，诸如缓冲溶液，诸如通过混合酸和/或盐溶液。溶液可在使用之前(例如在处理操作中，尤其是在生物处理操作中)存储，或可直接使用(例如通过将用于液体混合物的出口流体地连接到使用混合物的装置)。
本发明的第二方面的装置可包括如上文关于本发明的第一方面所描述的额外元件，尤其是气泡捕集器、压力传感器、温度传感器、pH传感器、流速传感器、传导率传感器、空气传感器和uv传感器(诸如uv/可见多波长传感器)中的一种或多种。可存在前述每种中的一个或多个。
本发明的第二方面的设备优选地包括单个泵。在某些高度优选的实施例中，泵为四级隔膜泵。
在本发明的第二方面的设备中采用的静态混合器优选为延时的分流静态混合器。
在许多实施例中，本发明的第二方面的设备在可编程控制单元(优选为计算机)的控制下操作。
本发明的第二方面的设备可有利地操作而无需并入复杂的反馈机构来调节所产生液体的成分。
可为本发明的设备所采用的液体包括本领域中已知的用于执行适当的处理单元操作的那些。示例包括酸性、中性和碱性溶液，诸如具有在2.5至14范围内的pH的那些，例如氢氧化钠钾或铵溶液、磷酸、硫酸、盐酸或醋酸溶液；盐溶液，诸如具有最多约3M的盐浓度的溶液，包括钠盐、钙盐、钾盐和铵盐，例如磷酸盐、氯盐、醋酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐；缓冲溶液，其示例在本领域中是众所周知的；还原剂(例如DTT和TCEP)；氨基酸(例如，组氨酸、精氨酸、甘氨酸)；清洁剂(例如Tween 20、Triton-X100)和水可混溶溶剂(诸如多元醇，例如甘油和PEG)；以及前述一种或多种的混合物。
可使用本发明来处理的生物分子包括例如pDNA；细胞治疗物、疫苗(诸如病毒疫苗)、基因治疗产品、糖、包涵体(特别是包括多肽且尤其是重组多肽的包涵体)。
pDNA可呈多种形式中的一种或多种，诸如超螺旋、线性和开环(即切口或松弛)亚型。超螺旋pDNA亚型具有共价闭环形式，且pDNA通过宿主酶系统的作用在宿主细胞中负超螺旋。在开环亚型中，pDNA双链体的一股在一个或多个位置处断裂。
用于产生pDNA的方法在本领域中是众所周知的。pDNA可为天然或人工的，例如，携带外来DNA插入物的克隆媒介。在许多实施例中，pDNA在1千碱基至50千碱基的尺寸范围内。例如，编码表达干扰RNA的pDNA典型地在3千碱基至4千碱基的尺寸范围内。
多肽(尤其是重组多肽)包括治疗性蛋白和肽，包括细胞因子、生长因子、抗体、抗体片段、免疫球蛋白样多肽、酶、疫苗、肽激素、趋化因子、受体、受体片段、激酶、磷酸酶、异构酶、水解酶、转录因子和融合多肽。
抗体包括具有生物活性的单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段，包括前述任一种的多价和/或多特异性形式。
天然存在的抗体典型地包括由二硫键互连的四个多肽链、两个相同的重(H)链和两个相同的轻(L)链。每个重链包括可变区域(VH)和恒定区域(CH)，该CH区域包括呈其天然形式的三个域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括可变区域(VL)和包括一个域CL的恒定区域。
VH和VL区域可进一步细分为高变异性区域，称为互补确定区域(CDR)，其散布有更保守的区域，称为框架区域(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
可表达的抗体片段包括完整抗体的一部分，所述部分具有期望的生物活性。抗体片段大体上包括至少一个抗原结合位点。抗体片段的示例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1域；(ii)Fab衍生物，诸如在CH1域的C末端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab'片段，其可通过两个Fab衍生物之间的二硫键桥接来形成二价片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1域；(iv)Fd衍生物，诸如在CH1域的C末端处具有一个或多个半胱氨酸残基的Fd衍生物；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH域；(vi)单链抗体分子，诸如单链Fv(scFv)抗体，其中VL和VH域共价链接；(vii)VH或VL域多肽，其不带有链接到带有或不带有恒定区域的另一可变域(VH或VL域多肽)的恒定区域，(例如，VH-VH、VH-VL或VL-VL)；(viii)域抗体片段(诸如由VH域或VL域构成的片段)以及VH或VL域的抗原结合片段(诸如分离的CDR区域)；(ix)所谓的“双抗体(diabodies)”，其包括在相同多肽链中的两个抗原结合位点，例如连接到轻链可变域(VL)的重链可变域(VH)；(x)所谓的线性抗体，其包括成对的串联Fd节段，其与互补的轻链多肽一起形成成对的抗原结合区域。
包涵体包括形成在细菌细胞(诸如大肠杆菌)的细胞质中的不溶性团聚体，最通常包括多肽且尤其是重组多肽。
用于处理生物分子(诸如重组多肽且最尤其是纯化或分离的重组多肽)的方法形成本发明的另外方面。
参照图1描述根据本发明的设备的一个实施例。用于执行生物处理操作的第一装置包括用于包括目标生物分子的液体的供给1，以及用于六股不同缓冲剂的供给2a至2f，提供用于注射的加水2g。每个供给装配有阀，诸如直通隔膜阀3和3a至3g，以允许流接通或关断。在示出的实施例中，缓冲剂供给2a和2b、2c和2b以及2d和2e分别在阀3a至3f的下游组合，以形成三个缓冲剂供给线，该供给线连同用于注射的水的供给2g一起流体地连接到多入口流量控制器4上的不同入口，该多入口流量控制器4包括带有单个出口的四阀歧管，该单个出口具有快速作用的螺线管促动器。通过该构造，以及通过适当地打开和关闭阀3a和3b、3c和3d以及3e和3f，允许在缓冲器2a和2b、2c和2d或2e和2f之间选择，从而提高设备操作的灵活性。出自多入口流量控制器4的出口在泵6的上游5处与用于包括目标生物分子1的液体的供给流体连接，泵6给予组合的供给通过装配有气泡捕集器8的静态混合器且到达第一层析柱12的入口的流动。将来自泵6的输出供给到层析柱12的线装配有压力传感器7、空气传感器9、流量计10(诸如超声波流量计)以及组合的温度和传导率传感器11。在一些实施例中，响应于来自流量计10的反馈信号29经由可编程控制单元来控制泵6。在一些实施例中，可选地，响应于来自传导率和温度传感器11的反馈信号28经由可编程控制单元来控制多入口流量控制器4。来自层析柱12的出口线设有压力传感器13、组合的温度和传导率传感器14、uv检测器(诸如uv/可见多波长检测器)15、pH计16和可变位置阀30，如果期望，其可用来调节压力和施加背压。优选地，响应于来自压力传感器7和13的反馈信号26和27经由可编程控制单元来控制泵6和可变位置阀30的操作，且从而控制设备中的压力的调节。出口线通过一系列的阀17、19和20，其允许控制排出供给18、到废物的供给21或出口供给22之间的流，例如允许收集或取样。设备还装配有阀23a和23b(如果在操作期间需要，其允许流转移绕过柱12)，且还装配有阀24和25(其允许通过柱的流停止)。排出供给18然后可用作用于执行生物处理操作的第二装置中的包括目标生物分子的供给线，如图1中示出的那样构造，但其中层析柱12优选地以用于执行单元操作(诸如不同类型的层析或非层析单元操作)的不同器件替换，且其中在用于执行单元操作的第二装置中，供给1包括来自用于执行单元操作的第一器件的排出供给18。
在一种操作方法中，打开阀3，同时关闭阀3a至3g，且使包括生物分子的液体由泵6供给到柱12，以用生物分子装载柱，例如在生物分子为单克隆抗体的情况下，柱包括蛋白A亲和树脂，使得单克隆抗体选择性地结合到蛋白A树脂。在期望的装载完成时，关闭阀3，且打开阀3a至3g中的一个或多个，以允许生物处理液体2a至2g中的一股或多股泵送通过柱12。在一些实施例中，最初仅打开阀3a，且操作多入口阀4以便打开入口阀，缓冲剂2a(其可为洗涤缓冲剂)供应到该入口阀，使得用缓冲剂2a洗涤所装载的柱。在期望的洗涤阶段完成时，可打开阀3b至3g中的一个或多个，其中阀3a保持打开或关闭。打开多入口阀4上的入口阀，以便允许生物处理液体2b至2g或其混合物泵送通过柱12。通过控制多入口阀4和/或阀3a至3g上的阀的打开和关闭，可根据期望来改变和控制供给到柱的生物处理液体的成分。例如，在阀3b、3c和3e打开的情况下，改变多入口流量控制器4中打开的入口阀且关闭其它阀允许所供给的液体的成分以逐步方式改变。在另一示例中，多入口流量控制器4的入口阀中的两个或更多个可以以给定的频率打开和关闭，且在所选择的时间段内允许生物处理液体的给定混合物供给到柱12。调整多入口阀4上的入口阀打开或关闭的时间和/或频率允许改变供给到柱的液体的成分。在时间和/或频率以逐步方式改变的情况下，成分也以逐步方式改变。在一时间段内逐渐改变时间和/或频率的情况下，成分也逐渐改变，允许对柱12施加梯度。无论通过哪种期望的方法，供给到柱的液体成分改变为引起生物分子从柱洗脱的成分。在洗脱之前，从柱12离开的液体经由出口22收集，或发送到废物21，且相应地设置阀17、19和20。为了洗脱生物分子，关闭阀19和20，且打开阀17，允许生物分子传到第二单元操作18。
用于执行单元操作的第二器件的操作可基本如上文关于第一单元操作所描述的那样。将认识到，通过排出线(其等同于用于执行单元操作的第一器件的排出线18)离开用于执行单元操作的第二器件的生物分子可回收且按原样使用，或可经受一个或多个另外的单元操作。此类另外的单元操作可采用常规的设备，或根据图1中示出的构造或另外根据本发明的另外的设备。
通过以下示例而非限制性地示出本申请。
在层析过程操作中，蛋白结合到层析树脂，用不同盐浓度的缓冲剂洗涤，且然后通过使用高盐浓度的缓冲剂去除(洗脱)。例如，使用其中氯化钠浓度从0至1M的pH 7.5的磷酸钠缓冲剂来将重组乳铁蛋白结合到2.3L POROS-XS阳离子交换树脂柱且从该柱洗脱。这在带有完全一次性的流径的单个独立单元上执行，除了阀23b以简单的流体连接件替换之外，该流径包含图1中描述的特征。原液按以下顺序附接到入口：2M氯化钠附接到入口2a；0.1M磷酸氢钠附接到入口2c；0.01M磷酸二氢钠附接到入口2e；水附接到入口2g；以及蛋白供给附接到样品入口1。通过按比例地选择原液中的每种以通过多入口流量控制器4和下游泵6和静态混合器8的作用产生期望的缓冲剂成分来生成缓冲剂。在建立正确的缓冲剂成分期间，在阀24和25关闭的情况下通过阀23a绕过柱12，将不想要的缓冲剂引导到废物21。一旦缓冲剂均匀(如由来自上游传导率传感器11的稳定读数所指示的)，通过打开阀24和25且关闭阀23a处的旁路线来将缓冲剂供应到层析柱12。在柱12下游使用传导率传感器14、UV传感器15和pH传感器16来监测过程条件。在蛋白结合到柱之前柱的调节以及使用后的水冲洗期间，将液体引导到废物21。一旦调节，用由泵6的作用通过样品入口1吸入的蛋白来装载层析树脂，该蛋白通过静态混合器8推到柱12上。来自柱的流过物通过排出供给18收集，而第一低盐缓冲剂洗涤物通过出口供给22收集，且第二中等盐缓冲剂洗涤物通过排出供给18收集。最后，蛋白使用高盐洗脱缓冲剂从柱回收，且通过出口供给22收集。
从附接到系统的4种原液使用如表1中列举的特定比率的盐、酸、碱和水来生成三种处理缓冲剂：25mM磷酸钠，pH 7.5±0.1(低盐)；25mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH 7.5±0.1(中等盐)；以及25mM磷酸钠，1.0M氯化钠，pH 7.5±0.1(高盐)。使用四种原料浓缩物，以31L/h使层析柱加料(高盐)、均衡(低盐)、洗涤(低盐和中等盐)和洗脱(高盐)。将pH 7.5的25mM磷酸钠中的3L 0.8g/L乳铁蛋白装载到柱上，且以15L/h用2L预制的25mM磷酸钠追迹。运行结果在图2至图4中示出。图2示出在整个运行(包括当柱置于旁路中时的缓冲剂填装块)中关于传导率、pH和A280吸光度的传感器读数。图3示出泵送到柱上的缓冲剂的传导率，指示在线缓冲剂调节成功起作用。图4示出柱后传导率、pH和A280吸光度。图4示出从旁路到传感器有预期的残余物冲洗到缓冲剂外，且在新的缓冲剂通过柱之前有延迟，其由传导率的急剧上升和逐步下降所引起。关键阶段是洗脱步骤，其中柱从洗涤过渡到高盐且成功地去除所结合的蛋白。这证明系统的优点：它可使用实时在线调节从用于供应到单元操作中的原液生成正确的缓冲剂。在该示例中，系统成功地执行典型的结合-洗脱层析运行，其用于以原液纯化蛋白，而无需预制所有不同的处理缓冲剂。
表1. 关于在线调节的缓冲剂的传导率和pH值
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。

Claims (14)

1.用于处理包括目标物质的液体的设备，所述设备至少包括用于执行单元操作的第一器件和第二器件，用于执行单元操作的每个器件包括：
(i)用于液体的供给，所述供给与包括可变流量入口阀和出口的流量控制器的入口流体连接，其中用于执行单元操作的所述器件中的至少一个包括用于至少两股液体的供给，所述供给与多入口流量控制器的所述入口流体连接，所述多入口流量控制器包括用于计量所述至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，所述流量控制器还包括出口；
(ii)用于包括所述目标物质的液体给料的供给，所述供给与出自所述流量控制器的出口流体连接，从而允许用于包括所述目标物质的液体的供给与混合的生物处理液体组合以产生装置供给；
(iii)用于实现处理操作的装置，所述装置包括装置入口和装置出口，所述装置入口与所述装置供给流体连接；以及
(iv)用于给予通过所述流量控制器的流动和从用于所述液体给料的供给经由所述装置入口通过处理装置的流动的器件；
其中对于用于执行单元操作的所述第二器件的用于包括所述目标物质的液体给料的供给包括出自用于执行单元操作的所述第一器件的出口。
2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，在其中所述目标物质包括重组多肽的每种情况下，所述单元操作选自层析、病毒灭活、过滤、超滤、渗滤、微滤、在线调节和再折叠。
3.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其特征在于，用于给予流动的所述器件包括单个泵，所述单个泵位于所述给料与出自所述流量控制器的出口之间的连接之间的流体连接件的下游。
4.根据权利要求3所述的设备，其特征在于，所述泵位于用于实现生物处理操作的所述装置的上游。
5.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其特征在于，用于执行单元操作的所述器件与对于用于执行单元操作的后续器件的用于包括所述目标物质的液体给料的供给串联连接，所述供给包括出自用于执行单元操作的前面器件的出口。
6.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其特征在于，每个单元操作不同于其它单元操作。
7.根据前述权利要求中任一项所述的设备，其特征在于，用于执行单元操作的每个器件包括基本相同的流径。
8.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备包括：
(i)用于至少两股液体的供给；
(ii)多入口流量控制器，所述多入口流量控制器包括用于混合至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，所述流量控制器还包括单个出口；
(iii)用于包括所述目标物质的液体给料的供给，所述供给与出自所述流量控制器的出口流体连接；
(iv)用于典型地利用泵来给予通过所述流量控制器的流动和从用于所述液体给料的供给经由供给入口通过生物处理设备的流动的器件；
(v)用于确保所述至少两股液体均匀混合的装置；
(vii)用于从过程液体中捕集气泡的装置；
(vii)用于实现生物处理操作的共同流径，所述流径包括装置入口和装置出口，所述装置入口与所述供给入口流体连接；
(viii)所述装置入口和所述装置出口，其与用于层析、过滤(包括病毒过滤)、切向流过滤、单程切向流过滤、再折叠和病毒灭活的模块流体连接；
(ix)绕过所述装置入口和所述装置出口的器件；
(x)在所述装置出口下游调节压力的器件；
(xi)多个传感器，所述多个传感器适于监测所述装置入口和所述装置出口上游和下游的生物处理操作；以及
(xii)至少一个出口，所述至少一个出口与所述供给入口流体连接。
9.用于制备液体混合物的设备，所述设备包括：
(i)用于至少两股液体的供给；
(ii)多入口流量控制器，所述多入口流量控制器包括用于计量至少两股液体的两个或更多个可变流量入口阀，所述流量控制器还包括出口；
(iii)泵，所述泵用于给予通过所述流量控制器的流动和从用于液体给料的所述供给经由供给入口通过生物处理设备的流动；
(iv)静态混合器，所述静态混合器用于在线混合所述至少两股液体；以及
(v)出口，所述出口用于所述液体混合物；
其中所述泵在用于在线混合的所述装置的上游，且所述泵和用于在线混合的所述装置两者位于多入口流的下游。
10.根据权利要求9所述的设备，其特征在于，所述设备包括单个泵。
11.根据权利要求9或10所述的设备，其特征在于，所述静态混合器为延时的分流静态混合器。
12.一种用于制备缓冲溶液的工艺，所述工艺包括使用根据权利要求9、10和11中任一项所述的设备来混合液体，优选为酸和/或盐溶液。
13.一种用于制备生物分子的工艺，所述工艺包括使用根据前述权利要求中任一项所述的设备来处理所述生物分子。
14.根据权利要求13所述的工艺，其特征在于，所述生物分子为重组多肽。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201818709D0 (en) 2018-11-16 2019-01-02 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Mixer
GB201911686D0 (en) * 2019-08-15 2019-10-02 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process for purifying target substances
GB201911687D0 (en) * 2019-08-15 2019-10-02 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Apparatus for purifying a liquid comprising a target substance
JP7388206B2 (ja) * 2020-01-22 2023-11-29 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフおよび分析方法
JP7006713B2 (ja) * 2020-03-04 2022-01-24 ウシオ電機株式会社 クロマトグラフおよび試料分析方法
KR102409145B1 (ko) * 2020-03-23 2022-06-15 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 버퍼 조제 및 이송 시스템

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7515994B2 (en) * 2003-10-17 2009-04-07 Technikrom, Inc. Accurate blending module and method
US9527010B2 (en) * 2009-09-25 2016-12-27 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Separation system and method
ES2895173T3 (es) * 2012-06-29 2022-02-17 Emd Millipore Corp Métodos para inactivar virus durante un proceso de purificación de proteínas
GB201600290D0 (en) * 2016-01-07 2016-02-24 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process
GB201600287D0 (en) 2016-01-07 2016-02-24 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Process

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