JP2019506846A - 気分障害精神疾患の診断又は予後の解析のためのmiRNA−206を検出する方法、診断のための情報の提供方法及びmiRNA−206を標的とする組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、気分障害精神疾患の診断又は予後の解析のためのmiRNA−206を検出する方法、診断のための情報の提供方法及びmiRNA−206を標的とする組成物に係り、更に詳しくは、前記気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーを検出することができ、患者の組織試料からmiR−206の発現レベルを測定することにより、気分障害精神疾患のより正確な診断が可能である他、前記miR−206の発現レベルを測定し得る製剤を診断用の組成物として提供することができ、ひいては、micro RNA−206と相補的に結合し得るオリゴヌクレオチドを用いることにより、気分障害精神疾患を治療及び予防することのできる薬学組成物を提供することに関する。
Description
本発明は、特定の疾患の診断又は予後の解析のための方法、特定のmiRNAを標的とする疾患の診断及び薬学用の組成物に関する。
気分障害と言われる疾患の中の一つのタイプであるうつ病の生涯有病率は、男性7〜12%、女性20〜35%と報告されており、最も高い有病率を有する精神疾患であるといえる。うつ病は、悲しみ、無気力、不幸及び他の脳機能障害を伴うなど多岐に亘る症状があることを特徴とし、20〜50%が2年以内に、また、50〜70%が5年以内に再発すると言われる疾患である。なお、うつ病は、 障害生存年数(Years of Life Lived with Disability;YLDs)があらゆる疾患の中でも1位を占めてあり、世界保健機関 (WHO)では、うつ病が今後の数十年間に亘って全世界の健康問題の最も重要な疾患になるものと推定している。
うつ病患者の自殺危険度は10倍以上高まっており、自殺の80%がうつ病に関連しており、若しくは自殺の33%は直接的なうつ病症状が原因となって起こることが知られている。うつ病の診断は、現象学的な症状に基づいて行い、米国精神医学会において提示された精神疾患診断統計便覧(DSM−IV−TR)又は世界保健機関(WHO)の国際疾病分類(ICD−10)の基準に準拠しており、これまで実用レベルに至ったうつ病の生物学的な診断ツールはないのが現状である。
過去数十年間に亘って多種多様な治療法が開発されてきたにも拘わらず、うつ病患者のうちの50%以上が不良な治療反応を示しており、35%以上が治療抵抗性を示している。遺伝体変異を用いた動物研究において、抗うつ剤(抗うつ薬)の治療と脳由来筋萎縮性因子(brain−derived Amyotrophic factor;BNF)など神経生成関係の生体指標の変化との間の相関性は継続的に報告されているが、遺伝への取り組みは、ほとんどの場合、候補遺伝子の有意性の導出に失敗している。したがって、遺伝体的なアプローチ法を用いたより根本的な治療のための治療剤の開発及び診断ツールの開発が望まれているのが現状である。
本発明は、上述した課題を解決するために案出されたものであり、気分障害精神疾患の診断又は予後の解析のために特定のmiRNAを検出する方法、気分障害精神疾患の診断のための情報を提供する方法、気分障害精神疾患の診断用の組成物及び薬学組成物を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、本発明は、気分障害精神疾患の診断又は予後の解析に必要な情報を提供するためにmiR−206の発現を検出する方法を利用する気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーの検出方法であることを特徴とする。
また、本発明は、患者の組織試料からmire−206の発現レベルを測定するステップ及び前記miR−206の発現レベルを基準レベルと比較するステップを含む気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法であることを特徴とする。
更に、本発明は、miR−206の発現レベルを測定する製剤として、前記miR−206と相補的に結合し得るプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドを含む気分障害精神疾患診断用の組成物であることを特徴とする。
更にまた、本発明は、miR−206の活性を抑制し得る気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物であることを特徴とする。
更にまた、本発明は、miR−206の活性を抑制し得る気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物であることを特徴とする。
本発明に係る気分障害精神疾患の診断方法は、miR−206の相対的な発現レベルを比較することにより、より正確に診断することができ、ひいては、miR−206をターゲットとする物質をマーカーとして用いることにより、気分障害精神疾患の予後の解析を行うことができる。
また、本発明に係る気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法を通じて診断をより効率的に行うことができる。
また、本発明に係る気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法を通じて診断をより効率的に行うことができる。
更に、本発明に係るmiR−206を標的とする気分障害精神疾患の診断用の組成物を通じて気分障害精神疾患の誤診率を下げることができ、miR−206を標的とする薬学組成物を通じて気分障害精神疾患の根本的な治療又は予防用の薬学組成物を提供することにより、治療効果を高めることができ、しかも、治療の副作用を極力抑えることができる。
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。しかしながら、本発明は多数の異なる形態に具体化可能であり、記述された実施形態に何等制限されないということを理解すべきである。下記において説明される本発明の実施形態は、当業者に本発明の思想を十分に伝えるためのものであるということに留意すべきである。
本発明のmiR−206の配列は、ヒト由来の配列であり、成熟配列は、5’−UGFGAGA G−3’である。本発明に係る気分障害精神疾患の治療及び予防用の薬学組成物は前記miR−206を標的として結合することができ、前記薬学組成物の有効成分として用いられるアンチセンスmiR−206の成熟配列のうち1−8番目や2−8番目、又は2−7番目のヌクレオチド配列と相補的な配列を有し得る。本発明において有効成分として用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの最も好ましい配列は、配列番号1のヌクレオチド配列(すなわち、miR−206の成熟配列)の全体と相補的な配列を有するが、これに制限されない。前記miR−206の成熟配列は、miRNAデータベース(http://www.mirbase.org)から得られる。
一般に、マイクロRNAは、pre−miRNAと呼ばれるヘアピン構造を有する約70−80nt(ヌクレオチド)の長さの前駆体に転写された後、RNAse III酵素であるダイサーによって切り離されて成熟された形態で生成される。miRNAは、miRNPと呼ばれるリボヌクレオ錯体を形成して標的部位に相補的に結合して標的遺伝子を切断したり、翻訳を抑制したりする。30%以上のヒトmiRNAはクラスターとして存在し、一つの前駆体に転写された後、切断過程を経て成熟miRNAが最終的に形成される。
本願で用いられる用語「miRNA」又は「マイクロRNA」又は「マイクロアールエヌエー」とは、標的RNAの分解(degradation)を促したり、それらの翻訳を抑制したりすることにより、遺伝子の発現を転写後に調節する21〜23個のノンコーディングRNAのことをいう。
本願における用語「miRNAの活性を抑制し得る物質」は、その発現及び/又は活性を抑制し得る任意の物質を含む。前記任意の物質は、例えば、アンタゴmir、アンチセンス分子、小ヘアピンRNA分子(shRNA)、小妨害RNA分子(siRNA)、シード標的ロックド核酸(LNA:Locked Nucleic Acid)オリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、アプタマー、リボザイム、又はDNA:RNAハイブリッドを認知する抗体などを含み得る。
本発明に係る一実施形態において、「miRNAの活性を抑制し得る物質」は、本願に係るmiRNAの前駆及び/又は成熟配列の全部又は一部、特に、シード配列に相補的に結合して、この活性を抑制し得るアンチセンスオリゴヌクレオチドである。前記活性の抑制は、本願に係るmiRNAの転写及び/又はこの標的mRNAとの結合を抑制することである。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、これを構成するヌクレオチド又はヌクレオチドを連結するバックボーン(骨格)が一つ以上の変形を含んでもよく、又は含まなくてもよい。前記変形は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する一つ以上のヌクレオチドがロックド核酸(LNA)、又は少なくとも一つ以上の2’−O−メチル化された糖を有するヌクレオチド、又は一つ以上のホスホロチオエートをバックボーンに含み得る。
本願で用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的とするmiRNA、特に、miRNAのシード配列の全部又は一部と相補的な配列を有しているため、miRNAとデュプレックス(duplex)を形成し得る核酸を基盤とする分子を網羅するものである。したがって、本願で用いられる用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、「相補的な核酸を基盤とする抑制剤」と表わされる。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドには様々な分子が含まれていてもよく、例えば、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、アンタゴmir、2’−O−変形オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート−バックボーンデオキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−バックボーンリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA:Peptide Nucleic Acid)オリゴヌクレオチド又はロックド核酸(LNA:Locked Nucleic Acid)オリゴヌクレオチドなどを含み得る。
好ましくは、前記リボ核酸(RNA)を使用することができ、前記リボ核酸(RNA)は、二本鎖siRNA(small interfering RNA)、小ヘアピンRNA(shRNA)及びリボザイム(Ribozyme)を含み得る。
前記ロックド核酸(LNA:Locked Nucleic Acid)は、変形リボヌクレオチドであり、リボース糖部位の2’炭素と4’炭素との間にさらなるブリッジを含んでロックされた(locked)形態を有し、そのため、ロックド核酸(LNA)付きオリゴヌクレオチドは、改善された熱安定性を有する。
前記ペプチド核酸(PNA:Peptide Nucleic Acids)は、ポリヌクレオチドにおいて糖リン酸バックボーンの代わりにペプチドを基盤とするバックボーンを含む。2’−O−変形オリゴヌクレオチドは、好ましくは、2’−O−アルキルオリゴヌクレオチドであり、より好ましくは、2’−O−C1−3アルキルオリゴヌクレオチドであり、最も好ましくは、2’−O−メチルオリゴヌクレオチドである。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、狭い意味のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir及び抑制RNA分子を含む。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、狭い意味のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir及び抑制RNA分子を含む。
本願で用いられる用語「アンタゴmir」は、一本鎖の化学的に変形されたオリゴヌクレオチドであり、内因性miRNAの遮断(silence)に用いられる。前記アンタゴmirは、アルゴノート2(Ago2)切断部位において相補的ではない配列を含むか、例えば、2’メトキシ基、3’コレステロール基、ホスホロチオエートに塩基が変形されてAgo2の切断を抑制することができる。標的配列に相補的な配列を有す。
本願に係る前記アンタゴmirは、本願に係るmiRNAに少なくとも部分的に又は完全に相補的な配列を有してもよく、一実施形態において、アンタゴmirは、一つ以上の変形(例えば、2’−O−メチル−糖変形、又は3’コレステロール変形)を含む。他の実施形態において、アンタゴmirは、一つ以上のホスホロチオエート結合を含んでいてもよく、且つ、部分的にホスホロチオエートバックボーンを有してもよい。
本願に係るmiRNAの活性を抑制するのに適したアンタゴmirの長さは、7〜50nt、好ましくは、10〜40nt、より好ましくは、15〜30nt、更に好ましくは、15〜25nt、最も好ましくは、16〜19ntであるが、これに制限されない。例えば、miR−206シード配列と相補的に結合し得る配列を有するmiRNA調節物質を含み得る。
本願において用いられる用語「相補的」とは、所定の混成化又はアニーリング条件、好ましくは、生理学的な条件下でアンチセンスオリゴヌクレオチドが本願に係るmiRNAの標的に選択的に混成化し得る程度に十分に相補的であることを意味し、一部又は部分的ではあるが、実質的に相補的(substantially complementary)であること及び完璧に相補的(perfectly complementary)であることを網羅する意味を有し、好ましくは、完全に相補的であることを意味する。実質的に相補的(substantially complementary)とは、完璧に相補的(perfectly complementary)であるわけではないが、標的配列に結合して本願に係る効果、すなわち、miRNAの活性を妨げないのに十分な効果を出す程度の相補性を有することを意味する。
本願において用いられる用語「核酸」は、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、DNA、RNA及びその類似体及びその誘導体を含み得、例えば、ペプチド核酸(PNA)又はその混合物を含み得る。なお、核酸は、一本鎖又は二本鎖であってもよく、ポリペプチド、mRNA、miRNA又はsiRNAなどを含む分子をコードし得る。
本発明の一実施形態において、本願のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は核酸分子は、本願に係るmiRNAシード配列の全部又は一部に相補的な配列を含む。シード配列は、miRNAの標的分子の認知に非常に重要な各種の種において保存された配列である。miRNAは、シード配列を通じて標的と結合するため、シード配列及び標的間の相互作用を抑制する場合、標的mRNAの翻訳などを効果的に抑制することができる。
本発明に係る薬学組成物は、気分障害精神疾患の治療又は予防のために提供され、究極的に前記疾患の治療又は予防が必要な対象体に前記薬学組成物を有効量だけ投与して前記疾患に対する治療又は予防に効果的に使用可能である。
本願で用いられる用語「治療」、「緩和」又は「改善」とは、 前記薬学組成物の投与で、関連する精神疾患の症状を好転させたり有利に変更したりするあらゆる行為のことをいう。本願が属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などが提示している資料を参照して疾患の正確な基準を理解し、改善、向上及び治療された度合いを判断することができる筈である。
また、本願で用いられる用語「予防」とは、関連する精神疾患の発病を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。本願の組成物は、初期症状を示すときに、又は初期症状を示す前に投与する場合、関連する精神疾患を予防することができるということは当業者にとって自明である。
一方、本発明に係る前記薬学組成物は、前記miRNAの活性を抑制し得る物質に加えて、気分障害精神疾患の治療と関連して同一又は類似の機能を有する有効成分を1種以上更に含み得るか、或いは、有効成分の溶解性及び/又は吸収性を維持/増加する化合物を更に含み得る。なお、化学治療剤、抗炎症剤、抗ウィルス剤及び/又は免疫調節剤などを選択的に更に含み得る。
更に、前記薬学組成物は、上述した有効成分に加えて、 薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び/又はアジュバント(adjuvant)を1種以上更に含み得る。前記薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソーム及びこれらの成分のうちの一つ以上の成分を混合して使用するものを含み得、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、靜菌剤など通常の添加剤を更に含み得る。なお、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化してもよく、標的器官に特異的に作用できるように標的器官特異的な抗体又はその他のリガンドを前記担体と結合して使用してもよい。
更に、当該技術分野の適切な方法を用いて、又はレミントンの文献に開示されている方法を用いて、各疾患に応じて、又は成分に応じて好適に剤形化してもよい。例えば、前記薬学組成物は、溶液、エマルション及びリポソーム剤形などの様々な剤形及び投薬形態として製造されてもよく、活性成分を薬学的に許容可能な液体及び/又は微細粉末の固形担体又は賦形剤と混合して、錠剤、カプセル、ゲル、シロップ又は坐剤として製造してもよい。
また、前記薬学組成物は、水性、非水性又は混合媒質を用いた懸濁液として製造されてもよい。水性懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び/又はデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を更に含み得る。
本発明において、前記薬学組成物の投与方法は、特に制限されるものではなく、公知の抑制剤の投与方法を適用することができる。前記薬学組成物は、目的とする方法に応じて、非経口投与(例えば、鼻腔内、静脈内、皮下、腹腔内又は局所に適用)したり経口投与したりしてもよく、迅速な治療効果を得るためには鼻腔内への注入による投与を採用することが好ましい。なお、前記薬学組成物は、様々な経路により伝達可能であり、例えば、インフュージョン又はボーラス注射、表皮又は粘膜(経口粘膜、肛門粘膜、腸粘膜など)を介して投与されてもよく、全身投与又は局所投与されてもよい。
更に、前記薬学組成物は、適切な経路を通じて中枢神経又は抹消神経にも取り込むことが好ましい。適切な経路は、脳室内(intraventricular)又は髄腔内 (intrathecal)の投与を含み得る。このような投与は、貯蔵庫に連結されたカテテールを用いて達成してもよい。なお、エアロゾールに剤形化されて吸入器又は噴霧器を介して肺を用いた投与が行われてもよく、静脈内投与、皮下注射、脳脊髄腔内注射、吸入投与、又は経口投与用の剤形を除外するものではない。
本発明の一実施形態において、薬学組成物は、鼻腔内に投与されることが好ましい。鼻腔内に前記薬学組成物を投与するとき、嗅覚神経経路に沿って脳に伝達されることにより、前記薬学組成物の効果を高めることができる。前記薬学組成物の鼻腔内投与のために許容可能な担体を含み得るが、前記担体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトの鼻腔上皮のある部分に投与するのに適した一種以上の適切な固相、フィラー希釈剤又はカプセル化物質を含み得る。典型的には、前記担体は、液体、溶液、懸濁液、ゲル、軟膏、ローション、又はこれらの組み合わせであってもよく、好ましくは、水性担体であってもよい。
また、前記薬学組成物は、色々な単位投与形態として製造されてもよい。このような形態としては、点鼻液(nasal drop)、鼻腔用スプレイ、鼻腔用ゲル、鼻腔用軟膏、及び鼻腔用粉末が挙げられるが、これらに制限されない。
前記担体は伝達強化剤を含み得るが、鼻腔内伝達強化剤には、凝集阻害剤、投与量変更剤、pH制御剤、分解酵素阻害剤、粘液質溶解又は粘液除去剤、纖毛安定試薬、膜透過促進剤(例えば、界面活性剤、胆汁酸塩、リン脂質又は脂肪酸添加剤、混合ミセル(micelle)、リポソーム、又は担体、アルコール、エナミン(enamine)、酸化窒素供与体混合物、長鎖(long−chain)両親媒性分子、小型疎水性浸透強化剤、ナトリウム又はサリチル酸誘導体、アセト酢酸のグリセロールエステル、シクロデキストリン又はβ−シクロデキストリン誘導体、中間鎖脂肪酸、キレート試薬、アミノ酸又はその塩、N−アセチルアミノ酸又はその塩、選択された膜成分に対する分解酵素、脂肪酸合成阻害剤、コレステロール合成阻害剤又は酸化窒素刺激物質、キトサン、及びキトサン誘導体などの上皮接合生理学の調節薬剤、血管拡張剤、選択的な運搬促進剤、及び鼻腔内粘膜の伝達を強化するために、前記薬学組成物を効果的に組み合わせ、結合、保管又はカプセル化したり活性薬剤を安定化したりする安定的な輸送体、担体、支持物質又は錯体形成種(complex−forming species)などが含まれ得る。
本願で用いられる用語「薬学的又は治療的に有効な量」とは、医学的な治療に適用し得る合理的なベネフィット/リスクの比率で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効容量レベルは、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時に使用される薬物を含む要素及びその他の医学分野に広く知られている要素によって決定され得る。
前記薬学組成物は、個別の治療剤として投与されてもよく、他の治療剤と併用されて投与されてもよく、従来の治療剤と順に又は同時に投与されてもよく、単一又は多重に投与されてもよい。前記薬学組成物は、前記提示された全ての要素を考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られるような量を投与することが最も重要であり、これは、当業者によって容易に決定され得る。
一方、前記薬学組成物の投与量の範囲は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などに応じて非常に多岐に亘っており、適正な投与量は、患者の体内に蓄積された薬物の量及び/又は用いられるポリヌクレオチドの具体的な効能の度合いによって異なる。一般に、in−vivo動物モデル及びin−vitro条件下で効果的であると測定された半数効果濃度(EC50:halfmaximaleffectiveconcentration)に基づいて計算されてもよく、例えば、体重1kg当たり0.01μg〜1gであってもよく、日別、週別、月別又は年別の単位期間で、単位期間当たり1回乃至数回に分けて投与されてもよい。なお、インフュージョンポンプを用いて長期に亘って連続して投与されてもよく、繰り返し投与回数は、薬物が体内に留まる時間、体内の薬物の濃度などを考慮して決定してもよい。疾患の治療の経過に伴いたとえ治療が行われた後であっても、疾患の再発を防ぐために前記薬学組成物が持続的に投与されてもよい。
本発明において、前記薬学組成物に更に含まれ得る気分障害精神疾患と関連する有効成分としてアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それ自体で又は薬学的に許容可能な塩の形態で前記薬学組成物に更に含まれ得る。
前記薬学的に許容可能な塩とは、ポリヌクレオチドの生物学的な活性は保ちながらも毒性は極力抑えたもののことを言う。このような前記薬学的に許容可能な塩は、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンと形成された塩基付加塩、有機アミノ酸と形成された塩、アンモニア、N,N−ジベンジルエチレンジアミン(dibenzylethylene−diamine)、D−グルコサミン(D−glucosamine)、テトラエチルアンモニウム(tetraethylammonium)又はエチレンジアミン(ethylenediamine)由来のカチオンと形成された塩を含み得るが、これらに制限されない。
一方、本発明に係る気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法は、試料におけるmiR−206の存否及び発現の度合いを確認する過程であって、miR−206の量を測定することにより、その発現レベルの増加有無が分かる。本発明において、発現レベルの測定は、miRNA−206の発現量の測定を含む。このための解析方法としては、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競争的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、RNase保護解析法、ノーザンブロッティング又はDNAチップなどを用いた方法が挙げられるが、これらに制限されない。
前記診断方法は、miR−206の発現レベルの増加の有無とともに検査対象者の臨床情報を更に含んで、気分障害精神疾患の発病有無を判断することができる。このような検査対象者の臨床情報は、前記検査対象者の年齢、性別、体重、食習慣、体質量、基礎疾患、血液検査結果、脳MRI結果、脳CT結果、又は脳脊髄液検査結果のうちの少なくとも一つ以上を含むが、これらに制限されない。
本発明に係る気分障害精神疾患は、うつ病、気分変調性障害、うつ病性障害、短期うつ病性障害、月経前症候群や月経前不快気分障害及び双極性障害を含むが、これらに制限されない。
また、本発明において、診断は、特定の疾病又は疾患に対する客体の感受性(susceptibility)を判定すること、ある客体が特定の疾病又は疾患を現在有しているかどうかを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかったある客体の予後(prognosis)を判定すること、又はセラメトリックス(therametrics)(例えば、治療効能に関する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること)を含む。
本発明の実施例のために用いられた実験段階は、下記のように説明され得る。
1.うつ病動物モデルの作成
動物としては、B6マウスの一種であるC57BL/6を使用し、正常群、実験群の年齢及び性別をいずれも整合させた。うつ病モデルは、次のように2種類の方法によって作成された。
1)コルチコステロン(Corticosterone,CORT)の注入によるうつ病モデル
動物としては、B6マウスの一種であるC57BL/6を使用し、正常群、実験群の年齢及び性別をいずれも整合させた。うつ病モデルは、次のように2種類の方法によって作成された。
1)コルチコステロン(Corticosterone,CORT)の注入によるうつ病モデル
35μg/mLのCORT(5mg/kg/day相当量、シグマアルドリッチ社製、セントルイス、米国ミズーリ州セントルイス)を0.45%のβ−シクロデキストリン(β−CD;シグマアルドリッチ社製)を含む水で処理して正常マウスに42日間摂取させ、CORTが処理された水は3日おきに交換した。なお、光が遮断される水筒を用いた。
2)長期に亘っての電気刺激によりストレスが誘導された(chronic foot−shock stress,CFS)うつ病モデル
2)長期に亘っての電気刺激によりストレスが誘導された(chronic foot−shock stress,CFS)うつ病モデル
正常マウスに0.3mAのフットショック(足底刺激)を2秒間与えることを4週間に1時間ずつ行った。フットショックは、予測できないように2秒〜15秒おきにランダムに与えた。
2.miRNAの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)
miR−206の発現量を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)(逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応)を用いて調べた。対照群(正常マウス)及び実験群(CORT誘導うつ病モデル及びCFS誘導うつ病モデル)の脳からmiRNAをmirVanamiRNA単離キット(アンビオン社製)を用いて分離し、リアルタイムPCRは、TaqMan MicroRNAアッセイ(米国ライフテクノロジーズ社製)に含まれているプローブ及びプライマーを製造者の方法の通りに用いて行った。次いで、ABI PRISM 7000シーケンス検出システム(米国アンビオン−アプライドバイオシステムズ社製)を用いて解析した。条件は、50℃で2分間及び95℃で10分間加熱し、95℃で15秒間及び60℃で60秒間加熱することにより行われる熱処理を40回(サイクル)繰り返し行い、全ての反応は三重に行われた。相対的な発現の度合いは、比較閾値サイクル(comparative threshold cycle;Ct)2−ΔCt式を用いて計算し、miRNAの濃度は、内因性snoRNA検出キット(米国アンビオン−アプライドバイオシステムズ社製)を用いて測定したsnoRNA−202濃度にノーマライズ(濃度均一化)した。
miR−206の発現量を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(qRT−PCR)(逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応)を用いて調べた。対照群(正常マウス)及び実験群(CORT誘導うつ病モデル及びCFS誘導うつ病モデル)の脳からmiRNAをmirVanamiRNA単離キット(アンビオン社製)を用いて分離し、リアルタイムPCRは、TaqMan MicroRNAアッセイ(米国ライフテクノロジーズ社製)に含まれているプローブ及びプライマーを製造者の方法の通りに用いて行った。次いで、ABI PRISM 7000シーケンス検出システム(米国アンビオン−アプライドバイオシステムズ社製)を用いて解析した。条件は、50℃で2分間及び95℃で10分間加熱し、95℃で15秒間及び60℃で60秒間加熱することにより行われる熱処理を40回(サイクル)繰り返し行い、全ての反応は三重に行われた。相対的な発現の度合いは、比較閾値サイクル(comparative threshold cycle;Ct)2−ΔCt式を用いて計算し、miRNAの濃度は、内因性snoRNA検出キット(米国アンビオン−アプライドバイオシステムズ社製)を用いて測定したsnoRNA−202濃度にノーマライズ(濃度均一化)した。
好ましくは、miR−206の定量検出のために、前記miR−206と相補的に結合し得る一種以上のオリゴヌクレオチドを含み得るが、これらの一部の配列に対応するプライマー、逆転写酵素、Taqポリメラーゼ、PCR用プライマー及びdNTPを含み得る。
3.miR−206の抑制
miRNA−206の抑制は、miRNA−206に対する配列特異的なアンタゴmir(AM−206、2’−O−メチル化アンチセンスオリゴヌクレオチド、配列:5’−ccacacacuuccuuacauucca−3’、韓国(株)バイオニア社製)を用いて行った。マウスを麻酔した後、AM−206(24μlの0.1% v/vジエチルピロカーボネートが処理された蒸留水5nmol)を2分おきに各鼻孔を変えながら、4μlずつピペットを用いて鼻腔内に投与した(合計6分画)。対照群のマウスにはジエチルピロカーボネートが処理された蒸留水(ビヒクル)を同等な体積だけ投与した。AM−206は、3日間に亘って一日につき一回ずつ投与した。
miRNA−206の抑制は、miRNA−206に対する配列特異的なアンタゴmir(AM−206、2’−O−メチル化アンチセンスオリゴヌクレオチド、配列:5’−ccacacacuuccuuacauucca−3’、韓国(株)バイオニア社製)を用いて行った。マウスを麻酔した後、AM−206(24μlの0.1% v/vジエチルピロカーボネートが処理された蒸留水5nmol)を2分おきに各鼻孔を変えながら、4μlずつピペットを用いて鼻腔内に投与した(合計6分画)。対照群のマウスにはジエチルピロカーボネートが処理された蒸留水(ビヒクル)を同等な体積だけ投与した。AM−206は、3日間に亘って一日につき一回ずつ投与した。
4.行動実験
AM−206及びビヒクルを投与してから一週間が経った後、うつ病動物モデルに行動実験を行った。行動実験としては、不安感の測定のための高架式十字迷路(EPM)テスト及び絶望感を測定するための尾懸垂テスト(TST)を行い、全ての行動実験はビデオで記録した。
1)高架式十字迷路(EPM)
AM−206及びビヒクルを投与してから一週間が経った後、うつ病動物モデルに行動実験を行った。行動実験としては、不安感の測定のための高架式十字迷路(EPM)テスト及び絶望感を測定するための尾懸垂テスト(TST)を行い、全ての行動実験はビデオで記録した。
1)高架式十字迷路(EPM)
高架式十字迷路(EPM)はアクリルにより作製され、床面から40cm上に設けられた十字状(+)の迷路により構成される。迷路の4つの通路のうち向かい合う2つの通路は開放されており(オープンアーム)、他の向かい合う2つの通路は高さ20cmの壁により取り囲まれている(クローズドアーム)。中央のプラットホームは、横及び縦がそれぞれ8cmであり、実験を始めるとき、マウスを中央のプラットホームに置き、マウスに5分間迷路を自由に探索させた。次いで、マウスが開放された通路及び閉鎖された通路に滞在した時間及び各通路の出入り回数を解析した。
2) 尾懸垂テスト(TST)
高さ5cmに位置する水平棒の中間に約1cmのマウスの尾をテープで貼り付けた後、6分間中の無動であった時間(無動化時間)を計測した。
2) 尾懸垂テスト(TST)
高さ5cmに位置する水平棒の中間に約1cmのマウスの尾をテープで貼り付けた後、6分間中の無動であった時間(無動化時間)を計測した。
5.統計解析
対照群(正常マウス)及び実験群(CORTうつ病誘導モデル群及びCFSうつ病誘導モデル群)の結果の比較は、スチューデントのT検定法を用いて行い、且つ、対照群(正常マウス)、実験群1(CORTうつ病誘導モデル群)及び実験群2(CFSうつ病誘導モデル群)間の結果の比較は、一元配置分散分析(one−way ANOVA)方法を用いて行った。全ての結果は、平均±標準誤差で示し、統計解析のためにSPSS 21.0(SPSS社製、米国シカゴ、III)を使用し、P数値は、0.05よりも小さい値を有意な値とみなした。
対照群(正常マウス)及び実験群(CORTうつ病誘導モデル群及びCFSうつ病誘導モデル群)の結果の比較は、スチューデントのT検定法を用いて行い、且つ、対照群(正常マウス)、実験群1(CORTうつ病誘導モデル群)及び実験群2(CFSうつ病誘導モデル群)間の結果の比較は、一元配置分散分析(one−way ANOVA)方法を用いて行った。全ての結果は、平均±標準誤差で示し、統計解析のためにSPSS 21.0(SPSS社製、米国シカゴ、III)を使用し、P数値は、0.05よりも小さい値を有意な値とみなした。
<実施例1>
うつ病誘導マウスモデルの脳組織におけるmiR−206の上向き発現
上記の実験方法を実質的に同様に行って、実験群(CORTうつ病誘導モデル(n=3)及びCFSうつ病誘導マウスモデル(n=5))及び対照群(正常マウス)(n=5)の脳組織におけるmiRNA−206の発現量を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法(qRT−PCR)で比較解析した結果を図1に棒グラフで示す。図1の棒グラフの横軸は、対照群及び実験群を示し、縦軸は、snoRNA−202にmiR−206の発現量を正常平準化させた値を示す。
うつ病誘導マウスモデルの脳組織におけるmiR−206の上向き発現
上記の実験方法を実質的に同様に行って、実験群(CORTうつ病誘導モデル(n=3)及びCFSうつ病誘導マウスモデル(n=5))及び対照群(正常マウス)(n=5)の脳組織におけるmiRNA−206の発現量を定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応法(qRT−PCR)で比較解析した結果を図1に棒グラフで示す。図1の棒グラフの横軸は、対照群及び実験群を示し、縦軸は、snoRNA−202にmiR−206の発現量を正常平準化させた値を示す。
図1の棒グラフを参照すると、実験群(CORT誘導うつ病モデル及びCFSうつ病誘導モデル)のマウスにおいてmiRNA−206が対照群(正常マウス)よりも上向き発現されることを確認することができた。snoRNA−202を内部対照群として使用し、棒グラフの数値は、snoRNA−202にmiRNA−206の発現を正常平準化させた値である(control,1.38±0.01;Depression,1.42±0.01,*P<0.01、バー(Bar)は、±標準誤差を示す)。
<実施例2>
AM−206の投与によるCORT誘導うつ病モデルの不安感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、高架式十字迷路(EPM)テストを通じて対照群及び実験群1(CORT誘導うつ病モデル群)の憂うつ感の度合いを測定し、その結果を図2に棒グラフで示す。図2の棒グラフの横軸は、開放された通路(openarm)、閉鎖された通路(closedarm)及び中央プラットホーム(center)を示し、縦軸は、各通路に滞在した時間(sec)を示す。
AM−206の投与によるCORT誘導うつ病モデルの不安感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、高架式十字迷路(EPM)テストを通じて対照群及び実験群1(CORT誘導うつ病モデル群)の憂うつ感の度合いを測定し、その結果を図2に棒グラフで示す。図2の棒グラフの横軸は、開放された通路(openarm)、閉鎖された通路(closedarm)及び中央プラットホーム(center)を示し、縦軸は、各通路に滞在した時間(sec)を示す。
図2の棒グラフを参照すると、実験群1(CORT誘導うつ病モデル群)は、対照群(control)よりも閉鎖された通路(closed arm)において更に長い時間を過ごし(control,233.93±9.12;CORT,278.76±3.85;CORT−AM206,229.20±25.16sec)、開放された通路(open arm)では短い時間を過ごしたこと(control,25.65±6.25;CORT,1.98±0.96;CORT−AM206,43.61±23.56sec)を確認することができる。このような結果から、CORT誘導うつ病モデルのマウスが高い不安感を示すことを確認することができる。
しかしながら、miRNA−206に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであるAM−206(antagomirformiR−206)が投与されたCORT誘導うつ病モデル(CORT−AM206)のマウスは、閉鎖された通路(closed arm)及び開放された通路(open arm)において対照群(正常マウス)と略同じ時間を過ごすことを確認することができる。
一方、図3は、それぞれの通路(arm)への進入回数(活動性)を棒グラフで示すものである。図3の棒グラフの横軸は、全ての通路方向(total)及び開放された通路方向(to open arm)を示し、縦軸は、通路への進入回数を示す。
図3の棒グラフを参照すると、対照群(control)と比較して、実験群1(CORT誘導うつモデル)において減少した総回数(control,15.80±1.34;CORT,6.18±1.49;CORT−AM206,11.90±2.09)及び開放された通路(open−arm)への進入回数(活動性)(control,2.10±0.35;CORT,0.29±0.14;CORT−AM206,1.4±0.43)がCORT−AM206群において回復したことを確認することができる(対照群n=10、CORT誘導うつ病モデル群n=17、CORT−AM206群n=10、*P<0.05、one−way ANOVA、バー(Bar)は、±標準誤差を示す。)。
したがって、図2及び図3において、AM−206は、うつ病モデルの高い不安感を回復させることを確認することができる。
したがって、図2及び図3において、AM−206は、うつ病モデルの高い不安感を回復させることを確認することができる。
<実施例3>
AM−206によるCORTうつ病モデルの絶望感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、対照群(正常マウス)及び実験群1(CORT誘導うつ病モデル)の絶望感の度合いを尾懸垂テスト(TST)を用いて測定し、その結果を図4に棒グラフで示す。図4の棒グラフの横軸は、対照群(control)、実験群1(CORT誘導うつ病モデル)、CORT−AM206群を示し、縦軸は、無動化時間(sec)を示す。
AM−206によるCORTうつ病モデルの絶望感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、対照群(正常マウス)及び実験群1(CORT誘導うつ病モデル)の絶望感の度合いを尾懸垂テスト(TST)を用いて測定し、その結果を図4に棒グラフで示す。図4の棒グラフの横軸は、対照群(control)、実験群1(CORT誘導うつ病モデル)、CORT−AM206群を示し、縦軸は、無動化時間(sec)を示す。
図4の棒グラフから、実験群1(CORT誘導うつ病モデル)は対照群(control)よりも長い時間無動であったことから、対照群よりも絶望感が高いことを確認することができる。しかしながら、CORT−AM206群は、対照群(正常マウス)と略同じ数値を示すことを確認することができる(control,85.30±15.46;CORT,138.60±9.74;CORT−AM206,104.33±7.53sec)。このような結果から、AM−206がCORT誘導うつ病モデルの高い絶望感を回復させることを確認することができる(対照群(control)n=14、CORT誘導うつ病モデル群n=12、CORT−AM206群n=9、*P<0.05、one−way ANOVA、バー(Bar)は、±標準誤差を示す。)。
<実施例4>
AM−206によるCFS誘導うつ病モデルの絶望感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、実験群2(CFS誘導うつ病モデル)における絶望感の度合いを尾懸垂テスト(TST)を用いて測定し、その結果を図5に棒グラフで示す。図5の棒グラフの横軸は、対照群(control)、実験群2(CFS誘導うつ病モデル)及びCFS−AM206群を示し、縦軸は、無動化時間(sec)を示す。
AM−206によるCFS誘導うつ病モデルの絶望感の回復
上記の実験方法を実質的に同様に行って、実験群2(CFS誘導うつ病モデル)における絶望感の度合いを尾懸垂テスト(TST)を用いて測定し、その結果を図5に棒グラフで示す。図5の棒グラフの横軸は、対照群(control)、実験群2(CFS誘導うつ病モデル)及びCFS−AM206群を示し、縦軸は、無動化時間(sec)を示す。
図5の棒グラフから、実験群2(CFS誘導うつ病モデル)は対照群(control)よりも長い時間無動であったことから、対照群よりも絶望感が高いことを確認することができるが、AM−206を投与したCFS−AM206群は、対照群(control)と略同じ数値を示すことを確認することができる(control,85.30±15.46;CFS,132.14±14.42;CFS−AM206,73.61±10.55sec)。このことから、AM−206がCFS誘導うつ病モデルの高い絶望感を回復させることを確認することができる(対照群(control)n=14,CFS誘導うつ病モデルn=20,CFS−AM206群n=12、*P<0.05、one−way ANOVA、バー(Bar)は、±標準誤差を示す。)。
以上、本発明の一実施形態について詳細に説明したが、本発明の権利範囲はこれに何等限定されるものではなく、下記の特許請求の範囲において定義している本発明の基本概念を用いた当業者の種々の変形及び改良形態もまた、本発明の権利範囲に属するものである。
本発明において用いられる全ての用語は、別途の断りのない限り、本発明の関連分野における通常の当業者が一般的に理解する意味と同じ意味で用いられる。
Claims (17)
- 気分障害精神疾患の診断又は予後の解析に必要な情報を提供するためにmiR−206の発現を検出する方法を利用する気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーの検出方法。
- 前記miR−206の発現の検出は、miR−206と相補的に結合するプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドを用いて行う請求項1に記載の気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーの検出方法。
- 前記miR−206の発現を検出する方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競争的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、RNase保護解析法、ノーザンブロッティング又はDNAチップを用いる方法である請求項1に記載の気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーの検出方法。
- 前記気分障害精神疾患は、うつ病、気分変調性障害、うつ病性障害、短期うつ病性障害、月経前症候群や月経前不快気分障害、双極性障害である請求項1に記載の気分障害精神疾患の診断又は予後解析マーカーの検出方法。
- 患者の組織試料からmiR−206の発現レベルを測定するステップと、
前記miR−206の発現レベルを基準レベルと比較するステップと、
を含む気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法。 - 前記miR−206の発現レベルを基準レベルと比較して、前記発現レベルが増加すれば、気分障害精神疾患であると判定するステップを更に含む請求項5に記載の気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法。
- 前記比較するステップにおいては、患者の年齢、性別、体重、食習慣、体質量、基礎疾患、血液検査結果、脳MRI結果、脳CT結果又は脳脊髄液検査結果のうちの少なくとも一つ以上の臨床情報を更に用いて気分障害精神疾患であると判定し得る請求項5に記載の気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法。
- 前記miR−206の発現レベルは、miR−206と相補的に結合するプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドを用いて測定する請求項5に記載の気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法。
- 前記miR−206の発現レベルを測定する方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、競争的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、RNase保護解析法、ノーザンブロッティング又はDNAチップを用いる方法である請求項5に記載の気分障害精神疾患の診断のための情報の提供方法。
- miR−206の発現レベルを測定する製剤として、前記miR−206と相補的に結合し得るプライマー対、プローブ又はアンチセンスヌクレオチドを含む気分障害精神疾患診断用の組成物。
- 請求項10に記載の診断用の組成物を含む気分障害精神疾患診断用のキット。
- miR−206を標的とする気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
- 前記miR−206を標的とする物質は、前記miR−206の配列番号1のヌクレオチド配列の全部又は一部に結合し得る核酸分子を含む請求項12に記載の気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
- 前記核酸分子は、RNA、DNA、アンタゴmir、アンチセンス分子、siRNA、shRNA、2’−O−変形オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート−バックボーンデオキシリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−バックボーンリボヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)オリゴヌクレオチド又はロックド核酸(LNA)オリゴヌクレオチドである請求項13に記載の気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
- 前記miR−206を標的とする組成物は、不安感の回復作用を通じて気分障害精神疾患を治療又は予防し得る製剤を生産するのに用いられることを特徴とする請求項12に記載の気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
- 前記miR−206を標的とする組成物は、絶望感の回復作用を通じて気分障害精神疾患を治療又は予防するのに用いられることを特徴とする請求項12に記載の気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
- 前記miR−206を標的とする組成物は、miR−206の発現又は活性を抑制する作用を通じて気分障害精神疾患の治療又は予防用の製剤を生産するのに用いられることを特徴とする請求項12に記載の気分障害精神疾患の治療又は予防用の薬学組成物。
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