CN112048553A

CN112048553A - 血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的应用

Info

Publication number: CN112048553A
Application number: CN202011042834.0A
Authority: CN
Inventors: 林红; 廖卉
Original assignee: YICHANG SPECIAL CARE HOSPITAL
Current assignee: YICHANG SPECIAL CARE HOSPITAL
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2020-09-28
Publication date: 2020-12-08

Abstract

本发明公开了血浆外周血分子标志物hsa‑miR‑574‑5p的应用，涉及医学分子生物学领域，该分子标志物用于制备双相障碍的早期识别及临床时相判断试剂盒，通过实时荧光定量PCR检测和相对定量内参标准化体系对比，首次研究双相障碍躁狂发作患者血浆microRNA‑574‑5p表达水平变化特点，验证microRNA‑574‑5p参与了双相障碍躁狂发作的发病机制，表明血浆microRNA‑574‑5p的表达水平与躁狂状态的改善有关；同时，首次研究双相障碍躁狂发作患者治疗前后血浆microRNA‑574‑5p表达水平变化的差异，及与YMRS和临床特征的关系，验证microRNA‑574‑5p可成为躁狂状态及疗效的标记物，为双相障碍类疾病的早期诊断、精准治疗和预防策略提供了技术支撑。

Description

血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的应用

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，更具体地说，它涉及血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的应用。

背景技术

双相障碍(Bipolar disorder，BD)是心境障碍的一个亚型，也是一种常见的精神疾病。该病常起病于儿童晚期或青春早期，以反复或交替发作的躁狂或抑郁为特征，具有高患病率、高复发率、高致残率和高共病率的特点。WHO协调的世界心理健康调查计划显示，双相障碍的终生患病率为2.4％，12个月的患病率为0.8％。目前我国还缺乏系统性的流行病学调查，各地区由于经济和社会状况、疾病认识、诊断分类系统及调查方法的差异，流行病学调查数据悬殊。2005年山东省双相障碍的现患率为0.19％，同期青海的现患率为0.05％，2009年我国4省(山东、浙江、甘肃和青海)的流行病学调查结果显示，双相障碍月患病率为2.01‰，同期河北省的时点患病率和终患病率分别为3.31‰和5.15‰。2015年辽宁省双相障碍的月现患率为0.46％，同期山东省的患病率为0.23％。2017年中华医学会第十五次全国精神医学年会公布的最新中国精神卫生调查显示，双相障碍的终生患病率为0.57％，12个月患病率为0.46％，残疾率为0.29％，残疾治疗率仅有18.61％。上述数据对比可见，我国双相障碍的患病率在逐步上升。

对于双相障碍的发病机制尚不十分清楚，目前倾向认为，遗传与环境因素在其发病过程中均起到重要作用，以遗传因素的影响更为突出。现有的研究认为，双相障碍的遗传是一种多基因遗传，具有明显的家族聚集性，遗传度高达85％。对于遗传机制的探索，目前国内学者多聚焦于神经营养失衡假说和神经递质紊乱假说，分子遗传学的研究发现4p16、4p35、6q22等染色体易感位点与其存在连锁关系。5-羟色胺受体基因、5-羟色胺转运体基因、色氨酸羟化酶2基因、单胺氧化酶A基因、儿茶酚胺O-甲基转移酶基因、多巴胺受体基因、多巴胺转运体基因、脑源性神经营养因子基因、谷氨酸受体离子化N-甲基-D-天冬氨酸受体基因、去甲肾上腺素转运体基因等生物胺相关基因及锌指蛋白804A基因可能与双相障碍的病理过程相关联。在表观遗传学方面，研究发现BDNF、5-羟色胺系统等多个基因启动子区及SLC6A4、SLC6A3、ARNTL、MAGI2、FAM111A等基因的甲基化水平升高，而儿茶酚胺O-甲基转移酶基因启动子区及SMPD1、ZEB2、KVNQ5等基因的甲基化水平降低。另外近年来的研究发现BD患者体内microRNA表达异常，而microRNA功能的失调与神经精神障碍的发生、发展有着密切的关系。

因此，对microRNA与双相障碍的关系进行深入研究是我们目前战胜双相障碍疾病急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p，可用于对双相障碍患者的早期识别及临床时相判断方面的应用方法及制备的试剂盒

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

检测血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的制剂在制备双相障碍的早期识别及临床时相判断试剂盒中的应用。

进一步的，所述分子标志物hsa-miR-574-5p的序列为：5’-UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU-3’，如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述试剂盒的相对定量内参标准化体系由hsa-miR-7a-3p组成，其序列为：5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

进一步的，所述分子标志物hsa-miR-574-5p在血浆外周血中的表达与对照中的表达相比被下调。

进一步的，所述试剂盒包括总RNA提取体系、反转录体系、扩增体系以及相对定量内参标准化体系。

进一步的，所述总RNA提取体系包括：2×Denaturing Solution 100μL-625μL，β-巯基乙醇375μL；Wash Solution 2/3 500μL，无水乙醇40mL；miRNA Wash Solution 1 350μL，无水乙醇21mL。

进一步的，所述反转录体系包括：100mM dNTPs 0.15μL；MultiscribeTM ReverseTranscriptase 1.00μL；10×Reverse Transcription Buffer 1.50μL；RNase Inhibitor0.19μL；DEPC 4.16μL。

进一步的，所述扩增体系包括2×Taqman Universal PCR buffer,UNG 5μL；20×Taqman MicroRNA Assay Mix 0.5μL；Template 0.75μL；H₂O 3.75μL。

进一步的，所述相对定量内参标准化体系具体为：获取每个反应孔内的荧光信号达到规定的阈值所经历的循环数，即Ct值，结果取3孔中的平均值，以microRNA-7a-3p为内参，将原始Ct减去内参Ct得出ΔCt，microRNA-547-5p相对表达量为2^-ΔCt。

综上所述，本发明具有以下有益效果：首次研究双相障碍躁狂发作患者血浆microRNA-574-5p表达水平变化特点，验证microRNA-574-5p参与了双相障碍躁狂发作的发病机制，表明血浆microRNA-574-5p的表达水平与躁狂状态的改善有关；同时，首次研究双相障碍躁狂发作患者治疗前后血浆microRNA-574-5p表达水平变化的差异，及与YMRS和临床特征的关系，验证microRNA-574-5p可成为躁狂状态及疗效的标记物，为双相障碍类疾病的早期诊断、精准治疗和预防策略提供了技术支撑。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中的效果对比图。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

一、对象与方法

(1)研究对象

研究对象为2015年8月至2016年4月期间在宜昌市精神卫生中心精神病科的住院患者。符合下列入组标准及排除标准，所有受试者均书面签C.YMRS评分≥22分。

1)入组标准：

A.符合ICD-10“双相障碍，目前为不伴有精神病性症状的躁狂发作”诊断标准；

B.年龄18-60岁，性别不限；

D.患者本人或监护人签署书面知情同意书。

2)排除标准：

A.合并严重躯体疾病、肥胖或严重营养不良及脑器质性疾病者；

B.有精神发育迟滞、癫痫及其他精神病病史者；

C.实验室检查或心电图检查结果严重异常，有临床意义者；

D.有酒精或精神活性物质滥用或依赖病史者(烟草除外)；

E.入组前1月内使用过长效抗精神病药物者；入组前2周使用过心境稳定剂或抗精神病药者；

F.妊娠或哺乳期妇女，入组时妊娠试验阳性或有可能在试验期间怀孕的孕龄妇女；

G.近1月接受过其他临床试验，或正在参加其他临床试验者；

H.入组前半年使用过免疫抑制剂或免疫增强剂，应用过无抽搐电休克治疗。

(2)样本量计算

使用PASS 11软件，根据预实验结果，按α＝0.05,1-β＝0.9的条件，算出power约为0.90248，约需52人，考虑到失访等因素，拟入组病例60例。

(3)研究方法

所有参试人员均在临床研究开始前进行YMRS培训及一致性测试合格，拟受试人员入组前由2名精神科主治或以上职称的医师进行精神科检查及诊断，并在入组当日进行血常规、肝肾功能等实验室检验，心电图、头颅CT检查及YMRS评定，对符合入组条件者，签署研究知情同意书，于入组4周后再由同一参试人员对其进行YMRS评定。在受试期间进行以丙戊酸盐为主的治疗，夜间睡眠差者可短期使用(4周以内)苯二氮卓类药物，禁止使用锂盐及无抽搐电休克治疗。参试人员密切注意其病情变化及药物不良反应，对不能完成试验者及时处理。采用自制表格收集患者的年龄、性别、首次发病年龄、发病次数、总病程、本次病程等一般人口学资料及临床特征资料。

二、血浆标本采集与处理

受试者于入组及治疗4周后空腹12小时，第2日清晨抽取上肢静脉血4ml，迅速转入EDTA抗凝管中，在1小时内45000rpm离心15分钟后取上层血浆，转至清洁的离心管中，置于-80℃的冰箱中保存备用。所有标本收集完成后统一采用实时定量荧光PCR检测其microRNA-574-5p含量，所需各种引物及内参均由上海某公司合成与设计。

三、血浆total RNA提取

(1)配置下列液体混匀后备用；

组分1	组分2
		2×Denaturing Solution	β-巯基乙醇375μL
Wash Solution 2/3	无水乙醇40mL
		miRNA Wash Solution 1	无水乙醇21mL

(2)取适量的血浆(100μL-625μL，不足100μL时，用Cell Disruption Buffer补至100μL)，加入等量的2×Denaturing Solution，涡旋混匀，在冰上放置5分钟；

(3)添加与总体积等量的酚/氯仿，涡旋混匀30-60秒，10000g，室温离心5分钟；

(4)小心吸取上清到新的1.5mL离心管中，添加1.25倍体积的无水乙醇，涡旋混匀；

(5)将洁净的离心柱放置到洁净的收集管中，吸取上一步的液体到柱子中，10000g，室温离心30秒，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中。重复该步骤，直到所有的液体过柱；

(6)吸取350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，10000g，室温离心15秒，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；

(7)混合10/μL DNase I stock solution和70μl Buffer RDD QIAGEN(#79254)共80μl加到离心柱中的膜上，25℃放置15分钟；

(8)吸取350μL miRNA Wash Solution 1到离心柱中，10000g，室温离心15秒，弃流过液，将离心柱重新放置到收集管中；

(9)500μL Wash Solution 2/3过柱两次，空柱离心1分钟。将离心柱放置到新的收集管中，柱中心加入100μL 95℃预热的Elution Solution，10000g，室温离心25秒，收集管中的液体即为提取的Total RNA，置于-80℃保存。

RNA纯度检测：total RNA经NanoDrop ND-2000分光光度计及AgilentBioanalyzer 2011(Agilent technologies，Santa Clara，CA，USA)进行质量监测。

四、cDNA第一链合成

(1)从-80℃冰箱中取出RNA，在4℃下解冻，然后置入配制有如下成分预混液的PCR管中：

组分	体积(μL)
		100mM dNTPs	0.15
Multiscribe<sup>TM</sup> Reverse Transcriptase	1.00
		10×Reverse Transcription Buffer	1.5
RNase Inhibitor	0.19
		DEPC	4.16

(2)在PCR管中加入7μL的预混液，5μLRNA和3μL反转录引物；

(3)移液枪将混合液体混匀，4℃低温离心集中离心，300转/分，离心2分钟；

(4)将PCR管置于PCR仪上，运行程序如下：16℃下30分钟；42℃下30分钟；85℃下5min；

(5)将制备的cDNA置于4℃冰箱保存备用。

五、实时定量PCR

(1)在0.2ml PCR管中配制如下反应液：

组分	体积(μL)
		2×Taqman Universal PCR buffer,UNG	5
20×Taqman MicroRNA Assay Mix	0.5
		Template	0.75
H<sub>2</sub>O	3.75

(2)将反应液加入384孔板中；

(3)将384孔板置于7900HT Sequence Detection System中，运行程序如下：50℃下2分钟；95℃下10分钟；95℃下15秒；60℃下1分钟；共运行40个循环，每个样本做3孔。

记录每个反应孔内的荧光信号达到规定的阈值所经历的循环数，即Ct值，结果取3孔中的平均值，以microRNA-7a-3p为内参，将原始Ct减去内参Ct得出ΔCt，microRNA-547-5p相对表达量＝2^-ΔCt，，其效果对比如图1所示。

六、引物

各引物由Thermo Fishier Scientific公司合成，序列及相关信息如下：

Assay ID	Assay Name	Reporter	Context Sequence
				479357_mir	hsa-miR-574-5p	Fam	5’-UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU-3’
477861_mir	hsa-miR-7a-3p	Fam	5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’

七、研究量表

Young躁狂评定量表(Young Mania Rating Scale，YMRS)由Young RC等于1978年编制，是精神科常用量表之一，主要用于评价躁狂患者的病情严重程度及疗效。该量表包含心境高涨、活动/精力增加、性兴趣、睡眠、易激惹、言语-语速和量、语言-思维障碍、(思维)内容、破坏-攻击行为、外表和自知力共11项，每项分为5级，多数采用0-4分评分，少数采用0-8分评分。得分范围0-44分，0-5分为无明显躁狂症状；6-10分为肯定有躁狂症状；22分以上有严重躁狂症状。评定时间范围一般为最近48小时，也可根据情况扩展至一周。根据原作者报告，该量表评定员间有很好的一致性，两评定员评出总分的相关系数达0.93，个条目的相关系数在0.66-0.92之间。除了适用于成年人外，该量表还适用于青少年人群。

八、统计学分析

所有数据导入SPSS19.0中进行统计分析，microRNA的相对表达量的计算采用2^-ΔCt法，用Kolmogorov-Smirnov检验对数据进行正态分布分析。符合正态分布的计量资料数据采用均数±标准差描述，不符合正态分布的计量资料数据采用中位数、最大值、最小值描述。计数资料采用χ²检验，符合正态分布计量资料采用配对样本t检验，相关性用Pearson相关分析，不符合正态分布的计量资料进行对数转换，转换后仍不符合的采用非参数检验，用Spearn检验分析相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

九、实验结果

(1)受试对象的一般人口学资料及临床特征

本次试验共入组60人，有3人中途自愿退出，4人出院后失去联系，未能完成第4周的量表评测及抽血，共有53人完成了整个临床试验。年龄20-60岁，平均37.51±11.41岁，所有受试者均采用丙戊酸盐治疗，无使用锂盐的病例。具体见表1和表2。

表1受试对象的一般人口学资料(N＝53)

表2受试对象的临床特征

(2)受试对象YMRS评分及microRNA-574-5p表达量比较

经Kolmogorov-Smirnov检验，治疗前后YMRS评分呈正态分布，而microRNA-574-5p相对表达量呈非正态分布，取对数后呈正态分布。入组时受试对象的YMRS评分为31.55±2.92分，lg(microRNA-574-5p)为1.25±0.89，治疗4周后受试对象的YMRS评分为2.49±1.19分，lg(microRNA-574-5p)为0.63±0.59，经配对样本t检验，治疗后量表评分和lg(microRNA-574-5p)均显著低于治疗前(t＝64.84、4.37，P<0.01)，治疗前后YMRS评分和microRNA-574-5p表达量比较,

见表3。

表3治疗前后YMRS评分和microRNA-574-5p表达量比较

(3)受试对象microRNA-574-5p表达量与临床特征的相关性

由于受试对象的首次发病年龄、本次病程、病程等临床特征经Kolmogorov-Smirnov检验为非正态分布，而YMRS评分、lg(microRNA-574-5p)和年龄呈正态分布，故microRNA-574-5p表达量与YMRS评分及年龄的相关性用Pearon检验，而与临床特征的相关性采用Spearn检验，结果显示治疗前后microRNA-574-5p表达量与YMRS评分正相关(治疗前R＝0.61、P<0.01，治疗后R＝0.43、P<0.01)，而与年龄、首次发病年龄、总病程、本次病程均无相关性(治疗前R＝-0.06、0.04、-0.08、-0.20，P＝0.70、0.77、0.57、0.15，治疗后R＝0.12、0.16、-0.04、-0.04，P＝0.41、0.27、0.80、0.76)。见表4和表5。

表4治疗前microRNA-574-5p表达量与临床特征的相关性

表5治疗后microRNA-574-5p表达量与临床特征的相关性

(4)不同性别受试对象microNRA-547-5p表达量比较

本研究共有男性32人，女性21人，经独立样本t检验发现，男性和女性BD患者的lg(microRNA-574-5p)无统计学差异(t＝-0.91、-0.56，P＝0.37、0.58)，具体见表6。

表6不同性别microRNA-574-5p表达量比较

十、实验结论

本研究之前预实验的显示，治疗前BD患者血浆microRNA-574-5p水平较健康对照者高表达，治疗后无显著差异，本研究显示治疗后BD患者血浆的microRNA-574-5p表达水平显著低于治疗前，同时YMRS评分也显著降低，表明BD躁狂患者存在microRNA-574-5p的表达异常。

本研究显示双相障碍躁狂发作患者治疗后血浆microRNA-574-5p的表达水平和YMRS评分均较治疗前显著下降，表明血浆microRNA-574-5p的表达水平与躁狂状态的改善有关。进一步的相关分析发现，治疗前后microRNA-574-5p的表达水平与年龄、首次发病年龄、总病程、本次病程均无关，而与代表躁狂严重程度的YMRS评分有关，且治疗前后不同性别血浆microRNA-574-5p表达水平无显著差异，表明microRNA-574-5p有可作为BD的状态及疗效标记物。

外周血microRNA-574-5p的调节异常参与了双相障碍躁狂发作的病理生理过程，进一步证实了microRNA在精神疾病中的作用，对该类疾病的早期诊断、精准治疗和预防策略找到了新的方法。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

SEQUENCE LISTING

<110> 宜昌市优抚医院

<120> 血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的应用

<130> 5

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ugagugugug ugugugagug ugu 13

<210> 2

<211> 321

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

cuauacaauc uacugucuuu c 11

Claims

1.检测血浆外周血分子标志物hsa-miR-574-5p的制剂在制备双相障碍的早期识别及临床时相判断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述分子标志物hsa-miR-574-5p的序列为：5’-UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU-3’。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述试剂盒的相对定量内参标准化体系由hsa-miR-7a-3p组成，其序列为：5’-CUAUACAAUCUACUGUCUUUC-3’。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述试剂盒为实时荧光定量PCR检测试剂盒。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述分子标志物hsa-miR-574-5p在血浆外周血中的表达与对照中的表达相比被下调。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述试剂盒包括总RNA提取体系、反转录体系、扩增体系以及相对定量内参标准化体系。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述总RNA提取体系包括：2×DenaturingSolution 100μL-625μL，β-巯基乙醇375μL；Wash Solution 2/3500μL，无水乙醇40mL；miRNA Wash Solution 1 350μL，无水乙醇21mL。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述反转录体系包括：100mM dNTPs 0.15μL；MultiscribeTM Reverse Transcriptase 1.00μL；10×Reverse Transcription Buffer1.50μL；RNase Inhibitor 0.19μL；DEPC 4.16μL。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述扩增体系包括2×Taqman UniversalPCR buffer,UNG 5μL；20×Taqman MicroRNA Assay Mix 0.5μL；Template 0.75μL；H₂O3.75μL。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征是，所述相对定量内参标准化体系具体为：获取每个反应孔内的荧光信号达到规定的阈值所经历的循环数，即Ct值，结果取3孔中的平均值，以microRNA-7a-3p为内参，将原始Ct减去内参Ct得出ΔCt，microRNA-547-5p相对表达量为2-ΔCt。