JP2019507116A - エストロゲン受容体を活性化する新規化合物ならびにその組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全内容が本明細書に援用されている、2016年1月6日に出願された米国仮出願第62/275,416号に対する優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたAT006288、DK015556、およびHL087564、および米国農務省によって授与されたILLU-698-909による政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
エストロゲンは多くの必須の生理学的過程を調節し、生殖系の内外の多くの成人標的組織の機能維持に必要である。しかしながら、エストロゲンは乳癌や子宮癌を促進する上で有害な行動を起こす可能性がある。多様な標的組織における望ましい活性と望ましくない活性とのこのバランスは、骨の健康、血管運動の症状からの寛解、および乳房または子宮の刺激なしに代謝と血管の保護を与えるような更年期ホルモン置換の最小限のリスクによる正味の利益を提供する組織選択的エストロゲンの開発にとって興味深い機会を与える。
2つの異なるシグナル伝達経路を利用することによって、エストロゲンがエストロゲン受容体(ER)を介して作用することが現在認識されており、2つの異なるシグナル伝達経路は、ERがクロマチン結合リガンド調節転写因子として機能する直接核開始(「ゲノム」性)経路と核外からのER作用によって開始されるキナーゼカスケードを含む核外開始(「非ゲノム」性)経路である。核外ER作用によるエストロゲンの作用による特異的キナーゼの活性化は、一般に迅速かつしばしば一時的であり、その開始は、ER-ホルモン複合体によるトリガーシグナルの入力のみを必要とし、核外開始ERシグナル伝達経路を介してキナーゼカスケードと細胞活性を開始させるようである。対照的に、直接核ERシグナル伝達経路を介した遺伝子の活性化は、熱ショックタンパク質の解離、コレギュレータータンパク質の動員、クロマチンへのER結合の刺激、クロマチン構造の改変および ヒストンを修飾し、RNA pol IIを活性化して遺伝子転写を開始するのに充分である、ERホルモン複合体のより持続性の作用を必要とするようである。強力な核ER活性を有するERリガンドはより動力学的に安定な受容体-補因子複合体を形成し、活性化補助因子結合はリガンドの解離速度を数桁遅らせることがある(Gee、Mol Endocrinol 13, 1912-1923,1999)。したがって、核内より核外ERシグナル伝達に優先的なERリガンドは、特定のエストロゲンの構造を、それらの本質的な化学的特徴、フェノールおよびしばしば第二級アルコール、ならびにそれらの全体的な組成および形状を維持するように再設計することによって得られるであろうが、それらの高親和性ER結合をかなり減少させることになることが可能であると思われる。
好都合な薬理学的プロファイルを有するエストロゲンは、骨の健康、血管運動症状の軽減、および代謝および血管の保護のような更年期女性の望ましい活性を支持するが、乳房および子宮に対する刺激活性は欠如している。
一態様において、本開示は、式(i)の化合物ならびにその立体異性体および医薬的に許容される塩を提供する:
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R4は、各々独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、C1-4アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
---は、二重結合であってもよい)。
(式中、
mは、0〜3の整数であり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R5は、H、ヒドロキシ、またはC1-4アルキルであり;
R6は、各々独立して、H、ヒドロキシ、ハロまたはC1-4アルキルである)。
(式中、
R1およびR2は、H、C1-4アルキル基、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、シクロアルキルオキシアルキル、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、シクロアルキルチオアルキル、R'R''N-アルキル(R'およびR''は、独立して、アルキル、アルキルカルボニルまたは環状アルキルである)から選択され、括弧はヒドロキシルの有無を表し;
R3およびR4は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、シアノ、シアノアルキル、ニトロ、ニトロアルキル、-C(O)-アリール、-C(O)H、アルキルアルデヒド、カルボキシルおよびカルボキシアルキルから選択されるか;または
R3およびR4は、4〜8員原子の環を形成する(上記環はシアノまたはヒドロキシで置換されている)。
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R4は、各々独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
R6およびR7は、独立して、C1-4アルキルおよびHから選択され;
---は、二重結合であってもよい)。
(式中、
R7およびR8は、独立して、H、C1-5アルキル、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、アミド、環状C3-8アルキルまたはヘテロシクリルである)。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の化合物および組成物を使用する方法を提供する。
上述のもの以外の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明を考慮すると、より容易に明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
特許またはアプリケーションファイルは、カラーで実行される少なくとも1つの図面を含む。この特許または特許出願の刊行物とカラー図面の写しは、請求および必要な手数料の支払いを受けて庁が提供する。
以下に添付の図面を参照して本発明の組成物をより詳細に説明するが、本発明のすべての実施形態ではないが、いくつかの実施形態が示される。実際、本発明は、多くの異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載された実施形態に限定されるものと解釈されるべきではない;むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供される。
同様に、本明細書に記載された組成物の多くの変更および他の実施形態は、前述の説明および関連する図面に示された教示の利益を有する本発明に関連する当業者には思い浮かぶであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、変更および他の実施形態が添付の特許請求の範囲に含まれるものとすることが理解されるべきである。本明細書では特定の用語を使用しているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定のためではない。
本明細書に列挙された任意の数値(例えば、範囲)は、下限値から上限値までのすべての値を含むこと、すなわち、列挙された最低値と最高値との間のすべての可能な数値の組合せがこの出願に明示的に記載されているとみなされることが特に理解される。例えば、濃度範囲が1%〜50%と記載されている場合、2%〜40%、10%〜30%、または1%〜3%などの値がこの明細書に明示的に列挙されることが意図される。これらは、具体的に意図されているものの例にすぎない。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価な任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。
本開示には、特許請求される式の化合物が含まれる。上記化合物は、直接核開始経路よりも核外開始シグナル伝達経路を活性化するのに充分であり得るERとの相互作用を有することができる。ある実施形態では、その化合物は、標準エストロゲンエストラジオールの約50,000倍、または約25,000倍、約10,000倍、または約5,000倍、または約1,000倍少ないERに対する親和性を有する。上記化合物は、直接核開始経路よりもエストロゲン受容体作用の核外開始経路に対して、より高い活性または効力を有する経路選択性エストロゲン(Pathway Preferential Estrogens)(PaPE)を含み得る。核外で開始される経路を活性化するための上記化合物の選択性は、ヒトの健康に有益であり得る細胞およびインビボ生物学的効果の好ましいパターンをもたらし得る。上記化合物は、生殖組織、乳房組織、または乳癌細胞の刺激を最小限にするか、またはまったく生じさせない、遺伝子調節パターンおよび細胞および生物学的プロセスを誘発し得る。理論に縛られることを望むものではないが、これらの組織の刺激は、通常、エストロゲンの核開始作用に主として起因すると考えられている;したがって、上記化合物は、標準エストロゲンエストラジオールによって行われる刺激と比較して、限られた活性しか有さない。ある実施形態では、上記化合物は、標準エストロゲンエストラジオールによって行われる刺激と比較して、生殖組織、乳房組織または乳癌細胞に対して約20%未満の刺激、または標準エストロゲンエストラジオールによって行われる刺激と比較して、約15%未満、または約10%未満、または約5%未満、または約2%未満、または約1%未満、または約0.5%未満、または約0.1%未満の刺激しか生じないであろう。対照的に、上記化合物は、代謝組織(脂肪、肝臓)および脈管構造に対して活性の好ましいパターンを有し、卵巣切除後の体重増加および脂肪蓄積を減少させ、内皮損傷の修復を加速する。これらの組織の刺激は、エストロゲンの核外開始作用に大きく起因すると考えられる。したがって、これらの組織における応答において、上記化合物は、標準的エストロゲン、エストラジオールと同じまたはそれ以上の有益な健康影響を有し得るか、エストラジオールの約50%の有益性を有し得る。この設計されたリガンド構造変化プロセスは、閉経後ホルモン置換に有益であることが示されるであろう組織選択的/非核経路選択的エストロゲンを得るために、ER作用の核外開始経路対核開始経路の利用におけるバランスを支配する新規アプローチを表している。
ERに対するPaPE-1および他のPaPEの親和性はE2の親和性よりも約50,000倍低いが、非ゲノム性効果はE2よりも約100倍過剰のPaPEを使用して刺激され、これは、非ゲノム性シグナル伝達経路が、ゲノム性経路よりも受容体に対するリガンドの親和性に対する依存性が低い可能性があることを示唆する所見である。また、E2の後にパターニングされたPaPE-1、-2、および-3はすべてE2と同様の物理的特性(親油性、極性表面積、体積など)を有するが、PaPE-4はE2および他のPaPEよりもかなり大きく、より極性であるが、PPE-4は他の3つのPaPEと非常によく似た生物学的活性を有しており、PaPE様化合物のクラスがかなり広い範囲の物理的および構造的特性をカバーできることを示唆している。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文書が支配する。好ましい方法および材料は下に記載されているが、本明細書において記載されているものと同様のまたは等価な方法および材料が本発明の実施または試験において使用することができる。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が援用されている。本明細書に開示された材料、方法および実施例は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用する「含む(comprise)」、「含める(include)」、「有している」、「有する」、「することができる」、「含有する」という用語およびそれらの変形は、付加的な行為または構造の可能性を排除しない非限定型の移行句、用語、または言葉であることを意味する。単数形「a」、「an」及び「the」には、文脈上他に明確に指示されていない限り、複数の言及が含まれる。本開示は、また、明示的に示されているか否かにかかわらず、本明細書に提示された実施形態または要素を「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
特定の官能基および化学用語の定義は、以下でより詳細に記載される。この開示のために、元素の周期律表、CAS版、Handbook of Chemistry and Physics、第75版、内部カバーに従って化学元素を同定し、特定の官能基は一般にその中に記載されているように定義される。さらに、有機化学の一般的原理、ならびに特定の官能部分および反応性は、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987に記載されている;これらの各々の全内容は、本明細書に援用されている。
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、1〜10個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素鎖を意味する。「低級アルキル」または「C1-C6アルキル」という用語は、1〜6個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。「C1-C3-アルキル」という用語は、1〜3個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖の炭化水素を意味する。アルキルの代表的な例には、メチル、エチル、n-プロピル、iso-プロピル、n-ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n-ヘキシル、3-メチルヘキシル、2,2-ジメチルペンチル、2,3-ジメチルペンチル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニルおよびn-デシルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「アルコキシアルキル」という用語は、本明細書で定義されるアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルコキシ基を意味する。
本明細書で使用する「アルコキシフルオロアルキル」という用語は、本明細書で定義されるフルオロアルキル基を介して親分子部分に付加した、本明細書で定義されるアルコキシ基を意味する。
本明細書で使用する「アルキレン」という用語は、1〜10個の炭素原子、例えば2〜5個の炭素原子の直鎖または分枝鎖炭化水素から誘導される二価の基を意味する。アルキレンの代表例には、-CH2CH2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、および-CH2CH2CH2CH2CH2-が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「アルケニル」という用語は、少なくとも1つの炭素-炭素結合が二重結合である、1〜10個の炭素原子の直鎖または分枝鎖の炭化水素から誘導される二価の基を意味する。
本明細書で使用する「アルキルアミノ」という用語は、本明細書で定義されるような少なくとも1つのアルキル基が、親分子部分に本明細書で定義されるようなアミノ基を介して付加されていることを意味する。
本明細書で使用する「アミド」という用語は、Rが水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルケニルまたはヘテロアルキルであり得る-C(O)NR-または-NRC(O)-を意味する。
本明細書で使用される「アミノ」という用語は、-NRxRy(RxおよびRyは、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルケニルまたはヘテロアルキルであり得る)を意味する。アミノが2つの他の部分を一緒に付加するアミノアルキル基または任意の他の部分の場合、アミノは-NRX-(Rxは水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルケニルまたはヘテロアルキルでもよい)でもよい。
本明細書で使用する「アリール」という用語は、フェニル基または二環式縮合環系を意味する。二環式縮合環系は、親分子部分に付加され、本明細書で定義されるようなシクロアルキル基、フェニル基、本明細書で定義されるようなヘテロアリール基、または本明細書で定義されるような複素環に縮合したフェニル基によって例示される。アリールの代表例には、インドリル、ナフチル、フェニル、キノリニルおよびテトラヒドロキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「シアノフルオロアルキル」という用語は、少なくとも1つの-CN基を意味し、本明細書で定義されるフルオロアルキル基を介して親分子部分に付加される。
本明細書で使用する「シクロアルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部分に付加される本明細書で定義のシクロアルキル基を意味する。
本明細書で使用する「シクロアルキル」という用語は、3〜10個の炭素原子、0個のヘテロ原子および0個の二重結合を含有する炭素環系を意味する。シクロアルキルの代表例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニルおよびシクロデシルが挙げられるが、これらに限定されない。また、「シクロアルキル」にはシクロアルキル基が親分子部分に付加され、本明細書で定義されるアリール基(例えば、フェニル基)、本明細書で定義されるヘテロアリール基、または定義される複素環に縮合している炭素環系が含まれる。このようなシクロアルキル基の代表的な例には、2,3-ジヒドロ-1H-インデニル(例えば、2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-イルおよび2,3-ジヒドロ-1H-インデン-2-イル)、6,7-ジヒドロ-5H-シクロペンタ[b]ピリジニル(例えば、6,7-ジヒドロ-5H-シクロペンタ[b]ピリジン-6-イル)、および5,6,7,8-テトラヒドロキノリニル (例えば、5,6,7,8-テトラヒドロキノリン-5-イル)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「フルオロアルキル」という用語は1、2、3、4、5、6、7または8個の水素原子がフッ素と置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。フルオロアルキルの代表例としては、2-フルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、トリフロロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチルおよびトリフルオロプロピル(例えば3,3,3-トリフルオロプロピル)が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「フルオロアルキル」という用語は、1,2,3,4,5,6,7または8個の水素原子がフッ素で置き換えられている、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。フルオロアルキルの代表例には、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシおよび2,2,2-トリフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、Cl、Br、IまたはFを意味する。
本明細書で使用される「ハロアルコキシ」という用語は、本明細書で定義されるような少なくとも1つのハロアルキル基が、酸素原子を介して親分子部分に結合していることを意味する。
本明細書で使用する「ハロシクロアルキル」という用語は、1個以上の水素原子がハロゲンで置き換えられている、本明細書で定義されるシクロアルキル基を意味する。
本明細書で使用する「ヘテロアルキル」という用語は、1個以上の炭素原子がS、O、PおよびNから選択されるヘテロ原子によって置換された、本明細書で定義されるアルキル基を意味する。ヘテロアルキルの代表例には、アルキルエーテル、第二級および第三級アルキルアミン、アミドおよびアルキルスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヒドロキシアルキル」という用語は、少なくとも1つの-OH基を意味し、本明細書で定義されるアルキレン基を介して親分子部分に付加される。
本明細書で使用される「ヒドロキシフルオロアルキル」という用語は、少なくとも1つの-OH基を意味し、本明細書で定義されるフルオロアルキル基を介して親分子部分に付加される。
いくつかの例では、ヒドロカルビル置換基(例えば、アルキルまたはシクロアルキル)中の炭素原子の数は、接頭辞「Cx-Cy-」によって示され、xは最小であり、yは置換基中の炭素原子の最大数を意味する。したがって、例えば、「C1-C3-アルキル」は、1〜3個の炭素原子を含むアルキル置換基を意味する。
本明細書で使用される「スルホンアミド」という用語は、-S(O)2NRd-または-NRdS(O)-を意味し、Rdは水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルケニルまたはヘテロアルキルであり得る。
「置換基」という用語は、その基の任意の原子におけるアリール基、ヘテロアリール基、フェニル基またはピリジニル基上の「置換」基を意味する。任意の原子を置換することができる。
本明細書の数値範囲の列挙では、同じ程度の精度でその間に介在する各数字が明示的に考慮される。例えば、6〜9の範囲では、6と9に加えて7と8の数値が考慮され、6.0〜7.0の範囲では6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9および7.0の数値が明示的に考慮される。
本明細書で使用する「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療される疾患または状態の1つまたは複数の症状をある程度緩和するであろう充分な量の投与される薬剤または化合物を意味する。その結果は、疾患の徴候、症状、または原因の減少および/または軽減、または生物系の任意の他の所望の改変であり得る。例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患症状の臨床的に有意な減少を提供するために必要とされる本明細書に開示される化合物を含む組成物の量である。個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増研究などの技術を使用して決定することができる。
「対象」または「患者」という用語は、哺乳動物および非哺乳動物を包含する。哺乳動物の例には、哺乳動物クラスの任意のメンバー:ヒト、非ヒト霊長類(例えば、チンパンジー)、および他の類人猿およびサル種;ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜;ウサギ、イヌ、およびネコなどの家畜;ラット、マウスおよびモルモットなどのげっ歯類を含める実験動物などが挙げられるが、これらに限定されない。非哺乳動物の例としては、鳥類、魚類などが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される方法および組成物の一実施形態において、哺乳動物はヒトである。
したがって、「予防すること」とは、疾患または障害の進行の遅延、停止または逆転、または本明細書に記載の化合物のうちの少なくとも1つを含む医薬組成物の適用または投与を含む適用を意味し、対象は疾患の疾患または症状を有し、その目的は疾患または疾患の症状を治療、治癒、緩和、軽減、改変、回復、寛解、改善または作用することである。「治療すること」と「防止すること」との共通部分があることができるにもかかわらず、「予防する」ことは、「治療すること」の間に観察されるよりも劇的(すなわち、あまり微妙でない)な疾患または障害の減少であることを意図している。同様に、「治療すること」は、疾患または障害を有する個体において生じ得る一方で、「予防すること」は、疾患または障害の顕性徴候および症状に単に感受性があるかまたはまだ阻止していない個体において生じ得る。
本開示の一態様は、下記式の化合物ならびにその立体異性体および医薬的に許容される塩を提供する:
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R4は、各々独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、C1-4アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
---は、二重結合であってもよい)。
ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはC1-4アルキルである。ある実施形態において、R1およびR2は両方ともC1-4アルキルである。実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはメチルである。ある実施形態において、R1およびR2の両方はメチルである。ある実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチル、クロロ、-CH2OHおよび-CH2OMeから選択される。
ある実施形態において、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシは、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシおよびC1-4アルコキシの1つ以上で置換されていてもよい。適切には、置換基はヒドロキシである。
ある実施形態において、R4は、フルオロ、クロロ、ブロモ、メトキシ、ヒドロキシまたはオキソから選択される。
ある実施形態において、R5はHである。ある実施形態において、R5は-CCHである。
ある実施形態において、mは0である。ある実施形態において、nは1である。実施形態において、nは2である。
上記において同定された好ましい置換基の組合せおよび置換は、明示的に考慮される。
(式中、
Rは、Hまたはメチルである)。
(式中、
mは、0〜3の整数であり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R5はH、ヒドロキシまたはC1-4アルキルであり;
R6は、各々独立して、H、ヒドロキシ、ハロまたはC1-4アルキルである)。
ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはC1-4アルキルである。ある実施形態において、R1およびR2は両方ともC1-4アルキルである。実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはメチルである。実施形態において、R1およびR2の両方はメチルである。ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはハロゲンであり、好ましくは塩素である。
ある実施形態において、R5はヒドロキシである。ある実施形態において、R5はC1-4アルキルである。適切には、R5は置換C1-4アルキルである。ある実施形態において、R5は、-CH(OH)(CH3)である。
ある実施形態において、R6はC1-4アルキルである。好適には、R6は置換C1-4アルキルである。ある実施形態において、R6は-CH2OHである。
ある実施形態において、mは1である。
上記で特定される好ましい置換基の組合せおよび置換は、明示的に考慮される。
(式中、
R1およびR2は、H、C1-4アルキル基、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、シクロアルキルオキシアルキル、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、シクロアルキルチオアルキル、R'R''N-アルキル(R'およびR''は独立してアルキル、アルキルカルボニルまたは環状アルキルである)から選択され、括弧は、ヒドロキシルの有無を表し、
R3およびR4は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、シアノ、シアノアルキル、ニトロ、ニトロアルキル、-C(O)-アリール、-C(O)H、アルキルアルデヒド、カルボキシルおよびカルボキシアルキルから選択されるか、または
R3およびR4は、4員〜8員原子の環を形成し、その環はシアノまたはヒドロキシで置換されている)。
ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはC1-4アルキルである。ある実施形態において、R1およびR2は両方ともC1-4アルキルである。ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはメチルである。ある実施形態において、R1およびR2の両方はメチルである。ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはハロゲンであり、好ましくは塩素である。
ある実施形態において、R3はヒドロキシである。ある実施形態において、R3はC1-4アルキルである。好適には、R3は置換C1-4アルキルである。ある実施形態において、R3は-CH(OH)(CH3)である。
ある実施形態において、R4はC1-4アルキルである。好適には、R4は置換C1-4アルキルである。実施形態において、R4は-CH2OHである。
ある実施形態において、R3およびR4は、5員または6員環を形成する。
上記で特定された好ましい置換基の組合せおよび置換は、明示的に考慮される。
(式中、
R5およびR6は、独立して、ヒドロキシル、シアノ、ヒドロキシルアルキル、シアノアルキル、ハロゲン化ヒドロキシルアルキル、およびハロゲン化シアノアルキルから選択される)。
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R4は、各々独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
R6およびR7は、独立して、C1-4アルキルおよびHから選択され;
---は、二重結合であってもよい)。
ある実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはC1-4アルキルである。ある実施形態において、R1およびR2は両方ともC1-4アルキルである。実施形態において、R1およびR2の少なくとも1つはメチルである。実施形態において、R1およびR2の両方はメチルである。実施形態において、R1およびR2は、独立して、H、メチル、エチル、クロロ、-CH2OHおよび-CH2OMeから選択される。
ある実施形態において、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシは、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシおよびC1-4アルコキシの1つ以上で任意に置換されていてもよい。適切には、その置換基はヒドロキシである。
ある実施形態において、R4は、フルオロ、クロロ、ブロモ、メトキシ、ヒドロキシまたはオキソから選択される。
ある実施形態において、R5は、Hである。ある実施形態において、R5は、-CCHである。
ある実施形態において、R6はメチルである。ある実施形態において、R7はHである。
ある実施形態において、mは0である。ある実施形態において、nは1である。ある実施形態において、nは2である。
上記で特定された好ましい置換基の組合せおよび置換は、明示的に考慮される。
(式中、
R7およびR8は、独立して、H、C1-5アルキル、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、アミド、環状C3-8アルキル、およびヘテロシクリルである)。
実施形態において、R7はメチルである。
実施形態において、R8は置換C1-5アルキルである。適切には、R8は、-C(O)-R、-C(O)NRN1RN2、-C(O)OR、-NRN1C(O)Rまたは-OC(O)Rで置換され、RN1、RN2およびRは、独立して、HまたはC1-4アルキルから選択されている。実施形態において、RN1、RN2またはRの少なくとも1つは-(CH2)n-R10であり、nは2〜5の整数であり、R10は-C(O)-R、-C(O)NRN1RN2、-C(O)OR、-NRN1C(O)Rまたは-OC(O)Rであり、RN1、RN2およびRは、独立して、H、アリール、シクロアルキル、またはOHまたはアミノで置換されていてもよいC1-4アルキルから選択される。
上記で特定された好ましい置換基の組合せおよび置換が明示的に考慮される。
本開示の化合物の式において、可変または未定義の置換位置および立体化学は、「太字のくさび形結合」または「破線のくさび形結合」の代わりに「環系を通る線」、「くねくねした結合」または「直線結合」のような一般的な化学構造描写規則を使用して示され、慣例によると指定平面(「太線のくさび形結合」)から出てくるか、または指示された平面から離れる置換基(「破線のくさび形結合」)を示している。
本開示に従う化合物では、基およびその置換基は、原子および置換基の許容される原子価に従って選択することができ、その結果、選択および置換は、安定した化合物をもたらし、例えば、転位、環化、脱離などによって自発的に変換を受けない。
本開示に従う化合物には、1つ以上の同位体的濃縮原子の存在のみが異なる化合物が含まれる。例えば、化合物は、重水素またはトリチウムによる水素の置換、または13C-または14C-濃縮炭素による炭素の置換を除いて、本発明の構造を有し得る。
中性形態の化合物は、塩を塩基または酸と接触させ、親化合物を従来の方法で単離することによって再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒への溶解性のような特定の物理的性質において種々の塩形態とは異なるが、そうでなければ塩は本開示のための化合物の親形態と同等である。
塩形態に加えて、本発明は、また、プロドラッグ形態である本開示に従う化合物を提供することができる。上記化合物のプロドラッグは、生理学的条件下で容易に化学変化を受けて化合物を提供する化合物である。プロドラッグは、生体外環境において化学的または生化学的方法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適切な酵素または化学試薬を用いて経皮パッチリザーバーに入れたときに本発明の化合物にゆっくりと変換することができる。
本開示に従う化合物の調製物は、選択された立体中心に対応する、選択された立体化学、例えばRまたはSを有する上記化合物の異性体を濃縮することができる。例えば、上記化合物は、選択された立体中心の選択された立体化学を少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%有する化合物に対応する純度を有し得る。化合物は、例えば、選択された立体中心で選択された立体化学、例えばRまたはSを有する1つまたは複数の構造が濃縮された本明細書に開示された化合物の調製物を含めることができる。
いくつかの実施形態において、本開示に従う化合物の調製物は、上記化合物のジアステレオマーである異性体(対象異性体)について濃縮されてもよい。本明細書で使用するジアステレオマーは、同じ化合物の別の立体異性体の鏡像ではない2つ以上のキラル中心を有する化合物の立体異性体を意味する。例えば、上記化合物は、少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の選択されたジアステレオマーを有する化合物に対応する純度を有することができる。
化合物は、立体特異的合成または分割によって、ラセミ形態または個々のエナンチオマーまたはジアステレオマーとして調製することができる。上記化合物は、例えば、光学活性塩基との塩形成による立体異性体対の形成、その後の分別結晶化および遊離酸の再生などの標準的な技術によって、それらの成分のエナンチオマーまたはジアステレオマーに分割することができる。上記化合物は、立体異性体エステルまたはアミドの形成、続いてのクロマトグラフィー分離およびキラル補助剤の除去によっても分解することができる。あるいは、キラルHPLCカラムを使用して上記化合物を分割することができる。また、エナンチオマーはリパーゼ酵素を使用した対応するエステルのラセミ体の速度論的分割から得ることができる。
また、本開示に従う化合物は選択的な生物学的特性を高めるために適切な官能基を付加することによって変性することもできる。そのような変性には、当技術において公知であり、所定の生物学的系(例えば、血液、リンパ系、中枢神経系)への生物学的浸透を増加させ、経口利用可能性を高め、注射による投与を可能にする溶解性を高め、代謝を変えかつ/または排泄率を変化させるものが含まれる。これらの変性の例には、ポリエチレングリコールによるエステル化、ピバレートまたは脂肪酸置換基による誘導体化、カルバメートへの変換、芳香族環のヒドロキシル化、および芳香族環におけるヘテロ原子置換が含まれるが、これらに限定されない。
これらの化合物の多くを合成するための一般的経路を下記に示す:
化合物は、受容体リガンド結合動態および平衡解析、コレギュレーター結合アッセイ、核外開始経路に対して核開始経路を介したエストロゲンの選択的作用に関連する受容体および他のタンパク質の細胞内分布免疫組織化学および近接ライゲーションアッセイ;特定の遺伝子のレギュレーションおよび全トランスクリプトーム(RNAシーケンシング、RNA-seq)解析、受容体、キナーゼ、およびクロマチン免疫沈降(ChIP)およびChlP配列決定法を使用するRNAポリメラーゼクロマチン結合調査、ならびに細胞増殖アッセイおよびエストロゲン受容体のリガンドが標的細胞内で働く経路をさらに規定するシグナル形質導入経路解析を含める細胞活性調査;子宮質量評価および生殖組織に対して刺激性であるかまたは刺激性でなく、ヒト乳癌および子宮癌を開始または促進しないであろう化合物を予測することができる乳房組織発生アッセイを含めるインビボアッセイ;動物体重および器官質量調査、およびヒトにおける代謝異常または代謝症候群の防止または発生に関係するであろう異なる食餌制限による動物に対する血中および組織脂質ならびにメタボミクス解析;核および非核エストロゲン受容体作用によって調節されるエストロゲン応答性遺伝子を含む内皮細胞機能の動物におけるアッセイ、内皮修復アッセイおよびヒトにおける血管疾患および代謝性疾患に対する活性を予測する正常および高脂肪食餌による野生型および変異動物におけるアテロームおよび新生内膜発生の抑制が含まれる血管健康のアッセイを含む多くの方法およびアッセイを使用して解析することができる。化合物の効果は、ヒトにおける糖尿病に関連する種々の食事の下での野生型および突然変異動物における代謝健康およびグルコース利用についてアッセイすることができる。化合物は、脳卒中、または心不全もしくは心臓発作のヒト疾患のモデルである強制虚血の条件下で、生体外心臓またはインビボ脳への損傷の抑制についてアッセイすることができる。化合物は、ヒトにおける骨粗鬆症または骨減少症への影響を予測するマウスまたはラットモデルにおいて、エストロゲン条件が低いため、骨密度、強度および構造の保護についてアッセイすることができる。これらの方法のいくつかは、実施例に記載されている。
別の態様において、対象において疾患または状態を治療する方法であって、本明細書の請求項のいずれかに記載の少なくとも1つの化合物の医薬的に有効な量を投与することを含む、上記方法が提供される。
別の態様において、対象における疾患または状態を改善する方法であって、本明細書の請求項のいずれかに記載の少なくとも1つの化合物の医薬的に有効な量を投与することを含む、上記方法が提供される。
別の態様において、対象における疾患または状態の進行を予防または遅延させる方法であって、本明細書の請求項のいずれかに記載の少なくとも1つの化合物の医薬的に有効な量を投与することを含む、上記方法が提供される。
ある実施形態において、上記疾患または状態は、エストロゲン受容体の核外開始経路によって影響されている。
上記疾患または状態は、例えば、閉経後症状、心血管疾患、脳卒中、血管疾患、骨疾患、代謝性疾患、糖尿病、関節炎、骨粗鬆症、肥満、認知低下、血管運動/ほてりおよび癌から選択される。
実施形態において、上記疾患は脳卒中である。実施形態において、上記疾患は代謝性疾患である。実施形態において、上記疾患は糖尿病である。実施形態において、上記疾患は、乳癌などの癌である。実施形態において、上記乳癌は、エストロゲン応答性乳癌または肥満関連乳癌である。実施形態において、上記疾患は血管疾患である。実施形態において、上記疾患は骨粗鬆症である。
また、本開示は、本開示に従う化合物および医薬的に許容される賦形剤を含む上記医薬組成物を提供する。
本開示の医薬組成物は、非限定例として、経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻腔内を含める様々な経路によって投与することができる。意図する送達経路に応じて、上記医薬組成物は、好ましくは、注射用組成物または経口組成物として、または経皮投与のための軟膏剤として、ローション剤としてまたはパッチ剤として製剤化される。
経口投与のための上記組成物は、バルク液体溶液または懸濁液、またはバルク粉末の形態を取ることができる。しかしながら、より一般的には、上記組成物は、正確な投与を容易にするための単位剤形で提供される。本明細書で使用される「単位剤形」は、適切な医薬的賦形剤と関連して、各々の単位が所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する、ヒト対象および他の哺乳動物のための単位用量として適切な物理的に別個の単位を意味する。典型的な単位剤形には、液体組成物の予め充填された予め測定されたアンプルまたはシリンジまたは固体組成物の場合は丸剤、錠剤、カプセル剤などが含まれる。そのような組成物において、併用治療は、通常、少量成分(約0.1質量%〜約50質量%、好ましくは約1質量%〜約40質量%)であり、残りは所望の投与形態を形成するのに役立つ様々な賦形剤または担体および加工助剤である。
注射用組成物は、典型的には、注射用滅菌生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水または当該技術において公知の他の注射用担体に基づく。前と同様に、そのような組成物中の活性化合物は、典型的には、少量成分であり、しばしば約0.05質量%〜10質量%であり、残りは注射用担体などである。
経皮組成物は、典型的には、活性成分を、一般的には、約0.01質量%〜約20質量%、好ましくは約0.1質量%〜約20質量%、好ましくは約0.1質量%〜約10質量%、より好ましくは約0.5質量%〜約15質量%の範囲の量で含有する局所用軟膏またはクリームとして処方される。軟膏として処方される場合、活性成分は、典型的には、パラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかと組み合わされる。あるいは、活性成分は、例えば水中油型クリーム基剤を用いてクリーム中に処方することができる。そのような経皮製剤は、当該技術において周知であり、一般に、有効成分または製剤の皮膚浸透または安定性を高めるための追加の成分を含める。このような既知の経皮製剤および成分はすべて、本発明の範囲内に包含される。
経口投与用、注射用または局所投与用の組成物のための上記の成分は、単に代表的なものである。他の材料および加工技術などは、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Company, Easton, PennsylvaniaのPart 8に記載されている。
また、上記医薬組成物は、徐放性形態または徐放性薬剤送達系で投与することもできる。代表的な徐放性材料の説明は、上記のRemington's Pharmaceutical Sciencesに見ることができる。
一態様において、開示された化合物または他の薬剤が有用性を有する疾患または状態のリスクの治療、予防、制御、改善または低減において、開示された化合物を1つ以上の他の薬剤と組合せて使用することができ、ここで、上記薬剤の組合せは、いずれかの薬剤単独よりも安全であるかまたはより有効である。そのような他の薬剤は、そのために一般に使用される経路および量で、本開示の化合物と同時にまたは順次投与されることができる。本開示の化合物が1つ以上の他の薬剤と同時に使用される場合、そのような他の薬剤および開示された化合物を含有する単位投与形態の医薬組成物が好ましい。しかしながら、併用治療は、開示された化合物および1つ以上の他の薬剤が異なる重複スケジュールで投与される治療も含め得る。1つ以上の他の活性成分と組合せて使用する場合、開示される化合物および他の活性成分は、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用され得ることも企図される。
したがって、上記医薬組成物には、本開示の化合物に加えて、1つ以上の他の活性成分を含有するものが含まれる。
開示化合物と第2の有効成分との質量比は変更することができ、各成分の有効用量に依存する。一般に、それぞれの有効量が使用される。したがって、例えば、本開示の化合物が別の薬剤と組合される場合、開示化合物と他の薬剤との質量比は、一般に、約1000:1〜約1:1000、好ましくは約200:1〜約1:200の範囲である。本開示の化合物と他の活性成分との組合せは、一般に、上記の範囲内であるが、いずれの場合も、各有効成分の有効量を使用すべきである。
このような組合せにおいて、開示化合物および他の活性薬剤は、別々にまたは一緒に投与され得る。さらに、1つの要素の投与は、他の薬剤の投与の前、同時、またはその後にすることができる。
したがって、開示された化合物は、単独で、または開示化合物の効力、安全性、利便性を増加させるか、または望ましくない副作用または毒性を低減する受容体または酵素に影響を与える対象徴候または他の薬剤において有益であることが知られている他の薬剤と組合せて使用することができる。対象化合物および他の薬剤は、同時治療または固定された組合せのいずれかで同時投与することができる。
製剤1−錠剤:医薬組成物は、乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約1:2の質量比で混合することができる。少量のステアリン酸マグネシウムは滑沢剤として添加される。この混合物を錠剤プレス機で240〜270mgの錠剤(1錠剤当たり80〜90mgの活性化合物)に形成する。
製剤2−カプセル剤:医薬組成物は、乾燥粉末としてデンプン希釈剤と約1:1の質量比で混合することができる。この混合物を250mgカプセルに充填する(カプセル当たり125mgの活性化合物)。
製剤3−液体:医薬組成物(125mg)は、スクロース(1.75g)およびキサンタンガム(4mg)と混合してもよく、得られた混合物を混和し、No.10メッシュU.S.ふるいに通し、水中のミクロクリスタリンセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウム(11:89、50mg)の予め製造した溶液と混合する。安息香酸ナトリウム(10mg)、香味剤および着色剤を水で希釈し、撹拌しながら加える。次いで、充分な水を添加して総量5mLを生成してもよい。
製剤4−錠剤:医薬組成物は、乾燥粉末として乾燥ゼラチン結合剤と約1:2の質量比で混合してもよい。少量のステアリン酸マグネシウムが滑沢剤として添加される。この混合物を錠剤プレス機で450〜900mgの錠剤(活性化合物150〜300mg)に形成する。
製剤5−注射剤:医薬組成物は、緩衝化滅菌生理食塩水注射用水性媒体中に約5mg/mLの濃度に溶解または懸濁させることができる。
製剤6−局所用:約75℃でステアリルアルコール(250g)および白色ワセリン(250g)を溶融し、次いで水(約370g)に溶解した医薬組成物(50g)、メチルパラベン(0.25g)、プロピルパラベン 0.15g)、ラウリル硫酸ナトリウム(10g)およびプロピレングリコール(120g)の混合物を加えることができ、得られた混合物を凝固するまで撹拌する。
下記の非限定実施例は、いくつかの態様および実施形態を純粋に例示することを意図し、本開示に従って実施された特定の実験を示すものである。
材料および方法
細胞培養およびsiRNA処理
MCF-7細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)から得られ、それにより推奨されているように増殖させた。受容体発現はqPCRおよびウエスタンブロッティングによって確認し、エストラジオール(E2)に対する遺伝子発現および増殖応答を定期的にモニタした。E2およびPaPE処理による実験については、使用前に少なくとも5日間、フェノールレッドを含まない組織培養培地中で細胞を維持した。ERαノックダウン実験は、Dharmaconからの4つのsiRNAのSMARTプールを利用し、30nM siCtrlまたはsiERαまたはsiGPR30で72時間、記載されたように実施した(Madak-Erdogan et.al., Mol Endocrinol 22, 2116-2127, 2008参照)。これにより、対応するmRNAおよびタンパク質のノックダウンが80%を超えた。初代ウシ大動脈内皮細胞を、Chambliss, J Clin Invest 120, 2319-2330, 2010に記載されているように回収し、維持し、使用した。
研究は、C57BL/6バックグラウンドの野生型およびERαノックアウトマウスを使用した。動物を含むすべての実験は、イリノイ大学アーバナシャンペーン校とテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの承認を受けたプロトコルを用いて、動物の使用とケアのための国立衛生研究所標準に従って行われた。野生型C57BL/6マウスは、Jackson Laboratories/National Cancer Instituteから購入した。ERαおよび野生型同腹仔の完全切除を有するERαノックアウトマウスを、Taconicから入手し、以前にDupont et al., Development, 127, 4277-4291, 200およびHewitt et al.FASEB J., 24, 4660-4667, 2010に記載されたように使用した。
インビボでの代謝パラメータおよび遺伝子発現の研究において、総質量20mgとなるようにコレステロールと混合した化合物を含有するペレットを皮下移植することにより、卵巣摘出レシピエントマウスにリガンドを投与した。研究中は動物を単収容した。3週間の研究では、エストラジオール(E2、Sigma-Aldrich)の投与量(0.125mg/ペレット)を以前の知見に基づいて選択した。頸動脈再内皮化実験では、記載されているように(Chambliss, J Clin Invest 120, 2319-2330, 2010)、化合物を4週間(Model 2006)Alzetミニポンプによって6μg/日の用量で送達した。卵巣切除術後毎週総体重および食物摂取量をモニタした。EchoMRI-700 Body Composition Analyzer(Echo Medical Systems、 テキサス州ヒューストン )を使用して、3週間の終わりに、体脂肪および除脂肪体重の組成をモニタし、生きている動物の縦断的体組成を定量することができた。
ウエスタンブロット解析は、ERα(HC-20、Santa Cruz);ERK2(D-2、Santa Cruz);およびpS6、pS6K、pmTOR、pRAPTOR、pRICTOR、pMAPK(細胞シグナル伝達)に対する特異抗体を使用した。共免疫沈降アッセイでは、SRC3(Santa Cruz、C-20)およびERα(Santa Cruz、F10)に対する抗体を使用した。
ChIPアッセイは、記載されているように行った(Madak-Erdogan et al. Mol Syst Biol 9, 676 2013およびMadak-Erdogan et al., Mol Cell Biol 31, 226-236, 2011)。使用した抗体は、ERα(HC20)、ERK2(Santa Cruz, D2 and C14)、およびpSer5 RNA Pol II(Santa Cruz, sc-47701)に対するものであった。ChIP DNAをQIAGEN PCR精製キットを用いて単離し、ChlP-seq解析および定量的リアルタイムPCR(qPCR)に使用した。記載されているように、qPCRを使用して、調査された領域への動員を計算した。
ゲノムワイドChlP-seqについては、ChIP DNAをIllumina Solexa ChlP-seqサンプル処理法に従ってライブラリーに調製し、Illumina HiSeq 2000を使用してシングルリード配列決定を行った。生成した配列をBowtie2によってヒトゲノム(hgl 8)上に一義的にマッピングした。Madak-Erdogan, Mol Syst Biol 9, 676, 2013に記載されているように、6.0e-7のp値カットオフおよび0.01のFDRで豊富なピーク領域(デフォルト設定)を同定するために、MACS(ChlP-Seqのモデルベース解析)を使用した。
クラスタ、すなわち同様の組成特徴を有する座位の群を生成するために、両方向で500bpのウィンドウを用いてseqMINER密度アレイ法を使用した。各クラスタのBEDファイルは、Galaxy Cistrome統合解析ツール(Venn diagram, conservation, CEAS)でさらに解析するために使用された。
遺伝子発現解析については、各リガンド処理について3つの生物学的複製物からTrizol試薬を使用して総RNAを抽出し、RNAeasyキット(QIAGEN)を使用してさらに清浄化した。時間経過研究については、MCF-7細胞を、4時間および24時間、Veh(0.1%EtOH)、10nM E2または1μM PaPEで処理した。阻害剤研究については、MCF-7細胞をCtrl(0.1%DMSO)、1μM PP242または1μM AZD6244で30分間前処理し、次いで阻害剤の存在下または非存在下、Veh、10nM E2または1μM PaPE-1で4時間処理した。試料の品質および複製の再現性が確認されたら、各群からの2つの試料を配列決定に付した。ライブラリー構築にはヌクレアーゼを含まない水中で100ng/μLの濃度のRNAを使用した。cDNAライブラリーは、mRNA-TruSeqキット(Illumina, Inc.)を用いて調製した。要約すると、ポリA含有mRNAを総RNAから精製し、RNAを断片化し、断片化RNAから二本鎖cDNAを生成し、アダプターを末端に連結した。
HiSeq 2000からのペアエンド読取りデータを処理し、一連のステップを介して解析した。Casava 1.8.2を用いて、各レーン内のサンプルのベースコーリングおよび脱多重化を行った。FASTQトリマー(バージョン1.0.0)を使用してFASTQファイルをトリミングした。opHat2(バージョン0.5)を用いて、RefSeqゲノムレファレンスアノテーションと組み合わせて、対になったRNA-Seq読み取りをUCSCゲノムブラウザのヒト(Homo sapiens)レファレンスゲノムのバージョンhgl9にマッピングした。BAMファイルからの遺伝子発現値(生の読み取りカウント)は、StrandNGS(バージョン2.1)定量ツールを使用して計算した。部分的な読み取りが考慮され、新規の遺伝子およびエキソンの検出の選択肢が選択された。新規なエキソンおよび遺伝子を見つけるためのデフォルトパラメーターが特定された。デフォルト値を使用するDESeq正規化アルゴリズムが選択された。差次的に発現された遺伝子は、ビヒクル対照と比較して、各処理の各遺伝子についてのBenjaminiおよびHochbergの多重検定補正による倍数変化およびp値によって決定された。倍数変化> 2およびp値 <0.05を有する遺伝子は、統計学的に有意であり、差異的に発現されたと考えられた。すべてのRNA-Seqデータセットは、GEO受託番号GSE73663の下でNCBIに寄託されている。
過度に提示されたGO生物学的プロセスは、ウェブベースのDAVID Bioinformatics Resourcesデータベース、ClueGOおよびウェブベースGREATソフトウェアによって決定された。モチーフ濃縮解析は、Seqposを使用して行った。
ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色、および全体のマウント染色を、パラフィン包埋組織切片上で行った。画像は、フィジソフトウェアの3つの無作為に選択されたフィールドからの平均細胞サイズをモニタすることによって定量化した(http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji)。
ビヒクル(0.1%EtOH)、10nM E2または1μMPaPE-1で15分間処理した細胞をPBSで洗浄し、ガラスカバースリップ上に固定し、ERα(F10、Santa Cruz)に対する抗体、pSer5 RNA Pol II(Santa Cruz、47701)、またはRAPTOR(Cell Signaling)とインキュベートした。翌日、ZhaoZhao et.al., Endocrinology, 154, 1349-1360, 2013に記載されているように、Duolink In Situキット(Olink Bioscience)を使用して、製造業者の説明書にしたがって近接ライゲーションアッセイ(PLA)を行った。簡単に説明すると、一次抗体との一晩のインキュベーションの後、2つのPLAプローブを用いて37℃で1時間ハイブリダイゼーションし、次いで15分間ライゲーションし、37℃で90分間増幅した。カバースリップを各スライドに取り付け、画像取得および解析を行った。サンプルは、Zeiss LSM 700または710レーザ走査共焦点顕微鏡で63×/1.4オイルDIC M27対物レンズを使用して画像化した。画像は、PLAシグナルについて488本のAr(10mW)レーザ線を使用した逐次方法で得られた。励振シグナルの表面にじみを防止するために順次走査モードを使用してDAPIおよびPLAシグナルの個々のチャネルが得られた。レーザ出力、ゲインおよびオフセットはサンプルにわたって一定に保たれ、2/4フレームの平均を有する512×512または1024×1024ピクセルの高解像度フォーマットでスキャンされた。画像のさらなる定量化はFijiソフトウェアを使用した(http://fiji.se/wiki/index.php/Fiji)。簡単に説明すると、画像は各チャネルのセグメント化のために8ビットに変換され、画像はピクセルサイズ100のローリングボール法を使用してバックグラウンド減算され、DAPIチャネルを使用してセグメント化された。
96ウェルプレートに1000細胞/ウェルで細胞を播種した。2日目に、示された濃度で、細胞をVeh、E2またはPaPEで処理し、Madak-Erdogan, Mol Syst Biol 9, 676, 2013に記載されているようにWST-1試薬(Roche)を使用して増殖を評価した。
以前に報告された方法(Chambliss et.al., J Clin Invest 120, 2319-2330, 2010)を使用して、14C-L-シトルリンへの14C-L-アルギニンの15分間にわたる変換を測定することにより、インタクトな初代内皮細胞においてeNOS活性化を評価した。細胞をビヒクル(基底活性を生じる)、E2、またはPaPE単独で、または抗エストロゲンICI 182,780で示した濃度において処理した。
損傷後72時間のエバンスブルー染料の取り込みを評価することにより、マウスの血管周囲電気損傷後に頸動脈再内皮化を研究した。このモデルにおける損傷後の内皮脱落および回復は、ウィルブランド因子の免疫組織化学によって確認されている。8〜9週齢の卵巣摘出の時点で、雌のマウスに、6μg/日のE2またはPaPE-1を送達するように調製した腹腔内浸透圧ミニポンプを入れた。頸動脈露出は21日後に行った。選択された研究では、追加の処置にはビヒクルまたはICI 182,680(360μg/マウス)の頸動脈損傷の3日前および損傷の日の皮下注射投与が含まれる。研究の終わりに、子宮も採取し、重さを測定した。
短期間の研究として、卵巣摘出C57BL/6マウスに、100μl DMSO中100μg PaPE-1を皮下注射した。3匹のマウスを各時点で犠牲にし、400μlの血液を腹部大動脈から得た。サンプルを2000gで10分間遠心分離し、血清を回収した。各サンプルの50μl部分を解析のためにイリノイ大学のメタボロミクスセンターに提出した。長期間の研究として、卵巣摘出C57BL/6マウスに、8mg PaPE-1および12mgコレステロールで製造したペレットを皮下に埋め込んだ。血液サンプル(30μl)を、処置の第3週まで毎週尾を切って集めた。サンプルを2000gで10分間遠心分離し、血清を回収した。血清(10μl)を40μlのPBSと混合し、解析のためにメタボロミクスセンターに提出した。解析のために、5500QTrapとAgilent 1200 HPLCとを使用した液体クロマトグラフィー−質量解析法で分析する前に、各試料にPaPE-1(3重水素原子で標識した)の質量標準を添加した。
ERαにおいてC530に結合したフルオレセインの蛍光偏光特性または異方性特性は、結合したリガンドの性質に感受性である。これらの差異を利用して、1つのリガンドの解離および第2のリガンドの会合を検出することができ、リガンド交換の速度は最初に結合したリガンドの解離速度によって制限される。PaPE-1はERに結合したときにE2よりも約20%低い異方性値を与え、OH-TamはERに結合したときにE2よりも80%低い異方性値を与える。したがって、各リガンド対(PaPE-1/E2またはE2/OH-Tam)は異方性の明確な変化をもたらし、最初に結合したリガンドの解離速度をモニタするために使用できる。
C530に1つの活性システインを有するように突然変異したERα−リガンド結合ドメイン(LBD)を5-ヨードアセトアミドフルオレセインで部位特異的に標識し、次いでt/g緩衝液(50mMトリス、10%グリセロール、pH8)とキャリアタンパク質として添加した0.01Mメルカプトエタノールおよび0.03mg/mlのオボアルブミンに希釈して2nMのERを得た。ホモFRETを最小化するために、5倍過剰(10nM)の非標識ERα-LBD(10μM)を添加し、フルオレセイン標識および非標識ER二量体を室温において暗所で1時間交換し、それにより本質的にただ1つのモノマーがフルオレセイン標識された二量体を生成した。次いで、ERを100nM E2または100nM/RBAのPaPE-1と結合させた;PaPE-1のRBAは0.002%であり;したがって、100nM/RBA = 50μMのPaPEを使用した。これらのサンプルを室温において暗所で2.5時間リガンド結合を完了させた。
異方性は、一定の波長条件下でSpex fluorolog IIキュベットベースの蛍光計で測定した。励起は488nmに設定し、マジック角条件下に520nmで発光させ、3から5時点を0時間にした。PaPE-1の解離を開始させるために、300nMのE2をPaPE-1サンプルに加え、解離の時間経過に続いて異方性が変化した。グリセロールの粘度変化のために、室温と5℃との間にタンパク質異方性の変化がある;したがって、タンパク質およびキュベットチャンバを5℃に予冷するように注意した。
E2の解離を測定するために、300nM E2を、フルオレセイン標識および非標識アポ-ER二量体の予め交換した試料に加え、上記のように2.5時間結合させた。キュベットおよびチャンバを5℃に冷却し、ゼロ時点を取った後、5μM OH-Tamを添加することによってE2解離を開始し、異方性の変化を時間とともに追跡した。両方の解離実験のデータを、Prism 4を使用した線形回帰によって指数関数的減衰関数に適合させた。
ERα+ E2結晶構造(PDBコード:1GWR)から出発して、MOE(MOE:分子操作環境、ケミカルコンピューティンググループ)の構造調製ルーチンを使用して欠けているループ、側鎖、明示的な水素原子を補填した。カスタムボリューム視覚化コードを使用して、ERα+ E2構造の結合体積を生成し、図2Bにおいてスレートブルーで示されており;赤い点は構造的な水である。PaPE-1の結合のモデルは、リガンド結合ドメインの漸進的最小化と合わせて、E2の構造からPaPE-1リガンド構造の漸進的生成によって構築された:原子はまずB環を開くためにE2から除去され、C環を芳香族環に変換するが、A環上の2つのオルトメチル基はまだ付加しない。この段階でリガンドの酸素原子と全タンパク質原子の位置を固定し、0.1kcal/(mol・オングストローム)を終了勾配カットオフとしてMMFF94x力場を使用してエネルギー最小化を行い、PaPE-1リガンドコアの低いエネルギーコンフォメーションを得た。その後、すべての原子を固定せず、水素結合側鎖との相互作用を最適化するためにタンパク質主鎖を束縛しながらエネルギー最小化をさらに行った。2つのA環オルトメチル基を付加した後、束縛された骨格原子を用いて別のエネルギー最小化を行い、次いで、最終的な無束縛エネルギー最小化をすべて同じ勾配のカットオフに対して行った。得られたリガンドおよび水素結合残基の位置は、図2Bに黄色で示されている。
インビボ動物代謝研究からのデータを、異なるリガンド効果を比較するための一元配置ANOVAまたはGraphPad Prism 6を使用するBonferroni post hoc試験後の時間依存的変化を比較するための二元配置ANOVAのいずれかを用いて解析した。遺伝子発現研究からのデータは、t検定を使用して解析した。
NMR測定:1H NMRスペクトルをVarian vxr500MHz、u500またはu400MHz分光計で記録し、化学シフトを7.26ppmの残留溶媒ピーククロロホルム(CDC3)および3.31ppmのメタノール(CD3OD)を基準とするδ値[ppm]で示す。カップリング定数Jは、ヘルツで報告されている。材料および溶媒は、商業的供給源から入手可能な最高級のものであり、さらに精製することなく使用した。分子量は、Waters Quattro ultima ESIまたはWaters 70-VSE EI/CI/FD/FI質量分析計を使用して定量した。
THF-水混合物(200mg、0.79mmol)中の5-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オンの溶液に、NaBH4(50mg、1.31mmol)を室温で加え、混合物をシリカゲルTLC分析で出発物質が消失するまで撹拌した。NaBH4で還元すると、254nmのシリカゲルTLCで青色蛍光が消失した。n-ヘキサン中35%酢酸エチルを使用して短いシリカゲルパッドを通過させた後、化合物2(189mg)を収率94%で得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3+メタノール-d4) δ 1.95-2.05 (m, 1H), 2.31 (s, 6H), 2.48-2.58 (m, 1H), 2.84-2.92 (m, 1H), 3.02-3.16 (m, 1H), 4.66 (s, 1H, フェノールOH), 5.29 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 7.20 (s, 2H), 7.39-7.46 (m, 3H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 16.30, 30.06, 36.40, 76.48, 123.47, 123.50, 124.57, 125.83, 127.69, 133.61, 141.83, 143.50, 144.17, 152.07; ESI (m/z) 255.3 (M++1, 25%), 237.2 (M++1-H2O, 85%)
化合物8(14mg、0.51mmol)を、55℃で4時間、DMF(1mL)におけるシアン化カリウム(50mg、1.56mmol)およびTBA-CN(100mg)で処理した。反応混合物を水(10mL)に注ぎ、EtOAc(5mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥させ、真空下で濃縮して0.2mmSiO2 TLCプレート(20cm×20cm)にかけた。TLCプレートをn-ヘキサン溶媒中15%EtOAcで展開し、Rf 0.5バンドを掻き取り、抽出して化合物9(5mg)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 2.32 (s, 6H), 2.42-2.47 (m, 1H), 2.60-2.65 (m, 1H), 3.00-3.04 (m, 1H), 3.12-3.17 (m, 1H), 4.14 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 4.66 (s, 1H, フェノールOH), 7.20 (s, 2H), 7.43-7.47 (m, 3H).
5-(5-メトキシメチル-4-ヒドロキシ-3-メチルフェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オール(64). HPLCカラムクロマトグラフィー(Supelcoセミプレップシリカカラム、粒径10μm、L×I.D.25cm×10mm、n-ヘキサン中5%IPA、4ml/分、保持時間:11.79分)を使用して、化合物64(10mg)を集めた。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.97-2.03 (m, 1H), 2.36 (s, 3H), 2.52-2.60 (m, 1H), 2.84-2.91 (m, 1H), 3.05-3.14 (mm, 1H), 3.46 (s, 3H), 4.73 (s, 2H, ベンジルCH 2 ), 5.29 (q, 1H, J = 5.5 Hz), 7.09 (s, 1H), 7.33 (s, 1H), 7.41 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.42 (s, 1H), 7.45 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.66 (s, 1H, フェノールOH).
MeOH溶媒を蒸発させ、乾燥させた後、残渣をDCM(10mL)に再溶解し、三フッ化ホウ素メチルスルフィド(350mg、2.7mmol)を室温で添加し、反応物を6時間連続して撹拌した後、0℃でMeOHを滴下し、続いて酢酸エチル(10mL×3)で抽出し、Na2SO4で乾燥し、溶媒を真空下で蒸発させて、表題化合物(81mg)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.87 (s, 3H), 0.91-0.94 (m, 1H), 1.00-1.05 (m, 1H), 1.38-1.78 (m, 8H), 1.95-1.97 (m, 1H), 2.03-2.09 (m, 1H), 2.23 (s, 6H), 2.35-2.42 (m, 1H), 3.74 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 6.85 (s, 2H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 10.69, 16.25, 25.72, 30.32, 30.74, 33.90, 37.23, 42.77, 44.38, 45.69, 82.09, 123.04, 127.23, 139.27, 150.53.
MeOH中臭化銅(II)(110mg、0.49mmol)および5-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オン(40mg、0.16mmol)の混合物を、SiO2 TLC分析(n-ヘキサン中20%EtOAc)で出発物質が消失するまで還流した。反応混合物を真空下で濃縮し、EtOAcに再溶解してシリカゲルカラムに装填した。n-ヘキサン中の25%EtOAcによる第1および第2画分により、それぞれ2-ブロモ-5-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オン(45mg)および2,2-ジブロモ-5-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメチルフェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オン(62mg)を得、続いてTHF-水(1:1)中のNaBH4で処理して、それぞれ51(39mg)(Rf = 0.45)および52(56mg)(Rf = 0.38)を同様に得た。
5-(4-ヒドロキシ-3,5-(ジヒドロキシメチル)フェニル)-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オール(58). 1H NMR (500 MHz, CDCl3-CD3OD) δ 1.84-1.95 (m, 1H), 2.36-2.2.42 (m, 1H), 2.72-2.79 (m, 1H), 2.98-3.02 (m, 1H), 4.72 (s, 4H, ベンジルCH 2 ), 5.17 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 7.22 (s, 2H), 7.30 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.31 (s, 1H), 7.33 (d, 1H, J = 8.0 Hz).
実施例1に記載の方法にしたがって、3-メチル-4-メトキシフェニルボロン酸(199mg、1.20mmol)および5-ブロモ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オン(211mg、1.00mmol)を使用して、化合物55を合成した。収率は化合物2のものに匹敵した。
E2およびPaPE-1(図1)の相対結合親和性(RBA)値は、精製全長ヒトERαおよびERβを使用する競合放射測定結合分析によって得た(Carlson et.al., Biochemistry 36, 14897-14905, 1997)。E2のRBAは100と定義され、E2と比較して、PaPE-1はERαおよびERβに対して50,000倍弱く結合する。E2のナノモル未満のKD値(図10A)と比較して、同等のKD値は、PaPE-1についてERαおよびERβに対してそれぞれ10μMおよび25μMである。したがって、両方のERに対するPaPE-1のER結合親和性は、E2の物理的および機能的なグループ属性を可能な限り保存しながら低下している。
時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動(tr-FRET)アッセイを使用して、ステロイド受容体活性化補助因子3(SRC3)のERαへの結合をモニタした。(Jeyakumar et.al. J Biol Chem, 286, 12971-12982, 2011, Jeyakumar et.al., Anal Biochem 386, 73-78, 2009). 活性化補助因子滴定アッセイ(図10B)では、SRC3はE2とのERα複合体に高親和性で結合したが、PaPE-1とのERα複合体への結合は示さなかった。しかしながら、注目すべきことに、アンタゴニストであるトランスヒドロキシタモキシフェン(OH-Tam)は、E2によって促進されるER-SRC3相互作用を逆転させた;また、PaPE-1はER-SRC3相互作用を逆転させたが、より低いERα結合親和性に見合った、はるかに高い濃度でのみ逆転した(図10C)。MCF-7細胞からの複合体の共免疫沈降によってもERαとSRC3とのE2誘発相互作用が観察されたが、PaPE-1に曝露した後のERαおよびSRC3では共免疫沈降複合体は観察されなかった(図10D)。
PaPE-1は、LRRC54刺激によって示されるように、非ゲノム性遺伝子を活性化することにおいて選択的であったが、本質的には直接的ER遺伝子標的PgRに対して活性がなかった(図3A)。PaPE-1によるLRRC54遺伝子発現の活性化は、抗エストロゲン(フルベストラント)ICI 182,780(図3B)およびERαのノックダウン(図3C)による処理によって阻止された。対照的に、GPR30のノックダウンは遺伝子刺激に対して何ら影響を及ぼさなかった(図3C)。また、PaPE-1はMCF-7細胞の増殖を刺激しなかったが、E2は増殖を強力に刺激した(図3D)。
MCF-7細胞における主要なシグナル伝達経路の活性化をモニタすると、mTORC1活性化に関連するpP70S6Kおよびp4EBP1の増加、mTORC2活性化に関連するpSGK1の増加、およびpMAPKの増加によって見られるように、PaPE-1がmTORおよびMAPKシグナル伝達の活性化において非常に効率的であることが観察された(図3E)。また、pAKTおよびpSREBP1の上昇はE2と比較してPaPE-1において、より顕著であった。しかしながら、PaPE-1は、E2で観察され、ERαの分裂促進活性に関連するERαの検出可能なSer118リン酸化を誘導しなかった(図3E)。
mTOR経路は、環境の栄養状態を感知し、細胞内の代謝機能を調節する主要なシグナル伝達系である。mTORキナーゼは、2つの異なる複合体、mTORC1およびmTORC2として存在し、それぞれRAPTORおよびRICTOR足場折り畳みタンパク質の存在によって区別される。mTORC1は主に細胞代謝を調節するが、mTORC2は主に細胞骨格および細胞増殖の調節に関与すると考えられている。PaPE-1によるmTOR活性化をさらに特性評価するために、MCF-7細胞における近接ライゲーションアッセイ(PLA)を実施し、ERαがE2よりもPaPE-1の存在下でRAPTORとより大きく相互作用することを見出した。AktおよびmTORシグナル伝達において重要な、ERαとmTOR、またはERαおよび40kDaのプロリンに富むAkt基質(PRAS40)との相互作用は検出されず、ERαがRaptorとの直接相互作用を介してmTOR経路を調節したことを示唆した(図11)。
RNA-Seq解析を行って、発現レベルがPaPE-1および/またはE2によって変化した遺伝子を比較した。MCF-7細胞を、10nMのE2または1μM PaPE-1で4時間および24時間処理し、これらの2つの時点で各化合物によって調節される遺伝子を比較した(図4A)。両方の時点で、E2はPaPEより多くの遺伝子を調節し、E2による遺伝子調節の大きさはPaPEによる遺伝子調節の大きさよりも一般に高かった。4時間で、E2は約1500個の遺伝子を制御したが、PaPE-1はわずか500個の遺伝子の発現を調節した(図4A上のVennダイアグラム)。24時間で、約3000個の遺伝子がE2によって調節されたが、PaPE-1は2200個の遺伝子を調節した(図4A下のVennダイアグラム)。4時間および24時間の両方において、PaPE-1によって調節される遺伝子の3/4はE2の標的でもあった。特に、24時間の時点でE2のみが有糸分裂遺伝子をアップレギュレーションし、アポトーシス遺伝子をダウンレギュレーションし、PaPE-1がMCF-7細胞増殖を刺激しなかったという観察と一致した。
PaPE-1媒介転写事象におけるERα、ERK2および活性RNA Pol II動員の役割を調べるために、ChIP-Seq解析を行った。ChIP-Seq(図4C)により、ERαは細胞のE2処理時にクロマチンに動員され、一方ERαはPaPE-1の存在下でクロマチンに動員されなかったことが明らかにされた。PaPE-1はERK2の近位プロモーター領域への動員を引き起こし、一方、E2はERαと共にエンハンサー領域へのERK2の動員を引き起こした。異なるRNA Pol II動員部位がPaPE-1で観察され、PaPE-1が標的遺伝子のエンハンサー領域へのERαまたはERK2動員に影響を及ぼさずにRNA Pol IIの動員を介して転写事象を誘導することがさらに示唆された。図4Cの右にVeh、E2およびPaPE-1による細胞処理後のERα、ERK2およびpSer5 RNAポリメラーゼII結合のこれらの異なるパターンがTFF1/pS2遺伝子およびLRRC54/TSKU遺伝子について示されている。
PaPE-1は、ERおよびmTORシグナル伝達の組織特異的モジュレーターであり、非生殖(代謝および血管)組織における選択的エストロゲン様活性を有する。子宮、胸腺および乳腺の増殖に対するPaPE-1のE2様作用の欠如に対して、体重、肝臓、脂肪組織および脈管構造においてPaPE-1のE2様作用が見られた。8週齢のマウスを卵巣摘出し、2週間後、対照Veh、E2またはPaPE-1で3週間処置した。E2は子宮の成長を高めるのに非常に有効であったが、PaPE-1は子宮質量に対して刺激効果を示さなかった(図5A)。周知のように、E2は顕著な胸腺の退縮を誘導するが、PaPE-1は高用量でさえ胸腺の大きさに影響を及ぼさなかった(図5A)。同様に、PaPE-1は、ビヒクル対照マウスと比較して乳腺管形態を変化させなかったが、E2は顕著な管成長(伸長および分枝)を誘発した(図5B)。しかしながら、興味深いことに、E2およびPaPE-1の両方は、卵巣摘出後にマウスに発生する乳腺脂肪過多症を低下させた。これは、E2またはPaPE-1処置後の脂肪細胞面積の減少と関連していた(図5C)。
PaPE-1の主要な影響は、EchoMRI測定で観察されたように、動物の脂肪蓄積にあった。E2とPaPE-1はともに脂肪量を大幅に減少させたが、E2のみにより総除脂肪体重と水分量が増加し、これらはPaPE-1の影響を受けず、PaPE-1は動物の除脂肪体重よりも全体的な脂肪蓄積を変化させることによって働いたことを示した(図6C)。生殖腺周囲の脂肪組織のH&EおよびOil Red O染色(図6D)は、この組織に対するPaPE-1およびE2の両方の類似した著しいエストロゲン作用を強調した。PaPE-1およびE2は、検査された全脂肪デポーの質量を減少させた(図6E)。生殖腺周囲、腎周囲および皮下の脂肪組織は両方のリガンドによって減少したが、試験された用量ではE2により大幅に減少した。腸間膜脂肪組織は、両方のリガンドによって同様に減少し、また、両方のリガンドも血中のトリグリセリドレベルを減少させた(図6F)。
PaPE-1対E2による遺伝子発現およびシグナル伝達経路の活性化をインビボで複数の組織で研究した。PaPE-1は、遺伝子発現およびシグナル伝達経路活性化パターンにおける組織特異的分子変化を誘導することが見出された。長期研究において動物から採取された様々な組織におけるこれらの変化を特性評価するために、肝臓、骨格筋、生殖腺周囲の脂肪、膵臓、および子宮において変化することが文献に報告されている遺伝子の発現の解析を行った。PaPE-1およびE2は、代謝組織、すなわち肝臓および骨格筋において非常に類似したプロファイルを生成した;全く対照的に、E2のみが子宮において遺伝子発現変化を誘導し(図7A)、非生殖組織におけるPaPE-1の選択的刺激作用と一致した。
ERαノックアウトマウスにおいてPaPE-1活性は失われる。野生型およびERαノックアウトマウス(ERKO)において、E2およびPaPE-1の生理学的プロセスおよび遺伝子発現に対する選択された数の効果を比較した(図13)。OVXマウスをE2またはPaPE-1で3週間処置し、図13Aに示すように、卵巣摘出後の体重増加を減少させるE2またはPaPE-1の能力は、ERKOマウスにおいて失われた。子宮の成長のE2刺激は、予想通り、ERKOマウスでは観察されず(図13B)、E2またはPaPE-1後の血中トリグリセリドの減少もなかった(図13C)。図13Dは、ERαが、ERKOマウスにおいて観察されなかった野生型マウスの肝臓に見られるFASNおよびSREBPlc遺伝子に対するPaPE-1またはE2の抑制効果のメディエータであることを示す。
内皮への直接的効果を評価するために、培養中の無傷の初代ウシ内皮細胞による14C-L-アルギニンの14C-L-シトルリンへの変換を測定することによって、内皮NOシンターゼ(eNOS)活性化を評価した。eNOSは以前に観察されたようにE2によって活性化され(Chambliss、J Clin Invest 120,2319-2330、2010)、PaPE-1に対して匹敵する応答があった;E2およびPaPE-1の両方の効果は、ICIによって完全に弱められた(図8C)。
ER非ゲノム性シグナル伝達を優先的に活性化する化合物をさらに例示するために、PaPE-2およびPaPE-3からの結果を示す。この2つのリガンドはステロイドリガンドであるエストラジオールの変化した形態である点でPaPE-1に構造的に関連するが、もともとエストラジオールD環であった構造において変動を有する。すなわちPaPE-2では環が開裂しており、PaPE-3では環が拡大(図1)している。さらにPaPEの構造を多様化するために、 追加のリガンド、PaPE-4も研究した;このPaPEは、非ステロイド性エストロゲン、ビスフェノールA(BPA)に由来し、BPAのコアビスフェノール構造を維持するが、メチル基の1つを極性ビスアミド置換基で置換することによって減少したER結合親和性を有するように改変されている。PaPE-2、-3および-4のER結合および物理的特性を図1に示す。
これらのPaPEの全ては、インビトロおよびインビボで同様の生物学的活性を示した。それらはすべて、両方の遺伝子の発現を非常によく刺激したE2と比較して、ゲノム性遺伝子刺激に対して優先的な非ゲノム性遺伝子刺激を引き起こした(LRRC54> PgR)(図9A)。E2とは対照的に、これらのPaPEのいずれも、試験した広い濃度範囲にわたってMCF-7細胞の増殖を刺激しなかった(図9B)。すべてのPaPEは、これらの細胞におけるpMAPK、pP70S6およびpSREBP1、およびpAKTによってモニタされるように、MAPK、mTORおよびAKTシグナル伝達経路の活性化を増加させた(図9Cおよび9D)。内皮細胞では、PaPE-1で見られたように(図8C)、E2と同様にPaPE-2、-3および-4もNOS活性を増加させ(図9E)、NOS刺激は 抗エストロゲン、ICIで完全に阻止された。インビボで、4種のPaPEおよびE2は、卵巣切除後、摂食量を変化させずに(図9G)体重増加を低下させた(図9F)。4種のPaPEは子宮質量の増加を誘発しなかったが、これとは対照的に、E2により子宮質量は著しく増加した(図9H)。4種のPaPEによる体重の減少は、EchoMRIによってモニタされるように、体脂肪量の変化にほとんど起因し、除脂肪体重または水分量の変化はほとんどまたはまったくなかった。E2は脂肪量をより顕著に減少させ、除脂肪体重および水分量を増加させた(図9I)。これらの差異の影響は、E2処置動物の体重がPaPE処置動物の体重と一致したという事実を説明することができる。
E2と比較した、ERαのリガンド結合ポケットにおけるPaPE-1の適合性の構造的詳細を示すコンピューターモデルを図2に示す。ヘリックス3および6は結合ポケットのA環末端を拘束し、E2(銀/灰色)はGLU353およびARG394の両方に水素結合を形成し、GLUおよびARGを架橋する結晶水(赤い点)によってさらに安定化する。対照的に、PaPE-1のオルト-メチル基(黄色)は、H3およびH6との立体障害を導入し、リガンドの配置に有意な変化を誘導する。PaPE1のA環OHはGLU353への水素結合を維持し、結晶水は依然としてGLUとARGとの間を架橋するが、ARG394への直接リガンド接触は破壊されている(ER構造は黄色である)。ポケットのD環末端には、HIS524の位置決めにも微妙なシフトがある。全体的に、PaPE-1リガンドの体積が減少し、芳香族C環模倣物による平面性が増加することによって、ポケットの中央領域全体でのファンデルワールス接触がより少なくなるようである。ER-E2複合体に関するこれらの変化の全ては、PaPE-1の結合親和性が非常に低いことと一致する。それにもかかわらず、リガンド結合ポケットの全体的な形状は、PaPE-1の結合によって大きな変化はなく、PaPE-1はなお(短寿命ではあるが)ERと構造的に適格である複合体を形成できることが示唆される。
PaPE-1およびE2の解離速度をERαについて測定した(図10EおよびF)。それらは、ほぼ2000倍異なる。ER-E2複合体の半減期は約30時間であるのに対して、PaPE-1複合体の半減期は1分未満である。
LRRC54遺伝子をPgR遺伝子より高いレベルに選択的に活性化させる化合物は、核外開始経路、すなわち非ゲノム性経路の活性化に優先的であると考えられる。それぞれの場合において、この選択性は、2つの遺伝子の刺激における倍数変化を示すヒストグラムからだけでなく星またはレーダープロット(LRRC54の活性化が青色の曲線上の点としてプロットされ、PgRの活性化が赤い曲線上の点としてプロットされる)から明らかである(図14〜33)。
このヒストグラムにおいて、非ゲノム性遺伝子(LRRC54)の活性化倍数が、ゲノム性遺伝子(PgR)の活性化と比較してエストラジオール(E2)による活性化に対して高い場合に、その化合物は非ゲノム性遺伝子の活性化に対する経路選択を示す。星またはレーダープロットでは、非ゲノム性遺伝子の選択的な活性化は、青色の曲線上の点が、赤色の曲線上の点よりもプロットの中心からさらに遠くに広がっている場合に明らかである。
非ゲノム性経路の活性化のための選択の明確な証拠を示す化合物の例は以下の通りである:化合物2、3、4;15、16、18;24、26、29〜30;32;41;44-47;56-58;59〜60;63-64。適切な濃度(ピコモル濃度)で、化合物40は、非ゲノム性経路の選択性も示す(図25)。
非ゲノム性経路の活性化をほとんどまたは全く示さない化合物の例は、化合物5〜14;17、19〜22;23、25、27-28、31〜35、36〜40、42〜43;48〜49;50〜55;61、62、65〜67。
選択された化合物についてのERαおよびERβRBA値のリスト。RBA(相対結合親和性)値は、100のRBA値を有するエストラジオールのそれに対する結合親和性の尺度である。
肥満の閉経後女性における乳がん細胞の増殖と攻撃性を促進する要因の特定
肥満に関連する血清からの因子を同定するために、「中年の健康調査」と命名された最初の研究から合計100の試料(37人の非肥満、63人の肥満者)が使用された。ボルチモア市と周辺のいくつかの郡を含むボルチモア首都圏の住民である女性から血清を採取した。BMI> 25を、過体重および肥満として分類するためのカットオフとして使用した。対象はすべて閉経後2〜3年の女性であった。これらの100サンプルの炎症、CVDおよび腫瘍学パネルについて、全代謝産物プロファイリングおよびOLINKバイオマーカープロファイリングを実施した(図34AおよびB)。これらの解析は、対象のBMIに基づいて、血清代謝産物組成およびタンパク質組成がある程度階層化していることを示した。この研究の乳癌発症の追跡調査は利用できなかったので、各個体からの血清を使用してERα(+)MCF-7およびT47D細胞およびERα(−)MDA-MB-231細胞における増殖指標を導き出した(図34C)。ERα(+)細胞は肥満個体からの血清で処理された場合に細胞増殖が増加したが、ERα(−)細胞ではそうではなかった。インビトロ細胞増殖指標と血清ドナーのBMIとの間には統計的に有意な線形相関があったが、エストラジオール、テストステロンまたはプロゲステロンレベルでは相関しなかった(図35AおよびB)。MCF-7細胞におけるBT474細胞およびmTOR経路活性化のために、乳癌の攻撃性を測定するための代用物として運動性指標を使用した(図34D)。最初のサンプルセットは癌のない女性のものであるため、いくつかのよく知られている癌血清バイオマーカーのレベルは乳癌転帰を予測すると同定されたバイオマーカーの能力を検証するために測定される。例えば、健常者と比較して、乳癌患者の血液中には、より低いグリセロール、フェニルアラニン、グルタミン酸およびイソロイシンレベルが見出された。より高い増殖指標に関連する血清試料は、低い増殖指標に関連する試料と比較して、これらの代謝産物のレベルが低かった(図35C)。したがって、細胞増殖、運動性、およびmTOR経路活性化の評価は、乳癌の予後に関して有益であり、乳癌の攻撃性の増加に関連するバイオマーカーを同定するために使用された。
次に、相関解析を、血清代謝産物レベルとバイオマーカーレベルとERα(+)細胞からの細胞増殖指標との間で行った。ヒートマップを使用して、MCF-7増殖とp値<0.05で相関する代謝産物およびタンパク質バイオマーカーの相関係数を視覚化した。この解析は、オレイン酸/9-オクタデセン酸(OA)およびパルミチン酸(ヘキサデカン酸)、レプチン(LEP)、サイトカインCCL3およびIL-20が含まれるいくつかの遊離脂肪酸(FFA)がMCF-7およびT47D細胞増殖と正の相関があることを示した(図34EおよびF)。
ERα(+)細胞増殖を増加させる可能性がある特定のFFAを同定するために、同じ血清試料を遊離脂肪酸についてプロファイリングし(図36Aおよび2B)、乳癌細胞におけるより高い増殖を引き起こした試料が、解析した全てのFFAについて高いレベルを有することが確認された。さらに、中年の健康調査のサンプルのサブセットで代謝産物のプロファイリングを実施した。このサンプルには、研究の開始時に肥満であり、後に体重を減らし、研究の最後まで非肥満であった21人の閉経後女性のサンプルが含まれていた。これらの個体から初期試料(階層ツリーの中に濃い赤色の線で標識された)および最終血清試料(階層ツリーにおいて黒色で標識された)をプロファイリングし、減量後のFFAレベルの低下を観察した(図36C)。最後に、癌がなく、後に乳癌の診断を受けたときに血液を寄贈した閉経後女性のサンプルが含まれていたKomen Tissue Bankから得られたサンプルセットを使用した。年齢、BMIおよび人種合致対照サンプルからの血清サンプルもまた使用した。この解析は、乳癌を発症した肥満の閉経後女性は、健常対照と比較して血清中の高レベルのFFAを有することを示した(図36D)。各FFAのER(+)MCF-7細胞株の増殖に影響を及ぼす能力を試験することにより、フォローアップスクリーニングを行った(図36E)。不飽和脂肪酸、特にOAがMCF-7細胞における細胞増殖を増加させるには非常に効率的であることが分かった。対照的に、他のFFAは、細胞増殖を誘導するにはOAほど有効ではなかった(図36E)。
血清中のFFA混合物において細胞増殖を誘導することができる活性成分としてOAを検証するために、インビトロ増殖アッセイを実施した。このアッセイにより、高レベルのOAが乳癌細胞におけるより高い増殖指標と著しく関係していることが明らかになった(図37A)。肥満個体由来の血清もまたmTOR経路活性化を増加させることが見出されたので(図34C)、OAを使用して時間経過実験を行い、OA処理がmTOR経路の下流標的Akt、S6および4EBP1の強力な活性化を引き起こすことが見出された(図37B)。ERK1/ERK2もまた活性化されたが、この活性化はより早期で、かつ一過性であった(図37B)。次に、PaPE-1を使用し、OAがERα-mTORシグナル伝達を介して機能するかどうかを調べるために、PaPE-1がERα-mTORシグナル伝達クロストークを調節することを示した。PaPE-1での細胞の処理は、OA誘導mTOR経路活性化(図37C)およびOA誘導細胞増殖(図37D)を減少させた。OA誘導細胞増殖がERαおよびmTOR経路を介したものであることをさらに確認するために、4-OH-タモキシフェン(R-OH-Tam)、ERαアンタゴニストであるフルベストラント(Fulv)、およびmTOR経路阻害剤であるRADOO1、の存在下でOA処理を行った。試験した薬剤の全てがOA誘導細胞増殖を阻止した(図37E)。肥満個体由来血清もERαおよびmTOR経路を介してMCF-7細胞の増殖を誘導することを確かめるために、4-OH-Tam、FulvおよびPaPE-1の存在下で細胞増殖アッセイを行った。注目すべきことに、PaPE-1は、MCF-7細胞の血清誘導性増殖を阻害するのに最も有効な薬剤であった(図37F左パネル)。しかしながら、正常な細胞培養条件下では、4-OH-TamおよびFulvがより良好な薬剤であり(図37Fの右パネル)、これは肥満個体由来血清による処理がMCF-7細胞をPaPE-1の増殖阻害効果に対してより感受性にすることを示唆する。最後に、高レベルのOAが食餌とは独立であるが、肥満状態のみに関連することを確実にするために、正常または高脂肪食である野生型マウスおよび正常食餌によるレプチン欠損(ob/ob)マウスの両方を卵巣摘出し、6週間にわたってVehまたはPaPE-1を送達したAlzetミニポンプを皮下に埋め込んだ。PaPE-1処置は、食物摂取量を変更することなく、卵巣切除誘発性体重増加を低下させた。卵巣摘出に伴うエストロゲンレベルの低下は、卵巣摘出動物の血清中のOAレベルの上昇を、無傷の動物と比較して引き起こす(図37G、左パネル)。3つのモデルすべてにおいて、PaPE-1による治療は、OAの血清レベルを低下させ、乳癌細胞におけるERα-mTORシグナル伝達による直接作用に加えて、PaPE-1がOAの血清レベルを全身的に低下させることによって肥満を伴う乳癌を予防し得ることを示唆する(図37G)。
OA誘導ERαおよびmTOR経路調節に関連する遺伝子発現変化を明らかにするために、ビヒクル(Ctrl)、100nM OAまたは1μMPaPE-1の存在下の100nM OAでMCF-7細胞を処理した(図38A)。OAは約350個の遺伝子をアップレギュレーションし、これらのアップレギュレーションされた遺伝子の80%の活性化はPaPE-1によって阻止された。他方、約500個の遺伝子がOAによってダウンレギュレーションされ、PaPE-1はこれらの遺伝子の約60%の発現を回復することができた(図38BおよびC)。GOターム(Term)解析により、OAが、細胞増殖、エネルギー貯蔵代謝プロセス、上皮細胞遊走および血管新生に関与する遺伝子をアップレギュレーションすることが示された。他方、OA処理は、グルコースおよび脂肪酸代謝に関与する遺伝子ならびに上皮細胞増殖の阻害剤をダウンレギュレーションした(図38 4D)。
OA処置によって誘導された遺伝子発現変化のいずれかがクロマチンへの直接的なERα動員を介して生じたかどうかを試験するために、ChIP-Seq実験を実施したところ、ERαがOA処理により新規クロマチン部位に動員され、この動員のほとんどがPaPE-1処理によって阻止されることが示された(図39A)。PgRの古典的ERα結合部位を含む種々の部位へのERα動員のパターンが確認された(図39B)。OAの存在下でのERα動員のクロマチンへの動員の性質を理解するために、OA処理に際してERαによって占有される結合部位を研究した(図39AおよびC)。C1、C2、C3およびC4と命名された4つの主要なクラスターがあった(図39C)。これらの結合事象の大部分は、OA処理により発現が増加した遺伝子と関連していた。次いで、転写因子結合モチーフエンリッチメント解析をCistrome/GalaxyのSeqposツールを使用して実施した。興味深いことに、C2を除いたクラスターのいずれも、EREのエンリッチメントがなかったため、これらの部位へのERαの動員の可能性のある係留様式が示唆された(図39D)。次に、これらの因子のいくつかの転写活性を、Cignal finderアッセイと呼ばれるルシフェラーゼベースのシステムを使用して解析した(図39E)。OAへの曝露は、PPAR、LXRおよびRXRの転写活性を増加させ、ERαが遺伝子発現を調節するためにこれらの核受容体を動員し、パートナーとなり、代謝過程および乳癌細胞の生存に必須である変化をもたらすことを示唆する(図39EおよびF)。
遺伝子発現、ERαChlP-Seqおよび転写因子活性アッセイは、OA曝露時のMCF-7細胞における代謝経路の変化の可能性を指摘した。したがって、細胞代謝表現型アッセイを実施した。それによりOAの存在下では、細胞は活発な表現型を採用し、好気的および糖分解性代謝能を増加させることにより代謝ストレスによく対処することが明らかになった(図40A)。細胞はより糖分解性であり(図40B)、そのミトコンドリア代謝は増加し(図40C)、PaPE-1処理によってOA誘発性解糖系および好気性呼吸が逆転した。次に、細胞表現型実験(図40D)からの所見と一致し、ペントース経路(図40E)およびプロリンを含む特定のアミノ酸(図40E)の代謝産物の増加を有するMCF-7細胞で平行メタボロミクス実験を行った。OAは、リンゴ酸およびフマル酸を除くTCAサイクル代謝産物の多くをダウンレギュレーションし、細胞質ゾルからのリンゴ酸分路の増加を示唆したが(図40E)、これは特定のアミノ酸レベルの増加およびミトコンドリア活性の増加と一致する。最後に、脂肪酸生合成経路は、リノール酸合成まで全体的にダウンレギュレーションされ、高レベルの細胞外OAに起因する負のフィードバックループを示唆した(図40E)。全体として、これらの解析は、OA処理が乳癌細胞の有意な代謝再プログラミングを引き起こし、これはPaPE-1処理によって逆転され得ることを示唆している。
雌の8週齢のC57BL/6マウスを卵巣摘出した。次いで、2週間のウォッシュアウト期間の後、ビヒクル、エストラジオールまたはPaPE-1(無作為化、n = 9〜10/群)を含有する皮下ペレットインプラントを埋め込んだ。1週間後、マウスは30分間中大脳動脈閉塞され、続いて90分間の再灌流期間によって、脳虚血再灌流傷害を受けた。1つのコホートは、45分の一過性中大脳動脈閉塞(tMCAo)の前にローターロッドトレーニングを受け、tMCAo後2週間を通してMRIおよびローターロッドを評価した。脾臓白血球亜集団および子宮質量を定量した。別のコホートに45分間のtMCAoを施して、脳、脾臓および血液中の白血球亜集団を脳卒中の3日後定量化した。脳卒中3日後および7日後にMRIを実施し、脳卒中後13日間にわたりローターロッド試験を行った(図41)。
マウスは、tMCAo後2日目でベースラインから53%のローターロッド能力低下を経験した。PaPE-1はベースラインの85%(p = 0.005)および82%(p = 0.001)までそれぞれtMCAo後6日目および13日目で機能回復を改善したが、エストラジオール処置は脳卒中後のl3日目(p = 0.005)にのみ機能を改善した。ビヒクルと比較して、PaPE-1およびエストラジオールの両方が、tMCAo後3日目および7日目に梗塞体積を有意に減少させた。さらに、PaPE-1およびエストラジオール処置により、脳卒中3日後に脳内に浸潤した白血球数はそれぞれ93%(p = 0.002)および63%(p = 0.019)減少した。しかしながら、ビヒクルと比較して、エストラジオールは子宮湿潤質量の増加を引き起こしたが、PaPE-1は効果がなかった。
PaPE-1累積所見は、PaPE-1による非核エストロゲン受容体活性化が、マウスにおける脳卒中の損傷からの保護および有害なPaPE-1後遺症から保護することを示している。
本明細書に引用されたすべての特許、刊行物および参考文献は、ここに充分に援用されている。本開示と援用された特許、刊行物および参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先される。
Claims (79)
- 式(i)の化合物ならびにその立体異性体および医薬的に許容される塩:
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R4は、各々独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、C1-4アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
---は、二重結合であってもよい)。 - C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシが、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシおよびC1-4アルコキシの1つ以上で置換されている、請求項1記載の化合物。
- R3がヒドロキシルである、請求項1または2記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも1つがC1-4アルキルである、請求項1〜3のいずれか1項記載の化合物。
- R1およびR2の両方がC1-4アルキルである、請求項4記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも一方がメチルである、請求項4記載の化合物。
- R1およびR2の両方がメチルである、請求項6記載の化合物。
- C1-4アルキルが置換されている、請求項1〜7のいずれか1項記載の化合物。
- 置換基がヒドロキシである、請求項8記載の化合物。
- R1およびR2が、独立して、H、メチル、エチル、クロロ、-CH2OHおよび-CH2OMeから選択される、請求項1〜9のいずれか1項記載の化合物。
- R3が、H、OH、オキソ、クロロ、シアノまたはメトキシから選択される、請求項1〜10のいずれか1項記載の化合物。
- R4が、フルオロ、クロロ、ブロモ、メトキシ、ヒドロキシまたはオキソから選択される、請求項1〜11のいずれか1項記載の化合物。
- R5がHである、請求項1〜12のいずれか1項記載の化合物。
- R5が-CCHである、請求項1〜12のいずれか1項記載の化合物。
- mが0である、請求項1〜11、13または14のいずれか1項記載の化合物。
- nが1である、請求項1〜15のいずれか1項記載の化合物。
- nが2である、請求項1〜15のいずれか1項記載の化合物。
- 下記からなる群から選択される、請求項1、3〜7、10、11、13、15〜17のいずれか1項記載の化合物:
- 式(ii)の請求項1記載の化合物ならびにその立体異性体および塩
(式中、
Rは、Hまたはメチルである)。 - 式(iii)に従う化合物ならびにその立体異性体および塩
(式中、
mは、0〜3の整数であり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R5は、H、ヒドロキシまたはC1-4アルキルであり;
R6は、各々独立して、H、ヒドロキシ、ハロまたはC1-4アルキルである)。 - C1-4アルキルが、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシおよびC1-4アルコキシの1つ以上で置換されている、請求項20記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも一方がC1-4アルキルである、請求項20または21記載の化合物。
- R1およびR2の両方がC1-4アルキルである、請求項22記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも一方がメチルである、請求項22記載の化合物。
- R1およびR2の両方がメチルである、請求項22記載の化合物。
- C1-4アルキルが置換されている、請求項20〜25のいずれか1項記載の化合物。
- 置換基がヒドロキシである、請求項26記載の化合物。
- R5がヒドロキシである、請求項20〜27のいずれか1項記載の化合物。
- R5がC1-4アルキルである、請求項20〜27のいずれか1項記載の化合物。
- R5が置換されたC1-4アルキルである、請求項29記載の化合物。
- R5が-CH(OH)(CH3)である、請求項30記載の化合物。
- R6がC1-4アルキルである、請求項20〜31のいずれか1項記載の化合物。
- R6が置換されたC1-4アルキルである、請求項32記載の化合物。
- R6が-CH2OHである、請求項33記載の化合物。
- mが1である、請求項18〜32のいずれか1項記載の化合物。
- 下記からなる群から選択される請求項20〜35のいずれか1項記載の化合物:
- 式(iv)を有する化合物:
(式中、
R1およびR2は、H、C1-4アルキル基、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルキルオキシアルキル、シクロアルキルオキシアルキル、アルキルチオ、アルキルチオアルキル、シクロアルキルチオアルキル、R'R''N-アルキル(R'およびR''は独立してアルキル、アルキルカルボニルまたは環状アルキルである)から選択され、括弧は、ヒドロキシルの有無を表し、
R3およびR4は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、ヒドロキシ-C1-4アルキル、シアノ、シアノアルキル、ニトロ、ニトロアルキル、-C(O)-アリール、-C(O)H、アルキルアルデヒド、カルボキシルおよびカルボキシアルキルから選択されるか、または
R3およびR4は、4〜8員原子の環を形成し、前記環はシアノまたはヒドロキシで置換されている)。 - 式(v)の請求項37記載の化合物:
(式中、
R5およびR6は、独立して、ヒドロキシル、シアノ、ヒドロキシアルキル、シアノアルキル、ハロゲン化ヒドロキシルアルキルおよびハロゲン化シアノアルキルである)。 - 式(vi)に従う化合物ならびにその立体異性体および医薬的に許容される塩;
(式中、
nは、0〜4の整数であり;
mは、0〜4の整数であり;
Xは、H、ヒドロキシまたはC1-4アルコキシであり;
R1およびR2は、独立して、H、ヒドロキシ、C1-4アルキル、C1-4アルコキシ、アミノ、-S-C1-4アルキルまたはハロであり;
R3は、H、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
各R4は、独立して、水素、ヒドロキシ、オキソ、ハロ、C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシであり;
R5は、H、アルキニルであるか、または二重結合が存在する場合には存在せず;
R6およびR7は、独立して、C1-4アルキルおよびHから選択され;
---は、二重結合でああってもよい)。 - C1-4アルキルまたはC1-4アルコキシが、ハロ、シアノ、アミノ、ヒドロキシおよびC1-4アルコキシの1つ以上で置換されている、請求項39記載の化合物。
- R3がヒドロキシルである、請求項39または40のいずれか1項記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも一方がC1-4アルキルである、請求項39〜41のいずれか1項記載の化合物。
- R1およびR2の両方がC1-4アルキルである、請求項42記載の化合物。
- R1およびR2の少なくとも一方がメチルである、請求項42記載の化合物。
- R1およびR2の両方がメチルである、請求項44記載の化合物。
- C1-4アルキルが置換されている、請求項39〜45のいずれか1項記載の化合物。
- 置換基がヒドロキシである、請求項46記載の化合物。
- R1およびR2が、独立して、H、メチル、エチル、クロロ、-CH2OHおよび-CH2OMeから選択される、請求項39〜47のいずれか1項記載の化合物。
- R3が、H、OH、オキソ、クロロ、シアノまたはメトキシから選択される、請求項39〜48のいずれか1項記載の化合物。
- R4が、フルオロ、クロロ、ブロモ、メトキシ、ヒドロキシまたはオキソから選択される、請求項39〜49のいずれか1項記載の化合物。
- R5がHである、請求項39〜50のいずれか1項記載の化合物。
- R5が-CCHである、請求項39〜50のいずれか1項記載の化合物。
- mが0である、請求項39〜49、51または52のいずれか1項記載の化合物。
- nが1である、請求項39〜53のいずれか1項記載の化合物。
- nが2である、請求項39〜54のいずれか1項記載の化合物。
- R6がメチルである、請求項39〜55のいずれか1項記載の化合物。
- R7がHである、請求項39〜56のいずれか1項記載の化合物。
- 式(vii)に従う化合物ならびにその立体異性体および塩;
(式中、
R7およびR8は、独立して、H、C1-5アルキル、アミノ、ヒドロキシル、シアノ、アミド、環状C3-8アルキルまたはヘテロシクリルである)。 - R7およびR8が、C1-4アルキルアミノカルボキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキルアミノ-C1-4アルキル、C1-4アルキルアミノ-C1-4アルキル-アミノ-カルボキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキルオキシ-C1-4アルキルアミノ-カルボキシ-C1-4アルキル、C1-4アルキルチオ-C1-4アルキルアミノ-カルボキシ-C1-4アルキルまたはC1-4アルキルチオ-C1-4アルキルから選択される、請求項58記載の化合物。
- R7がメチルである、請求項58または59記載の化合物。
- R8が、置換されたC1-4アルキルである、請求項58〜60のいずれか1項記載の化合物。
- R8が、-C(O)-R、-C(O)NRN1RN2、-C(O)OR、-NRN1C(O)Rまたは-OC(O)R(ここで、RN1、RN2およびRは、独立して、HまたはC1-4アルキルから選択される)で置換されている、請求項61記載の化合物。
- RNI、RN2またはRの少なくとも1つが、-(CH2)n-R10(ここで、nは2〜5の整数であり、R10が-C(O)-R、-C(O)NRN1RN2、-C(O)OR、-NRN1C(O)Rまたは-OC(O)Rであり、RN1、RN2およびRは、独立して、H、アリール、シクロアルキル、またはOHまたはアミノで置換されていてもよいC1-4アルキルから選択される)である、請求項62記載の化合物。
- 下記の化合物である、請求項58〜63のいずれか1項記載の化合物
- 下記からなる群から選択される化合物ならびにその立体異性体および医薬的に許容される塩
- 下記からなる群から選択される、請求項65記載の化合物およびその医薬的に許容される塩:
- 請求項1〜66のいずれか1項記載の化合物および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
- 対象における疾患または状態を治療する方法であって、請求項1〜67のいずれか1項記載の化合物または組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
- 疾患または状態が、エストロゲン受容体の核外開始経路によって影響されている、請求項68記載の方法。
- 疾患または状態が、閉経後症状、心血管疾患、脳卒中、血管疾患、骨疾患、代謝性疾患、関節炎、骨粗鬆症、肥満、血管運動性症状/のぼせ、認知低下、および癌から選択される、請求項68または69記載の方法。
- 疾患が脳卒中である、請求項68〜70のいずれか1項記載の方法。
- 疾患が代謝性疾患である、請求項68〜70のいずれか1項記載の方法。
- 癌が乳癌である、請求項68〜70のいずれか1項記載の方法。
- 疾患が肥満関連乳癌である、請求項73記載の方法。
- 疾患がエストロゲン応答性乳癌である、請求項73記載の方法。
- 疾患が血管疾患である、請求項68〜70のいずれか1項記載の方法。
- 疾患が骨粗鬆症である、請求項68〜70のいずれか1項記載の方法。
- 対象がヒトである、請求項68〜77のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜67のいずれか1項記載の化合物または組成物および使用説明書を含むキット。
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