JP2019149996A - 貝類のノロウイルス不活化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この場合に、貝類由来の食中毒対策として、大腸菌,腸炎ビブリオ菌及びノロウイルス等の洗浄浄化,殺菌等の処理が出荷前に行われている。
特に牡蠣は消化器官である中腸線を含む牡蠣全部分を生食として摂取するため、牡蠣の中腸線に蓄積したノロウイルスがヒトの腸粘膜細胞に感染・増殖することに伴って、下痢や嘔吐、発熱等の胃腸炎症状が誘起される。
ノロウイルスの感染力は、ヒトが10〜100個程度のウイルスを摂取したのみで発症する非常に感染力の強いウイルスである。
実際、食中毒症状を訴える者の吐瀉物に菌類が検出されない場合、ノロウイルスが検出されることが多い。
また、従来の次亜塩素酸ソーダ等による殺菌方法は、遊離残留塩素濃度が10〜20ppmという高い濃度液においても、ノロウイルスを十分死滅させることが出来ないこと、海水中の有機物により塩素活性が失活すること、貝類の体内においても同様に有機物によって塩素活性が失活するため十分な対策ではない。
従って、海水中及び貝殻表面や剥き貝の表面の殺菌はある程度行えるものの、貝体内の殺菌を行うことができない。
すなわち、従来の方法は、貝類の体内に取り込まれているノロウイルスを排出させてウイルス量を減少させるものであって、貝類の体内に存在するノロウイルスを充分に不活化できるものではなかった。
しかし、同公報に開示する技術も牡蠣の体内に取り込まれているノロウイルスを不活化できるものではない。
これにより、貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できる。
この場合に、抗ノロウイルス抗体は水溶性蛋白質からなる免疫グロブリンであるのが好ましい。
ノロウイルスに属するウイルスは、Genogroup I(GI)と、Genogroup II(GII)の2つの遺伝子群に分類されている。
また、(GI)はさらに14の遺伝子型に分類され、(GII)は17の遺伝子型に分類され、極めて多様性を持った集団として存在する。
また、新しい遺伝子型も存在しているとみられている。
ノロウイルスのゲノムは、ORF1〜3の3つのオープンリーディングフレームを有し、ORF1は非構造蛋白質であり、ORF2は構造蛋白質となっており、このORF2はウイルスのカプシドを構成している。
このようにして作出したVLPは、構造がノロウイルスそのものであり、ウイルス粒子と同等の抗原性を有するが、内部にゲノムRNAを持たず中空で感染性がない。
そこで、バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させたノロウイルス様粒子(VLP:Virus like particle)を鳥類又は哺乳類に接種して得られたポリクローナル抗体を貝類のノロウイルス不活化に使用する方法に特徴がある。
一定間隔期間ごとに追加接種することで抗体力価・高アフィニティーを維持させることができる。
この水溶性蛋白質である抗ノロウイルス抗体は、塩化ナトリウム水溶液や清浄海水にて溶解状態でも安定化する。
貝類を浸漬した浄化用水槽の海水に抗ノロウイルス抗体溶液を直接投入し、貝類が海水の濾水活動条件である通気や海水温度を維持し1晩蓄養させるとよい。
貝類の飼育槽や出荷前の浄化過程における蓄養タンクの飼育水中に抗ノロウイルス抗体を投入することで、貝類表面に付着したノロウイルス及び、貝類から排出されて飼育水に浮遊するノロウイルスの感染性を確実に不活化することに加えて、従来の方法では実現できなかった貝類の体内に蓄積したノロウイルス及び、貝類から排出された糞中に含まれるノロウイルスの感染性も確実に不活化できる。
本来抗体は、生体の免疫防御システムにおいて、生体内、消化管内にて病原体の感染・増殖を阻止する機能を持つ蛋白質である。
また、抗体の大きな特徴に、一つの抗体が決まった抗原だけにしか反応しない特異性があり、「鍵と鍵穴の関係」に例えられるほど抗原抗体反応のアフィニティーや結合力が強く簡単に解離しない。
抗体は、貝類の体内においても高い活性と安定性を示す。
抗体の特異的作用により貝類の組織に作用せず、ヒトの食品として貝類の品質を低下させない。
貝類の体内に抗体が含まれた状態でヒトに食されても安全である。
逆に抗ノロウイルス抗体が含まれる貝類は、ノロウイルス感染症を予防するサプリメントともいえる。
また、抗体が含まれていても貝類本来の甘味や風味に影響を与えない。
仮に新たな遺伝型のノロウイルスが出現した場合、同様にその遺伝型VLPをバキュロウイルス発現系にて作出し、追加して動物への接種抗原とすることで迅速に対応できる。
抗ノロウイルス抗体を含む飼育水を循環と通気(空気を通すこと)させて貝類に呼吸をさせて、貝類の体内に飼育水と共に抗ノロウイルス抗体を取り込みさせる。
この浸漬時間は16〜24時間である。
遺伝子組換え技術で発現させたノロウイルスVLPとオイルアジュバント混和物を産卵鶏の胸筋内に接種し、接種鶏が産卵した卵の卵黄より抗ノロウイルス抗体を含有するポリクローナル抗体を抽出した。
評価試験に用いる陰性コントロール抗体は、通常飼育産卵鶏が産卵した卵の卵黄よりポリクローナル抗体を抽出した。
ノロウイルスの感染は、ノロウイルス受容体であるHBGAへの結合が重要とされている。
ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorvent Assay)を用いて抗ノロウイルス抗体のノロウイルスVLPのHBGA結合阻害を測定した。
ELISA用96ウエルプレートにA型,O型,B型の各血液型のHBGAを一晩吸着固相化させた後、PBS−Tで3回洗浄し、スキムミルクPBS−Tを分注して1時間ブロッキングし、PBS−Tで3回洗浄した。
抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体を400μg/mLから1.563μg/mL濃度まで2倍階段希釈した希釈系列抗体液とノロウイルスGII.4株VLP 1μg/mL(ノロウイルス粒子数として5.5×1010個/mL)を等量混合し1時間反応させた各混合溶液100μLをウエルに分注して1時間反応させた後、PBS−Tで4回洗浄した。
抗ノロウイルスVLPマウスIgG標識抗体を各ウエルに分注し1時間反応後、PBS−Tで4回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して30分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させ、OD値を測定した。
抗ノロウイルス抗体によるHBGAへの結合阻害はノロウイルスの非感染性に付与しており、ノロウイルスを不活化したこととなる。
ELISA用96ウエルプレートに各遺伝子型ノロウイルスVLPを一晩吸着固相化させた後、PBS−Tで3回洗浄し、スキムミルクPBS−Tを分注して1時間ブロッキングし、PBS−Tで3回洗浄した。
抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体の2倍階段希釈液を100μL各ウエルに分注して1時間反応させた後、PBS−Tで4回洗浄した。抗ニワトリIgG標識抗体を各ウエルに分注し1時間反応後、PBS−Tで4回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して30分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させ、OD値を測定した。
陰性コントロール抗体のOD値(0.086)に対して2倍以上であるOD値0.100以上を陽性とし、陽性を示す抗体希釈液の最大希釈倍数の逆数を抗体価とした。
その結果を図2のグラフに示す。
ノロウイルスの不活化に有効な消毒剤として次亜塩素酸ナトリウムをあげているが、有機物存在下では不活化効果が著しく消失する。
そこで、有機物存在下における抗ノロウイルス抗体のノロウイルス不活化評価試験を実施した。
牡蠣中腸線内容物を10%濃度として懸濁したリン酸緩衝液にノロウイルスVLPをウイルス粒子数相当として、5.5×1010/mL、5.5×109/mL、5.5×108/mL、5.5×107/mL、5.5×106/mLの各濃度になるよう添加して調製した。
10%牡蠣中腸線内容物リン酸緩衝液にノロウイルスVLP各濃度を添加した溶液100μLを体外診断用医薬品ノロウイルス抗原キット「イムノキャッチ−ノロ」にアプライして、ノロウイルス抗原の有無の判定を行い、本キットの検出限界値を求めた。
次に、ノロウイルスVLP 5.5×1010/mL濃度添加の10%牡蠣中腸線内容物リン酸緩衝液と抗ノロウイルス抗体10mg/mLリン酸緩衝液を1:1で混合し30秒後に、本キットにアプライしてノロウイルス抗原の有無の判定を行った。
同様にノロウイルスVLP 5.5×107/mL濃度溶液と抗ノロウイルス抗体0.01mg/mLリン酸緩衝液を1:1で混合し同様に30秒後に、本キットにアプライしてノロウイルス抗原の有無の判定を行った。
その結果を下記表1に示す。
抗ノロウイルス抗体は、有機物存在下においても僅か30秒の反応時間で、抗ノロウイルス抗体10mg/mLでノロウイルスVLP 5.5×1010/mLを、抗ノロウイルス抗体0.01mg/mLでノロウイルスVLP 5.5×107/mLを検出限界以下とした。
すなわち、抗ノロウイルス抗体は、有機物存在下でも瞬時にウイルスに特異的に結合しノロウイルスの抗原性をなくしたことから、ノロウイルスの感染性を不活化したことになる。
食用として流通できるマガキを濾過海水でかけ流し48時間以上無給餌に置いたマガキを被験貝として用いた。
人工海水で12時間通気撹拌し十分な酸素濃度のある人工海水にノロウイルスVLPを0.01ng/mL(ノロウイルス5.5×105個/mL相当)濃度になるように添加してよく撹拌した後、2つの水槽に同量ずつ分けた。
各水槽に総重量が同程度になるようマガキ11個/水槽を投入し24時間飼育後、抗ノロウイルス抗体または陰性コントロール抗体を水槽に添加して通気撹拌しながらさらに24時間飼育した。
開殻して軟体部を取り出し、さらに中腸線を採材乳剤化して分析サンプルとした。
また、飼育海水及び、マガキが排泄した糞または代謝物等を回収して分析を行った。
海水に添加した抗体を牡蠣が体内に取り込み消化器官内(中腸線)に滞留していることの確認試験として、ELISA法を用いて中腸線内の抗体量を定量した。
抗ニワトリIgGヤギIgGをELISA用96ウエルプレートに一晩吸着固相化させた後、PBS−Tで3回洗浄し、BSA−PBS−Tを分注して1時間ブロッキングし、PBS−Tで3回洗浄した。
中腸線乳剤または、抗体添加海水(飼育水)及び、検量線用の既知ニワトリIgGを適性濃度に希釈して100μLをウエルに分注して1時間反応させた後、PBS−Tで4回洗浄した。
抗ニワトリIgGヤギIgG標識抗体を各ウエルに分注し1時間反応後、PBS−Tで4回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して30分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させOD値を測定し、検量線より総ニワトリIgG抗体濃度を算出した。
その結果を下記表2に示す。
また、牡蠣から排泄された糞(代謝物を含む)からの抗体が検出され、海水中の抗体を取り込み消化器官内に滞留することが確認された。
抗ノロウイルスVLP IgGをELISA用96ウエルプレートに一晩吸着固相化させた後、PBS−Tで3回洗浄し、SM−PBS−Tを分注して1時間ブロッキングし、PBS−Tで3回洗浄した。
中腸線乳剤または、抗体添加海水(飼育水)及び、検量線用の既知ノロウイルスVLPを適性濃度に希釈して100μLをウエルに分注して1時間反応させた後、PBS−Tで4回洗浄した。
抗ノロウイルスVLPモルモットIgGを各ウエルに分注し1時間反応後、PBS−Tで4回洗浄後、抗モルモットIgG標識抗体を各ウエルに分注し1時間反応後、PBS−Tで4回洗浄後、発色試薬を各ウエルに分注して30分間呈色反応させて、各ウエルに停止液を分注して呈色反応を停止させOD値を測定し、検量線よりノロウイルスVLP濃度を算出した。
その結果を下記表2に示す。
また、海水中に排泄された糞1gあたり2.75×107が検出された。
抗ノロウイルスVLP抗体を添加した海水で飼育した試験区の牡蠣11検体の全検体の中腸線及び、海水中に排泄された糞のからノロウイルスVLPは検出されず検出限界以下であった。
また、モノクローナル抗体ではなく、鳥類または哺乳類が産生するポリクローナル抗体とすることで、安価に大量製造できること、貝類生産現場においては、貝類の浄化用の浄化水を貯留した浄化槽に抗ノロウイルス抗体溶液を投入し一晩浸漬飼育させるのみと簡易的かつ汎用性が高いことから迅速な普及が期待される。
Claims (4)
- 抗ノロウイルス抗体を投入した飼育水を用いて貝類を飼育することを特徴とする貝類のノロウイルス不活化方法。
- 貝類に含まれるノロウイルスのみならず、貝類表面に付着したノロウイルス及び飼育水中に浮遊するノロウイルスも合せて不活化できることを特徴とする請求項1記載の貝類のノロウイルス不活化方法。
- 前記抗ノロウイルス抗体は水溶性蛋白質からなる免疫グロブリンであることを特徴とする請求項1又は2記載の貝類のノロウイルス不活化方法。
- バキュロウイルス発現系を用いて昆虫細胞で発現させたノロウイルス様粒子(VLP:Virus like particle)を鳥類又は哺乳類に接種して得られたポリクローナル抗体を貝類のノロウイルス不活化に使用する方法。
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