KR20150116788A - 메틸렌블루를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메틸렌블루를 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학 조성물에 관한 것으로 메틸렌블루는 LXR-α 활성화 조절을 통한 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein)의 발현 및 활성을 억제한다. 따라서 메틸렌블루는 지질생성 유전자의 발현억제, 나아가 간 조직 내 중성지방의 축적 억제에 현저한 효과를 나타내어 고지질 식이로 유도되는 대사장애에 의한 지방간증 및 지방간염의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 메틸렌블루는 LXR-α 또는 SREBP-1의 과다 발현 및 과다 활성으로 인한 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

Description

메틸렌블루를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING METHYLENE BLUE FOR PREVENTING OR TREATING METABOLIC DISORDERS}

본 발명은 메틸렌블루의 대사성 질환 치료용 용도와 관련된 것이다.

대사성 질환 중 대표적인 것이 지방간이다. 지방간은 의학적으로 지방이 전체 간 무게의 5% 이상을 초과하는 병적 상태를 의미하는데, 이를 포함하는 간질환은 선진국 40-50대 성인 인구의 사망원인에서 암 다음으로 심각한 간질환으로 알려져 있다. 현재 지방간과 지방간염을 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이므로 운동과 식이요법이 권장되고 있으나, 실제로 이러한 방법에 의한 지방간의 치료효율은 매우 낮기 때문에 유효한 치료제 개발의 요구가 높다. 또한 LXR-α(Liver X Receptor-α) 활성화에 의해 매개되는 SREBP-1(Sterol Regulatory Element-Binding Protein-1) 전사 활성은 비알콜성지방간증의 진행을 촉진하지만 아직까지 LXR-α의 활성을 효과적으로 조절함으로써 간 내 지질축적을 억제하는 약물은 존재하지 않는다. 따라서 효과가 탁월하면서도 부작용을 유발하지 않는 안전한 지방간 치료제의 개발이 절실한 실정이다.

한국 공개특허 2007-0082557은 비만 및 대사증후군의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, NAD(P)H:quinone oxidoreductase (NQO1) 등의 산화환원 효소(oxidoreductase)가 NAD(P)H을 기질 또는 보효소로 사용하여 생체 조건(in vivo) 또는 시험관 조건(in vitro)에서 NAD(P)+의 농도를 높임으로써, 궁극적으로 NAD(P)+/NAD(P)H 비율을 높여 에너지 과잉의 문제로 인하여 발생될 수 있는 모든 질환, 즉, 비만, 당뇨, 대사증후군, 퇴행성 질환 및 미토콘드리아 기능이상 질환 등을 효과적으로 치료할 수 있는 방법, 이를 위한 약제의 스크리닝 방법 및 이를 바탕으로 하는 치료 약제 등을 개시한다.

본 발명은 지방간증, 지방간염 등을 포함하는 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학 조성물을 제공하는 것으로, 특히 대사성 질환을 포함하는 LXR-α 및/또는 SREBP-1 의 저해를 통해 LXR-α 또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병의 예방 또는 치료를 위한 약학조성물을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 메틸렌블루, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에 따르면 메틸렌블루는 지질생성 효소 유전자 발현을 조절하는 핵심 전사인자인 LXR-α (Liver X Receptor-α) 및 SREBP-1(Sterol Response Element Binding Protein)의 발현 및 활성, 그리고 지질생합성 유전자 ACC(acetyl CoA carboxylase)의 발현을 억제함으로써 대사장애에 의한 지방간증으로 인한 간 조직 내 중성지방의 축적을 억제하는 것으로 나타났다.

따라서 일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 LXRα 및 SREBP-1의 발현 또는 활성 억제를 통해 그 효과를 나타낸다.

다른 구현예에서 본원에 따른 조성물은 LXRα 활성 조절을 통한 SREBP-1 의 발현 및 활성을 억제하여 예를 들면 고지질 식이에 의한 지방간증 또는 지방간염의 치료 또는 예방에 효과가 있다.

또한 본원에 따른 조성물이 효과가 있는 대사성 질환은 LXR-α 또는 SREBP-1 의 과다 발현 또는 과다 활성에 의한 것으로 이러한 질환은 예를 들면, 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 신사구체경화(glomerulosclerosis), 단백뇨(proteinuria), 및 신장해(nephropathy)를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 메틸렌블루를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 대사장애에 의한 지방간증으로 인한 간조직 내 중성지방의 축적을 억제하고, 지질생성 효소 유전자 발현을 조절하는 핵심 전사인자인 LXR-α 및 SREBP-1의 발현 및 활성을 억제함으로써 지질생성을 억제한다. 따라서 메틸렌블루를 포함하는 약학 조성물은 지방간증 및 지방간염을 포함하는 대사성 질환을 예방하고 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.

아울러 메틸렌 블루를 포함하는 조성물은 LXR-α 또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병의 예방 및 치료 예를 들면 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 신사구체경화(glomerulosclerosis), 단백뇨(proteinuria), 및 신장해(nephropathy) 등의 예방 및 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

도 1은 간세포주인 HepG2에 LXRα의 리간드(T0901317)를 처리하여 유도된 LXRa 유전자의 발현에 대한 메틸렌블루의 효과를 분석한 결과로 메틸렌블루의 투여로 인해 LXR-α의 전사 활성이 감소되었음을 나타낸다 (**: 비히클 투여군과 비교하여 p<0.01, #: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.05, ##: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.01).
도 2는 간세포주인 HepG2에 LXRα의 리간드(T0901317)를 처리하여 유도된 LXRα의 전사활성에 대한 메틸렌블루의 효과를 분석한 결과로, 메틸렌블루의 투여로 인해 LXR-α의 전사 활성이 감소되었음을 나타낸다 (**: 비히클 투여군과 비교하여 p<0.01, ##: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.01).
도 3은 간세포주인 HepG2에 LXR-α 리간드 (T0901317)을 처리하여 유도된 SREBP-1 유전자의 발현에 대한 메틸렌블루의 효과를 분석한 결과로 메틸렌블루의 처리로 인해 SREBP-1 유전자의 발현이 감소되었음을 나타낸다 (**: 비히클 투여군과 비교하여 p<0.01, ##: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.01).
도 4는 LXRα 리간드인 T0901317을 간세포주인 HepG2, AML-12 및 래트 일차 배양 간세포(Rat Primary Hepatocyte)에 처리하여 유도된 SREBP-1 단백질의 발현에 대한 메틸렌블루의 효과를 웨스턴블럿 방법으로 분석한 결과로 메틸렌블루 처리에 의해 LXR-α 및 SREBP-1 단백질의 발현이 감소되었음을 나타낸다.
도 5는 HepG2에 LXRa의 리간드(T0901317)를 처리여 유도된 지질생합성 유전자 ACC(Acetyl coA carboxylase) 발현에 대한 메틸렌블루의 효과를 분석한 결과로 메틸렌블루에 의해 ACC 발현이 억제됨을 나타낸다 (**: 비히클 투여군과 비교하여 p<0.01, #: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.05, ##: 메틸렌블루를 투여하지 않은 T0901317 투여 군과 비교하여 p<0.01).
도 6은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 메틸렌블루 투여시 간 조직 내 중성지방의 함량을 분석한 결과로 메틸렌블루가 고지질 식이로 발생하는 간조직의 중성지질 축적을 억제하는 것을 나타낸다 (ND:정상식이군, HFD:고지질식이군, MB:메틸렌블루, **: ND군과 비교하여 p<0.01, #: 메틸렌블루를 투여하지 않은 HFD 군과 비교하여 p<0.05, ##: 메틸렌블루를 투여하지 않은 HFD 군과 비교하여 p<0.01).
도 7은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 메틸렌블루 투여에 의한 간조직의 변화를 지방 염색법 (Oil Red O)으로 분석한 결과로 메틸렌블루가 고지질 식이로 발생하는 간조직의 중성지질 축적을 억제할 수 있음을 나타낸다 (ND:정상식이군, HFD:고지질식이군, MB:메틸렌블루).
도 8은 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 메틸렌블루의 투여에 의한 간 조직의 변화를 헤마톡실린 & 에오신 (Hematoxylin & Eosin) 염색으로 분석한 결과로, 메틸렌블루가 고지질 식이로 발생하는 간조직의 중성지질 축적을 억제할 수 있음을 나타낸다.

본원은 메틸렌블루 (3,7-bis(Dimethylamino)-phenothiazin-5-ium chloride)의 질병 치료와 관련된 신규용도에 관한 것이다.

한 양태에서 본원은 메틸렌블루, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이들의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 조성물은 일 구현예에서 LXR-α(Liver X receptor-α) 및 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 발현 및 활성을 억제하며, 간세포주인 HepG2에 LXR-α 활성화제 (T0901317)을 처리하여 증가된 LXR-α 전사활성이 메틸렌블루 처리에 의하여 감소하였으며 LXR-α 및 SREBP-1 유전자의 발현이 감소된다는 것을 최초로 규명하였다 (도 1 내지 도 4).

또한 본원에 따른 다른 구현예에서는 메틸렌블루는 HepG2에 T0901317을 처리하여 증가된 지질생합성 유전자 ACC (acetyl CoA carboxylase)의 발현을 현저히 억제하였다(도 5),

또한 본원에 따른 또 다른 구현예에서는 메틸렌블루가 고지질 식이로 발생하는 간조직의 중성지질 축적을 억제하였다 (도 6 내지 도 8).

따라서 본원의 조성물은 LXR-α 또는 SREBP-1의 과다 발현 및 활성으로 인한 질병의 예방 또는 치료에 효과가 있으며, 이러한 질병은 예를 들면 지방간, 지방간염, 고중성지방혈증, 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증, 신사구체경화, 단백뇨, 및 신장해를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다 (Calkin and Tontonoz, Molecular 2012, cellular biology, Vol 13:213-224).

또한 일 구현예에서 본원의 조성물은 대사성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있다.

본원에서 "대사성 질환"은 대사 증후군 (metabolic syndrome)이라고도 불리며, 각종 심혈관 질환과 제 2형 당뇨병의 위험 요인들이 서로 군집을 이루는 현상을 하나의 질환군을 일컫는 것이다. 인슐린 저항성(Insulin Rersistance) 및 이와 관련된 복잡하고 다양한 여러 대사이상 및 임상양상을 모두 포괄한다. 대사증후군을 가질 경우 심혈관 질환 혹은 제2형 당뇨병의 발병 위험도가 증가된다. 대사증후군 환자 수는 비만인구 증가와 함께 폭발적으로 증가함이 보고되어 있다. 과체중/비만으로 발생하는 인슐린 저항성은 에너지 대사이상(당뇨병)의 만성 이환에 중요 결정요인이고, 아울러 만성적 염증상태 및 심혈관계 이상을 유도한다. 따라서 대사이상은 심혈관 질환 발병을 촉진하며, 간조직에서는 지방축적과 중증 간질환 발병의 위험성을 증가시키는 만성 난치성 질환의 근본적 원인 요소로 작용한다 (Anstee et al., Gastroenterology & Heaptology, 2013, Vol 10:330-344).

과량의 지방산 섭취는 몸의 여러 조직, 특히 지방조직에 트리글리세리드의 축적을 가져오고 이로 인해 지방조직에서 지질분해가 증가된다. 이로 인한 혈류의 지방산 증가는 인슐린 저항성을 초래하고 근육, 췌장 및 간과 같은 비지방조직까지 지방산의 증가를 가져온다. 인슐린 저항성이 있는 사람의 경우, 지방 및 비지방조직에서의 지방산결합수송단백질 (FABP 및 CD36)의 농도가 증가하여 지방산의 이용(uptake)를 촉진하게 된다. 이러한 과량의 자유 지방산 및 근육에의 지방산의 축적은 인슐린 신호전달 및 당의 사용에 있어 악순환을 초래한다. 췌장이 자유 지방산에 오래 노출되게 되면 지방독성 기전을 통하여 인슐린 분비에 장애를 가져오는 것으로 알려져 있다 (Lebovitz HE. Insulin resistance: definition and consequences. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2001;109:S135-48). 간에서도 당의 방출을 향상시켜 인슐린의 작용을 방해하는 것으로 알려졌다 (Goldstein BJ. Insulin resistance as the core defect in type 2 diabetes mellitus. Am J Cardiol. 2002;90:3G-10G). 간에 트리글라세리드가 쌓이게 되면 비알콜성 지방간을 초래하며, 이는 지방증, 지방간염, 간세포괴사, 섬유증과 같은 간의 손상을 가져와, 간의 주요기능인, 당대사를 막는다 (Angulo P. Nonalcoholic fatty liver disease. N Engl J Med. 2002;346:1221-31). 이러한 증상은 대사질환의 중요 증상이기도 하다 (Kadowaki T, Yamauchi T. Adiponectin and adiponectin receptors. Endocr Rev. 2005;26:439-51).

일 구현예에서 본원에 따른 조성물은 고지질 식이에 의한 지방간증 또는 지방간염의 예방 또는 치료에 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "치료"란 본원 조성물의 투여로 대사 질환의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "예방"은 본원 조성물의 투여로 대사 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 대사질환에 치료효과가 있는 본원의 본원 조성물은 지방간증 또는 지방간염 등과 같은 질환의 초기 증상, 또는 나타나기 전에 복용할 경우 이러한 질환을 예방할 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명에서 사용되는 약제학적으로 허용되는 부가 염은 약제학적으로 허용되는 산부가 염 및 약제학적으로 허용되는 염기 부가염을 포함한다. 예를 들면 산은 염산 또는 브롬산 등의 할로겐산; 황산, 질산 및 인산 등의 무기산; 및, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로판산, 하이드록시아세트산, 락트산, 피루브산, 옥살산, 말론산, 숙신산(즉, 부탄디오익산), 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 시클람산, 살리실산, p-아미노-살리실산 및 파모산 등의 유기산을 포함한다. 염기 염 형태는 예컨대, 암모늄 염, 알칼리 및 알칼리 토금속 염으로 예를 들면 리튬, 소듐, 포타슘, 마그네슘 및 칼슘 염등이고, 또한 벤자틴, N-메틸-D-글루카민, 히드라바민 염과 같은 유기 염기와의 염, 및 아르기닌, 리신 등과 같은 아미노산과의 염을 포함한다.

또한, 본원은 또한 메틸렌블루로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물을 모두 포함한다. 용매화물에는 수화물, 알코올레이트 등이 있다

본원에 따른 치료제 또는 약제학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 예로서 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.

본원의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 비경구 투여가 바람직할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본원의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 유효 투여량은 통상적으로 성인(60 kg)의 경우 일반적으로는 상기 조성물 1 내지 500 mg, 바람직하게는 30 내지 300 mg을 1일 1회 또는 수회 분할하여 투여할 수 있다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.

본원에 따르면 메틸렌블루는 지질생성 효소 유전자 발현을 조절하는 핵심 전사인자인 LXR-α 및 SREBP-1의 발현 및/또는 활성, 그리고 지질생합성 유전자 ACC(acetyl CoA carboxylase)의 발현을 억제함으로써 대사장애에 의한 지방간증으로 인한 간 조직 내 중성지방의 축적을 억제하는 것으로 나타났다.

따라서 메틸렌블루를 포함하는 약학 조성물은 지방간증 및 지방간염을 포함한 대사성 질환뿐만 아니라 LXR-α 또는 SREBP-1의 과다발현 또는 과다활성으로 인한 질병들의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법 및 재료

실험 동물 및 식이: 실험동물로 사용된 수컷 C57BL/6 마우스 (평균 체중 25 내지 30 g)는 Charles River Orient (Seoul. Korea)에서 구입하였다. 실험에 사용하기 전 1주 이상 55± 5%의 습도, 22± 2℃의 온도 및 환기가 조절된 서울대 약대 동물실험 연구동에서 동물을 적응시켰으며, 오전 7시와 오후 7시를 기준으로 하여 12시간 주기로 명암을 바꾸어 주었다. 실험이 진행되는 기간 동안 식이량 및 식수량에는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 고지질식이 동물실험모델의 경우, 동물의 무게와 상태를 매주 1회 검사하였고 고지질식이 (Dyets Inc., Israel) 또는 정상식이로 8주간 사육하였고 마지막 4주동안 메틸렌블루 (3-10 mg/kg, 4 times/week)를 투여하였다. 각 그룹은 총 4-10마리의 마우스로 구성되었다.

고지질식이 모델과 별도로 상기모델과 동일한 수컷 C57BL/6 마우스 (평균 체중 18 내지 20 g)에 1일 1회 총 3일간 메틸렌블루 (3-10 mg/kg)를 투여한 후 간조직을 적출하여 생화학적 분석을 수행하였다. 각 그룹은 총 5마리의 마우스로 구성되었다.

메틸렌블루: 미국 Sigma 사에서 구입했으며, 지방간 유발을 위한 고지질 식이는 미국 다이엣사(Dyets Inc.)에서 구입하였다. 원하는 농도의 메틸렌블루는 동물용 식용수에 희석하여 제조하였다.

실시간 역전사 PCR : 마우스 간에서 추출한 총 RNA (2 μg)와 d(T)16 프라이머 및 AMV 역전사효소 (reverse transcriptase)를 사용하여 cDNA를 얻었다. 유전자들의 상대적인 양은 하기 기재된 유전자 특이적 프라이머 및 CyBr green dye를 사용한 Real-time RT-PCR법에 의해 정량하였다. Real-time RT-PCR은 Roche (Mannheim, Germany)의 Light-cycler2.0 을 이용하였다. 제조사의 방법에 따라 PCR을 수행하고 Light-cycler software 4.0 프로그램을 사용하여 각 유전자 발현의 상대적인 양을 분석하였다.

웨스턴블랏 : 세포에서 총 단백질을 분리하여 SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)로 분리하였다. 간 시료의 용해분획을 샘플희석완충액 [63mM Tris (pH.6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 0.0013% bromophenol blue, 5% β-mercaptoethanol]에 희석하여 7.5%, 9% 젤을 사용하여 전극 완충액 (1L 용액 중 Tris 15g, glycine 72g, SDS 5g 포함)내에서 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 젤내의 단백질은 전이용 전기영동장치를 이용하여 전이완충액 [25mM Tris, 192mM glycine, 20% v/v methanol (pH.8.3)]내에서 190 mAmps로 1시간 동안 나이트로셀룰로오즈 막에 전이시켰다. 항-SREBP-1 항체(Sigma)를 1차 항체로 사용하여 반응시킨 후 2차 항체로 Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG를 1시간 반응시키고 ECL chemiluminescence system (Amersham, Gaithesberg, MA)으로 발색하였다. 시료 중 단백질 함량의 동질성은 항-β-actin 항체(Sigma)를 사용하여 확인하였다.

통계처리: 하기 실시예에서 제시한 결과는 약물학적 계산 프로그램을 이용하여 분석한 것으로, 다양한 실험군 간의 유의성을 일방향 평방편차 분석법 (Fisher, R.A., Statistical Methods for Research Workers, Edinburgh: Oliver & Boyd,1925) 으로 검정한 후 뉴먼-켈스 검사 (Norman GR 등., Biostatistics: The Bare Essentials,20000)로 판정하였다(*, # p<0.5, **, ## p<0.01).

실시예 1: 메틸렌블루 처리에 의한 LXR α의 발현억제 효과

대표적인 인간 간세포주인 HepG2 (ATCC® HB-8065)에 메틸렌블루(MB, 1μM 또는 3μM)을 1시간 전처리하고, LXRα 활성화제 T0901317 (10μM, Sigma)을 12시간 처리한 후, 간세포주에서 mRNA를 분리하고 RT-PCR을 통해 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머 (Human LXRα, 5'-GATCGAGGTGATGCTTCTGGAG-3' (sense) 및 5'-CCCTGCTTTGGCAAAGTCTTC-3' (antisense))를 이용하여 실시간 PCR로 LXRα유전자 발현을 분석하였다. 매체 대조군인 비히클(디메칠설폭시드, Dimethylsufoxide(DMSO)) 투여군의 LXRα mRNA의 수준을 1로 하였을 때, 각 시험군의 상대적인 LXRα mRNA의 수준을 분석하였다.

결과는 도 1에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 세포내 지질 센서인 LXRα의 발현이 T0901317에 의해 유의하게 약 3배 증가되었으나 (**p<0.01), 이러한 LXRα 발현의 증가는 메틸렌블루 1μM 투여에 의해 약 1.8배 (#p<0.05), 3μM 투여군에서는 약 1.6배로 억제되었다(##p<0.01).

실시예 2: 메틸렌블루 처리에 의한 LXR α 전사활성( LXRE 결합능 ) 억제 효과

LXRα은 표적유전자 프로모터에 존재하는 특정영역(LXRE)에 결합함으로서 다른 유전자의 발현을 조절한다. 메틸렌블루 처리에 의해 LXRE 결합능이 변화되는지를 관찰하고자 리포터 유전자(Luciferase reporter gene assay)를 이용하여 분석하였다.

먼저, LXRE를 함유한 벡터(Vector) TK-CYP7A1-LXREx3-LUC (Wu et al. Molecular Pharmacology 2011 vol. 80 no. 5 859-869)를 HepG2 세포주에 리포펙타민 (Invitrogen, USA)을 이용하여 전달이입하였다. 12시간 경과한 후, HepG2에 메틸렌블루(MB, 1μM 또는 3μM)을 1시간 전처리하고, LXRα활성화제 T0901317(10μM)을 12시간 처리하였다. 그런 후, Passive lysis buffer (Promega, USA)를 이용하여, 세포의 분획물을 획득한 후, 루미노미터(AutoLumat LB 953 - Berthold Technologies USA)를 이용하여 루시퍼라제 활성을 측정하였다.

결과는 도 2에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 LXRα활성화제(T0901317)를 HepG2에 처리 시 LXRa 결합부위가 포함된 LXRE 리포터 유전자의 활성이 12 시간 만에 비히클(DMSO) 투여군에 비하여 약 1.7배(**p<0.01) 증가하였으나, 이러한 증가는 메틸렌블루 처리에 의하여 감소하였다. 메틸렌블루 1 μM 처리시 상대적 루시퍼라제활성은 약 0.9배, 3μM 처리시 약 0.5배(##p<0.01)로 감소되었다.

실시예 3: 메틸렌블루 처치에 의한 SREBP -1 의 발현억제 효과

실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 각 시험군의 상대적인 SREBP-1 mRNA의 수준을 결정하였으며, 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다: Sense ; 5′-CGACATCGAAGACATGCTTCAG-3'; Anti-sense ; 5′-GGAAGGCTTCAAGAGAGGAGC-3'.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 그 결과 SREBP-1의 발현이 T0901317에 의해 유의하게 약 6.4배로 증가되었으나 (**p<0.01), 이러한 SREBP-1 발현의 증가는 메틸렌블루 1μM 투여군에서는 약 4.3배, 3μM 투여군에서는 약 3.6배로 억제되었다(##p<0.01).

이어 T0901317을 간세포주인 HepG2, AML-12 (ATCC® CRL-2254) 및 래트 일차배양 간세포 (primary hepatocyte)에 처리하고, 웨스턴블랏 방법에 의하여 SREBP-1 단백질을 확인하였다.

결과는 도 4에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 SREBP-1의 발현이 T0901317에 처리에 의해 12 시간 만에 현저하게 증가하였다 (도 4 각 젤 사진의 4번째 컬럼). 하지만 이렇게 증가된 SREBP-1 단백질은 메틸렌블루 처리에 의하여 농도 의존적으로 감소하였다(도 4 각 젤 사진의 5번째 및 6번째 컬럼). 이는 SREBP-1의 발현이 메틸렌블루에 의해 억제되는 것을 나타낸다.

실시예 4: 메틸렌블루 투여에 의한 ACC 유전자 억제효과

실시예 1과 같은 방법으로 실시하여 각 시험군의 지질 생합성 유전자 ACC(acetyl CoA carboxylase)의 상대적인 수준을 결정하였다. 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다: Sense ; 5′-GCTGCTCGGATCACTAGTGAA-3′; Anti-sense ; 5′-TTCTGCTATCAGTCTGTCCAG-3′

결과는 도 5에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 ACC의 발현이 T0901317에 의해 유의하게 약 2.3배 증가되었다(**p<0.01). 하지만 이러한 발현의 증가는 메틸렌블루 1μM 투여군에서는 약 1.5배 (#p<0.05), 3μM 투여군에서는 약 1.1배로 억제되었다(##p<0.05). 이는 ACC의 발현이 메틸렌블루에 의해 억제되는 것을 나타낸다.

실시예 5: 메틸렌블루 투여에 의한 고지질식이로 축적된 간조직 내 중성지방의 함량 억제효과

정상 식이 및 고지질 식이를 마우스에 8주간 실시하고 마지막 4주간 메틸렌블루를 주당 4회 3-10 mg/kg를 투여한 후 고지질 식이로 축적된 간조직 내 중성지방 함량에 대한 메틸렌블루의 효과를 관찰하였다. 간조직 내 중성지방의 함량은 지방간을 나타내는 지표이다.

결과는 도 6에 기재되어 있다. 메틸렌블루를 투여한 후 간조직 내 중성지방의 함량을 측정한 결과 고지질 식이(HFD)를 8주 실시한 마우스에서는 간조직 내 중성지방의 함량이 약 56 mg/g liver로서 약 29 mg/g liver인 정상식이군(ND)에 비하여 현저히 증가된 반면(**p<0.01), 메틸렌블루가 투여된 경우에는 조직 내 중성지방의 함량이 3mg/kg 투여군에서 약 42 mg/g liver (#p<0.05), 10mg/kg 투여군에서 약 41 mg/g liver (##p<0.01)으로 유의하게 감소하였다.

실시예 6: 메틸렌블루 투여에 의한 고지질식이로 유도된 지방간 동물모델에서 간 조직 분석결과

고지질식이로 유도된 지방간에 대한 메틸렌블루의 치료효과를 지방 특이 염색제인 오일 레드 오 (Oil Red O) 염색법을 이용하여 간 조직을 분석하여 확인하였다. 실시예 5에서 채취한 간 조직을 10% 중성포르말린 용액으로 고정하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 ㎛의 두께로 절편 하여 오일 레드 오로 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 7에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 고지질식이군에서는 오일레드오로 붉게 염색된 부분이 현저하게 나타났으며(HFD), 메틸렌블루가 투여된 군(HFD+MB)에서는 붉게 염색된 부분이 현저하게 줄어들어 메틸렌블루가 탁월한 치료효과를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 7: 메틸렌블루 투여에 의한 고지질식이로 유도된 지방간염 억제효과

메틸렌블루의 투여 후 고지질식이로 유도된 지방간염의 치료효과를 간 조직을 조직 진단용 염색제인 헤마톡실린 & 에오신 (Hematoxylin & Eosin) 염색법을 이용하여 분석하였다. 실시예 5에서 채취한 간 조직을 10% 중성포르말린 용액으로 고정하고 통상적인 고정절차 및 탈수과정을 거친 후 파라핀으로 조직을 포매하였다. 포매한 조직을 4 ㎛의 두께로 절편 하여 헤마톡실린 & 에오신으로 염색을 실시한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 8에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 고지질사료를 섭취한마우스의 간에서 증가한 간세포 손상 및 지질축적이 메틸렌블루의 투여에 의해 현저히 개선되었다.

본원의 실시예의 결과는 메틸렌블루를 투여에 의해 대사장애로 인한 지방간증과 지방간염을 유용하게 예방 및 치료할 수 있음을 나타내는 것이다.

Claims (5)

1. 메틸렌블루, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 용매화물 또는 수화물을 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 메틸렌블루에 의한 대사성 질환의 예방 또는 치료는 LXRα(Liver X receptorα) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein)의 억제에 의한 것인, 약학 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 대사성 질환은 고지질 식이에 의한 지방간증 또는 지방간염인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 대사성 질환은 LXR-α(Liver X receptor-α) 또는 SREBP-1 (Sterol Response Element Binding Protein-1)의 과다 발현 또는 과다 활성에 의한 것인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 대사성 질환은 고중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 고레닌혈증, 레닌으로 기인한 고혈압, 알도스테론증, 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 신사구체경화(glomerulosclerosis), 단백뇨(proteinuria), 신장해(nephropathy)인, 대사성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.

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