JP2019184401A - 試料観察装置及び試料観察方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】背景光の輝度値のばらつきの影響を低減でき、試料観察の再現性を向上できる試料観察装置及び試料観察方法を提供する。【解決手段】試料観察装置１は、試料Ｓに面状光Ｌ２をＸＺ面で照射する照射光学系３と、面状光Ｌ２の照射面Ｒを通過するように試料ＳをＹ軸方向に走査する走査部４と、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有し、試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する結像光学系５と、観察光Ｌ３の光像に対応するＸＺ画像データを複数取得する画像取得部６と、複数のＸＺ画像データに基づいてＸＹ画像データを生成する画像生成部８と、を備え、画像生成部８は、Ｙ軸方向について複数取得されたＸＺ画像データの解析領域を抽出し、少なくとも解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成し、Ｘ画像データをＹ軸方向に結合してＸＹ画像データを生成する。【選択図】図１

Description

本発明は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。
細胞などの３次元立体構造を持つ試料の内部を観察する手法の一つとして、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscopy）が知られている。例えば特許文献１に記載の断層像観察装置は、ＳＰＩＭの基本的な原理を開示したものであり、面状光を試料に照射し、試料の内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料内部の観察画像データを取得する。
面状光を用いた他の試料観察装置としては、例えば特許文献２に記載のＳＰＩＭ顕微鏡が挙げられる。この従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、試料の配置面に対して一定の傾斜角をもって面状光を照射し、面状光の照射面に対して直交する観察軸を有する観察光学系によって試料からの観察光を撮像する。
特開昭６２−１８０２４１号公報 特開２０１４−２０２９６７号公報
上述したような試料観察装置では、例えば試料容器の中に試料と溶液とを保持して観察を実施している。溶液からの蛍光は、背景光となるため、試料からの観察光を高い再現性で測定するためには、背景光の影響を低減させる必要がある。従来、取得画像から背景光の影響を低減させる手法としては、例えば取得画像から試料の存在しない領域の平均輝度値を求め、試料の存在する領域の輝度値から試料の存在しない領域の平均輝度値を減算して試料の輝度値を算出する手法が挙げられる。
しかしながら、背景光の輝度値の算出結果は、様々な要因でばらつくことが考えられる。例えば背景光が蛍光である場合、背景光の輝度値は、溶液の単位体積当たりの蛍光の強度と溶液の深さとの積で表される。同一の試料容器内で試料の存在しない領域の平均輝度値を求める場合、表面張力に起因して溶液の高さがばらつくことがある。また、背景光の検出用に溶液のみを保持した試料容器を用いる場合、溶液の分注精度がばらつくことがある。背景光の輝度値の算出結果がばらつくと、試料の蛍光の輝度値に対する背景光減算後の蛍光の輝度値のリニアリティが大きく崩れ、試料観察の再現性が低下してしまうおそれがある。
本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、背景光の輝度値のばらつきの影響を低減できる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。
本発明の一側面に係る試料観察装置は、試料に面状光をＸＺ面で照射する照射光学系と、面状光の照射面を通過するように試料をＹ軸方向に走査する走査部と、照射面に対して傾斜する観察軸を有し、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、結像光学系によって結像された観察光の光像に対応するＸＺ画像データを複数取得する画像取得部と、画像取得部によって取得された複数のＸＺ画像データに基づいて試料のＸＹ画像データを生成する画像生成部と、を備え、画像取得部は、ＸＺ画像データをＹ軸方向について複数取得し、画像生成部は、ＸＺ画像データにおける解析領域を抽出し、少なくとも解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成し、Ｘ画像データをＹ軸方向に結合してＸＹ画像データを生成する。
この試料観察装置では、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系によって試料のＸＺ画像データを複数取得する。各ＸＺ画像データでは、１画素に含まれる背景光のＺ方向成分を一定とすることができるため、背景光の輝度値のばらつきの影響を低減できる。したがって、Ｘ画像データをＹ軸方向に結合して得られるＸＹ画像データにおいても、背景光の影響を十分に低減することが可能となる。
画像生成部は、少なくとも解析領域に対してダークオフセット減算を実行した後に解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してもよい。ダークオフセット減算を実行することで画像取得部のノイズの影響を十分に低減できる。
画像生成部は、解析領域以外の領域の輝度値を低減し、ＸＺ画像データの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成してもよい。これにより、画像取得の際の装置固有のノイズの揺らぎの影響を抑えることができる。
画像生成部は、解析領域のみの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成してもよい。これにより、Ｚ軸方向に積算される画素数を制限できるため、画像取得の際の装置固有のノイズの揺らぎの影響を抑えることができる。
面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、１０°〜８０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を十分に確保できる。
面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、２０°〜７０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を一層十分に確保できる。また、観察軸の角度変化量に対する視野の変化を抑えることができ、視野の安定度を確保できる。
面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、３０°〜６５°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度及び視野の安定度を一層好適に確保できる。
試料観察装置は、ＸＹ画像データを含む観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えていてもよい。この場合、解析のスループットも向上させることができる。
また、本発明の一側面に係る試料観察方法は、試料に面状光をＸＺ面で照射する照射ステップと、面状光の照射面を通過するように試料をＹ軸方向に走査する走査ステップと、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、結像光学系によって結像された観察光の光像に対応するＸＺ画像データを複数取得する画像取得ステップと、複数のＸＺ画像データに基づいて試料のＸＹ画像データを生成する画像生成ステップと、を備え、画像取得ステップでは、ＸＺ画像データをＹ軸方向について複数取得し、画像生成ステップでは、ＸＺ画像データにおける解析領域を抽出し、少なくとも解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成し、Ｘ画像データをＹ軸方向に結合してＸＹ画像データを生成する。
この試料観察方法では、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系によって試料のＸＺ画像データを複数取得する。各ＸＺ画像データでは、１画素に含まれる背景光のＺ方向成分を一定とすることができるため、背景光の輝度値のばらつきの影響を低減できる。したがって、Ｘ画像データをＹ軸方向に結合して得られるＸＹ画像データにおいても、背景光の影響を十分に低減することが可能となる。
画像生成ステップにおいて、少なくとも解析領域に対してダークオフセット減算を実行した後に解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してもよい。ダークオフセット減算を実行することで画像取得部のノイズの影響を十分に低減できる。
画像生成ステップにおいて、解析領域以外の領域の輝度値を低減し、ＸＺ画像データの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成してもよい。これにより、画像取得の際の装置固有のノイズの揺らぎの影響を抑えることができる。
画像生成ステップにおいて、解析領域のみの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成してもよい。これにより、Ｚ軸方向に積算される画素数を制限できるため、画像取得の際の装置固有のノイズの揺らぎの影響を抑えることができる。
画像取得ステップにおいて、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度を１０°〜８０°としてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を十分に確保できる。
画像取得ステップにおいて、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度を２０°〜７０°としてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を一層十分に確保できる。また、観察軸の角度変化量に対する視野の変化を抑えることができ、視野の安定度を確保できる。
面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度を３０°〜６５°としてもよい。この範囲では、観察画像の解像度及び視野の安定度を一層好適に確保できる。
試料観察方法は、ＸＹ画像データを解析し、解析結果を生成する解析ステップを更に備えていてもよい。この場合、解析のスループットも向上させることができる。
この試料観察装置及び試料観察方法によれば、背景光の輝度値のばらつきの影響を低減できる。
試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。 試料の近傍を示す要部拡大図である。 試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。 画像生成部による観察画像の生成の一例を示す図である。 画像取得部による画像取得の様子を示す図である。 試料観察装置における視野の算出例を示す図である。 観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。 背景光の減算値のばらつきの影響を示す図である。 ＸＺ画像データの生成例を示す図である。 Ｘ画像データの生成例を示す図である。 ＸＹ画像データの生成例を示す図である。 画像生成ステップの一例を示すフローチャートである。 画像生成ステップの別例を示すフローチャートである。 画像生成ステップの更なる別例を示すフローチャートである。 画像生成ステップの更なる別例を示すフローチャートである。
以下、図面を参照しながら、本発明の一側面に係る試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
図１は、試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。この試料観察装置１は、面状光Ｌ２を試料Ｓに照射し、試料Ｓの内部で発生した観察光（例えば蛍光又は散乱光など）を結像面に結像させて試料Ｓ内部の観察画像データを取得する装置である。この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。試料観察装置１は、図１に示すように、光源２と、照射光学系３と、走査部４と、結像光学系５と、画像取得部６と、コンピュータ７とを備えて構成されている。
観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織、臓器、動物或いは植物自体、植物の細胞、組織などが挙げられる。これらの試料Ｓは、例えばフルオレセインーデキストラン（励起波長：４９４ｎｍ／蛍光波長：５２１ｎｍ）、テトラメチルローダミン（励起波長：５５５ｎｍ／蛍光波長：５８０ｎｍ）などの蛍光材料によって染色されている。なお、試料Ｓは、複数の蛍光物質によって染色されてもよい。また、試料Ｓは、溶液、ゲル、或いは試料Ｓとは屈折率の異なる物質に含まれていてもよい。
光源２は、試料Ｓに照射される光Ｌ１を出力する光源である。光源２としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源が挙げられる。また、光源２は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３に導光される。
照射光学系３は、光源２から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する光学系である。以下の説明では、照射光学系３の光軸Ｐ１を面状光Ｌ２の光軸という場合もある。照射光学系３は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源２に対して光学的に結合されている。照射光学系３は、対物レンズを含んで構成されていてもよい。照射光学系３によって形成された面状光Ｌ２は、試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２が照射された試料Ｓでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒにおいて観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３は、例えば面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、或いは面状光Ｌ２の拡散反射光である。
試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、後述するＺ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。したがって、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。
走査部４は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。本実施形態では、走査部４は、試料Ｓを保持する試料容器１１を移動させる移動ステージ１２によって構成されている。試料容器１１は、例えばマイクロプレート、スライドガラス、シャーレ等であり、面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３に対して透明性を有している。本実施形態では、マイクロプレートを例示する。試料容器１１は、図２に示すように、試料Ｓが配置される複数のウェル１３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部１４と、本体部１４の一面側においてウェル１３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材１５とを有している。
ウェル１３内への試料Ｓの配置にあたり、ウェル１３内には、試料Ｓと共に培養液、蛍光指示薬、バッファ等の溶液が充填されている。溶液からは、自家蛍光が発せられる。透明部材１５は、ウェル１３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面１５ａを有している。透明部材１５の材質は、面状光Ｌ２に対する透明性を有する部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。試料容器１１は、入力面１５ａが面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交するように移動ステージ１２に対して配置されている。なお、ウェル１３の他端側は、外部に開放された状態となっている。試料容器１１は、移動ステージ１２に対して固定されていてもよい。
移動ステージ１２は、図１に示すように、コンピュータ７からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器１１を走査する。本実施形態では、移動ステージ１２は、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器１１を走査する。以下の説明では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージ１２による試料容器１１の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。
結像光学系５は、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する光学系である。結像光学系５は、図２に示すように、例えば対物レンズ１６を含んで構成されている。結像光学系５の光軸は、観察光Ｌ３の観察軸Ｐ２となっている。この結像光学系５の観察軸Ｐ２は、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、１０°〜８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°〜７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°〜６５°であることが更に好ましい。
画像取得部６は、図１に示すように、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像に対応する画像データを複数取得する装置である。画像取得部６は、例えば観察光Ｌ３による光像を撮像する撮像装置を含んで構成されている。撮像装置としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系５による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ７に出力する。
画像取得部６は、観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する態様であってもよい。この場合、例えばエリアイメージセンサの撮像面においてサブアレイを設定し、当該サブアレイに含まれる画素列のみを読み出すようにして部分画像データを取得してもよい。また、エリアイメージセンサの全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出して部分画像データを取得してもよい。エリアイメージセンサに代えてラインセンサを用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分画像データを取得してもよい。観察光Ｌ３の一部のみを透過させるスリットをエリアイメージセンサの前面に配置し、スリットに対応する画素列の画像データを部分画像データとして取得してもよい。
コンピュータ７は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ７としては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ７は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源２及び移動ステージ１２の動作を制御するコントローラ、試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８、及び観察画像データを解析する解析部１０として機能する（図１参照）。
コントローラとしてのコンピュータ７は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源２、移動ステージ１２、及び画像取得部６を同期させて駆動する。この場合、コンピュータ７は、移動ステージ１２による試料Ｓの移動中、光源２が光Ｌ１を連続的に出力するように光源２を制御してもよく、画像取得部６による撮像に合わせて光源２による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系３が光シャッタ（不図示）を備えている場合、コンピュータ７は、当該光シャッタの制御によって試料Ｓへの面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。
また、画像生成部８としてのコンピュータ７は、画像取得部６によって生成された複数の画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、画像取得部６から出力された複数の画像データに基づいて、例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１に直交する面（ＸＹ面）における試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した観察画像データの格納、モニタ等への表示等を実行する。
解析部１０としてのコンピュータ７は、画像生成部８によって生成された観察画像データに基づいて解析を実行し、解析結果を生成する。解析部１０は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した解析結果の格納、モニタ等への表示等を実行する。なお、画像生成部８によって生成された観察画像データのモニタ等への表示は行わず、解析部１０によって生成された解析結果のみをモニタ等に表示してもよい。
図３は、試料観察装置１を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。同図に示すように、この試料観察方法は、照射ステップ（ステップＳ０１）、走査ステップ（ステップＳ０２）、結像ステップ（ステップＳ０３）、画像取得ステップ（ステップＳ０４）、画像生成ステップ（ステップＳ０５）、及び解析ステップ（ステップＳ０６）を備えている。
照射ステップＳ０１では、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて光源２が駆動し、光源２から光Ｌ１が出力される。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料Ｓに照射される。
走査ステップＳ０２では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて、光源２の駆動と同期して移動ステージ１２が駆動する。これにより、試料容器１１がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル１３内の試料Ｓが走査される。
結像ステップＳ０３では、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系５を用い、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を画像取得部６の結像面に対して結像する。画像取得ステップＳ０４では、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像に対応する画像データを複数取得する。画像データは、画像取得部６から画像生成部８に順次出力される。
画像生成ステップＳ０５では、複数の画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。本実施形態では、図１及び図２に示したように、試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面であり、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、画像生成部８には、図４（Ａ）に示すように、ＸＺ画像データ３１をＹ軸方向に複数取得することによって、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、複数のＸＺ画像データ３１を用いてデータが再構築され、例えば図４（Ｂ）に示すように、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ画像データ３２が試料Ｓの観察画像データとして生成される。なお、画像生成部８は、ＸＹ画像データ３２を含む３次元データを観察画像データとして生成してもよい。
解析ステップＳ０６では、解析部１０によって観察画像データを解析し、解析結果を生成する。例えば創薬スクリーニングでは、試料容器１１に試料Ｓ及び試薬を入れ、観察画像データであるＸＹ画像データ３２を取得する。そして、解析部１０は、ＸＹ画像データ３２に基づいて試薬を評価し、評価データを解析結果として生成する。解析部１０は、ＸＹ画像データ３２を含む３次元データを観察画像データとして取得し、解析してもよい。
上述した試料観察装置１について、更に詳細に説明する。
試料観察装置１では、図５（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査しながら画像取得部６によって画像取得を行っている。また、試料観察装置１では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対し、結像光学系５の観察軸Ｐ２が傾斜している。このため、画像取得部６では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向（Ｚ軸方向）におけるＸＺ画像データ３１を順次取得することが可能となり、画像生成部８では、複数のＸＺ画像データ３１に基づいて、試料ＳのＸＹ画像データ３２を生成できる。
この試料観察装置１では、図５（Ｂ）に示すように、試料Ｓを走査させながら画像取得を順次行うことが可能となる。従来の試料観察装置の動作では、移動ステージの駆動及び停止の際の度に、慣性の影響等により時間的なロスが生じる。これに対し、試料観察装置１では、移動ステージ１２の駆動及び停止の回数を削減し、試料Ｓの走査動作と画像取得とを同時進行することが可能となる。したがって、ＸＹ画像データ３２を得るまでのスループットの向上が図られる。
また、試料観察装置１では、図２に示したように、試料Ｓが面状光Ｌ２の入力面１５ａを有する試料容器１１によって保持され、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１が試料容器１１の入力面１５ａに対して直交するように配置されている。さらに、試料観察装置１では、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１（Ｚ軸方向）に対して直交する方向（Ｙ軸方向）に走査部４が試料Ｓを走査する。これにより、画像取得部６で取得したＸＺ画像データ３１の位置補正などの画像処理が不要となり、ＸＹ画像データ３２の生成処理を容易化できる。
また、試料観察装置１では、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対する結像光学系５の観察軸Ｐ２の傾斜角度θが１０°〜８０°、好ましくは、２０°〜７０°、より好ましくは３０°〜６５°となっている。以下、この点について考察する。図６は、試料観察装置における視野の算出例を示す図である。同図に示す例では、結像光学系が屈折率ｎ１の媒質Ａ中に位置し、面状光の照射面が屈折率ｎ２の媒質Ｂ中に位置している。結像光学系における視野をＶ、照射面をＶ’、照射面に対する観察軸の傾斜角度をθ、媒質Ａ，Ｂの境界面での屈折角をθ’、視野Ｖの傾斜角度θにおける媒質Ａと媒質Ｂの界面での距離をＬとした場合、以下の式（１）〜（３）が成り立つ。
（数１）
Ｌ＝Ｖ／ｃｏｓθ …（１）
（数２）
ｓｉｎθ’＝（ｎ１／ｎ２）×ｓｉｎθ …（２）
（数３）
Ｖ’＝Ｌ／ｔａｎθ’ …（３）
図７は、観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の相対値Ｖ’／Ｖとしている。そして、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときのＶ’／Ｖの値を傾斜角度θに対してプロットしている。Ｖ’／Ｖの値が小さいほど試料の深さ方向の解像度（以下、「Ｚ方向解像度」と称す）が高く、大きいほどＺ方向解像度が低いことを示している。
図７に示す結果から、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが等しい場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が反比例していることが分かる。また、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが異なる場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が放物線を描くことが分かる。この結果から、試料の配置空間の屈折率、結像光学系の配置空間の屈折率、及び観察軸の傾斜角度θによってＺ方向解像度をコントロールできることが分かる。そして、傾斜角度θが１０°〜８０°の範囲では、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲に比べて良好なＺ方向解像度が得られることが分かる。
また、図７に示す結果から、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、屈折率ｎ１と屈折率ｎ２との差が大きくなるにつれて小さくなる傾向があることが分かる。屈折率ｎ２が１．１〜２．０の範囲では、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、約４７°〜約５７°の範囲となる。例えば屈折率ｎ２が１．３３（水）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ５２°と見積もられる。また、例えば屈折率ｎ２が１．５３（ガラス）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ４８°と見積もられる。
図８は、観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の安定度としている。安定度は、傾斜角度θでのＶ’／Ｖに対する傾斜角度θ＋１でのＶ’／Ｖと傾斜角度θ−１でのＶ’／Ｖとの差分値の割合で表され、下記式（４）に基づいて算出される。安定度が０％に近い程、傾斜角度の変化に対する視野の変化が小さく、視野が安定していると評価できる。この図８では、図７と同様に、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときの安定度がプロットされている。
（数４）
安定度（％）＝（（Ｖ’／Ｖ）θ＋１−（Ｖ’／Ｖ）θ−１）／（Ｖ’／Ｖ）θ …（４）
図８に示す結果から、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲では、安定度が±２０％を超えており、視野のコントロールが困難であることが分かる。一方、傾斜角度θが１０°〜８０°の範囲では、安定度が±２０％以下となり、視野のコントロールが可能となる。さらに、傾斜角度θが２０°〜７０°の範囲では、安定度が±１０％以下となり、視野のコントロールが容易となる。
図９は、観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、左側の縦軸を視野の相対値、右側の縦軸を透過率としている。この図９では、試料容器における試料の保持状態を考慮し、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．５３（ガラス）、媒質Ｃの屈折率ｎ３を１．３３（水）とし、透過率の値は、媒質Ｂ，Ｃの界面及び媒質Ａ，Ｂの界面の透過率の積としている。図９には、Ｐ波の透過率、Ｓ波の透過率、及びこれらの平均値の角度依存性がプロットされている。また、図９には、媒質Ｃにおける視野の相対値が併せてプロットされている。
図９に示す結果から、観察軸の傾斜角度θを変化させることで、試料から結像光学系に至る観察光の透過率が可変となることが分かる。傾斜角度θが８０°以下の範囲では、少なくとも５０％以上の透過率が得られることが分かる。また、傾斜角度θが７０°以下の範囲では、少なくとも６０％以上の透過率が得られ、傾斜角度θが６５°以下の範囲では、少なくとも７５％以上の透過率が得られることが分かる。
以上の結果から、試料のＺ方向解像度が要求される場合には、例えば視野の相対値であるＶ’／Ｖの値が３以下であり、安定度が５％未満、かつ観察光の透過率（Ｐ波及びＳ波の平均値）が７５％以上となるように、傾斜角度θを３０°〜６５°の範囲から選択することが好適である。また、試料のＺ方向解像度が要求されない場合には、傾斜角度θを１０°〜８０°の範囲から適宜選択すればよく、１画素当たりの視野の範囲を確保する観点から、１０°〜３０°若しくは６５°〜８０°の範囲から選択することが好適である。
続いて、試料観察装置１における背景光の減算処理について説明する。
試料観察装置１では、試料容器１１のウェル１３内に試料Ｓと蛍光溶液とを保持して観察を実施している。溶液からの自家蛍光は、背景光となるため、試料Ｓからの観察光Ｌ３を高い再現性で測定するためには、背景光の影響を低減させる必要がある。従来、取得画像から背景光の影響を低減させる手法としては、例えば取得画像から試料の存在しない領域の平均輝度値を求め、試料の存在する領域の輝度値から試料の存在しない領域の平均輝度値を減算して試料の輝度値を算出する手法が挙げられる。
しかしながら、背景光の輝度値の算出結果は、様々な要因でばらつくことが考えられる。例えば背景光が蛍光である場合、背景光の輝度値は、溶液の単位体積当たりの蛍光の強度と溶液の深さとの積で表される。同一の試料容器内で試料の存在しない領域の平均輝度値を求める場合、表面張力に起因して溶液の高さがばらつくことがある。また、背景光の検出用に溶液のみを保持した試料容器を用いる場合、溶液の分注精度がばらつくことがある。
背景光の輝度値の算出結果がばらつくと、例えば図１０に示すように、試料の蛍光の輝度値に対する背景光減算後の蛍光の輝度値のリニアリティが大きく崩れ、試料観察の再現性が低下してしまうおそれがある。図１０では、背景光の減算値が±１０％ばらついた場合の試料の蛍光量に対する背景光減算後の蛍光量が示されている。この結果から、背景光の減算値が±数％ばらつくだけでも、背景光減算後の蛍光の輝度値のリニアリティが保たれなくなることが分かる。
これに対し、試料観察装置１の画像生成部８では、まず、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆの抽出を行う。解析領域Ｆの抽出は、ＸＺ画像データ３１で撮像される領域のうち、試料Ｓからの蛍光が存在する領域に対して行われる。図１１の例では、画像取得部６でＹ軸方向に複数される複数のＸＺ画像データ３１のうちの一のＸＺ画像データ３１が示されている。このＸＺ画像データ３１には、例えば試料容器１１の透明部材１５或いは空気に対応する光像４１、試料Ｓに対応する光像４２、溶液に対応する光像４３が含まれている。
画像生成部８は、図１２に示すように、このＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆを抽出し、解析領域Ｆの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データ３３を生成する。画像生成部８は、他のＸＺ画像データ３１についても同様に、解析領域Ｆの抽出及び解析領域Ｆの輝度値のＺ軸方向への積算を実行し、複数のＸ画像データ３３を生成する。画像生成部８は、図１３に示すように、これらのＸ画像データ３３をＹ軸方向に結合し、ＸＹ画像データ３２を生成する。
図１４は、画像生成ステップＳ０５の一例を示すフローチャートである。同図に示す画像生成ステップＳ０５の例では、まず、解析領域Ｆを抽出するための閾値の設定を実行する（ステップＳ１１）。閾値は、例えば溶液のみを保持した試料容器１１のウェル１３に対するＸＺ画像データ３１の輝度値に基づいて設定される。閾値は、試料Ｓの蛍光量が既知である場合には、当該蛍光量に基づいて設定されてもよい。閾値は、ＸＺ画像データ３１毎に設定されていてもよく、画像取得部６の画素毎にそれぞれ設定されていてもよい。
次に、設定された閾値に基づいて、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆの抽出を実行する（ステップＳ１２）。ここでは、解析領域Ｆとして、試料Ｓからの蛍光が存在する領域を抽出する。解析領域Ｆの抽出後、解析領域Ｆに対して画像取得部６のダークオフセット減算を実行する（ステップＳ１３）。ダークオフセットとは、撮像装置固有のノイズであり、例えば撮像装置の暗電流によって生じるノイズである。ダークオフセット減算実行後、解析領域Ｆの輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データ３３を生成する（ステップＳ１４）。そして、他のＸＺ画像データ３１について同様に得られたＸ画像データ３３をＹ軸方向に結合し、ＸＹ画像データ３２を生成する（ステップＳ１５）。なお、ステップＳ１３のダークオフセット減算は、ステップＳ１１の閾値の設定よりも前に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算分を考慮して閾値の設定を行うことが好ましい。ステップＳ１３のダークオフセット減算は、ステップＳ１４のＸ画像データ３３の生成よりも後に行ってもよい。この際、ダークオフセット減算は、Ｘ画像データ３３に対して行われることになるため、ダークオフセット減算をＸＺ画像データ３１全体に行うことと同等の効果を得る。
また、画像生成ステップＳ０５では、解析領域Ｆ以外の領域を構成する複数の画素の輝度値を低減した後に、ステップＳ１４によるＸ画像データ３３の生成を行ってもよい。例えば解析領域Ｆ以外の領域を構成する複数の画素の輝度値を０カウントとする処理を行った後、ＸＺ画像データ３１をＺ軸方向に積算してＸ画像データ３３を生成してもよい。この場合、撮像装置固有のノイズ（例えば読出しノイズ）の揺らぎによる影響を抑えることができる。このような処理は、背景光を発生しない場合（例えば溶液が自家蛍光を発生しない場合）においても有効である。
さらに、画像生成ステップＳ０５では、ステップＳ１２による解析領域Ｆの抽出の後、ＸＺ画像データ３１における解析領域ＦのみをＺ軸方向に積算してＸ画像データ３３を生成してもよい。この場合、Ｘ画像データ３３の生成において積算される画素数が制限されるため、撮像装置固有のノイズ（例えば読出しノイズ）の揺らぎによる影響を抑えることができる。このような処理は、背景光を発生しない場合（例えば、溶液が自家蛍光を発生しない場合）でも有効である。
図１５は、画像生成ステップＳ０５の別例を示すフローチャートである。この別例は、ＸＺ画像データ３１内で閾値を設定する点で、図１４に示した形態と相違している。この画像生成ステップＳ０５の例では、まず、ＸＺ画像データ３１における背景光の検出を行う（ステップＳ２１）。ここでは、背景光の輝度値は、ＸＺ画像データ３１のうち、試料Ｓが存在しない領域の輝度値から求められる。なお、試料Ｓが存在しない領域には、例えば試料容器１１の透明部材１５或いは空気に対応する光像４１の領域、及び溶液に対応する光像４３の領域が含まれる。
試料Ｓが存在しない領域の特定には、様々な手法を適用し得る。例えば試料Ｓが存在しない領域は、ＸＺ画像データ３１の上部領域としてもよい。また、試料Ｓの厚さが既知である場合には、試料Ｓが存在しない領域は、透明部材１５から試料Ｓの厚さ以上の範囲としてもよい。さらに、試料Ｓが存在しない領域は、試料Ｓの蛍光量が既知である場合には、当該蛍光量以下の値を閾値とし、閾値以下の輝度値を有する画素によって構成される領域としてもよい。
また、背景光の輝度値の取得には、様々な手法を適用し得る。例えば試料Ｓが存在しない領域の特定の画素の輝度値から求めてもよく、試料Ｓが存在しない領域のＸ方向もしくはＺ方向の複数の画素の輝度値分布から求めてもよい。さらに、背景光の輝度値は、試料Ｓが存在しない領域の特定のエリアを構成する複数の画素の輝度値分布から求めてもよい。
以下、検出した背景光に基づいて解析領域Ｆを抽出するための閾値の設定を実行する（ステップＳ２２）。また、図１４の場合と同様に、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆの抽出（ステップＳ２３）、ダークオフセット減算（ステップＳ２４）、Ｘ画像データ３３の生成（ステップＳ２５）、及びＸＹ画像データ３２の生成（ステップＳ２６）を実行する。ステップＳ２４のダークオフセット減算は、ステップＳ２１の背景光の検出よりも前に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算分を考慮して背景光の検出及び閾値の設定を行うことが好ましい。ステップＳ２４のダークオフセット減算は、ステップＳ２５のＸ画像データ３３の生成よりも後に行ってもよい。この際、ダークオフセット減算は、Ｘ画像データ３３に対して行われることになるため、ダークオフセット減算をＸＺ画像データ３１全体に行うことと同等の効果を得る。
図１６は、画像生成ステップＳ０５の更なる別例を示すフローチャートである。この更なる別例は、解析領域Ｆの抽出後に背景光の減算を行う点で、図１４に示した形態と相違している。この画像生成ステップＳ０５の例では、まず、図１５の場合と同様に、ＸＺ画像データ３１における背景光の検出を行い（ステップＳ３１）、検出した背景光に基づいて解析領域Ｆを抽出するための閾値の設定を実行する（ステップＳ３２）。次に、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆの抽出を実行し（ステップＳ３３）、及びダークオフセット減算を実行する（ステップＳ３４）。
ダークオフセット減算の実行後、解析領域Ｆに対する背景光の減算を実行する（ステップＳ３５）。ステップＳ３５では、例えば解析領域Ｆに対応する画素毎にステップＳ３１で検出された背景光の輝度値を減算する。減算に用いる背景光の輝度値は、ステップＳ３１で求めた背景光の輝度値であってもよく、別の手法で求めた背景光の輝度値であってもよい。
背景光の減算の後、Ｘ画像データ３３の生成（ステップＳ３６）、及びＸＹ画像データ３２の生成（ステップＳ３７）を実行する。ステップＳ３４のダークオフセット減算は、ステップＳ３１の背景光の検出よりも前に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算分を考慮して背景光の検出、閾値の設定、及び背景光の減算を行うことが好ましい。また、ステップＳ３５の背景光の減算は、ステップＳ３２の閾値の設定よりも前に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算分を考慮して背景光の検出を行い、ダークオフセット減算分及び背景光減算分を考慮して閾値の設定を行うことが好ましい。ステップＳ３４のダークオフセット減算及びステップＳ３５の背景光の減算は、ステップＳ３６のＸ画像データ３３の生成よりも後に行ってもよい。この際、ダークオフセット減算は、Ｘ画像データ３３に対して行われることになるため、ダークオフセット減算をＸＺ画像データ３１全体に行うことと同等の効果を得る。
図１７は、画像生成ステップＳ０５の更なる別例を示すフローチャートである。この更なる別例は、解析領域Ｆの中から試料Ｓの存在領域を更に抽出し、当該試料Ｓの存在領域を除いた領域に対して背景光の減算を行う点で、図１４に示した形態と相違している。この画像生成ステップＳ０５の例では、まず、図１５の場合と同様に、ＸＺ画像データ３１における背景光の検出（ステップＳ４１）、閾値の設定（ステップＳ４２）、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆの抽出（ステップＳ４３）、ダークオフセット減算（ステップＳ４４）を実行する。
次に、解析領域Ｆの中から試料Ｓの存在領域を抽出する（ステップＳ４５）。試料Ｓの存在領域は、ＸＺ画像データ３１における各画素の輝度値に基づく試料Ｓのエッジ検出によって抽出してもよく、試料Ｓの輝度プロファイルに基づいて抽出してもよい。試料Ｓの存在領域は、試料Ｓの蛍光量が既知である場合には、当該蛍光量に基づいて設定された閾値に基づいて抽出してもよい。試料Ｓの存在領域を抽出した後、当該試料Ｓの存在領域を除いた解析領域Ｆから背景光の減算を行う（ステップＳ４６）。減算に用いる背景光の輝度値は、ステップＳ４１で求めた背景光の輝度値であってもよく、別の手法でも求めた背景光の輝度値でもよい。背景光の減算の後、Ｘ画像データ３３の生成（ステップＳ４７）、及びＸＹ画像データ３２の生成（ステップＳ４８）を実行する。通常、試料Ｓの内部には溶液は存在しないが、試料Ｓからの蛍光は、光学系によって試料Ｓの周辺に広がることとなる。試料Ｓの周辺には溶液が存在するため、試料Ｓの周辺の光像を取得した画素から背景光の減算を行うことで、観察画像の精度の向上が図られる。
ステップＳ４４のダークオフセット減算は、ステップＳ４５の試料Ｓの存在領域の抽出とステップＳ４６の背景光の減算との間に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算を行う領域は、解析領域Ｆの全体を対象とすることが好ましい。また、ステップＳ４４のダークオフセット減算は、ステップＳ４１の背景光の検出よりも前に行ってもよい。この場合、ダークオフセット減算分を考慮して背景光の検出、閾値の設定、及び背景光の減算を行うことが好ましい。
また、ステップＳ４４のダークオフセット減算及びステップＳ４６の背景光の減算は、ステップＳ４７のＸ画像データ３３の生成の後に行ってもよい。この場合、背景光は、Ｚ軸方向の積算対象となる画素から試料Ｓの存在領域に対応する画素を除いた画素に存在すると考えられる。したがって、背景光の減算は、ＸＺ画像データ３１の解析領域Ｆに対応する画素から試料Ｓの存在領域に対応する画素を除いた画素に対して行うことが好ましい。
さらに、ステップＳ４４のダークオフセット減算及びステップＳ３５と同様の背景光の減算をステップＳ４１の背景光の検出とステップＳ４２の閾値の設定との間に行ってもよい。この場合、試料Ｓの存在領域について背景光の減算が過剰となる。したがって、ステップＳ４６の背景光の減算を実行する代わりに、ステップＳ４７のＸ画像データ３３の生成後に過減算分を加算する処理を行うことが好ましい。
以上説明したように、試料観察装置１では、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系５によって試料ＳのＸＺ画像データ３１を複数取得する。各ＸＺ画像データ３１では、１画素に含まれる背景光のＺ方向成分を一定とすることができるため、背景光の輝度値のばらつきの影響を低減できる。また、ＸＺ画像データ３１における解析領域Ｆを抽出することで、試料Ｓと背景とを分離できる。このため、解析領域Ｆの輝度値をＺ軸方向に積算して得られるＸ画像データ３３では、背景光の影響が十分に低減される。したがって、Ｘ画像データ３３をＹ軸方向に結合して得られるＸＹ画像データ３２においても、背景光の影響を十分に低減することが可能となり、試料観察の再現性を向上できる。
また、試料観察装置１では、画像生成部８が解析領域Ｆに対してダークオフセット減算を実行した後に解析領域Ｆの輝度値をＺ軸方向に積算する。ダークオフセット減算を実行することで画像取得部６のノイズの影響を十分に低減できる。したがって、試料観察の再現性を更に向上できる。
また、試料観察装置１では、画像生成部８が解析領域Ｆ以外の領域の輝度値を低減し、ＸＺ画像データ３１の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データ３３を生成し得る。これにより、撮像装置固有のノイズの揺らぎによる影響を抑えることができる。試料観察装置１では、画像生成部８が解析領域Ｆのみの輝度値をＺ軸方向に積算して、Ｘ画像データ３３を生成し得る。この場合も、Ｚ軸方向に積算される画素数を制限できるため、撮像装置固有のノイズの揺らぎの影響を抑えることができる。
また、試料観察装置１では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対する結像光学系５の観察軸Ｐ２の傾斜角度θが１０°〜８０°、好ましくは２０°〜７０°、さらに好ましくは３０°〜６５°となっている。この範囲によれば、観察画像の解像度及び観察軸の角度変化量に対する視野の安定性を十分に確保できる。また、試料観察装置１は、ＸＹ画像データ３２を解析し、解析結果を生成する解析部１０を備えている。これにより、解析のスループットも向上させることができる。
本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と試料容器１１の入力面１５ａとは、必ずしも直交していなくてもよく、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と走査部４による試料Ｓの走査方向とは、必ずしも直交していなくてもよい。
また、例えば上記実施形態では、試料容器１１においてウェル１３の一端側を塞ぐように透明部材１５が設けられており、透明部材１５の入力面１５ａから面状光Ｌ２を入力させているが、ウェル１３の他端側から面状光Ｌ２を入力させる構成としてもよい。この場合、屈折率が異なる媒質の界面の数が少なくなり、観察光Ｌ３の屈折回数を減らすことが可能となる。さらに、試料容器１１に代えて、ゲル等の固形物に試料Ｓを保持してもよく、フローサイトメーターのように、透明容器内に水等の流体を流して試料Ｓを移動させるようにしてもよい。
また、結像光学系５及び画像取得部６を複数対配置してもよい。この場合、観察範囲を拡大できるほか、複数の異なる波長の観察光Ｌ３を観察することが可能となる。また、結像光学系５に対して複数の画像取得部６を配置してもよく、複数の結像光学系５に対して画像取得部６を配置してもよい。複数の画像取得部６は、異なる種類の光検出器あるいは撮像装置を組み合わせてもよい。光源２は、波長の異なる光を出力する複数の光源によって構成されてもよい。この場合、波長の異なる励起光を試料Ｓに照射することができる。
また、非点収差の緩和のため、結像光学系５にプリズムを配置してもよい。この場合、例えば対物レンズ１６の後段側（対物レンズ１６と画像取得部６との間）にプリズムを配置してもよい。デフォーカス対策のため、観察軸Ｐ２に対して画像取得部６における撮像装置の撮像面を傾斜させてもよい。この他、例えば結像光学系５と画像取得部６との間にダイクロイックミラー或いはプリズムを配置して観察光Ｌ３の波長分離を行う構成としてもよい。
１…試料観察装置、３…照射光学系、４…走査部、５…結像光学系、６…画像取得部、８…画像生成部、１０…解析部、３１…ＸＺ画像データ、３２…ＸＹ画像データ、３３…Ｘ画像データ、Ｌ２…面状光、Ｌ３…観察光、Ｐ２…観察軸、Ｒ…照射面、Ｓ…試料、Ｆ…解析領域、θ…傾斜角度。

Claims (16)

  1. 試料に面状光をＸＺ面で照射する照射光学系と、
    前記面状光の照射面を通過するように前記試料をＹ軸方向に走査する走査部と、
    前記照射面に対して傾斜する観察軸を有し、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、
    前記結像光学系によって結像された前記観察光の光像に対応するＸＺ画像データを複数取得する画像取得部と、
    前記画像取得部によって取得された複数の前記ＸＺ画像データに基づいて前記試料のＸＹ画像データを生成する画像生成部と、を備え、
    前記画像取得部は、前記ＸＺ画像データを前記Ｙ軸方向について複数取得し、
    前記画像生成部は、前記ＸＺ画像データにおける解析領域を抽出し、少なくとも前記解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成し、前記Ｘ画像データを前記Ｙ軸方向に結合して前記ＸＹ画像データを生成する試料観察装置。
  2. 前記画像生成部は、少なくとも前記解析領域に対してダークオフセット減算を実行した後に前記解析領域の輝度値を前記Ｚ軸方向に積算する請求項１記載の試料観察装置。
  3. 前記画像生成部は、前記解析領域以外の領域の輝度値を低減し、前記ＸＺ画像データの輝度値をＺ軸方向に積算して前記Ｘ画像データを生成する請求項１又は２記載の試料観察装置。
  4. 前記画像生成部は、前記解析領域のみの輝度値をＺ軸方向に積算して前記Ｘ画像データを生成する請求項１又は２記載の試料観察装置。
  5. 前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、１０°〜８０°となっている請求項１〜４のいずれか一項記載の試料観察装置。
  6. 前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、２０°〜７０°となっている請求項１〜５のいずれか一項記載の試料観察装置。
  7. 前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、３０°〜６５°となっている請求項１〜６のいずれか一項記載の試料観察装置。
  8. 前記ＸＹ画像データを含む観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備える請求項１〜７のいずれか一項記載の試料観察装置。
  9. 試料に面状光をＸＺ面で照射する照射ステップと、
    前記面状光の照射面を通過するように前記試料をＹ軸方向に走査する走査ステップと、
    前記照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、
    前記結像光学系によって結像された前記観察光の光像に対応するＸＺ画像データを複数取得する画像取得ステップと、
    前記複数のＸＺ画像データに基づいて前記試料のＸＹ画像データを生成する画像生成ステップと、を備え、
    前記画像取得ステップでは、前記ＸＺ画像データを前記Ｙ軸方向について複数取得し、
    前記画像生成ステップでは、前記ＸＺ画像データにおける解析領域を抽出し、少なくとも前記解析領域の輝度値をＺ軸方向に積算してＸ画像データを生成し、前記Ｘ画像データを前記Ｙ軸方向に結合して前記ＸＹ画像データを生成する試料観察方法。
  10. 前記画像生成ステップにおいて、少なくとも前記解析領域に対してダークオフセット減算を実行した後に前記解析領域の輝度値を前記Ｚ軸方向に積算する請求項９記載の試料観察方法。
  11. 前記画像生成ステップにおいて、前記解析領域以外の領域の輝度値を低減し、前記ＸＺ画像データの輝度値をＺ軸方向に積算して前記Ｘ画像データを生成する請求項９又は１０記載の試料観察方法。
  12. 前記画像生成ステップにおいて、前記解析領域のみの輝度値をＺ軸方向に積算して前記Ｘ画像データを生成する請求項９又は１０記載の試料観察方法。
  13. 前記画像取得ステップにおいて、前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度を１０°〜８０°とする請求項９〜１２のいずれか一項記載の試料観察方法。
  14. 前記画像取得ステップにおいて、前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度を２０°〜７０°とする請求項９〜１３のいずれか一項記載の試料観察方法。
  15. 前記画像取得ステップにおいて、前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度を３０°〜６５°とする請求項９〜１４のいずれか一項記載の試料観察方法。
  16. 前記ＸＹ画像データを含む観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析ステップを更に備える請求項９〜１５のいずれか一項記載の試料観察方法。
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