JP2019089799A - トランスチレチン（ＴＴＲ）関連眼アミロイドーシスのためのｓｉＲＮＡ療法 - Google Patents

トランスチレチン（ＴＴＲ）関連眼アミロイドーシスのためのｓｉＲＮＡ療法 Download PDF

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Abstract

【課題】眼アミロイドーシスの治療方法の提供。【解決手段】トランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子を標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を、対象の網膜色素上皮に投与することによって、その対象におけるＴＴＲの発現を低下させ、それにより眼アミロイドーシスを治療する方法。好ましくは、コレステロール分子にコンジュゲートされたｄｓＲＮＡを投与する方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ｓｉＲＮＡによるＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを治療するための方法に関する。
関連出願への相互参照
本願は、２０１０年３月２９日出願の米国仮出願第６１／３１８，７０４号、および２０１０年３月２９日出願の米国仮出願第６１／３１８，７０２号の利益を主張し、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表への言及
本願は、２０１１年＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿に作成された、＿＿＿＿＿＿＿＿バイトの大きさで、＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿．ｔｘｔと名づけられたテキストファイルとして、電子的に提出された配列表を含む。該配列表は、参照により組み込まれる。
トランスチレチン（ＴＴＲ）は、分泌された甲状腺ホルモン結合タンパク質である。ＴＴＲは、血漿および脳脊髄液中のレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）／ビタミンＡ、および血清チロキシン（Ｔ４）に結合し、輸送する。
通常配列のＴＴＲおよび変異配列ＴＴＲは共に、アミロイドーシスを引き起こす。通常配列のＴＴＲは、高齢者における心アミロイドーシスを引き起こし、これは老年性全身アミロイドーシス（ＳＳＡ）（老年性心アミロイドーシス（ＳＣＡ）とも呼ばれる）と称される。ＳＳＡは、しばしば、多くの他の器官において、微細な沈着物を伴う。ＴＴＲの変異は、ＴＴＲのアミロイド形成の過程を加速し、臨床的意義のあるＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ（アミロイドーシス−トランスチレチン型）とも呼ばれる）の発症に対する最も重要な危険因子である。８５個以上のアミロイド生成性ＴＴＲ変異体が、全身家族性アミロイドーシスを引き起こすことが知られる。肝臓は、ＴＴＲの発現の主要部位である。発現の他の重要な部位には、脈絡叢、網膜、および膵臓が含まれる。
ＴＴＲアミロイドーシスは、種々の形態で現れる。末梢神経系が、さらに著しく影響を受ける場合、該疾患は、家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）と称される。心臓が主に関与するが、神経系は関与しない場合、該疾患は、家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）と称される。ＴＴＲアミロイドーシスの第３の主要型は、髄膜／ＣＮＳ（中秋神経系）アミロイドーシスと称される。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、高度に保存された調節機序で遺伝子発現を遮断することが示されている。国際公開ＷＯ第９９／３２６１９号（Ｆｉｒｅら）は、線虫における遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示している。また、ｄｓＲＮＡは、植物（例えば、国際公開ＷＯ第９９／５３０５０号、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、および国際公開ＷＯ第９９／６１６３１号、Ｈｅｉｆｅｔｚらを参照）、ショウジョウバエ（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００）、ならびに哺乳動物（国際公開ＷＯ第００／４４８９５号、Ｌｉｍｍｅｒ、および独国特許ＤＥ第１０１ ００ ５８６．５号、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらを参照）を含む、他の生物において標的ＲＮＡを分解することが示されている。
米国特許第２００７０２０７９７４号は、機能性および過機能性ｓｉＲＮＡを開示する。米国特許第２００９００８２３００号は、ＴＴＲを対象とするアンチセンス分子を開示する。米国特許第７，２５０，４９６号は、ＴＴＲを対象とするミクロＲＮＡを開示する。
本発明は、十分な量の二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を対象の網膜に投与することによって、対象の網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるトランスチレチン（ＴＴＲ）の発現を低下させるための方法を提供する。幾つかの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４またはＡＤ−１８５３４である。ｄｓＲＮＡは、例えば、コレステロールにコンジュゲート（conjugate）させることができる。
一実施形態において、対象は、ヒトである。別の実施形態において、対象は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするヒトである。また別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である。関連実施形態において、本方法は、ＲＰＥにおけるＴＴＲの発現の低下をもたらす。別の関連実施形態において、本方法は、対照と比較して少なくとも４０％または少なくとも６０％の、ＴＴＲのｍＲＮＡ発現の低下をもたらす。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、ヒトにおいて、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。
別の実施形態において、対象は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするＡＴＴＲ（アミロイド生成性トランスチレチン）のＶ３０Ｍ遺伝子を有するヒトである。一実施形態において、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ対象に投与されるｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である。関連実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるＶ３０ＭのＴＴＲの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも６０％のＶ３０ＭのＴＴＲのｍＲＮＡの発現の低下をもたらす。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ遺伝子を有するヒトにおいて、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定される炎症反応をもたらさない。
別の実施形態において、対象は、ダークアグーチ（Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ）（ＤＡ）ラットである。一実施形態において、ＤＡラットに投与されるｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８５３４である。別の実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるＴＴＲの発現の低下をもたらす。また別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも６０％のＴＴＲのｍＲＮＡの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、ＤＡラットにおいて、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定される炎症反応をもたらさない。
幾つかの実施形態において、対象は、ヒトＡＴＴＲ（アミロイド生成性トランスチレチン）のＶ３０Ｍ遺伝子を有するトランスジェニックラットである。一実施形態において、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍトランスジェニックラットに投与されるｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である。関連実施形態において、本方法は、網膜色素上皮におけるＴＴＲの発現の低下をもたらす。別の実施形態において、本方法は、対照と比較して、少なくとも６０％のＴＴＲのｍＲＮＡの発現の低下をもたらす。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、ＡＴＴＲ Ｖ３０Ｍ Ｔｇラットにおいて、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。
一実施形態において、本発明は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のＡＤ−１８３２４を、該患者の網膜に投与することによって、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを治療、予防、または管理するための方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は、ヒトを治療する方法を提供し、本方法は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されるヒトを同定することと、該ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のＡＤ−１８３２４を該ヒトの網膜に投与することと、を含む。
関連実施形態において、本発明は、網膜上皮細胞内のＴＴＲの発現を阻害するための方法を含み、本方法は、（ａ）ＡＤ−１８３２４またはＡＤ−１８５３４であるｄｓＲＮＡを該網膜上皮細胞に導入することと、（ｂ）ステップ（ａ）において産生された該細胞を、ＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間維持し、それによって、該細胞内の該ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害することと、を含む。一実施形態において、本方法において投与されるｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である。幾つかの実施形態において、網膜上皮細胞は、ヒト網膜色素上皮トランスジェニック細胞である。別の実施形態において、本方法は、少なくとも１０％、４０％、または少なくとも６０％のＴＴＲの発現の阻害をもたらす。関連実施形態において、該網膜上皮細胞への該ｄｓＲＮＡの導入は、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定される場合、炎症反応をもたらさない。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に説明される。本発明の他の特長、目的、利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から明らかとなる。
ＴＴＲのｓｉＲＮＡでのトランスフェクション後、培養したヒトＰＢＭＣにおける、ＴＮＦαおよびＩＦＮαレベルのグラフである。 ＨｅｐＧ２細胞内のＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８のそれぞれにおける用量反応曲線である。 ＨｅｐＧ２細胞内のＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８のそれぞれにおける用量反応曲線である。 ＨｅｐＧ２細胞内のＡＤ−１８２４６における用量反応曲線である。 ＬＮＰ０１に製剤化されたＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、およびＡＤ−１８２４６）の静脈内ボーラス投与による、トランスジェニックＨ１２９−ｍＴＴＲ−ＫＯ／ｉＮＯＳ−ＫＯ／ｈＴＴＲマウスにおける、肝臓ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。 ＬＮＰ０１に製剤化されたＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、およびＡＤ−１８２４６）の静脈内ボーラス投与による、トランスジェニックＨ１２９−ｍＴＴＲ−ＫＯ／ｉＮＯＳ−ＫＯ／ｈＴＴＲマウスにおける、肝臓ｍＲＮＡおよび血漿タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。 ＳＮＡＬＰに製剤化されたＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８）の１５分間の静脈内注入後の非ヒト霊長類の肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定の概要を示すグラフである。 図６Aおよび図６Bは、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の静脈内ボーラス投与によるトランスジェニックマウスにおける、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。群平均が決定され、ＰＢＳ対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。ＰＢＳと比較した、群平均の低下の割合（％）が、ＳＮＡＬＰ−１９５５およびＳＮＡＬＰ−１８３２８群に対して示される。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎの事後検定） 図６Aおよび図６Bは、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の静脈内ボーラス投与によるトランスジェニックマウスにおける、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの阻害を示す。群平均が決定され、ＰＢＳ対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。ＰＢＳと比較した、群平均の低下の割合（％）が、ＳＮＡＬＰ−１９５５およびＳＮＡＬＰ−１８３２８群に対して示される。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎの事後検定） 図７Aおよび図７Bは、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回静脈内ボーラス投与から２２日にわたる、トランスジェニックマウスにおける、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの低下の持続性を示す。群平均を決定した。ＴＴＲ／ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは、０日目のレベルに正規化され、プロットされた。各時点におけるＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して、正規化されたＴＴＲのｍＲＮＡレベルの割合の低下が、算出され、ＳＮＡＬＰ−１８３２８群に対して示される。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎの事後検定） 図７Aおよび図７Bは、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回静脈内ボーラス投与から２２日にわたる、トランスジェニックマウスにおける、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの低下の持続性を示す。群平均を決定した。ＴＴＲ／ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは、０日目のレベルに正規化され、プロットされた。各時点におけるＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して、正規化されたＴＴＲのｍＲＮＡレベルの割合の低下が、算出され、ＳＮＡＬＰ−１８３２８群に対して示される。（＊＊＊ｐ＜０．００１、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＤｕｎｎの事後検定） ＳＮＡＬＰ−１８３２８の１５分間の単回静脈内注入から１４日にわたる、非ヒト霊長類における、ＴＴＲの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。 ＳＮＡＬＰ−１８３２８の静脈内ボーラス投与後の、ヒトＶ３０Ｍ ＴＴＲ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウスの種々の組織中のＴＴＲ−免疫反応性の低下を示す。Ｅ：食道、Ｓ：胃、Ｉ１：腸／十二指腸、Ｉ４：腸／結腸、Ｎ：神経、Ｄ：後根神経節。 ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８の１５分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定値を示す。 図１１Aおよび図１１Bは、ＬＮＰ０９−１８３２８またはＬＮＰ１１−１８３２８の１５分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。図１１Ｃは、ＰＢＳ対照群と比較した時の、０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８３２８の１５分間の静脈内注入から２８日間にわたる、ＴＴＲの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。 図１１Aおよび図１１Bは、ＬＮＰ０９−１８３２８またはＬＮＰ１１−１８３２８の１５分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。図１１Ｃは、ＰＢＳ対照群と比較した時の、０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８３２８の１５分間の静脈内注入から２８日間にわたる、ＴＴＲの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。 図１１Aおよび図１１Bは、ＬＮＰ０９−１８３２８またはＬＮＰ１１−１８３２８の１５分間の静脈内注入後の、非ヒト霊長類の肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルのそれぞれの測定値を示す。図１１Ｃは、ＰＢＳ対照群と比較した時の、０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８３２８の１５分間の静脈内注入から２８日間にわたる、ＴＴＲの血清タンパク質レベルの時間経過を示す。 ヒトＴＴＲのｍＲＮＡ（参照配列ＮＭ＿０００３７１．３、配列番号１３３１）の配列を示す。 図１３Aおよび図１３Bは、ヒトおよびラットＴＴＲのｍＲＮＡのそれぞれの配列である。図１３Ａは、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０００３７１．２、配列番号１３２９）である。図１３Ｂは、ラットＴＴＲのｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０１２６８１．１、配列番号１３３０）である。 図１３Aおよび図１３Bは、ヒトおよびラットＴＴＲのｍＲＮＡのそれぞれの配列である。図１３Ａは、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０００３７１．２、配列番号１３２９）である。図１３Ｂは、ラットＴＴＲのｍＲＮＡの配列（参照配列ＮＭ＿０１２６８１．１、配列番号１３３０）である。 ＮＭ＿０００３７１．３、ＮＭ＿０００３７１．２、およびＡＤ−１８３２８のヌクレオチドアライメントを示す。 家族性アミロイド神経障害、家族性アミロイド心筋症、およびＣＮＳアミロイドーシスと関連するＴＴＲにおける、症状および変異を図示する。 異なるＴＴＲの注入継続時間での、ＳＮＡＬＰ−１８５３４を用いた肝臓中のｍＲＮＡレベルの低下を示す。動物群（ｎ＝４／群）は、１５分間、または１、２、または３時間の注入を介して１ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１８５３４を投与した。４８時間後、ラットは、安楽死させ、肝臓が採集された。ＴＴＲおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルが、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ｂＤＮＡアッセイを使用して、肝臓溶解物から測定された。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルとの比が、各動物について算出された。群平均が決定され、ＰＢＳ対照群に正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。（＊＊＊ｐ＜０．００１、ＰＢＳと比較した、一元配置ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定） ＬＮＰ０７−１８５３４またはＬＮＰ０８−１８５３４の１５分間の静脈内注入後の、ラットの肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの測定値を示す。 ＬＮＰ０９−１８５３４またはＬＮＰ１１−１８５３４の１５分間の静脈内注入後の、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの肝臓中の内因性ＴＴＲのｍＲＮＡレベルのインビボ阻害を示す。動物群（ｎ＝４／群）は、１５分間の注入を介して、０．０１、０．０３、０．１、または０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８５３４、ＬＮＰ−１１−１８５３４、またはＰＢＳを静脈内に投与した。４８時間後、動物は、安楽死させ、肝臓を採集した。ＴＴＲおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ｂＤＮＡアッセイを使用して、肝臓生検の溶解物から測定した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルとＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルとの比が、各動物について算出された。群平均が決定され、ＰＢＳ対照群に対して正規化され、次いで、プロットされた。エラーバーは標準偏差を示す。 非ヒト霊長類における、ＴＴＲを標的とするＬＮＰ１２に製剤化したｓｉＲＮＡの有効性を示す。データ点は、群平均±標準偏差を示す。 ＡＬＮ−ＴＴＲ０１によるｍＲＮＡの抑制の持続性を示すＮＨＰにおけるＧＬＰ研究からの結果を有するグラフである。 ＳＮＡＬＰ−１８３２８（ＡＬＮ−ＴＴＲ０１）の静脈内ボーラス投与後の、成熟動物（ｈＶ３０Ｍ ＴＴＲ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウス）の種々の組織中のＴＴＲの沈着物の後退を示すグラフである。 ＡＲＰＥ １９細胞におけるＴＴＲのｍＲＮＡの発現へのヒトＴＴＲのｓｉＲＮＡのＡＤ−１８３２４の効果を示すグラフである。ＡＤ−１８３２４は、ラットＴＴＲのｓｉＲＮＡのＡＤ−１８５３４と比較された。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ヒトＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。 ダークアグーチ（ＤＡ）ラットの網膜色素上皮細胞におけるＴＴＲのｍＲＮＡの発現へのＡＤ−１８５３４の効果を示すグラフである。ＡＤ−１８５３４は、対照ｓｉＲＮＡ群、生理食塩水群、および非処置群と比較された。内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。 ＡＴＴＲ Ｖ３０Ｍトランスジェニックラットの網膜色素上皮細胞におけるＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現へのＡＤ−１８３２４の効果を示すグラフである。ＡＤ−１８３２４は、対照ｓｉＲＮＡ群、生理食塩水群、および非処置群と比較された。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。 対照ｓｉＲＮＡと比較した、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍトランスジェニックラットの網膜色素上皮細胞におけるヒトＴＴＲタンパク質発現へのヒトＴＴＲのｓｉＲＮＡの効果を示すウエスタンブロット法である。 投与から１４日および２１日後の、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットの網膜色素上皮細胞におけるラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現へのＡＤ−２３０４３（ｃｈｏ−ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ）の効果を示すグラフである。内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。 投与から２１日後の、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットの網膜色素上皮細胞におけるラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現へのＡＤ−２３０４３（ｃｈｏ−ＴＴＲ ｓｉＲＮＡ）の効果を示すグラフである。内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。
発明の詳細な説明
本発明は、ｄｓＲＮＡ、およびｄｓＲＮＡがＴＴＲ遺伝子を標的とする、細胞または哺乳動物における、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡを使用する方法を提供する。本発明はまた、ＴＴＲ遺伝子の発現によって引き起こされる、哺乳動物における、ＴＴＲアミロイドーシス等の病態および疾患を治療するための、組成物および方法も提供する。ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる過程を通じてｍＲＮＡの配列に特異的な分解を導く。
本明細書で取り上げられる組成物のｄｓＲＮＡは、３０ヌクレオチド長未満、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長である、領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）を含み、ＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である。これらのｄｓＲＮＡの使用は、哺乳動物における、ＴＴＲの発現に関連する病理学に関係している遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能にする。特に、ＴＴＲのｄｓＲＮＡの非常に低い投薬量は、特異的かつ効率的にＲＮＡｉを媒介することができ、ＴＴＲ遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす。細胞に基づくアッセイを用いて、本発明者は、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡが、ＲＮＡｉを特異的かつ効率的に媒介することができ、ＴＴＲ遺伝子の発現の著しい阻害をもたらす事を実証した。したがって、これらのｄｓＲＮＡを含む方法および組成物は、肝臓疾患またはＴＴＲアミロイドーシス、例えば、ＦＡＰの治療において等、ＴＴＲを下方調節することによって媒介され得る病理過程を治療するのに有用である。
ＴＴＲのｄｓＲＮＡを含有する方法および組成物は、ＴＴＲアミロイドーシス等のＴＴＲの発現によって媒介される病理過程を治療するのに有用である。１つの実施形態において、ＴＴＲの発現によって媒介される障害を治療する方法には、ＴＴＲを標的とした、治療上有効な量のｄｓＲＮＡを、かかる処置を必要とするヒトに投与することが含まれる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．１、０．５、１．０、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍｇ／ｋｇで、ヒトに投与される。
以下の詳細な説明は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための、ｄｓＲＮＡを含有する組成物の作製方法および使用方法、ならびにこの遺伝子の発現によって引き起こされる疾患および障害を治療するための、組成物および方法を開示する。本発明で取り上げられる医薬組成物は、薬剤として許容される担体と共に、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＴＴＲ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡを含む。また、本発明で取り上げられる医薬組成物は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、ＴＴＲ遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、相補性の領域を有するアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡも含む。
ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、本明細書に開示されるセンス鎖のいずれかの１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、本明細書に開示されるアンチセンス鎖のいずれかの１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むことができる。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、５′−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、および／またはコレステリル誘導体基またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合される末端ヌクレオチドを含むことができる。１つの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、２′−デオキシ−２′−フルオロ修飾ヌクレオチド、２′−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックされたヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２′−アミノ−修飾ヌクレオチド、２′−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、および／またはヌクレオチドを有する非天然塩基を含むことができる。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの該相補性の領域は、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。１つの実施形態において、該相補性の領域は、配列番号１６９の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれ以上のヌクレオチド長である。１つの実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、７、および１６から選択される、センス鎖、または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１個のそのヌクレオチドフラグメント、ならびに表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、７、および１６から選択される、アンチセンス鎖、または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１個のそのヌクレオチドフラグメントを含む。
１つの実施形態において、細胞へのｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％もしくはそれ以上の阻害をもたらす。１つの実施形態において、細胞へのｄｓＲＮＡの投与は、リアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の約４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。１つの実施形態において、細胞へのｄｓＲＮＡの投与は、分岐ＤＮＡアッセイによって測定した場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。１つの実施形態において、細胞へのｄｓＲＮＡの投与は、分岐ＤＮＡアッセイによって測定した場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の約４０％〜４５％、４５％〜５０％、５０％〜５５％、５５％〜６０％、６０％〜６５％、６５％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、もしくはそれ以上の阻害をもたらす。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｐＭ、０．１ｐＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、または１０００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、約０．０１、０．１、１、５、または１０ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０を有する。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、カニクイザルにおける、ＴＴＲのｍＲＮＡを約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上低下させることができる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上、または血清ＴＴＲのタンパク質レベルを、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上低下させる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡの投与は、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベル、および／または血清ＴＴＲのタンパク質レベルを最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５日、もしくはそれ以上の日数、低下させる。
１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＬＮＰ製剤に製剤化され、ＰＢＣ対照群と比較して、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、もしくは１ｍｇ／ｋｇの用量で、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上低下させる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ＬＮＰ製剤に製剤化され、ウエスタンブロットによって測定した場合、ＰＢＣ対照群と比較して、ＴＴＲのタンパク質レベルを、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくはそれ以上低下させる。１つの実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｍｇ／ｋｇで、それを必要とする対象に投与する時、処置してから最長１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５日目まで、血清ＴＴＲのタンパク質レベルを抑制する。
したがって、幾つかの態様において、ＴＴＲのｄｓＲＮＡおよび薬剤として許容される担体を含有する医薬組成物、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するために組成物を使用する方法、およびＴＴＲ遺伝子の発現によって引き起こされる疾患を治療するために医薬組成物を使用する方法が、本発明で取り上げられる。
Ｉ． 定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される、特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分の用語の用法と、本項で提供されるその定義との間に明らかな相違がある場合、本項の定義が優先される。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」のそれぞれは、一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書で交換可能に使用され、核酸塩基がチミン、例えば、デオキシリボチミン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｔｈｙｍｉｎｅ）である、デオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、以下でさらに詳述する修飾ヌクレオチド、または代替の置換部分も指すことができることが理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルが、かかる置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換可能であることを十分認識している。例えば、限定されないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対を形成することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドと置換され得る。かかる置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
本明細書で使用される、「トランスチレチン」（「ＴＴＲ」）とは、細胞内の遺伝子を指す。ＴＴＲはまた、ＡＴＴＲ、ＨｓＴ２６５１、ＰＡＬＢ、プレアルブミン、ＴＢＰＡ、およびトランスチレチン（プレアルブミン、アミロイドーシスＩ型）としても知られている。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡ転写物の配列は、ＮＭ＿０００３７１で見出され得る。マウスＴＴＲのｍＲＮＡの配列は、ＮＭ＿０１３６９７．２で見出され得、ラットＴＴＲのｍＲＮＡ配列は、ＮＭ＿０１２６８１．１で見出され得る。
本明細書で使用される、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＴＴＲ遺伝子の転写の間に形成される、ｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続する部分を指す。
本明細書で使用される、「配列を含む鎖」という用語は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して言及される配列によって説明される、ヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、別途記載のない限り、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される時の「相補的」という用語は、当業者には理解されるように、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１２〜１６時間５０℃もしくは７０℃、その後の洗浄を含み得る。生物内で遭遇され得る、生理的に適切な条件等の他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、２つの配列の相補性の試験に最も適切な、一連の条件を決定することができよう。
これには、第１および第２のヌクレオチド配列の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドに対する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの塩基対形成が含まれる。かかる配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」と呼ぶことができる。しかし、本明細書において、第１の配列が第２の配列に対して「実質的に相補的」であると言われる場合、２つの配列は完全に相補的であり得るか、あるいはそれらの最終的な用途に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しながら、ハイブリダイズ時に、１個以上であるが、一般に４、３、または２個を超えないミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイズ時に１つ以上の単鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合、かかるオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとは見なされないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の目的上、やはり「完全に相補的」であるとして言及され得る。
また、本明細書で使用される、「相補的」な配列は、それらのハイブリダイズ能に関する上記の要件が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、および／または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対を含み得るか、または完全にそれらから形成され得る。かかる非ワトソンクリック塩基対には、Ｇ−Ｕゆらぎ（Wobble）またはフーグスティーン（Hoogstein）型塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書における「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、これらが使用される文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基一致に対して使用され得る。
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、５′ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３′ＵＴＲを含む、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に実質的に相補的である、ポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＴＴＲをコードするｍＲＮＡの中断されていない部分に実質的に相補的である場合、ＴＴＲのｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、２つの逆平行な、上記で定義されるように実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。一般に、各鎖のヌクレオチドの大半はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれもしくは両方の鎖は、少なくとも１個の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ｄｓＲＮＡ」は、複数のヌクレオチドでの大幅な修飾を含み、本明細書で開示されるか、または当該技術分野において既知であるあらゆる種類の修飾を含む、リボヌクレオチドへの化学修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子内で使用される、このようないずれの修飾も、本明細書および特許請求の範囲の目的上、「ｄｓＲＮＡ」によって包含される。
二重鎖構造を形成する２本の鎖は、より長い１つのＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいはそれらは別個のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖がより長い１つの分子の一部であり、したがって二重鎖構造を形成する１本の鎖の３′末端とそれぞれのもう一方の鎖の５′末端との間の中断されていないヌクレオチド鎖によって接続される場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と称される。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する１本の鎖の３′末端とそれぞれのもう一方の鎖の５′末端との間の、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合的に接続される場合、該接続構造は、「リンカー」と称される。該ＲＮＡ鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、二重鎖内に存在するいずれかのオーバーハングを差し引いた、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖内のヌクレオチド数である。二重鎖構造に加えて、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。また、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上に記載の通り、ｄｓＲＮＡを指すように本明細書に使用される。
本明細書で使用される、「ヌクレオチドオーバーハング」とは、不対ヌクレオチド、またはｄｓＲＮＡの１本の鎖の３′末端がもう一方の鎖の５′末端を越えて延びるか、またはその逆である時に、ｄｓＲＮＡの二重鎖構造から突出するヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡのその末端に不対ヌクレオチドがない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」ｄｓＲＮＡは、その長さ全体にわたって二本鎖であるｄｓＲＮＡであり、すなわち、該分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがない。
「アンチセンス鎖」という用語は、標的配列に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。本明細書で使用される、「相補性の領域」という用語は、配列、例えば本明細書において定義される標的配列に実質的に相補的である、アンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が標的配列に完全に相補的ではない場合、該ミスマッチは、該末端領域内に最も許容され、存在する場合、一般に、末端領域内、例えば、５′および／または３′末端の６、５、４、３、もしくは２ヌクレオチド内にある。
本明細書で使用される、「センス鎖」という用語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的である領域を含む、ｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、安定な核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｄｓＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡが転写されるプラスミド等の核酸を含む、少量の水性内部をコーティングする、脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号、第２００７０１３５３７２号、および２００８年４月１５日に出願の第ＵＳＳＮ６１／０４５，２２８号に説明されている。これらの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｄｓＲＮＡについて言及する際、「細胞への導入」とは、当業者には理解されるように、細胞への取り込みまたは吸収を促進することを意味する。ｄｓＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的な拡散過程もしくは活性な細胞過程を通じて、または補助的な薬剤もしくは装置によって発生し得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｄｓＲＮＡは、生命体の一部である「細胞に導入」することもできる。そのような場合、細胞への導入は、該生物への送達を含む。例えば、インビボ送達については、ｄｓＲＮＡを組織部位に注射するか、または全身投与することができる。細胞へのインビトロでの導入には、電気穿孔法およびリポフェクション法等の当該技術分野において既知の方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に説明されているか、または当該技術分野において既知である。
「発現停止させる（silence）」、「〜の発現を阻害する」、「〜の発現を下方制御する」、および「〜の発現を抑制する」等の用語は、それらがＴＴＲ遺伝子について言及する限り、本明細書において、第１の細胞もしくは細胞群と実質的に同一であるが、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように処置されていない第２の細胞もしくは細胞群（対照細胞）と比較して、ＴＴＲ遺伝子が転写され、ＴＴＲ遺伝子の発現が阻害されるように処置された第１の細胞もしくは細胞群から単離され得るｍＲＮＡの量の低下によって表した場合、ＴＴＲ遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、以下で表される。
［｛（対象細胞中のｍＲＮＡ）−（処理細胞中のｍＲＮＡ）｝／（対象細胞中のｍＲＮＡ）］・１００％
代替として、阻害の程度は、ＴＴＲ遺伝子の発現に機能的に結び付けられるパラメータ、例えば細胞によって分泌されるＴＴＲ遺伝子によってコードされるタンパク質の量、または特定の表現型、例えばアポトーシスを提示する細胞の数の低下に関して与えられてもよい。原則的に、ＴＴＲ遺伝子の発現停止は、構成的に、またはゲノム工学によってのいずれか、ならびに任意の適切なアッセイによって、該標的を発現する任意の細胞において決定することができる。しかし、あるｄｓＲＮＡが特定の程度、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害し、したがって本発明に包含されるかどうかを決定するために参照が必要とされる場合、以下の実施例で提供されるアッセイが、かかる参照の役割を果たす。
例えば、特定の場合において、ＴＴＲ遺伝子の発現は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。幾つかの実施形態において、ＴＴＲ遺伝子は、本発明で取り上げられる二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。
ＴＴＲの発現の文脈において本明細書で使用される、「治療する」、「治療」等の用語は、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程の軽減または緩和を指す。本発明の文脈において、本明細書で以下に列挙される他の病態のうちのいずれかに関連する限り（ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程以外）、「治療する」、「治療」等の用語は、かかる病態に関連する少なくとも１つの症状の軽減もしくは緩和、またはＦＡＰ等のＴＴＲアミロイドーシスの進行の遅延等の、かかる病態の進行の遅延もしくは逆行を意味する。ＴＴＲアミロイドーシスの症状には、神経障害（例えば、知覚障害、遠位部の感覚鈍麻）、自律性神経障害（例えば、胃潰瘍または起立性低血圧症等の胃腸障害）、運動神経障害、発作、認知症、ミエロパシー、多発性神経障害、手根管症候群、自律神経不全症、心筋症、硝子体混濁、腎不全、腎症、実質的に減少したｍＢＭＩ（修正ボディー・マス・インデックス）、脳神経障害、および角膜格子状変性が含まれる。
本明細書で使用される、「治療上有効な量」および「予防上有効な量」という句は、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程の処置、阻止、もしくは管理、またはＴＴＲの発現によって媒介される病理過程の明らかな症状において、治療的有用性を提供する量を指す。治療上有効である具体的な量は、普通の開業医が容易に決定することができ、例えば、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程の種類、患者の病歴および年齢、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程のステージ、ならびに他のＴＴＲの発現によって媒介される病理過程に抗する薬剤の投与等の、当該技術分野において既知の因子に依存して異なり得る。
本明細書で使用される、「医薬組成物」は、薬理学上有効な量のｄｓＲＮＡと、薬剤として許容される担体とを含む。本明細書で使用される、「薬理学上有効な量」、「治療上有効な量」、または単に「有効量」は、目的とする薬理学的、治療的、または阻止的結果を産生するのに効果的なＲＮＡの量を指す。例えば、ある臨床的治療が、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータにおいて、少なくとも２５％の低下がある時に有効であると見なされる場合、該疾患または障害を治療するための薬物の治療上有効な量は、該パラメータにおける少なくとも２５％の低下をもたらすために必要な量である。例えば、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、ＴＴＲの血清レベルを少なくとも２５％低下させることができる。別の例において、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡの治療上有効な量は、肝機能または腎機能を少なくとも２５％向上させることができる。
「薬剤として許容される担体」という用語は、治療薬を投与するための担体を指す。かかる担体には、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。該用語は、明確に、細胞培養基を除く。経口投与される薬物について、薬剤として許容される担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および防腐剤等の薬剤として許容される賦形剤が含まれるが、これらに限定されない。好適な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが含まれ、コーンスターチおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤にはデンプンおよびゼラチンを含むことができ、一方滑沢剤が存在する場合は、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクであろう。所望の場合、錠剤をモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の材料でコーティングして、消化管内での吸収を遅らせることができる。
本明細書で使用される、「形質転換細胞」は、ベクターが導入されて、そこからｄｓＲＮＡ分子を発現することができる細胞である。
ＩＩ． 二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明は、細胞または哺乳動物内、例えば、アミロイドーシスに罹患しているヒトのＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を提供し、該ｄｓＲＮＡは、ＴＴＲ遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である相補性の領域を有する、アンチセンス鎖を含み、該相補性の領域は、３０ヌクレオチド長未満、一般に１９〜２４ヌクレオチド長であり、該ｄｓＲＮＡは、該ＴＴＲ遺伝子を発現する細胞と接触すると、例えば、ＰＣＲまたは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、またはウエスタンブロット等によるタンパク質ベースの方法によってアッセイした場合、該ＴＴＲ遺伝子の発現を少なくとも３０％阻害する。ＴＴＲ遺伝子の発現は、以下の実施例で説明されるようにアッセイによって測定したとき、少なくとも３０％軽減され得る。例えば、Ｈｅｐ３Ｂ細胞等の細胞培養内のＴＴＲ遺伝子の発現は、ｂＤＮＡまたはＴａｑＭａｎアッセイ等によってＴＴＲのｍＲＮＡレベルを測定することによって、またはＥＬＩＳＡアッセイ等によってタンパク質レベルを測定することによってアッセイされ得る。本発明のｄｓＲＮＡは、１以上の単鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。
該ｄｓＲＮＡは、以下でさらに説明されるように、当該技術分野において既知の標準的な方法、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から市販されるもの等の自動ＤＮＡ合成装置の使用によって、合成することができる。該ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成するのに十分相補的である、２本のＲＮＡ鎖を含む。該ｄｓＲＮＡの１本の鎖（アンチセンス鎖）は、ＴＴＲ遺伝子の発現の間に形成されたｍＲＮＡの配列から派生した標的配列に実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である、相補性の領域を含み、もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的である領域を含み、その結果、２本の鎖は、好適な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。一般に、二重鎖構造は、１５〜３０、または２５〜３０、または１８〜２５、または１９〜２４、または１９〜２１、または１９、２０もしくは２１塩基対長である。一実施形態において、二重鎖は１９塩基対長である。別の実施形態において、二重鎖は２１塩基対長である。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、二重鎖の長さは同一であってもよく、または異なってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡのそれぞれの鎖は、一般に１５〜３０、または１８〜２５、または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド長である。他の実施形態において、それぞれの鎖は２５〜３０ヌクレオチド長である。二重鎖のそれぞれの鎖は、同一長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。２本の異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、各ｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖の長さは、同一であってもよく、または異なってもよい。
本発明のｄｓＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの１つ以上の単鎖のオーバーハングを含むことができる。一実施形態において、該ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１〜４、一般には１または２個のヌクレオチドの、単鎖のヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖の３′末端および５′末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。さらなる実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の３′末端および５′末端のそれぞれに、１〜１０個のヌクレオチドのオーバーハングを有する。
少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、平滑末端の対応物より予想外に優れた阻害特性を有し得る。幾つかの実施形態において、１つのみのヌクレオチドオーバーハングの存在により、その全体的な安定性に影響を及ぼすことなく、ｄｓＲＮＡの干渉活性が強化される。１つのみのオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養基、血液、および血清内で特に安定および効果的であることが判明している。一般に、単鎖のオーバーハングは、アンチセンス鎖の３′末端、または代替として、センス鎖の３′末端に位置する。該ｄｓＲＮＡは、一般にアンチセンス鎖の５′末端に位置する、平滑末端も有し得る。かかるｄｓＲＮＡは改善された安定性および阻害活性を有し得、したがって、低投薬量、すなわち、１日当たり受容者の体重１ｋｇにつき５ｍｇ未満の投与を可能にする。一般に、該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３′末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５′末端は平滑である。別の実施形態において、オーバーハング内のヌクレオチドのうちの１つ以上が、ヌクレオシドチオリン酸と置換される。
一実施形態において、ＴＴＲ遺伝子はヒトＴＴＲ遺伝子である。特定の実施形態において、該ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７からのセンス配列のうちの１つであり、該アンチセンス鎖は、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７からのセンス配列のうちの１つである。表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７に提供される標的配列のいずれかの箇所を標的とする代替のアンチセンス剤を、標的配列および隣接するＴＴＲ配列を使用して、容易に決定することができる。
当業者は、２０〜２３個だが、特に２１個の塩基対の二重鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘発に特に効果的であると認められていることをよく認識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかし、他方、より短いもしくはより長いｄｓＲＮＡが、同様に効果的であり得ることを見出している。上記の実施形態において、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の長さの少なくとも１本の鎖を含むことができる。一端または両端のわずかな数のヌクレオチドを差し引いた、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７の配列のうちの１つを有するより短いｄｓＲＮＡが、上記のｄｓＲＮＡと比較して、同様に効果的であり得ることは、妥当に予想され得る。したがって、表３、４、６、または７の配列のうちの１つからの、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分的配列を有するｄｓＲＮＡは、本明細書で以下に記載されるアッセイにおいて、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するそれらの能力が、完全な配列を含むｄｓＲＮＡと阻害の５、１０、１５、２０、２５、もしくは３０％以下の異なるｄｓＲＮＡが、本発明によって意図される。さらに、所望のＴＴＲ標的配列内で切断するｄｓＲＮＡを、対応するＴＴＲアンチセンス配列および相補的なセンス配列を用いて容易に作製することができる。
加えて、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７に提供されるｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉに基づく切断の影響を受けやすい、ＴＴＲ内の部位を同定する。したがって、本発明は、本発明の薬剤のうちの１つによって標的とされる配列内を標的とする、ｄｓＲＮＡをさらに特徴とする。本明細書で使用される、第２のｄｓＲＮＡは、第２のｄｓＲＮＡが、第１のｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に相補的であるｍＲＮＡ内のいずれかの箇所でメッセージを切断する場合、第１のｄｓＲＮＡの配列内を標的とすると言われる。かかる第２のｄｓＲＮＡは、一般に、ＴＴＲ遺伝子内の選択した配列に隣接する領域から取られたさらなるヌクレオチド配列に連結される、表３Ａ、３Ｂ、４、６Ａ、６Ｂ、または７に提供される配列のうちの１つからの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドからなる。
ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要であれば、当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技法によって、日常的に検出することができる。ｄｓＲＮＡの標的ｍＲＮＡにおける切断部位は、一般に、当業者に既知の方法、例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；２００４，Ｖｏｌ．４３２，ｐｐ．１７３−１７８に記載の５′−ＲＡＣＥ法（全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を用いて決定することができる。１つの実施形態において、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋらによって記載の５′−ＲＡＣＥ法を用いて、ＡＬＮ−１８３２８が、配列番号１３３１（ＮＭ＿０００３７１．３）の６３６位のグアニンヌクレオチドと配列番号１３３１の６３７位のアデニンヌクレオチドとの間で、ＴＴＲのｍＲＮＡを切断することが確認された。１つの実施形態において、ＡＬＮ−１８３２８が、配列番号１３３１の６３７位のアデニンヌクレオチドと配列番号１３３１の６３８位のグアニンヌクレオチドとの間で、ＴＴＲのｍＲＮＡを切断しないことが確認された。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的配列との１つ以上のミスマッチを含有してもよい。一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲が、相補性の領域の中心に位置しないことが好ましい。該ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から５ヌクレオチド、例えば、相補性の領域の５′もしくは３′末端のいずれかから５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチドに制限されることが好ましい。例えば、ＴＴＲ遺伝子の領域に相補的である２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ鎖について、該ｄｓＲＮＡは、一般には、中央の１３個のヌクレオチド内にはいかなるミスマッチも含有しない。本発明内で記載される方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するｄｓＲＮＡが、ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害に効果的であるかどうかを判定することができる。ＴＴＲ遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するｄｓＲＮＡの有効性を考慮することは、特にＴＴＲ遺伝子内の特定の相補性の領域が、集団内に多型の配列多様性を有することが既知である場合、重要である。
修飾
また別の実施形態において、該ｄｓＲＮＡは、安定性を増加させるために化学修飾される。本発明で取り上げられる核酸は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるもの等の、当該技術分野において十分確立された方法によって、合成および／または修飾することができ、該文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明において有用であるｄｓＲＮＡ化合物の具体例には、修飾された骨格を含むか、または天然のヌクレオシド間結合を含まないｄｓＲＮＡが含まれる。本明細書で定義されるように、修飾された骨格を有するｄｓＲＮＡには、該骨格にリン原子を保持するもの、および該骨格にリン原子を有しないものが含まれる。本明細書の目的上、また当該技術分野において時折言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格にリン原子を有しない修飾されたｄｓＲＮＡも、オリゴヌクレオシドであると見なすことができる。
修飾されたｄｓＲＮＡ骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３′−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３′−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに正常な３′−５′結合を有するボラノホスフェート、２′−５′結合したこれらの類似体、そしてヌクレオシド単位の隣接する対が３′−５′から５′−３′へ、または２′−５′から５′−２′へ結合する、逆向きの極性を有するものが含まれる。また、種々の塩、混合塩、および遊離酸形態も含まれる。
上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を含まない、修飾されたｄｓＲＮＡ骨格は、単鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１個以上の単鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成された）、シロキサン骨格、硫化物、スルホキシド、およびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２を混合した構成成分を有する他のもの、を有するものが含まれる。
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
他の好適なｄｓＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、骨格が、新規の基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とハイブリダイズするために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているそのようなオリゴマー化合物の１つであるｄｓＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物では、ｄｓＲＮＡの糖骨格が、アミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、該骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に見出すことができる。
本発明の他の実施形態は、ホスホロチオエート骨格を有するｄｓＲＮＡ、およびヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドであり、特に上述の米国特許第５，４８９，６７７号の−−ＣＨ２−−ＮＨ−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｏ−−ＣＨ２−−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、−−ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ３）−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−、および−−Ｎ（ＣＨ３）−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−［式中、天然のホスホジエステル骨格は、−−Ｏ−−Ｐ−−Ｏ−−ＣＨ２−として表される］、および上述の米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格である。また、上述の米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有するｄｓＲＮＡも好ましい。
また、修飾されたｄｓＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分も含有することができる。好ましいｄｓＲＮＡは、２′位に、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルのうちの１つを含み、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が特に好ましく、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である。他の好ましいｄｓＲＮＡは、２′位に、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、もしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、介入物、ｄｓＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｄｓＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似した特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾には、２′−メトキシエトキシ（２′−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であって、２′−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２′−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）すなわち、アルコキシ−アルコキシ基が含まれる。好ましいさらなる修飾には、本明細書において以下の実施例に記載される、２′−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２′−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、ならびに、同様に、本明細書において以下の実施例に記載される、２′−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野で２′−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルもしくは２′−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２′−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｏ−−ＣＨ２−−Ｎ（ＣＨ２）２が含まれる。
他の好ましい修飾には、２′−メトキシ（２′−ＯＣＨ３）、２′−アミノプロポキシ（２′−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２′−フルオロ（２′−Ｆ）が含まれる。同様の修飾を、ｄｓＲＮＡの他の位置、特に３′末端ヌクレオチドもしくは２′−５′結合ｄｓＲＮＡ内の糖の３′位、および５′末端ヌクレオチドの５′位で作製することもできる。また、ｄｓＲＮＡは、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分等の糖模倣体を有してもよい。かかる修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のうちのあるものは本出願によって共同所有され、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ｄｓＲＮＡは、核酸塩基（当該技術分野ではしばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換をも含み得る。本明細書で使用される、「非修飾」もしくは「天然」の核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニン等の、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０で開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３で開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３で開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基のうちの特定のものは、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるために、特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されていて（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例示的な塩基置換であり、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされると、さらに特に好ましい。
上記の修飾された核酸塩基の特定のもの、ならびに他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、および第５，６８１，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれ、米国特許第５，７５０，６９２号も、参照により本明細書に組み込まれる。
コンジュゲート（conjugate）
本発明のｄｓＲＮＡの別の修飾は、該ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させる、１つ以上の部分またはコンジュゲートの該ｄｓＲＮＡへの化学的結合を含む。かかる部分には、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチル−アンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３−９３７）等の脂質部分が含まれるが、これらに限定されない。
かかるｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号が含まれるが、これらに限定されず、当該特許のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
ある化合物の全ての位置が均一に修飾されている必要はなく、実際、前述の修飾のうちの１つ以上を単一化合物に、あるいはさらにはｄｓＲＮＡ内の単一ヌクレオシドに組み込むことができる。また、本発明は、キメラ化合物であるｄｓＲＮＡ化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」ｄｓＲＮＡ化合物または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」は、ｄｓＲＮＡ化合物であり、特に２つ以上の化学的にはっきりと異なる領域を含有し、それぞれ、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、ｄｓＲＮＡ化合物の場合のヌクレオチドからなる、ｄｓＲＮＡである。これらのｄｓＲＮＡは、典型的には、該ｄｓＲＮＡは、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、および／または標的核酸に対する結合親和性の増加を該ｄｓＲＮＡに付与するように、修飾される、少なくとも１つの領域を含有する。ｄｓＲＮＡのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質としての役割を果たすことができる。一例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それにより遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率を大きく亢進させる。それ故、キメラｄｓＲＮＡが使用される場合、同一標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、しばしばより短いｄｓＲＮＡによって匹敵する結果を得ることができる。
特定の場合において、該ｄｓＲＮＡは、非リガンド基によって修飾されてもよい。多くの非リガンド分子が、ｄｓＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みを亢進させるためにｄｓＲＮＡにコンジュゲートされており、かかるコンジュゲーション（conjugation）を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）等の脂質部分が含まれている。かかるｄｓＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上に列記されている。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するｄｓＲＮＡの合成を含む。次いで、アミノ基を、適切なカップリングもしくは活性化試薬を使用して、コンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、依然として固体支持体に結合されたｄｓＲＮＡを用いて、または溶液相中でのｄｓＲＮＡの切断後のいずれかに実行することができる。典型的には、ＨＰＬＣによってｄｓＲＮＡコンジュゲートを精製して、純粋なコンジュゲートが得られる。
ベクターによりコードされるｄｓＲＮＡ
別の態様では、ＴＴＲのｄｓＲＮＡ分子が、ＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えばＣｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０、Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａらの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄの国際ＰＣＴ公開ＷＯ第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄの米国特許第６，０５４，２９９号を参照されたい）。これらの導入遺伝子は、線状構築物、環状プラスミド、またはウイルスベクターとして導入することができ、宿主ゲノムに統合される導入遺伝子として導入されて、受け継がれ得る。また、導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして受け継がれるのを可能にするように、構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｄｓＲＮＡの個々の鎖を、２つの個別の発現ベクター上のプロモーターを用いて転写し、標的細胞に同時トランスフェクションすることができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個々の鎖を、いずれも同一発現プラスミド上に位置するプロモーターを用いて転写してもよい。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステムアンドループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって接合される逆方向反復として発現される。
組換えｄｓＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。ｄｓＲＮＡを発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（概説として、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照）、アデノウイルス（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９８）６：６１６）、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４）、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照））、またはアルファウイルス、ならびに当該技術分野において既知の他のものに基づいて構築することができるが、これらに限定されない。種々の遺伝子を、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にインビトロおよび／またはインビボで導入するために、レトロウイルスが使用されている（例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：１３９５−１３９８、Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）８５：６４６０−６４６４、Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８、Ａｒｍｅｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１６１４５、Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３、Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５、ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０−１９、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７、Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５、Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４−４１１５、米国特許第４，８６８，１１６号、米国特許第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０７１３６号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０２４６８号、ＰＣＴ出願ＷＯ第８９／０５３４５号、およびＰＣＴ出願ＷＯ第９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入して発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７およびＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の好適なパッケージング細胞系にトランスフェクションすることによって、産生することができる（Ｃｏｍｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：５−１０、Ｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６３４９）。感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、およびチンパンジー）内の多岐にわたる細胞および組織を感染させるために、組換えアデノウイルスベクターを使用することができ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ，１６６：７６９）、これは、感染に有糸分裂的に活性な細胞を必要としない利点も有する。
発現されるｄｓＲＮＡ分子のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクターを使用することができ、例としては、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス等に由来するベクターである。ウイルスベクターの指向性は、エンベロープタンパク質もしくは他のウイルスからの他の表面抗原を用いて該ベクターをシュードタイピングすることにより、または異なるウイルスのキャプシドタンパク質を適宜置換することによって、修正することができる。
例えば、本発明で取り上げられるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることができる。本発明で取り上げられるＡＡＶベクターは、ベクターが異なるキャプシドタンパク質の血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２のゲノム上に血清型２のキャプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と称される。ＡＡＶ２／２ベクター内のこの血清型２のキャプシド遺伝子を、血清型５のキャプシド遺伝子と置換して、ＡＡＶ２／５ベクターを産生することができる。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当該技術分野の技能内であり、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたく、その開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明における使用に好適な組換えウイルスベクターの選択、ｄｓＲＮＡの発現のために核酸配列を該ベクターに挿入するための方法、および該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野の技能内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１−３１０、Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４、Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５−１４、Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０、およびＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−４０６を参照されたく、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
ウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶに由来し得る。一実施形態において、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから、２つの別個の相補的な単鎖ＲＮＡ分子として発現される。
本発明のｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するために好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、該ベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際特許出願ＷＯ第９４／１３７８８号、および国際特許出願ＷＯ第９３／２４６４１号に記載され、それらの開示全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明で取り上げられるＤＮＡプラスミドもしくはウイルスベクターのいずれか内でｄｓＲＮＡの発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例えばリボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えばＣＭＶ初期プロモーター、もしくはアクチンプロモーター、もしくはＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、または一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばＵ６ ｓｎＲＮＡもしくは７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、あるいは原核生物プロモーター、例えば、発現プラスミドもＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするという条件で、Ｔ７プロモーターであり得る。該プロモーターは、膵臓への導入遺伝子の発現を導くこともできる（例えば、ｔｈｅ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｐａｎｃｒｅａｓ（Ｂｕｃｃｈｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２５１１−２５１５）を参照）。
さらに、導入遺伝子の発現は、、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環ブドウ糖レベル、またはホルモンに感受性である調節配列等の、誘発可能な調節配列および発現系を使用することによって、正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物内の導入遺伝子の発現を制御するために好適である、かかる誘発可能な発現系には、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量化の化学誘発物質、およびイソプロピル−ベータ−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＥＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者は、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の目的とする用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができよう。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子を発現することができる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に生き残る。代替として、ｄｓＲＮＡ分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。かかるベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。発現すると、ｄｓＲＮＡは標的ＲＮＡに結合し、その機能または発現を調節する。ｄｓＲＮＡを発現するベクターの送達は、静脈内もしくは筋肉内投与等によって全身的、患者から外植された標的細胞に投与後、該患者へ再導入することによって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段等によって、であり得る。
ｄｓＲＮＡ発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体（例えばオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ））、または非カチオン性脂質に基づく担体（例えばＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として、標的細胞にトランスフェクションされる。１週間以上の期間にわたって、単一のＴＴＲ遺伝子の異なる領域または複数のＴＴＲ遺伝子を標的とする、ｄｓＲＮＡによって媒介されるノックダウンのための複数回の脂質のトランスフェクションもまた、本発明によって企図される。ベクターの宿主細胞への導入の成功は、種々の既知の方法を使用して監視することができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光マーカー等のレポーターを用いて示すことができる。エクスビボ細胞の安定なトランスフェクションは、トランスフェクション細胞に、ハイグロマイシンＢ耐性等の、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性を提供するマーカーを使用して、保証することができる。
また、ＴＴＲに特異的なｄｓＲＮＡ分子は、ベクターに挿入して、ヒト患者に対する遺伝子療法ベクターとして使用することもできる。遺伝子療法ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）、または定位固定注射（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中の遺伝子療法ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達媒体が中に埋め込まれる徐放性マトリックスを含んでもよい。代替として、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子送達ベクターを無傷で産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含んでもよい。
ＩＩＩ． ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡと、薬剤として許容される担体とを含有する医薬組成物を提供する。該ｄｓＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程等の、ＴＴＲ遺伝子の発現もしくは活性に関連する疾患もしくは障害の治療に有用である。かかる医薬組成物は、送達様式に基づいて製剤化される。一例は、眼への直接送達用に製剤化される組成物である。別の例は、非経口投与を介して、例えば、静脈（ＩＶ）送達による全身投与用に製剤化される組成物である。別の例は、例えば、持続ポンプ注入等による脳への注入によって、脳実質への直接送達用に製剤化される組成物である。
本明細書で取り上げられる医薬組成物は、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するために十分な投薬量で投与される。
一般に、ｄｓＲＮＡの好適な用量は、１日当たり受容者の体重１キログラムにつき０．００００１〜２００．０ミリグラムの範囲、一般には、１日当たり体重１キログラムにつき１〜５０ｍｇの範囲であろう。
幾つかの実施形態において、該投薬量は、ｓｉＲＮＡが、眼に投与されるとき、体重に対応しない。
該投薬量は、例えば、７５ｋｇの人に対して２５μｇ、例えば、０．３μｇ／ｋｇであり得る。他の投薬量は、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、０．１、０．３、０．５、０．７、１．０、３．０、５．０、７．０、１０．０、３０．０、５０．０、７０．０、または１００．０μｇ／ｋｇを含む。
例えば、該ｄｓＲＮＡは、単回用量当たり０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６２８ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
一実施形態において、該投薬量は、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇである。例えば、該ｄｓＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１０ｍｇ／ｋｇ、０．１１ｍｇ／ｋｇ、０．１２ｍｇ／ｋｇ、０．１３ｍｇ／ｋｇ、０．１４ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１６ｍｇ／ｋｇ、０．１７ｍｇ／ｋｇ、０．１８ｍｇ／ｋｇ、０．１９ｍｇ／ｋｇ、または０．２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
一実施形態において、該投薬量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ〜１．６２８ｍｇ／ｋｇである。例えば、該ｄｓＲＮＡは、０．００５９ｍｇ／ｋｇ、０．０２９５ｍｇ／ｋｇ、０．０５９０ｍｇ／ｋｇ、０．１６３ｍｇ／ｋｇ、０．５４３ｍｇ／ｋｇ、０．５９００ｍｇ／ｋｇ、または１．６２８ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
一実施形態において、該投薬量は、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．５ｍｇ／ｋｇである。例えば、該ｄｓＲＮＡは、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、または１．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
ｄｓＲＮＡは、０．０３ｍｇ／ｋｇ、または０．０３、０．１、０．２、もしくは０．４ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。
該医薬組成物は、１日１回投与することができ、あるいは、該ｄｓＲＮＡは、１日にわたって適切な間隔で、２、３、またはそれ以上の分割用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）として、さらに、持続注入または放出制御製剤による送達を用いて投与されてもよい。その場合、各分割用量に含有されるｄｓＲＮＡは、１日当たりの総投薬量を達成するように、対応してより小さくなければならない。投薬量単位は、例えば、数日間にわたって該ｄｓＲＮＡの持続放出を提供する、従来の持続放出製剤を使用して、数日間にわたる送達用に配合することができる。持続放出製剤は当該技術分野において周知であり、本発明の薬剤を用いて使用され得る部位等の特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。本実施形態では、投薬量単位は、対応する複数の１日量を含む。
ＴＴＲレベルに対する単回用量の効果は長く続き、その結果、その後の用量は、３、４、もしくは５日の間隔より多くなく、または１、２、３、もしくは４週間の間隔より多くなく、または５、６、７、８、９、もしくは１０週間の間隔より多くない量で投与される。
当業者には、限定されないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の処置、総体的な健康、および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることが理解されよう。さらに、治療上有効な量の組成物を用いた対象の治療には、単回処置または一連の治療が含まれ得る。本発明により包含される個々のｄｓＲＮＡに対する効果的な投薬量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法を使用して、または本明細書のいずれかの箇所で記載される適切な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて、行うことができる。
マウス遺伝学における進歩によって、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程等の種々のヒト疾患の研究用に、多くのマウスモデルが生成されている。かかるモデルは、ｄｓＲＮＡのインビボ試験、ならびに治療上有効な用量を決定するために使用される。好適なマウスモデルは、例えば、ヒトＴＴＲを発現するプラスミドを含有するマウスである。別の好適なマウスモデルは、ヒトＴＴＲを発現する導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスである。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する）を達成するように、処方決定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
投与
本発明はまた、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤も含む。本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置が所望されるか、および処置される範囲に依存して、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的、噴霧器によってを含む、例えば、粉末もしくは噴霧剤の吸入もしくは吹送による経肺、気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口もしくは非経口であり得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腔内、もしくは筋肉内注射もしくは注入、または頭蓋内、例えば、実質内、くも膜下腔内、もしくは脳室内投与が含まれる。
該ｄｓＲＮＡは、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。
ｄｓＲＮＡは、眼等の特定の組織を標的とする様態で送達することができる。眼への送達の様式は、眼球後方、皮下瞼、結膜下、眼球鞘下、前房、または硝子体注射（または内部注射もしくは注入）を含む。
本発明は、脳に直接注射することによって送達することができる医薬組成物が含まれる。該注射は、脳の特定領域（例えば、黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球）への定位固定注射によるものであり得、該ｄｓＲＮＡは、中枢神経系への複数領域（例えば、脳、および／または脊髄への複数領域）に送達され得る。該ｄｓＲＮＡは、脳の拡散領域に送達（例えば、脳の皮質への拡散送達）され得る。
一実施形態において、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡは、カニューレ、または例えば、脳等の組織（例えば、脳の黒質、皮質、海馬、線条体、もしくは淡蒼球）内に埋め込まれた一端を有する他の送達デバイスを経由して送達され得る。該カニューレは、該ｄｓＲＮＡ組成物の貯蔵容器に接続することができる。流入または送達は、ポンプ、例えば、Ａｌｚｅｔポンプ等の浸透圧ポンプもしくはミニポンプによって媒介され得る（Ｄｕｒｅｃｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）。一実施形態において、ポンプおよび貯蔵容器は、組織から離れたエリア、例えば腹部内に埋め込まれ、送達は、ポンプまたは貯蔵所から放出部位に誘導する導管によって達成される。該ｄｓＲＮＡ組成物の脳への注入は、数時間にわたって、または数日間、例えば、１、２、３、５、もしくは７日間、もしくはそれ以上であり得る。脳への送達用のデバイスは、例えば、米国特許第６，０９３，１８０号、および第５，８１４，０１４号に記載されている。
局所投与用の医薬組成物および製剤には、経皮パッチ、軟膏、ローション、グリーム、ゲル、ドロップ剤、坐薬、スプレー、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬用担体、水性、粉末、もしくは油性基剤、増粘剤等が必要であるか、または望ましくあり得る。被覆したコンドーム、手袋等も有用であり得る。好適な局所製剤には、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤等の局所送達剤と混合されるものが含まれる。好適な脂質およびリポソームには、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジル（ＤＯＰＥ）エタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））、ならびにカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピル（ＤＯＴＡＰ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＴＭＡ））が含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、リポソーム内にカプセル化されてもよく、あるいはそれ、特にカチオン性リポソームと複合体を形成してもよい。代替として、ｄｓＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合されてもよい。好適な脂肪酸およびエステルには、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜１０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピル（ＩＰＭ））、モノグリセリド、ジグリセリド、あるいはその薬剤として許容される塩が含まれるが、これらに限定されない。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
コレステロールコンジュゲート
ｓｉＲＮＡは、本明細書に記載されるコレステロールおよびビタミンＥ等のリガンドにコンジュゲートされ得る。他のコンジュゲートは、当業者に公知の類似の方法によってオリゴヌクレオチドに結合することができることが理解され、そのような方法は、米国公開第２００５／０１０７３２５号、第２００５／０１６４２３５号、第２００５／０２５６０６９号、および第２００８／０１０８８０１号に見いだされ得、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
リポソーム製剤
薬物の製剤化用に研究されて、使用されているマイクロエマルジョンの他に、組織立った多くの界面活性剤の構造がある。これらには、単層、ミセル、二重層、および小胞が含まれる。リポソーム等の小胞は、薬物送達の観点からの、それらが提示する特異性および作用の持続時間から、大きな関心を集めている。本発明において使用される、「リポソーム」という用語は、球状の１つまたは複数の二重層に配置された両親媒性脂質の小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料および水性の内部から形成される膜を有する、単層状または多層状の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含有する。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができる利点を有する。非カチオン性のリポソームは、細胞壁とさほど効率的に融合することはできないが、マクロファージによってインビボで取り込まれる。
哺乳動物の無傷の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下、それぞれ５０ｎｍ未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能で、そのような微細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点には、天然のリン脂質から得られたリポソームは、生体適合性および生分解性であること、リポソームは、広範な水溶性および脂溶性の薬物を組み込むことができること、リポソームは、それらの内部区画でカプセル化された薬物を、代謝および分解から保護できること、が含まれる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製において考慮すべき重要な事項は、脂質の表面電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性容積である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜と同様であるため、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜との融合を開始し、リポソームと細胞との融合が進行するに従って、リポソームの内容物が細胞内へ出て、そこで活性薬剤が作用し得る。
リポソーム製剤は、多くの薬物のための送達様式として、広範な調査の焦点となっている。局所投与について、リポソームが他の製剤に勝る幾つかの利点を提示するという証拠が増えつつある。かかる利点には、投与された薬物の高度な体内吸収に関連する副作用の減少、投与された薬物の所望の標的での蓄積の増加、ならびに親水性および疎水性の両方の多岐にわたる薬物を皮膚へ投与する能力が含まれる。
幾つかの報告は、高分子量のＤＮＡを含む薬剤を皮膚へ送達するリポソームの能力について詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量のＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。大半の適用が、表皮上層の標的化をもたらした。
リポソームは、広義の２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に荷電したＤＮＡ分子と相互に作用し、安定な複合体を形成する、正に荷電したリポソームである。正に荷電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に荷電した細胞表面に結合し、エンドソーム内に取り入れられる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性であるか、または負に荷電したリポソームは、ＤＮＡと複合するのではなく、それを捕捉する。ＤＮＡおよび脂質は共に同様に荷電されているため、複合体形成ではなく反発が生じる。それでもなお、ＤＮＡの一部は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培養下の細胞単層へ送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されている。外因性遺伝子の発現が、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要な種類には、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性のリポソーム組成物は、一般にジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性の膜融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。リポソーム組成物の別の種類は、例えば、大豆ホスファチジルコリン、および卵ホスファチジルコリン等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。
幾つかの研究が、リポソーム製剤の皮膚への局所送達を評価している。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス炎の軽減をもたらし、一方、他の手段（例えば、溶液またはエマルジョンとして）を介したインターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、さらなる研究は、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用するインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤は水溶性投与より優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
また、非イオン性のリポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系における、薬物の皮膚への送達の実用性を決定するために調べられている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性のリポソーム製剤が、シクロスポリンＡをマウス皮膚の真皮に送達するために使用された。結果は、かかる非イオン性のリポソーム系が、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着の促進に効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
また、リポソームには、「立体的に安定化された」リポソームが含まれ、該用語は、本明細書で使用される場合、１つ以上の特定化された脂質を含むリポソームを指し、リポソームに組み込まれると、かかる特定化された脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の向上をもたらす。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１等の１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分等の１つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されるものである。いずれの特定の理論にも束縛されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増加は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが当該技術分野において既知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善する能力について報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳しく説明されている。共にＡｌｌｅｎらによる、米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開ＷＯ第８８／０４９２４号は、（１）スフィンゴミエリン、および（２）ガングリオシドＧＭ１もしくはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開ＷＯ第９７／１３４９９号（Ｌｉｍら）に開示されている。
１つ以上の親水性ポリマーによって誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該技術分野において既知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏら（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性界面活性剤、２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームについて記載している。Ｉｌｌｕｍら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子のポリマーグリコールによる親水性コーティングが、血中半減期の著しい増加をもたらすことを指摘している。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号、および第４，５３４，８９９号）によって記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧによって誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期の著しい増加を有することを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅら（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、このような観察を、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧとの組み合わせから形成されるＤＳＰＥ−ＰＥＧに広げた。外部表面に共有結合されたＰＥＧ部分を有するリポソームが、欧州特許ＥＰ第０ ４４５ １３１ Ｂ１号および国際公開ＷＯ第９０／０４３８４号（Ｆｉｓｈｅｒ）に記載されている。ＰＥＧによって誘導体化された１〜２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅら（米国特許第５，０１３，５５６号、および第５，３５６，６３３号）、ならびにＭａｒｔｉｎら（（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許ＥＰ第０ ４９６ ８１３ Ｂ１号）によって記載されている。他の多くの脂質−ポリマーコンジュゲートを含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（共にＭａｒｔｉｎらによる）、ならびに国際公開ＷＯ第９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙら）に開示されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームが、国際公開ＷＯ第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉら）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉら）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａら）は、表面に官能基部分をさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームについて記載している。
核酸を含む多くのリポソームが当該技術分野において既知である。Ｔｈｉｅｒｒｙらによる国際公開ＷＯ第９６／４００６２号は、高分子量の核酸をリポソーム中にカプセル化するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａらによる米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示し、かかるリポソームの内容物にはｄｓＲＮＡが含まれ得ると主張している。Ｒａｈｍａｎらによる米国特許第５，６６５，７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中にカプセル化する特定の方法について記載している。Ｌｏｖｅらによる国際公開ＷＯ第９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
トランスファーソームはさらに別の種類のリポソームであり、薬物送達媒体の興味を引く候補者である、高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは脂質小滴として記載されてもよく、これは、高度に変形可能であるため、この小滴より小さな孔に容易に浸透することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、自己最適性（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復性であり、しばしば断片化されることなく標的に到達し、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）である。トランスファーソームを作製するために、標準的なリポソーム組成物に対して、表面エッジアクチベータ（ｓｕｒｆａｃｅ ｅｄｇｅ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、通常界面活性剤を添加することができる。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚へ送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソームによって媒介される送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同様に効果的であることが示されている。
界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム等の製剤中に幅広い用途を見出す。天然および合成の両方の、多くの異なる種類の界面活性剤の性質を分類および順位付ける最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部基」としても知られる）の性質が、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、これは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧品に幅広い用途を見出し、広範なｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、その構造に依存して、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが含まれる。脂肪アルコールエトキシ化物（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅ）、プロポキシ化（ｐｒｏｐｏｘｙｌａｔｅｄ）アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤が、非イオン性界面活性剤のクラスのうちで最も一般的な構成物質である。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散された時に負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸等のカルボン酸塩、アシルラクチレート（ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸塩およびエトキシ化アルキル硫酸塩等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート（ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ）、アシルタウレート（ｔａｕｒａｔｅ）、およびスルホコハク酸塩等のスルホネート、ならびにリン酸塩が含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスのうちで最も重要な構成物質は、アルキル硫酸塩および石鹸である。
界面活性剤分子が正の荷電を保有する場合、それが水中に溶解または分散されると、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが含まれる。第四アンモニウム塩がこのクラスで最も使用される構成物質である。
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれをも保有する能力を有する場合、その界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびフォスファチドが含まれる。
薬品、製剤、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
一実施形態において、本発明で取り上げられるＴＴＲのｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全にカプセル化されて、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。本明細書で使用される、「ＳＮＡＬＰ」という用語は、ＳＰＬＰを含む安定な核酸脂質粒子を指す。本明細書で使用される、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内にカプセル化されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を阻止する脂質（例えば、ＰＥＧ脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長時間の循環寿命を呈し、遠位の部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用に非常に有用である。ＳＰＬＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公開ＷＯ第００／０３６８３号に記載されるカプセル化された縮合剤と核酸との複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、該核酸は、本発明の核酸脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、およびＰＣＴ公開ＷＯ第９６／４０９６４号に開示されている。
一実施形態において、脂質の薬物に対する比率（質量／質量比率）（例えば、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であろう。幾つかの実施形態において、脂質のｄｓＲＮＡに対する比率は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、または１１：１であり得る。
一般に、核酸脂質粒子は、緩衝液、例えば、投与用のＰＢＳ中に懸濁される。一実施形態において、脂質を製剤化したｓｉＲＮＡのｐＨは、６．８〜７．８、例えば、７．３または７．４である。オスモル濃度は、例えば、２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、約３００、例えば、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、または３０５であり得る。
カチオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ（ＤｉＬｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｎｙｌｏｘｙ）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｔｈｉｏ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ（ｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ（Ｄｉｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌ）−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、またはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１′−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、あるいはそれらの混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％〜約５０モル％、または約４０モル％からなり得る。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン ４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、アニオン性脂質または中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５モル％〜約９０モル％、約１０モル％、または約５８モル％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質は、例えば、制限されないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。ＰＥＧコンジュゲートの他の例には、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ（Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン）、ｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧ（ｍＰＥＧ−ジミリスチルグリコール（２，０００の平均分子量を有する）、およびＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）が含まれる。粒子の凝集を阻止する共役された脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％〜約２０モル％、または約１．０、１．１、１．２、０．１３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２モル％であり得る。
幾つかの実施形態において、該核酸脂質粒子には、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％〜約６０モル％、または約４８モル％のコレステロールがさらに含まれる。
一実施形態において、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために、化合物、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成については、２００８年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載され、当該特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
例えば、脂質ｓｉＲＮＡ粒子には、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン、１０％のＤＳＰＣ、４０％のコレステロール、１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）が含まれ、粒径６３．０±２０ｎｍおよび０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質比である。
さらに別の実施形態において、脂質ｓｉＲＮＡ粒子を調製するために、化合物、１，１′−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）を使用することができる。例えば、ｄｓＲＮＡは、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、Ｔｅｃｈ−Ｇ１、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧを含む脂質製剤に、７：１（ｗｔ：ｗｔ）の総脂質のｓｉＲＮＡに対する比率で、製剤化され得る。
ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質様（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）ＮＤ９８−４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（式１）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれエタノール中の原液を、ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍＬ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６、１００ｍｇ／ｍＬのように調製することができる。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６の原液を、例えば、４２：４８：１０のモル比に混合することができる。混合された脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、および最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように、（例えば、酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中の）ｓｉＲＮＡ水溶液と混合することができる。脂質ｓｉＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然発生的に形成される。所望の粒径分布に依存して、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）等のサーモバレル押出機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出ステップは割愛されてもよい。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
Figure 2019089799
ＬＮＰ０１製剤については、例えば、国際出願公開ＷＯ第２００８／０４２９７３号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
さらなる例示的な脂質ｓｉＲＮＡ製剤は、以下の通りである。
Figure 2019089799

Figure 2019089799
ＬＮＰ０９製剤およびＸＴＣを含む製剤は、例えば、２００９年９月３日出願の米国仮出願第６１／２３９，６８６号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ１１製剤およびＭＣ３を含む製剤は、例えば、２００９年９月２２日出願の米国仮出願第６１／２４４，８３４号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＬＮＰ１２製剤およびＴｅｃｈＧ１を含む製剤は、例えば、２００９年５月５日出願の米国仮出願第６１／１７５，７７０号に記載されており、当該出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
標準的な方法、または押出を伴わない方法のうちのいずれかによって調製された製剤を同様の様態で特徴付けることができる。例えば製剤は、典型的には、目視検査によって特徴付けられる。それらは、凝集物または沈降物のない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒径および粒径分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ（ＵＳＡ）を使用して、光散乱によって測定することができる。粒子は、４０〜１００ｎｍ等の約２０〜３００ｎｍの粒径であるべきである。粒径分布は、単峰型であるべきである。製剤中、ならびに捕捉された画分中の総ｓｉＲＮＡ濃度は、色素排除アッセイを使用して推定される。製剤化されたｓｉＲＮＡの試料を、製剤を分裂させる界面活性剤、例えば、０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の存在または不在下、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）等のＲＮＡに結合する色素を用いてインキュベートすることができる。製剤中の総ｓｉＲＮＡは、標準曲線に対する、該界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。捕捉された画分を、総ｓｉＲＮＡ含有量からｓｉＲＮＡを「含まない」含有量（界面活性剤の不在下のシグナルによって測定される）を差し引くことによって決定する。捕捉されたｓｉＲＮＡのパーセントは、典型的には８５％超である。ＳＮＡＬＰ製剤については、粒径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には少なくとも約５０ｎｍ〜少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ〜少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ〜少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与用の組成物および製剤には、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは疎水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェット、錠剤、またはミニタブレットが含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましくあり得る。幾つかの実施形態において、経口製剤とは、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが、１つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と併用して投与されるものである。好適な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。好適な胆汁酸／塩には、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、ならびにグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが含まれる。好適な脂肪酸には、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、もしくはその薬剤として許容される塩（例えば、ナトリウム）が含まれる。幾つかの実施形態において、浸透促進剤の組み合わせが使用され、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩が挙げられる。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で経口的に送達されるか、または微小もしくはナノ粒子を形成するように複合されてもよい。ｄｓＲＮＡ複合剤には、ポリ−アミノ酸類；ポリイミン類；ポリアクリレート類；ポリアルキルアクリレート類、ポリオキセタン類、ポリアルキルシアノアクリレート類；カチオン化ゼラチン類、アルブミン類、デンプン類、アクリレート類、ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、およびデンプン類；ポリアルキルシアノアクリレート類；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン類、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）類、セルロース類、およびデンプン類が含まれる。好適な複合剤には、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。ｄｓＲＮＡ用の経口製剤およびそれらの調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載され、これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内への）、くも膜下腔内、脳室内、または肝内投与用の組成物および製剤には、滅菌水溶液が含まれてもよく、これも、限定されないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬剤として許容される担体もしくは賦形剤等の緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る。
本発明の医薬組成物には、溶液、エマルジョン、およびリポソームを含有する製剤が含まれるが、これらに限定されない。これらの組成物は、予め形成された液体、自己乳化型固体および、自己乳化型半固体を含む種々の構成成分から生成することができるが、これらに限定されない。肝臓癌等の肝障害を処置する際に肝臓を標的とする製剤が特に好ましい。
本発明の医薬製剤は、簡便に単位剤形で提示することができ、医薬産業において周知である従来の技法によって、調製することができる。かかる技法には、活性成分を１つもしくは複数の医薬用担体または１つもしくは複数の賦形剤と合わせるステップが含まれる。一般に、該製剤は、活性成分を液体担体もしくは微粉化した固体担体、あるいはその両方と均一かつ密接に関連させ、次いで必要であれば該産物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟質ゲル、坐薬、および浣腸等の考えられる多くの剤形のうちのいずれかに製剤化することができる。また、本発明の組成物は、水性、疎水性、または混合媒体中の懸濁液として製剤化することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質をさらに含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。
エマルジョン
本発明の組成物は、エマルジョンとして調製および製剤化することができる。エマルジョンは、典型的には、１つの液体が、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態の別の液体中に分散された多相系である（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、しばしば、互いに密接に混合および分散される、２つの非混合性の液相を含む二相系である。一般に、エマルジョンは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれかの種類であり得る。水相が、大部分を占める油相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルジョンと称される。あるいは、油相が、大部分を占める水相中に微細に分割されて、微小液滴として分散される場合、得られる組成物は、水中油（ｏ／ｗ）型エマルジョンと称される。エマルジョンは、分散相に加えてさらなる構成成分と、水相または油相のいずれか中の溶液として、またはそれ自体別個の相として存在し得る、活性薬物とを含有することができる。また、乳化剤、安定剤、染料、および抗酸化剤等の医薬用賦形剤が、必要に応じてエマルジョン中に存在してもよい。また、医薬用エマルジョンは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルジョンの場合等の、２つを超える相を含む、多重エマルジョンであってもよい。このような複合製剤は、しばしば、単純な二元エマルジョンは提供しない、特定の利点を提供する。ｏ／ｗ型エマルジョンの個々の油滴が小さな水滴を囲む多重エマルジョンは、ｗ／ｏ／ｗ型エマルジョンを構成する。同様に、油の連続相中で安定化された水の小球内に囲まれた油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏ型エマルジョンを提供する。
エマルジョンは、熱力学的安定性によってほとんどまたは全く特徴付けられない。しばしば、エマルジョンの分散相または不連続相が、外相または連続相中に良好に分散され、乳化剤の手段または製剤の粘度によってこの形態が維持される。エマルジョンの相のいずれも、エマルジョン型軟膏基剤およびクリームの場合のように、半固体または固体であり得る。エマルジョンを安定化する他の手段は、エマルジョンのいずれかの相に組み込むことができる乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、大きく、合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収基剤、および微細に分散された固体の４つのカテゴリーに分類することができる（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
合成界面活性剤は、表面活性剤としても知られ、エマルジョン製剤における広範な適用性が見出されており、文献で概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性および疎水性の部分を含む。界面活性剤の、親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称されており、製剤の調製時の界面活性剤の分類および選択における、貴重なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性の異なるクラスに分類することができる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５）。
エマルジョン製剤に使用される天然乳化剤には、ラノリン、蜜蝋、フォスファチド類、レシチン、およびアカシアが含まれる。吸収基剤は、水を吸収してｗ／ｏ型エマルジョンを形成するが、依然として無水ラノリンおよび親水性ペトロラタム等のそれらの半固体の稠度を保持することができる、親水性を有する。微細に分割された固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、また粘性の調製物中で、良好な乳化剤として使用されている。これらには、極性の無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド性ケイ酸アルミニウムおよびコロイド性ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、ならびに非極性固体、例えば、炭素もしくはトリステアリン酸グリセリルが含まれる。
また、多岐にわたる非乳化材料もエマルジョン製剤に含まれ、エマルジョンの性質に寄与する。これらには、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドには、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲニン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）等の、天然に存在するガムおよび合成ポリマーが含まれる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の液滴の周りに強い界面薄膜を形成し、外相の粘度を増加させることによってエマルジョンを安定化させる、コロイド溶液を形成する。
エマルジョンは、しばしば、微生物の成長を容易に支持することができる炭水化物、タンパク質、ステロール、およびフォスファチド等の多くの成分を含有するため、これらの製剤には、しばしば防腐剤が組み込まれる。エマルジョン製剤に含まれる一般的に使用される防腐剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が含まれる。また、製剤の劣化を阻止するために、抗酸化剤も一般的にエマルジョン製剤に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、ならびに抗酸化剤シナージスト、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
皮膚、経口、および非経口経路を介するエマルジョン製剤の適用、ならびにそれらを製造するための方法は、文献で概説されている（Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。経口送達用のエマルジョン製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収および生物学的利用能の見地からの有効性から、非常に広範に使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。鉱油基材の緩下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物が、ｏ／ｗ型エマルジョンとして一般的に経口投与されている材料に含まれる。
本発明の一実施形態において、ｄｓＲＮＡおよび核酸の組成物が、マイクロエマルジョンとして製剤化される。マイクロエマルジョンは、水、油、および単一の、光学的に等方性かつ熱力学的に安定な液体溶液である両親媒性物質の系として定義することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。典型的には、マイクロエマルジョンは、まず油を界面活性剤水溶液中に分散し、次に十分な量の第４の構成成分、一般には中間鎖長のアルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される、系である。したがって、マイクロエマルジョンは、表面活性分子の界面薄膜によって安定化される、２つの非混和液の熱力学的に安定で等方的な、透明の分散物質としても記載されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的に、油、水、界面活性剤、共界面活性剤、および電解質を含む、３〜５つの構成成分の組み合わせを通じて調製される。マイクロエマルジョンが油中水（ｗ／ｏ）型、または水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の性質、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的な畳み込みに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相図を利用する現象論的手法が広範に研究されており、マイクロエマルジョンを製剤化する方法についての包括的な知識を当業者にもたらしている（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５）。従来のエマルジョンと比較して、マイクロエマルジョンは、自然発生的に形成される熱力学的に安定な液滴の製剤において、不水溶性薬物を可溶化する利点を提示する。
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤には、単独、または共界面活性剤と組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が含まれるが、これらに限定されない。共界面活性剤は、通常、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール等の短鎖アルコールであるが、界面活性剤の薄膜中に浸透し、その結果、界面活性剤分子の間に生成される空隙のために不規則な薄膜を形成することによって、界面流動性を増加させる役目を果たす。しかしながら、マイクロエマルジョンは、共界面活性剤の使用を伴わずに調製することができ、アルコールを含まない自己乳化型のマイクロエマルジョン系が、当該技術分野において既知である。水相は、典型的には、水、該薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定されない。油相には、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリ糖化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｚｅｄ）グリセリド、飽和ポリ糖化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、ならびにシリコーンオイル等の材料が含まれ得るが、これらに限定されない。
マイクロエマルジョンは、薬物の可溶化および薬物吸収の亢進の見地から、特に興味深い。ペプチドを含む薬物の経口での生物学的利用能を亢進させるために、脂質基剤のマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ型およびｗ／ｏ型の両方）が提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、改善された薬物の可溶化、酵素的加水分解からの薬物の保護、界面活性剤が誘発する膜流動性および透過性における変化による薬物吸収の潜在的な亢進、調製の容易さ、固形剤形を超える経口投与の容易さ、改善された臨床的効力、および低減した毒性の利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。しばしば、マイクロエマルジョンは、その構成成分が周囲温度で引き合わされると、自然発生的に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｄｓＲＮＡを製剤化する際に特に有利であり得る。また、マイクロエマルジョンは、化粧用途および医薬用途の双方における活性構成成分の経皮送達に効果的である。本発明のマイクロエマルジョン組成物および製剤は、消化管からのｄｓＲＮＡおよび核酸の向上された体内吸収を促進し、ｄｓＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが期待される。
また、本発明のマイクロエマルジョンは、製剤の特性を改善し、本発明のｄｓＲＮＡおよび核酸の吸収を亢進させるための、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透促進剤等のさらなる構成成分および添加剤を含有することができる。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれが、上述されている。
浸透促進剤
一実施形態において、本発明は、核酸、特にｄｓＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を達成させるために、種々の浸透促進剤を用いる。ほとんどの薬物は、イオン化および非イオン化の両方の形態で溶液中に存在する。しかしながら、通常脂溶性または親油性の薬物のみが、容易に細胞膜を横断する。横断される膜が浸透促進剤で処理されている場合、非親油性薬物でさえも、細胞膜を横断し得ることが発見されている。非親油性薬物の細胞膜を横断する拡散の補助に加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も亢進する。
浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の、５つの大きなカテゴリーのうちの１つに属するものとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。浸透促進剤の前述のクラスのそれぞれについて、以下により詳細に記載する。
界面活性剤：本発明に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）とは、水溶液中に溶解されると、溶液の表面張力または該水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収が亢進されるという結果をもたらす、化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）、ならびにＦＣ−４３等のペルフルオロ化合物エマルジョンが含まれる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジ−グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｙｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
胆汁塩：胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ′ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸透促進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁の天然に存在する構成成分のうちのいずれも、ならびにそれらの合成誘導体のうちのいずれもが含まれる。好適な胆汁塩には、例えば、コール酸（もしくはその薬剤として許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｕｃｈｏｌａｔｅ））、グリコール酸（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が含まれる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
キレート剤：本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、粘膜を通るｄｓＲＮＡの吸収の亢進という結果をもたらす化合物として、定義することができる。本発明における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼは触媒作用に二価金属イオンを必要とすることから、キレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮアーゼ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニレート（ｈｏｍｏｖａｎｉｌａｔｅ））、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびベータ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が含まれるが、これらに限定されない（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３、Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用される、非キレート非界面活性剤の浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤としてわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず消化器粘膜を通じてのｄｓＲＮＡの吸収を亢進する化合物として、定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの浸透促進剤には、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、ならびにジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン等の非ステロイド性抗炎症薬（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が含まれる。
担体
また、本発明の特定の組成物には、製剤中に担体化合物が組み込まれる。本明細書で使用される、「担体化合物」または「担体」は、不活性（すなわち、それ自体生物活性を有さない）であるが、例えば、生物活性のある核酸の分解、または循環からのその除去の促進によって、生物活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボ過程によって、核酸として認識される、核酸、またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との同時投与は、典型的には後者の物質を過剰に伴い、おそらく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の循環外の貯蔵所で回収される核酸の量の著しい減少をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸（ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、または４′−アセトアミド−４イソチオシアノ−スチルベン−２，２′−ジスルホン酸と同時投与される場合、減少され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１、Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬用担体」または「賦形剤」は、１つ以上の核酸を動物に送達するための、薬剤として許容される溶媒、懸濁剤、または任意の他の薬理学的に不活性な媒体である。賦形剤は液体または固体であり得、核酸および所定の医薬組成物の他の構成成分と組み合わされた時に、所望の用量、軟度等を提供するように、計画された投与の様態を念頭において選択される。典型的な医薬用担体には、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム等）、ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）が含まれるが、これらに限定されない。
また、核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を、本発明の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬剤として許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
核酸の局所投与用の製剤には、滅菌および非滅菌水溶液、アルコール等の一般的な溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固形の油基剤中の核酸の溶液が含まれ得る。該溶液は、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）投与に好適な薬剤として許容される有機または無機賦形剤を使用することができる。
好適な薬剤として許容される賦形剤には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が含まれるが、これらに限定されない。
他の構成成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来認められる他の補助的な構成成分を、それらの当該技術分野において確立された使用量レベルで、さらに含有することができる。したがって、例えば、本組成物は、さらに、例えば、鎮痒薬、収斂薬、局所麻酔薬、または抗炎症薬等の、適合性の、薬剤として活性な材料を含有してもよく、あるいは、染料、香味剤、防腐剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤等の、本発明の組成物の種々の剤形に物理的に製剤化するために有用な、さらなる材料を含有してもよい。しかし、かかる材料は、添加された時に、本発明の組成物の構成成分の生物活性を過度に妨げてはならない。該製剤を滅菌し、所望される場合、補助的な薬剤、例えば、該製剤の１つまたは複数の核酸と有害に相互作用しない滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝液、着色物質、香味物質、および／または芳香物質等と混合してもよい。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。また、懸濁液は、安定剤も含有することができる。
幾つかの実施形態において、本発明で取り上げられる医薬組成物には、（ａ）１つ以上のｄｓＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序によって機能する１つ以上の抗サイトカイン生物剤が含まれる。かかる生物学の例には、ＩＬ１β（例えばアンキンラ）、ＩＬ６（トシリズマブ）、またはＴＮＦ（エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、もしくはセルトリズマブ）を標的とする生物学が含まれる。
かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）、およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。高い治療指数を呈する化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトにおける使用のための一連の投薬量の処方決定に使用することができる。本発明で取り上げられる組成物の投薬量は、一般に、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に依存して、この範囲内で異なり得る。本発明で取り上げられる方法において使用されるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、まず細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定される、ＩＣ５０（すなわち、症状の半値阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合は、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲（例えば、該ポリペプチドの濃度の低下を達成する）を達成するように、処方決定することができる。かかる情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
それらの投与に加えて、上述のように、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、ＴＴＲの発現によって媒介される病理過程の処置に効果的な他の既知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合においても、投与する医師は、当該技術分野において既知であるか、または本明細書に記載される、標準的な有効性の測定値を使用して得られた結果に基づいて、ｄｓＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＴＴＲ遺伝子の発現によって引き起こされる眼疾患を治療するための方法
本発明は、特に、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療のための、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡの使用に関する。本発明は、これは、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のＡＤ−１８３２４を、該患者の網膜に投与することによって、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理する方法を特徴とする。一実施形態において、本方法は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されるヒトを特定し、該ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のＡＤ−１８３２４を該ヒトの網膜に投与することによって、ヒトを治療することを含む。本発明はまた、ＡＤ−１８３２４またはＡＤ−１８５３４であるｄｓＲＮＡを網膜上皮細胞に導入し、ＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間、前述のステップにおいて産生された細胞を維持し、それによって、細胞内のＴＴＲ遺伝子の発現を阻害することによって、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスに罹患しているヒトを治療する方法も含む。幾つかの実施形態において、本発明のＴＴＲのｓｉＲＮＡは、トランスチレチン（ＴＴＲ）関連の家族性アミロイド多発性神経障害（ＦＡＰ）患者、ならびに硝子体混濁および緑内障等の眼症状発現の治療の方法において使用される。網膜色素上皮（ＲＰＥ）によって合成されたアミロイド生成性トランスチレチン（ＡＴＴＲ）が、眼アミロイドーシスの進行において重要な役割を果たすことを当業者により理解されよう。ＲＰＥ細胞を軽減させ、ガラス体中のアミロイドの沈着の進行を妨げ、これにより、ＲＰＥ中のＡＴＴＲの発現の効果的な抑制を示す、汎網膜レーザー光凝固術が、眼アミロイドーシスの新規の療法になり得ることを、前述の研究は、示している（例えば、Ｋａｗａｊｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２０１０）１１７：５５２−５５５）。本明細書に開示されるＴＴＲのｓｉＲＮＡのいずれかの投与は、例えば、眼アミロイドーシス等のＴＴＲ関連ＦＡＰの眼症状発現の治療に使用することができる。ｄｓＲＮＡは、眼等の特定の組織を標的とする様式で送達することができる。眼への送達の様式は、眼球後方、皮下瞼、結膜下、眼球鞘下、前房、または硝子体注射（または内部注射もしくは注入）を含む。眼送達用の特定の製剤には、点眼剤または軟膏が含まれる。
ｄｓＲＮＡおよびさらなる治療薬は、同様の併用で、例えば、非経口で投与することができるか、またはさらなる治療薬は、別個の組成物の一部として、または本明細書に記載の別の方法によって投与することができる。
本発明は、ＴＴＲアミロイドーシス、例えば、ＦＡＰ等のＴＴＲの発現によって媒介される疾患または障害を有する患者に、ＴＴＲを標的とするｄｓＲＮＡを投与する方法を取り上げる。該ｄｓＲＮＡの投与は、例えば、ＦＡＰに罹患している患者において、末梢神経系の機能を安定させ、向上させることができる。患者は、治療量のｄｓＲＮＡ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを投与することができる。該ｄｓＲＮＡは、一定期間、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、６０分間、１２０分間、または１８０分間にわたって投与することができる。例えば、定期的に、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、またはそれ以上の期間、隔週で（すなわち、２週間ごとに）、反復投与される。初期治療レジメン後、該治療は、より低い頻度で、投与することができる。例えば、隔週で３ヶ月間、投与した後、６ヶ月間、またはそれ以上の期間、１ヶ月に１回、反復投与することができる。該ｄｓＲＮＡの投与は、患者における血液中または尿のＴＴＲレベルを、少なくとも２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％もしくはそれ以上軽減することができる。
総量の該ｄｓＲＮＡを投与する前に、患者は、総量の５％用量等の少量の用量を投与し、アレルギー反応または肝機能の変化等の副作用を監視することができる。例えば、肝機能の変化に対して監視される患者において、ＬＦＴ（肝機能検査）の変化の低い発生率（例えば、ＬＦＴの１０〜２０％発生率）は、許容される（例えば、可逆的な、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）および／またはＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）レベルの３倍の増加）。
多くのＴＴＲ関連の疾病および障害は、遺伝性である。したがって、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを必要とする患者は、家族歴を得ることによって特定することができる。医者、看護師、または家族等のヘルスケア提供者は、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを処方する、または投与する前に家族歴を得ることができる。ＤＮＡテストもはまた、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを患者に投与する前に、ＴＴＲ遺伝子の変異を同定するために、該患者に実施され得る。
該患者は、ＴＴＲのｄｓＲＮＡを受ける前に実施される生検を有し得る。該生検は、例えば、胃粘膜、末梢神経、皮膚、腹部脂肪、肝臓、もしくは腎臓等の組織上にあり得、該生検は、ＴＴＲによって媒介される障害を示す、アミロイド斑を示し得る。アミロイド斑を確認すると、患者は、ＴＴＲのｄｓＲＮＡが投与される。
ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための方法
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物における、ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。該方法は、標的ＴＴＲ遺伝子の発現が停止されるように、本発明で取り上げられる組成物を該哺乳動物に投与することを含む。
処置される生物がヒト等の哺乳動物である場合、本組成物は、頭蓋内（例えば脳室内、脳実質内、およびくも膜下腔）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（噴霧剤）、経鼻、直腸、ならびに局所（口腔および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口の経路を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の手段によって投与することができる。ある実施形態において、本組成物は、静脈内注入もしくは注射によって投与される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および化学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡおよび方法の実践または試験に際して、本明細書に記載されるものと同様または等価の方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含み、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は例示に過ぎず、限定するものではない。
実施例１：ｄｓＲＮＡ合成
試薬の供給源
試薬の供給源が本明細書に具体的に与えられていない場合、かかる試薬は、分子生物学の用途に標準的な質／純度で、分子生物学用の試薬の任意の供給業者から得ることができる。
ｓｉＲＮＡ合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および固体支持体として制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用して、１μモルの規模で固相合成によって単鎖ＲＮＡを生成した。ＲＮＡおよび２′−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するＲＮＡを、対応するホスホラミダイトおよび２′−Ｏ−メチルホスホラミダイト（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ））をそれぞれ用いて、固相合成によって生成した。これらの構成要素を、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されるような、標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学反応を用いて、オリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に組み込んだ。ヨウ素酸化剤溶液を、アセトニトリル（１％）中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ（Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ））の溶液と置き換えて、ホスホロチオエート結合を導入した。さらなる補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
確立された手順に従い、陰イオン交換ＨＰＬＣによって、粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を行った。収量および濃度を、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ、（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ））を使用した、２６０ｎｍの波長でのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸収によって判定した。アニーリング緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ 塩化ナトリウム）中で相補鎖の等モル溶液を混合し、３分間８５〜９０℃の湯浴中で加熱し、３〜４時間かけて室温まで冷却することによって、二本鎖ＲＮＡを生成した。アニールされたＲＮＡ溶液は、使用するまで−２０℃で保管した。
３′−コレステロールにコンジュゲートしたｓｉＲＮＡ（本明細書で−Ｃｈｏｌ−３′と称される）の合成には、ＲＮＡ合成のために適切に改質された固体支持体が使用された。改質された固体支持体は、以下のように調製した。
ジエチル−２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレートＡＡ
Figure 2019089799
水酸化ナトリウムの４．７Ｍの水溶液（５０ｍＬ）を、水（５０ｍＬ）中のグリシンエチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の、撹拌して氷冷した溶液に添加した。次いで、エチルアクリレート（２３．１ｇ、０．２３モル）を添加し、混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで、室温で撹拌した。１９時間後、該溶液をジクロロメタン（３×１００ｍＬ）で分配した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ
Figure 2019089799
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ミリモル）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷冷した。ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ミリモル）を該溶液に０℃で添加した。その後、ジエチル−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ミリモル）、およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ミリモル）を添加した。該溶液が室温になるようにし、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣで確認した。反応混合物を真空下で濃縮し、酢酸エチルを添加して、ジイソプロピル尿素を沈殿させた。この懸濁液を濾過した。濾液を５％塩酸水溶液、５％飽和重炭酸ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させて濃縮し、粗生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（５０％ ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）で精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ
Figure 2019089799
 ３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステルＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ミリモル）を、０℃のジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンに溶解した。この溶液を１時間撹拌し続けた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣に水を添加し、酢酸エチルで生成物を抽出した。この粗生成物をその塩酸塩に変換することによって精製した。
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステルＡＤ
Figure 2019089799
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステルＡＣ（４．７ｇ、１４．８ミリモル）の塩酸塩をジクロロメタンに溶解した。この懸濁液を氷上で０℃に冷却した。この懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ミリモル）を添加した。得られた溶液に、コレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ミリモル）を添加した。反応混合物を終夜撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステルＡＥ
Figure 2019089799
カリウムｔ−ブトキシド（１．１ｇ、９．８ミリモル）を３０ｍＬの乾燥トルエンでスラリーにした。この混合物を氷上で０℃に冷却し、５ｇ（６．６ミリモル）のジエステルＡＤを２０分以内のうちに、撹拌しながらゆっくりと添加した。添加の間、温度は５℃未満に維持した。撹拌を０℃で３０分間継続し、１ｍＬの氷酢酸、その直後に４０ｍＬの水中の４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを添加した。得られた混合物を２回、それぞれ１００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、合わせた有機抽出物を２回、それぞれ１０ｍＬのリン酸緩衝液で洗浄し、乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃に冷却し、それぞれ５０ｍＬの、ｐＨ９．５の冷炭酸塩緩衝液で３回抽出した。水性抽出液をリン酸でｐＨ３に調整し、それぞれ４０ｍＬのクロロホルムで５回抽出し、合わせて乾燥させ、蒸発乾固させた。残渣を２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用して、カラムクロマトグラフィーで精製し、１．９ｇのｂ−ケトエステルを得た（３９％）。
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＦ
Figure 2019089799
メタノール（２ｍＬ）を、ｂ−ケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ミリモル）と、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の水素化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ミリモル）との還流混合物に、１時間かけて滴下した。撹拌を還流温度で１時間継続した。室温に冷却後、１ＮのＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を添加し、混合物を酢酸エチルで抽出した（３×４０ｍＬ）。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濃縮して生成物を得て、カラムクロマトグラフィー（１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）で精製した（８９％）。
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステルＡＧ
Figure 2019089799
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ミリモル）を、真空内でピリジン（２×５ｍＬ）を用いて蒸発乾固した。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４′−ジメトキシトリチルクロリド（０．７２４ｇ、２．１３ミリモル）を撹拌しながら添加した。反応は、終夜室温で行われた。メタノールを添加して反応を停止させた。反応混合物を真空下で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を添加した。この有機層を１Ｍの飽和重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。トルエンを蒸発させて残渣のピリジンを除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィー（２％ ＭｅＯＨ／クロロホルム、５％ ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中Ｒｆ＝０．５）で精製した（１．７５ｇ、９５％）。
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステルＡＨ
Figure 2019089799
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ミリモル）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ミリモル）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ミリモル）と混合し、終夜４０℃の真空内で乾燥させた。該混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ミリモル）を添加し、この溶液をアルゴン雰囲気下で１６時間、室温で撹拌した。次いで、これをジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。該有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮乾固した。残渣をそのまま次のステップに使用した。
コレステロール誘導体化ＣＰＧ ＡＩ
Figure 2019089799
コハク酸ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ミリモル）を、ジクロロメタン／アセトニトリル（３：２、３ｍＬ）の混合物に溶解した。その溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ミリモル）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２′−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ミリモル）を順次添加した。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍＬ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ミリモル）を添加した。反応混合物の色が鮮やかな橙色に変わった。この溶液を、手首動作式振盪機（ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ ｓｈａｋｅｒ）を使用して短く撹拌した（５分）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１ｍＭ）を添加した。懸濁液を２時間撹拌した。焼結漏斗を通してＣＰＧを濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで順次洗浄した。無水酢酸／ピリジンを使用して未反応のアミノ基を遮蔽した。達成されたＣＰＧの装填を、ＵＶ測定値を取ることによって測定した（３７ｍＭ／ｇ）。
５′−１２−ドデカン酸ビスデシルアミド（ｂｉｓｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）基（本明細書で「５′−Ｃ３２−」と称される）または５′−コレステリル誘導体基（本明細書で「５′−Ｃｈｏｌ−」と称される）を担持するｓｉＲＮＡの合成は、コレステリル誘導体について、酸化ステップが、核酸オリゴマーの５′末端にホスホロチオエート結合を導入するために、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬を使用して行われたことを除いて、国際公開ＷＯ第２００４／０６５６０１号に記載されるように行った。
核酸配列を、標準的なヌクレオチド命名法、具体的には、表１の略語を使用して、以下に示す。
表１：略
核酸配列に使用されるヌクレオチドモノマーの略語の説明。これらのモノマーは、オリゴヌクレオチドが存在する場合、５′−３′−ホスホジエステル結合によって相互に結合することが理解されよう。
Figure 2019089799
共役したｓｉＲＮＡ
コレステロールおよびビタミンＥ等のリガンドに共役されたｓｉＲＮＡの調製を、スキーム１および２に示す。
Figure 2019089799
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実施例２Ａ.ＴＴＲのｓｉＲＮＡ設計
転写物
ｓｉＲＮＡ設計は、ヒト（記号ＴＴＲ）およびラット（記号Ｔｔｒ）からの遺伝子トランスチレチンを標的とするｓｉＲＮＡを同定するように行われた。該設計は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑ収集からのＴＴＲの転写物ＮＭ＿０００３７１．２（配列番号１３２９）（ヒト）およびＮＭ＿０１２６８１．１（配列番号１３３０）（ラット）を使用した。それらのそれぞれのＴＴＲ遺伝子に１００％同一性がある、ｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。
ｓｉＲＮＡ設計および特異性の予測
全ての可能な１９塩基（mer）の予測された特異性を、それぞれの配列に対して決定した。ＴＴＲのｓｉＲＮＡを、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ヒトおよびラットのトランスクリプトーム（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿の記録のセットとして定義される）に対する包括的検索において使用した。次いで、Ｐｙｔｈｏｎスクリプト「オフターゲットＦａｓｔａ．ｐｙ」を使用して、整列を解析し、ｓｉＲＮＡと任意の潜在的「オフターゲット」転写物との間のミスマッチの位置および数に基づいてスコアを得た。該オフターゲットスコアは、分子の５′末端から２〜９位での、ｓｉＲＮＡの「播種」領域の差異を強調するように重み付けする。該オフターゲットスコアは、以下のとおり算出される。オリゴと転写物との間のミスマッチに、ペナルティーを課す。オリゴの２〜９位での、播種領域のミスマッチには、２．８のペナルティーを課し、推定切断部位１０および１１のミスマッチには、１．２のペナルティーを課し、１２〜１９位でのミスマッチには、１のペナルティーを課す。１位でのミスマッチは、考慮されない。次いで、それぞれのオリゴ転写物対のオフターゲットスコアが、ミスマッチのペナルティーを合計することによって計算される。次いで、全てのオリゴ転写物対からの最小オフターゲットスコアを決定し、オリゴのその後の分類に使用する。両方のｓｉＲＮＡ鎖を、算出したスコアに従って、特異性のカテゴリーに割り当てた。３を超えるスコアは、高度の特異性があり、３に等しいスコアは、特異性があり、２．２〜２．８のスコアは、中程度の特異性があると見なす。どのオリゴが合成されるべきか選択するときに、アンチセンス鎖のオフターゲットスコアを、降順に並べ、ヒトからの最良の１４４個（最小オフターゲットスコア）オリゴ対、およびラットからの最良の２６個の対を選択した。
ｓｉＲＮＡの配列選択
ヒトＴＴＲに由来する合計１４０個のセンスおよび１４０個のアンチセンスのｓｉＲＮＡオリゴを合成し、二重鎖に形成した。ラットＴＴＲに由来する合計２６個のセンスおよび２６個のアンチセンスのｓｉＲＮＡオリゴを合成し、二重鎖に形成した。二重鎖を、表２〜４（ヒトＴＴＲ）および表５〜７（ラットＴＴＲ）に示す。
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ＴＴＲ配列の合成
１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成機において、ＴＴＲ配列を合成した。配列表の全ての配列については、「エンドライト」化学反応を以下の詳細のように適用した。
・センス鎖内の全てのピリミジン（シトシンおよびウリジン）は、対応する２′−Ｏ−メチル塩基（２′ Ｏ−メチルＣおよび２′−Ｏ−メチルＵ）と置換された。
・アンチセンス鎖では、リボＡヌクレオシドに隣接する（５′位に向かって）ピリミジンは、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドと置換された。
・センスおよびアンチセンス配列の両方の３′末端で、２つの塩基ｄＴｄＴの拡張を導入した。
・配列ファイルをテキストファイルに変換し、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウェアにおける負荷に対して互換性を保つようにした。
ＴＴＲ配列の合成は、ホスホラミダイト化学反応を用いて、固定支持されたオリゴヌクレオチド合成を使用した。９６ウェルプレート中の１ｕｍの規模で、上記の配列の合成を行った。アミダイト溶液を、０．１Ｍ 濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。
合成した配列を切断し、第１のステップにおいてメチルアミン、および第２のステップにおいて、トリエチルアミン３ＨＦを用いて、９６ウェルプレート中に脱保護した。このようにして得られた粗配列を、アセトンとエタノールの混合液を用いて、沈殿させ、ペレットを、０．５Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料を、ＬＣ−ＭＳによって分析し、得られる大量データにより配列の同一性を確認した。試料の選択されたセットはまた、ＩＥＸクロマトグラフィーによっても分析した。
過程における次のステップは、精製であった。全ての配列は、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムを用いて、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムにおいて精製した。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集し、続いて、イオン交換クロマトグラフィーによって純度について分析した。
ＡＫＴＡ精製機を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上に精製された配列を、脱塩した。脱塩したＴＴＲ配列を、濃度および純度について分析した。次いで、ＴＴＲ−ｄｓＲＮＡを形成するために、単鎖をアニールした。
実施例２Ｂ.ｍＲＮＡ抑制に対するＴＴＲのｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ｄｓＲＮＡを標的とするヒトＴＴＲ（表２）について、ＴＴＲのｍＲＮＡを定量化するために、ｑＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲ）およびｂＤＮＡ（分岐ＤＮＡ）アッセイを用いて、ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂ細胞内の内因性ＴＴＲの発現の阻害のアッセイを行った。ｄｓＲＮＡを標的とする齧歯類ＴＴＲ（表５）を合成し、ｂＤＮＡアッセイを用いて、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞内の内因性ＴＴＲの発現の阻害のアッセイを行った。単回用量アッセイからの結果は、ＩＣ５０を計算するための用量反応実験用のＴＴＲのｄｓＲＮＡ二重鎖のサブセットを選択するために使用した。ＩＣ５０の結果は、さらなる試験用のＴＴＲのｄｓＲＮＡを選択するために使用した。
細胞培養およびトランスフェクション：
肝細胞株のＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＨ．４．ＩＩ．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、トリプシン処理によりプレートから放出される前に、１０％ ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）で補完されるダルベッコ改変イーグル培地（ＡＴＣＣ）中の５％ ＣＯ２の雰囲気下で、３７℃でほぼコンフルエントまで増殖した。また、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞も、イーグル最小必須培地中で増殖した。逆転写は、１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、ウェル当たり０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ＃１３７７８−１５０）と一緒に、９６ウェルプレート中に５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭをウェル当たり５μＬのｓｉＲＮＡ二重鎖に添加することによって行われ、室温で１５分間インキュベートした。次いで、４×１０４（ＨｅｐＧ２）、２×１０４（Ｈｅｐ３Ｂ）、または２×１０４（Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ）細胞を含有する、抗生物質を含有しない、８０μＬの完全成長培地を添加した。ＲＮＡ精製前に、細胞を、２４時間インキュベートした。１０ｎＭの最終２倍濃度で単回用量実験を行い、１０、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、０．００００１ｎＭで用量反応実験を行った。
ＭａｇＭＡＸ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ，部品番号＃：ＡＭ１８３０）を用いた総ＲＮＡ単離：
細胞は、採集され、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解され、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで１分間混合した（混合速度は、過程を通して同一であった）。２０マイクロリットルの磁気ビーズを、細胞溶解物に添加し、５分間混合した。磁気ビーズは、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく、浮遊物を除去した。浮遊物を除去した後、磁気ビーズを洗浄液１（イソプロパノールを添加）で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの洗浄液２（エタノールを添加）で洗浄し、捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、５０μＬのＤＮアーゼ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再生溶液を添加し、３分間混合した。浮遊物を除去し、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄液２で再度洗浄し、１分間混合し、浮遊物を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合し、ＲＮＡを５０μＬの水で溶離する前に乾燥させた。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：
２μＬの１０×緩衝液、０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および反応当たり３．２μＬのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μＬの総ＲＮＡに添加した。ステップ：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持を通して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００のサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。
リアルタイムＰＣＲ法：
２μＬのｃＤＮＡを、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃４３２６６５９）中のウェル当たり１μＬの１８Ｓ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３１９４１３Ｅ）、１μＬのＴＴＲ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ ＨＳ００１７４９１４ Ｍ１）、および１０μＬのＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３２４０１８）のマスターミックスを添加した。ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いて、ＡＢＩ ７０００ ＰｒｉｓｍまたはＡＢＩ ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、リアルタイムＰＣＲを行った。全ての反応を、３重に行った。
ΔΔＣｔ法を用いて、リアルタイムデータを分析し、倍率変化を計算するために、１０ｎＭ ＢｌｏｃｋＩＴ 蛍光オリゴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃２０１３）または１０ｎＭ ＡＤ−１９５５（非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照二重鎖）でトランスフェクションした細胞から行われたアッセイにたいして正規化した。
分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ１．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ．ｃａｔ＃：ＱＧ０００４）−齧歯類特異的な二重鎖をスクリーニングするために使用
Ｈ．４．ＩＩ．Ｅ細胞（ＡＴＣＣ）を、１０ｎＭ ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。培地を除去した後、Ｈ．４．ＩＩ．Ｅを、１００ｕＬの希釈した溶解混合物（１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含有しない水、および２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に対して１ｍＬ当たり１０ｕＬのプロテイナーゼＫの混合物）で溶解し、次いで、６５℃で３５分間インキュベートした。次いで、８０μＬの作業プローブセット（ＴＴＲまたはＧＡＰＤＨプローブの混合物）および２０ｕＬの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを、５３℃±１℃で終夜（約１６〜２０時間）インキュベートした。捕捉プレートは、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分１、および洗浄緩衝液の構成成分２の混合物）で３回洗浄し、次いで、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。１００μＬの増幅作業用試薬を捕捉プレートに添加し、次いで、これを密閉し、４６℃±１℃で１時間インキュベートした。洗浄および乾燥ステップを、１時間インキュベートした後に繰り返し、１００μＬの標識溶液試薬を添加した。次いで該プレートを洗浄し、乾燥させ、１００μＬの基質（ラウリル硫酸リチウムと基質溶液の混合物）を添加した。捕捉プレートを４６℃±１℃で３０分間インキュベーター中に入れた。次いで、捕捉プレートをインキュベーターから取り出し、室温で３０分間インキュベートした。最終的に、Ｖｉｃｔｏｒ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、捕捉プレートを読み取った。
分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ｃａｔ＃：ＱＳ００１１）：全ての他の二重鎖をスクリーニングするために使用
提示された用量で、２４時間インキュベートした後、培地を取り出し、細胞を、１００ｕＬの溶解混合物（１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含有しない水、および２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に対して１０ｕＬのプロテイナーゼＫ／ｍＬの混合物）中で溶解し、次いで、６５℃で３５分間インキュベートした。次いで、２０μＬの作業プローブセット（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内因性対照用のＧＡＰＤＨ）および８０μＬの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを５５℃±１℃で（約１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分１、および洗浄緩衝液の構成成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。１００μＬの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、１００μＬの増幅作業試薬を添加した。１時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、１００μＬの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、５０℃±１℃で１時間インキュベートした。次いで、該プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、次いで、１００μＬの基質を捕捉プレートに添加した。５〜１５分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、捕捉プレートを読み取った。
ｂＤＮＡデータ分析
ｂＤＮＡデータは、（ｉ）それぞれの３重の試料から平均バックグラウンドを減算し、（ｉｉ）得られる３重のＧＡＰＤＨ（対照プローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）値を平均し、次いで、（ｉｉｉ）比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）を得ることによって分析された。
結果
ＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＴＴＲのｓｉＲＮＡ）における単回用量およびＩＣ５０の結果の概要を、下表８に示す。単回用量の結果は、ＨｅｐＧ２細胞においてアッセイした、対照に対するＴＴＲのｍＲＮＡの割合（％）として表す。ＩＣ５０は、表示されるように、ＨｅｐＧ２および／またはＨｅｐ３Ｂ細胞において決定した。
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５つのＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＡＤ−１８２５８、ＡＤ−１８２７４、ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、およびＡＤ−１８３３９）に対するＩＣ５０を特定するために使用された用量反応データを、下表９に詳細に示す。全て５つのｓｉＲＮＡが、ｐＭ単位のＩＣ５０を有することが確認された。表８中のｄｓＲＮＡに対するＩＣ５０データは、下表９に表したデータの要約である。
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齧歯類特異的なＴＴＲ−ｄｓＲＮＡ（ＴＴＲのｓｉＲＮＡ）に対する単回用量の結果の概要を、下表１０に表す。単回用量の結果は、対照に対するＴＴＲのｍＲＮＡの割合（％）として表し、１０ｎＭで齧歯類特異的なＴＴＲのｓｉＲＮＡをトランスフェクションした後、ラットＨ．４．ＩＩ．Ｅ細胞においてアッセイした。これらの結果は、幾つかの齧歯類特異的なＴＴＲのｓｉＲＮＡが、インビトロで内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であることを示す。
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実施例３.ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの分泌の誘発に対するＴＴＲのｓｉＲＮＡのインビトロアッセイ
免疫刺激に対する潜在性を評価するために、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−αの分泌の誘発に対するＴＴＲのｓｉＲＮＡを、インビトロでアッセイした。
ヒトＰＢＭＣは、標準フィコールハイパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度遠心分離によって、健常なドナーから得た新たに回収したバフィーコート（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から単離された。新たに単離された細胞（１×１０５／ウェル／１００μＬ）を、９６ウェルプレートに播種し、１０％ 加熱不活性化したウシ胎仔血清および１％ 抗生物質／抗真菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補完されるＲＰＭＩ １６４０ ＧｌｕｔａＭａｘ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。
ＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ｓｉＲＮＡをＰＢＭＣにトランスフェクションした。ＤＯＴＡＰは、まず、ｓｉＲＮＡを含有する等容量のＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合する前に、５分間Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で希釈した。製造業者の取扱説明書によって規定されるように、ｓｉＲＮＡ／ＤＯＴＡＰ複合体をインキュベートし、続いて、ＰＢＭＣ（５０μＬ／ウェル）に添加し、次いで、これを２４時間培養した。陽性および陰性対照ｓｉＲＮＡを、全てのアッセイに含んだ。ＡＤ−５０４８を、陽性対照ｓｉＲＮＡとして使用した。ＡＤ−５０４８は、ヒトアポリポタンパク質Ｂ（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００４）を標的とする配列に対応し、このアッセイにおいて、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの両方の分泌を引き起こす。このアッセイにおいて、ＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの分泌を引き起こさない、ＡＤ−１９５５を、陰性対照ｓｉＲＮＡとして使用した。全てのｓｉＲＮＡを、１３３ｎＭの最終濃度で使用した。ＲＮＡのトランスフェクション試薬に対する比は、ＤＯＴＡＰの１μｇ当たり１６．５ｐモルであった。
両方ともＢｅｎｄｅｒ ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）からのＩＦＮ−α（ＢＭＳ２１６ＩＮＳＴ）およびＴＮＦ−α（ＢＭＳ２２３ＩＮＳＴ）用の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、培養浮遊物中のサイトカインを、検出し、定量化した。ＴＴＲのｓｉＲＮＡのサイトカイン誘発は、陽性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−５０４８に対する、産生したＩＦＮ−αまたはＴＮＦ−αの割合として表される。
多くのＴＴＲのｓｉＲＮＡに対するＩＦＮ−αおよびＴＮＦ−αの刺激結果を、図１（４重のウェル±標準偏差の平均）および下表１１（ＡＤ−５０４８と比較した割合）に表す。ＴＴＲのｓｉＲＮＡは、培養したヒトＰＢＭＣによる誘発した有意なＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αの分泌は、評価されなかった。
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５つのＴＴＲ標的化リードｄｓＲＮＡ（ＴＴＲのｓｉＲＮＡ）を、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｅｐ３Ｂにおいて、および免疫刺激活性の不在下で、ｐＭ範囲のＩＣ５０に基づいて選択した。いずれのミスマッチもない二重鎖は、オリゴとｍＲＮＡとの間でミスマッチがある二重鎖よりも標的転写物の有意なノックダウンを達成する可能性が高い。交差種毒物学的データのより良好な翻訳を可能にし、ヒト患者に対して広範な適用性を有するために、ラット、カニクイザル、およびヒトからのオーソロガス遺伝子において１００％同一性を有し、既知の多型を有する領域を標的としない、二重鎖が、一般に好ましい。５つのリード化合物は、ｐＭ範囲の肝細胞株におけるＩＣ５０に基づいて、免疫刺激活性の不在下で、ヒトＴＴＲ転写物への特異性、および二重鎖によって標的とされるｍＲＮＡの領域内で、既知の多型（変異）の不在下で選択された。ＴＴＲの場合は、ヒト、ラット、およびカニクイザルにおいて、完全な同一性がある、１９塩基オリゴは見出されなかった。これらのデータの概要を、表１２に表し、これにはまた、二重鎖および交差種反応性によって標的とされる領域内の既知のＴＴＲ変異の情報も含まれる。
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実施例４.トランスジェニックマウスにおける、ＬＮＰ０１−１８３２４、ＬＮＰ０１−１８３２８、およびＬＮＰ０１−１８２４６による肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡおよび血漿ＴＴＲタンパク質のインビボの低下
２つのＴＴＲのｓｉＲＮＡであるＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８を、インビボ評価のために選択した。これらの二重鎖は、肝細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２）における、インビボで有力な用量依存的な発現停止を示した。図２Ａおよび図２Ｂは、ＡＤ−１８３２４（図２Ａ）またはＡＤ−１８３２８（図２Ｂ）でトランスフェクションした後の、ＨｅｐＧ２細胞内の用量反応を示し、ここで、該用量は、ｘ軸上にｎＭで表し、反応は、ｙ軸上に、対照と比較した、画分ＴＴＲのｍＲＮＡの残存として表す。ＨｅｐＧ２細胞では、ＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８のＩＣ５０は、それぞれ、２ｐＭおよび３ｐＭであると確認された。両方のリードｄｓＲＮＡ候補に対するＴＴＲ標的部位は、ＴＴＲのｍＲＮＡの３′非翻訳領域、文献で報告された変異がない領域内にある。
表からの２つのリード候補のそれぞれの鎖の配列を、以下に再現する。鎖：ｓ＝センス、ａｓ＝アンチセンス 位置：ＮＭ＿０００３７１．２の転写物における５′位の塩基
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加えて、齧歯類交差反応性ＴＴＲのｄｓＲＮＡ、ＡＤ−１８２４６をインビボでさらなる評価のために選択した。ＡＤ−１８２４６は、オープンリーディングフレームの８８位で開始する配列を標的とし、ここに、文献中に報告された３つの変異がある。ＨｅｐＧ２細胞内のＡＤ−１８２４６に対する用量反応曲線を図３に示す。ＡＤ−１８２４６は、実質的には、ＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８よりも有力ではなく、ＡＤ−１８２４６のＩＣ５０は、２６５ｐＭであると決定した。
ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、およびＡＤ−１８２４６を、ＬＮＰ０１に製剤化した後、トランスジェニックマウスに投与した。３〜５月齢のＨ１２９−ｍＴＴＲ−ＫＯ／ｉＮＯＳ−ＫＯ／ｈＴＴＲのトランスジェニックマウス（マウストランスチレチンのノックアウト／誘導一酸化窒素シンターゼノックアウト／ヒトのトランスチレチントランスジェニック）に、ｓｉＲＮＡのＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８に対して、１．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、または６．０ｍｇ／ｋｇで、ｓｉＲＮＡのＡＤ−１８２４６に対して、３．０ｍｇ／ｋｇで、およびｓｉＲＮＡのＡＤ−１９５５に対して、６．０ｍｇ／ｋｇの濃度で、尾静脈を介して、２００μＬのＬＮＰ０１に製剤化したトランスチレチンに特異的なｓｉＲＮＡ（ＡＤ−１８３２４、ＡＤ−１８３２８、またはＡＤ−１８２４６）、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とするＬＮＰ０１に製剤化した対照ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−１９５５）、またはＰＢＳを静脈内（ＩＶ）投与した。ＬＮＰ０１は、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６からなる脂質様製剤である。
約４０時間後、マウスに、２００μＬのケタミンで麻酔をかけ、次いで、右側の尾動脈を切断することによって採血した。全血は単離され、血漿は単離され、アッセイするまで−８０℃で保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。
処置の有効性は、（ｉ）投薬から４８時間後、肝臓におけるＴＴＲのｍＲＮＡの測定、ならびに（ｉｉ）前採血および投薬から４８時間後、血漿中のＴＴＲタンパク質の測定によって評価された。ＴＴＲ肝臓のｍＲＮＡレベルは、分岐ＤＮＡアッセイ−ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ ｃａｔ＃：ＱＳ００１１）を利用してアッセイされた。簡潔に言えば、マウス肝臓の試料を粉砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含有しない水、および２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に対して１０ｕＬのプロテイナーゼＫ／ｍＬの混合物）を、６５℃で３５分間インキュベートした。次いで、２０μＬの作業プローブセット（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内因性対照用のＧＡＰＤＨ）および８０μＬの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを５５℃±１℃（約１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分１、および洗浄緩衝液の構成成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。１００ｕＬの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、１００μＬの増幅作業試薬を添加した。１時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、１００μＬの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、５０℃±１℃で１時間インキュベートした。次いで、該プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、１００μＬの基質を捕捉プレートに添加した。５〜１５分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、捕捉プレートを読み取った。ｂＤＮＡデータは、それぞれの３重の試料から平均バックグラウンドを減算し、得られる３重のＧＡＰＤＨ（対照プローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）値を平均し、次いで、比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）をコンピュータで計算することによって分析された。
ＴＴＲ血漿中レベルは、製造業者のガイドラインに従って、市販のキットの「ＡｓｓａｙＭａｘヒトプレアルブミンＥＬＩＳＡキット」（ＡｓｓａｙＰｒｏ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ，Ｃａｔａｌｏｇ＃ＥＰ３０１０−１）を利用して、アッセイした。簡潔に言えば、マウス血漿は、１×混合希釈液中で１：１０，０００に希釈し、標準キットと共に前被覆されたプレートに添加し、室温で２時間インキュベートし、続いて、キットの洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０マイクロリットルのビオチン化プレアルブミン抗体を、それぞれのウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて、洗浄緩衝液で５回洗浄した。５０マイクロリットルのストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを、それぞれのウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートし、続いて、前述のように洗浄した。５０μＬ／ウェルの停止溶液を添加することによって反応の停止を伴い、５０μＬ／ウェルの発色基質を添加し、室温で１０分間インキュベートすることによって、反応を生じさせた。４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上でを読み取り、データを、Ｓｏｆｔｍａｘ４．６ソフトウェアパッケージ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を利用して分析した。
ＬＮＰ０１−１８３２４およびＬＮＰ０１−１８３２８は、ＩＶボーラス投与を伴う用量依存的な様式で、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ（図４Ａ）および血漿ＴＴＲタンパク質（図４Ｂ）レベルを低下することが見出された。ＬＮＰ０１−１８３２８のｍＲＮＡ ＥＤ５０は、約１ｍｇ／ｋｇであると決定され、一方、ＬＮＰ０１−１８３２４のＥＤ５０は、約２ｍｇ／ｋｇであることが確認された。６ｍｇ／ｋｇでの対照のＬＮＰ０１−１９５５が、ＰＢＳ群と比較して、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに有意に影響を及ぼさなかったため、ＬＮＰ０１−１８３２４およびＬＮＰ０１−１８３２８の効果は特異的であった。ＬＮＰ０１−１８３２４およびＬＮＰ０１−１８３２８は、ＰＢＳ群と比較して、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルにおけるものと同様の効力を有する、血漿ＴＴＲタンパク質レベルを低下させた。３ｍｇ／ｋｇで、ＬＮＰ０１−１８２４６は、３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０１−１８３２４またはＬＮＰ０１−１８３２８よりも少ない程度で肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させた。
これらの結果は、ＩＶボーラスにより投与された、ＬＮＰ０１−１８３２４およびＬＮＰ０１−１８３２８が、実質的には、トランスジェニックマウス肝臓によって発現されたヒトＴＴＲのｍＲＮＡを低下させ、血中循環中のヒトＴＴＲタンパク質の低下をもたらすことを実証する。
実施例５.ＳＮＡＬＰ−１８３２４およびＳＮＡＬＰ−１８３２８による非ヒト霊長類の肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのインビボの低下
非ヒト霊長類における、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルのＴＴＲ ｓｉＲＮＡのＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８３２８の有効性を評価するために、該ｓｉＲＮＡは、ＳＮＡＬＰに製剤化され、１５分間のＩＶ注入によって投与された。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（２〜５ｋｇ、１群当たり３匹の動物）に、ＳＮＡＬＰ−１８３２４（０．３、１．０、もしくは３．０ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ−１８３２８（０．３、１、もしくは３ｍｇ／ｋｇ）、またはＳＮＡＬＰ−１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する）を１５分間のＩＶ注入で投与した。投薬から４８時間後、サルに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、失血させた。ＴＴＲのｍＲＮＡ決定に対する肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。
特注の分岐ＤＮＡアッセイを利用して、およびＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ１．０技術を利用して、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、アッセイした。簡潔に言えば、サル肝臓の試料を粉砕し、組織溶解物を調製した。肝臓溶解混合物（１容量の溶解混合物、２容量のヌクレアーゼを含有しない水、および２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度に対して１０ｕＬのプロテイナーゼＫ／ｍＬの混合物）を、６５℃で３５分間インキュベートした。次いで、２０μＬの作業プローブセット（遺伝子標的用のＴＴＲプローブおよび内因性対照用のＧＡＰＤＨ）および８０μＬの細胞溶解物を捕捉プレートに添加した。捕捉プレートを５５℃±１℃で（約１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、該捕捉プレートを、１×洗浄緩衝液（ヌクレアーゼを含有しない水、緩衝液の構成成分１、および洗浄緩衝液の構成成分２）で３回洗浄し、次いで、２４０ｇで１分間遠心分離を行うことによって乾燥させた。１００μＬの事前増幅作業試薬を捕捉プレートに添加し、これをアルミホイルで密閉し、５５℃±１℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートした後、洗浄ステップを繰り返し、次いで、１００μＬの増幅作業試薬を添加した。１時間後、洗浄および乾燥ステップを繰り返し、１００μＬの標識プローブを添加した。捕捉プレートを、５０℃±１℃で１時間インキュベートした。次いで、該プレートを１×洗浄緩衝液で洗浄し、乾燥させ、次いで、１００μＬの基質を捕捉プレートに添加した。５〜１５分間インキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて、捕捉プレートを読み取った。ｂＤＮＡデータは、（ｉ）それぞれの３重の試料から平均バックグラウンドを減算し、（ｉｉ）得られるＧＡＰＤＨ（対照プローブ）およびＴＴＲ（実験プローブ）値を平均し、次いで、（ｉｉｉ）比：（実験プローブ−バックグラウンド）／（対照プローブ−バックグラウンド）を得ることによって分析された。
結果を図５に示す。ＳＮＡＬＰ−１８３２４およびＳＮＡＬＰ−１８３２８は、陰性対照ＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して、用量依存的な様式で、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させた。ＳＮＡＬＰ−１８３２８およびＳＮＡＬＰ−１８３２４のｍＲＮＡ ＥＤ５０は、それぞれ、約０．３および約１ｍｇ／ｋｇであると決定した。
これらの結果は、ＳＮＡＬＰ−１８３２４およびＳＮＡＬＰ−１８３２８が、ＩＶ注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であることを実証する。
実施例６.トランスジェニックマウスにおける、ＳＮＡＬＰ−１８３２８による変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲのｍＲＮＡおよびタンパク質のインビボの低下
肝臓中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲタンパク質における、ＴＴＲのｓｉＲＮＡ ＡＤ−１８３２８の有効性を評価するために、ＡＤ−１８３２８を、ＳＮＡＬＰに製剤化し、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスに、ＩＶボーラスにより投与した。８〜１２週齢のＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウス（５匹の動物／群）に、２００μＬのＳＮＡＬＰ−１８３２８（０．０３、０．３、もしくは３ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ−１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する）、またはＰＢＳを静脈内（ＩＶ）投与した。使用したマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｏｒｔｏ，ＰｏｒｔｕｇａｌからのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ株Ｈ１２９−ｈＴＴＲ ＫＯであった。簡潔に言えば、ｈＴＴＲ Ｈ１２９トランスジェニックマウスを、Ｈ１２９内因性ＴＴＲ ＫＯマウス（ヌルマウスＴＴＲのバックグラウンドにおいて、Ｈ１２９−ｈＴＴＲトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７−２０．）と交配した。
注射してから４８時間後、全て５つの処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。血清試料は、収集し、分析するまで−８０℃で保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いることによって、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料に対するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得た。
ＴＴＲタンパク質の定量化については、製造業者のプロトコルに従って、ＡｓｓａｙＰｒｏ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）のＡｓｓａｙｍａｘ ＰｒｅＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡキットを用いて、血清をアッセイした。
肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質における結果を、それぞれ、図６Ａおよび図６Ｂに示す。ＳＮＡＬＰ−１８３２８で処置したＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスは、ＰＢＳ対照群と比較して、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルにおいて、用量依存的、かつ有意な低下があり、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の３ｍｇ／ｋｇで、９７％（ｐ＜０．００１）の最大低下率、およびＳＮＡＬＰ−１８３２８の約０．１５ｍｇ／ｋｇで、５０％低下（ＥＤ５０）に達した。血清ＴＴＲタンパク質はまた、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の３ｍｇ／ｋｇで、（投薬前のレベルと比較して）血清ＴＴＲタンパク質の９９％（ｐ＜０．０１）の最大低下率を有する、用量依存的な様式で抑制され、これは、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルの低下と一致した。３ｍｇ／ｋｇでのＳＮＡＬＰ−１９５５は、ＰＢＳと比較して、ＴＴＲのｍＲＮＡあるいはタンパク質レベルのいずれかにおいて統計的に有意な効果がなかった。
これらの結果は、ＩＶ投与した時、ＳＮＡＬＰ−１８３２８が、トランスジェニックマウス肝臓中の変異Ｖ３０Ｍ ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに活性があり、血中循環中の変異Ｖ３０Ｍ ＴＴＲタンパク質の低下をもたらすことを実証する。
実施例７.トランスジェニックマウスにおける、ＳＮＡＬＰ−１８３２８によるＴＴＲのｍＲＮおよびタンパク質抑制の持続性
ＳＮＡＬＰ−１８３２８によるＴＴＲのｍＲＮＡおよびタンパク質抑制の持続性を評価するために、ＡＤ−１８３２８をＳＮＡＬＰに製剤化し、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスにＩＶボーラス投与した。投薬後の種々の時点で、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルおよび血清ＴＴＲのタンパク質レベルを定量化した。８〜１２週齢のＶ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウス（４匹の動物／群）に、２００μＬのＳＮＡＬＰ−１８３２８（１ｍｇ／ｋｇ）、またはＳＮＡＬＰ−１９５５（１ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する）を静脈内（ＩＶ）投与した。使用したマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｏｒｔｏ，ＰｏｒｔｕｇａｌからのＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ株Ｈ１２９−ｈＴＴＲ ＫＯであった。簡潔に言えば、ｈＴＴＲ Ｈ１２９トランスジェニックマウスを、Ｈ１２９内因性ＴＴＲ ＫＯマウス（ヌルマウスＴＴＲのバックグラウンドにおいて、Ｈ１２９−ｈＴＴＲトランスジェニックマウスを生成するためのヌルマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７−２０）と交配した。投薬から３日目、８日目、１５日目、または２２日目に、両方の処置群の動物は、致死量のケタミン／キシラジンを与えられた。血清試料は、収集し、分析するまで−８０℃で保存された。肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いることによって、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料に対するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得た。
ＴＴＲタンパク質の定量化については、製造業者のプロトコルに従って、ＡｓｓａｙＰｒｏ（Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）のＡｓｓａｙｍａｘ ＰｒｅＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡキットを用いて、血清をアッセイした。
肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質における結果を、それぞれ、図７Ａおよび図７Ｂに示す。ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍトランスジェニックマウスにおいて、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回ＩＶボーラス投与は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルおよび血清中のＴＴＲタンパク質レベルの持続的な阻害をもたらした。対照群（１ｍｇ／ｍＬ ＳＮＡＬＰ−１９５５）と比較して、１ｍｇ／ｋｇでのＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回ＩＶ投与は、投薬から３日目、８日目、１５日目、および２２日目の相対的ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、それぞれ、９６％（ｐ＜０．００１）、９０％（ｐ＜０．００１）、８２％（ｐ＜０．００１）、および７３％（ｐ＜０．００１）で有意に低下させ、研究の終了時（投薬から２２日目）に、基線レベルに戻らなかった。タンパク質レベルはまた、投薬から３日目で、（ＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して）９７％（ｐ＜０．００１）の血清ＴＴＲの最大の低下を伴い減少した。投薬から８日目、１５日目、および２２日目で、ＴＴＲタンパク質レベルは、ＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して、それぞれ、７２％（ｐ＜０．０５）、３２％（ｐ＜０．０５）、および４０％（ｐ＜０．００１）で抑制された。
これらの結果は、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回ＩＶ投与は、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲトランスジェニックマウスにおいて、標的肝臓ｍＲＮＡおよび血清タンパク質レベルの持続的な抑制を生じ、投薬から２２日目で、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清ＴＴＲタンパク質の有意な低下を得ることを実証する。
実施例８.非ヒト霊長類における、ＳＮＡＬＰ−１８３２８による血清ＴＴＲタンパク質および肝臓ｍＲＮＡ抑制の持続性
ＳＮＡＬＰ−１８３２８による血清ＴＴＲタンパク質抑制の持続性を評価するために、ＡＤ−１８３２８をＳＮＡＬＰに製剤化し、非ヒト霊長類にＩＶ注入により投与した。投薬後の種々の時点で、血清ＴＴＲのタンパク質レベルを定量化した。
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ＳＮＡＬＰ−１８３２８群用のｎ＝５匹の動物／群およびＳＮＡＬＰ−１９５５群およびＰＢＳ群用のｎ＝３匹の動物／群）に、ＳＮＡＬＰ−１８３２８（０．３、１、もしくは３ｍｇ／ｋｇ）、ＳＮＡＬＰ−１９５５（３ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする、陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する）、またはＰＢＳを１５分間のＩＶ注入で投与した。投与期の０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、７日目、１０日目、および１４日目で、血清試料は、収集され、分析まで−８０℃で保存された。
ウエスタンブロット分析を使用して、血清試料中のＴＴＲタンパク質レベルを評価した。それぞれの群からの血清試料は、プールされ、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を用いて１：１に希釈した（β−メルカプトエタノールを１：２０の希釈で添加した）。該試料を９５℃で１０分間加熱した。１２．５μＬのそれぞれの試料を、１０〜２０％ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）調製用ゲルのそれぞれのレーンに装填し、１２０Ｖで１．５時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、次いで、１５Ｖで１時間、セミドライシステムを用いて、ニトロセルロース膜に移した。１×ＰＢＳを用いて１：１に希釈したＬｉＣＯＲ（Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）ブロッキング緩衝液中で、該膜を、終夜４℃でブロックした。まず、ロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）上で室温で１時間、ＬｉＣＯＲブロッキング緩衝液／ＰＢＳ中で１：１０００に希釈した希釈液で、該ブロットを、一次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からのヤギ抗ＴＴＲ）でプローブした。ブロットは、ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて４回洗浄した（洗浄当たり１０分間）。蛍光標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からの抗ヤギ６８０ｎｍ）を、ＬｉＣＯＲブロッキング緩衝液／ＰＢＳ中で１：１０，０００の希釈液で添加し、該ブロットを室温で１時間インキュベートした。インキュベートした後、ブロットを、ＰＢＳ＋０．２％ Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄し、続いて、１ラ ＰＢＳで１回洗浄した。Ｌｉ−ＣＯＲ社のＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、タンパク質バンドを検出した。ＴＴＲモノマーは、１５ｋＤａで移動する。
結果を図８に示す。血清ＴＴＲのタンパク質レベルは、投薬前（０日目）のレベルと比較した場合、１または３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１８３２８で用量依存的な低下を示した。ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回ＩＶ投与後の、抑制の持続性は、１または３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１８３２８での処置から少なくとも１４日間である。
これらの結果は、ＳＮＡＬＰ−１８３２８の単回ＩＶ投与は、非ヒト霊長類（カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））において、血中循環中のＴＴＲタンパク質の持続的な抑制を生じ、投薬から１４日目で、ＴＴＲタンパク質の有意な低下を得ることを実証する。
ＳＮＡＬＰ−１８３２８による肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡ抑制の持続性を評価するために、ＡＤ−１８３２８をＳＮＡＬＰ（ＡＬＮ−ＴＴＲ０１）に製剤化し、非ヒト霊長類に単回ＩＶ注入により投与した。肝臓ｍＲＮＡレベルは、投与後３日目または３０日目に、本明細書に記載されるとおりに測定した。
これらの結果を、図２０に示し、野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのＡＬＮ−ＴＴＲ０１の抑制が、非ヒト霊長類において、投薬量１．０および３．０ｍｇ／ｋｇに対して３日後、ならびに１０ｍｇ／ｋｇの用量で３０日間、持続性があることを実証する。
実施例９.トランスジェニックマウスにおける、ＳＮＡＬＰ−１８３２８による末梢組織中の変異（Ｖ３０Ｍ）ＴＴＲのインビボの低下
予防有効性
末梢組織中のＴＴＲの低下におけるＳＮＡＬＰ−１８３２８（ＡＬＮ−ＴＴＲ０１）の有効性を評価するために、ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウスを、ＴＴＲに対する免疫組織化学染色で評価した。２月齢のｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウス（Ｍａｅｄａ，Ｓ．，（２００３），Ｕｓｅ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｍｉｃｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｍｙｌｏｉｄ Ｐ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ａｍｙｌｏｉｄ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ．Ａｍｙｌｏｉｄ Ｓｕｐｐｌ．１，１７−２０）に、０日目、１４日目、２８日目、および４２日目での合計４回の投薬のために、２週間に１回の３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１８３２８（１２匹の動物）、３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１９５５（非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する、４匹の動物）、またはＰＢＳ（４匹の動物）をＩＶボーラス投与した。複数の末梢組織中のＴＴＲ肝臓ｍＲＮＡレベルおよびＴＴＲ免疫活性は、５６日目の、第１の投薬から８週間で評価された。
マウスに、１ｍｇ／ｋｇのメデトミジンで麻酔をかけ、致死量のケタミンを与えた。対象となる組織および臓器を収集した。免疫組織化学のために、食道（Ｅ）、胃（Ｓ）、腸（十二指腸（Ｉ１）および結腸（Ｉ４））、神経（Ｎ）、ならびに後根神経節（Ｄ）を、中性緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンで包埋した。ＴＴＲ検出のために、ウサギ抗ヒトＴＴＲ一次抗体（１：１０００、ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、および抗ウサギビオチン共役二次抗体（１：２０ Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を、ＴＴＲタンパク質に染色するために、ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ標識体（１：２０，Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）が続いた。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ＡＥＣ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を用いて生じさせた。基質の反応色によって占められる領域を測定し、総画像領域に対してのこの値を正規化する、Ｓｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔプログラムを用いて、免疫組織化学スライドの半定量分析を行った。占領領域の割合（％）の平均値は、対応する標準偏差と共に表示する。それぞれの動物組織を、４つの異なる領域において評価した。胃および腸の副交感神経節中のヒトＴＴＲの存在は、一次抗体としてウサギ抗ヒトＴＴＲ（１：１０００，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）およびマウス抗ＰＧＰ９．５（１：４０，Ｓｅｒｏｔｅｃ，ＵＳＡ）で染色する二重免疫蛍光によって検査され、二次抗体は、それぞれ、抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，ＵＫ）およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，ＵＫ）であった。スライドは、ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に実装され、ＦＩＴＣおよびローダミン用のフィルターを装備するＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で可視化された。
結果を図９に図示する。ＰＢＳおよびＳＮＡＬＰ−１９５５で処置した動物と比較して、ＳＮＡＬＰ−１８３２８で処置した動物は、検査した全ての組織（食道（Ｅ）、胃（Ｓ）、腸（十二指腸（Ｉ１）および結腸（Ｉ４））、神経（Ｎ）、ならびに後根神経節（Ｄ））において、ＴＴＲの免疫活性の有意な低下を得た。
これらの結果は、ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウスへのＳＮＡＬＰ−１８３２８投与は、食道、胃、腸（十二指腸および結腸）、神経、および後根神経節を含む、末梢組織および臓器において、ＴＴＲタンパク質の沈着の有意な低下を生じることを実証する。
治療有効性
ＡＬＮ−ＴＴＲ０１を、成熟ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウスに投与して、変異ヒトＴＴＲの沈着の回帰におけるＴＴＲのｓｉＲＮＡ治療の効果を判定した。
２１月齢の動物群（ｈＴＴＲ Ｖ３０Ｍ／ＨＳＦ−１ノックアウトマウス）に、０日目、１４日目、２８日目、１４日目、５６日目、および７０日目に、３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１または対照ｓｉＲＮＡをＩＶボーラス投与した。７７日目に、マウスに麻酔をかけ、組織を採取し、ＴＴＲの沈着物を、本明細書に記載のＳｃｉｏｎ ｉｍａｇｅ ｑｕａｎｔプログラムを用いて、免疫組織化学染色スライドの半定量分析によってアッセイした。食道、結腸、胃、坐骨神経、および後根神経節を検査し、これらの結果を、この動物モデルにおいて、歴史的データと比較し、これにより、この歳で組織中に存在するＴＴＲの沈着とＴＴＲの線維の両方を実証した。
結果を図２１のグラフに示す。結果は、ＴＴＲのｓｉＲＮＡによる治療が、Ｖ３０Ｍ ｈＴＴＲ組織沈着が存在する９０％を超える回帰をもたらすことを実証する。
実施例１０.ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８による非ヒト霊長類の肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのインビボの低下
非ヒト霊長類において、ｓｉＲＮＡの送達についての新規の脂質ナノ粒子製剤ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰの有効性を評価するために、ＴＴＲのｓｉＲＮＡ ＡＤ−１８３２８を、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ（ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８）に製剤化し、１５分間のＩＶ注入により投与し、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡを定量化した。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８（０．０３、０．１、０．３、または１ｍｇ／ｋｇ）またはＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１９５５（１ｍｇ／ｋｇ、非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を有する）を１５分間のＩＶ注入で投与した。投薬から４８時間後、サルに、ペントバルビタールナトリウムで麻酔をかけ、失血させた。ＴＴＲのｍＲＮＡ決定に対する肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。肝組織中のＴＴＲのｍＲＮＡの定量化のために使用される方法は、上記の実施例５に記載されるものと同様であった。
結果を図１０に示す。ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８は、陰性対照ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１９５５と比較して、用量依存的様式で、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させた。ｍＲＮＡ ＥＤ５０は、約０．１ｍｇ／ｋｇ ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８であると決定した。
これらの結果は、ＸＴＣ−ＳＮＡＬＰ−１８３２８が、ＩＶ注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であることを実証する。
実施例１１.ＬＮＰ０９−１８３２８およびＬＮＰ１１−１８３２８による非ヒト霊長類肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのインビボの低下
非ヒト霊長類において、ｓｉＲＮＡの送達のために、２つの新規の脂質ナノ粒子製剤のＬＮＰ０９およびＬＮＰ１１の有効性を評価するために、ＴＴＲのｓｉＲＮＡ ＡＤ−１８３２８を、ＬＮＰ０９（ＬＮＰ０９−１８３２８）またはＬＮＰ１１（ＬＮＰ１１−１８３２８）に製剤化し、１５分間のＩＶ注入により投与し、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡおよび血清ＴＴＲのタンパク質レベルをアッセイした。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に、ＬＮＰ０９−１８３２８（０．０３、０．１、もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ）、ＬＮＰ１１−１８３２８（０．０３、０．１、もしくは０．３ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＢＳを、１５分間のＩＶ注入により投与した。肝臓生検試料は、投薬から４８時間後に収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。血清は、投薬する前（採血前）、および投薬から１日目、２日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、および２８日目に、収集され、処理するまで−８０℃で保存された。肝組織および血清ＴＴＲタンパク質の評価におけるＴＴＲのｍＲＮＡの定量化に使用された方法は、上記の実施例５および８に記載のものと同様であった。
結果は、ｍＲＮＡについては、図１１Ａ、およびタンパク質については、図１１Ｂおよび図１１Ｃに示す。ＬＮＰ０９−１８３２８およびＬＮＰ１１−１８３２８で処置した動物は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの用量依存的な低下を示し、ＰＢＳ対照と比較して、０．３ｍｇ／ｋｇで、約８５％（ＬＮＰ０９−１８３２８）および約９０％（ＬＮＰ１１−１８３２８）のｍＲＮＡの最大低下率に達した。ｍＲＮＡ ＥＤ５０は、ＬＮＰ０９−１８３２８およびＬＮＰ１１−１８３２８の両方において、約０．０２ｍｇ／ｋｇであると決定した。投薬から７日目で、血清試料もまた、ＰＢＳ対照レベルと比較して、０．１および０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８３２８およびＬＮＰ１１−１８３２８に対して、ＴＴＲタンパク質の用量依存的な低下を示した。図１１Ｃは、ＬＮＰ０９−１８３２８の０．３ｍｇ／ｋｇの用量を有するＴＴＲタンパク質レベルの減少が、ＰＢＳ対照群と比較して、および採血前の試料と比較して、投薬から少なくとも２８日間にわたって存続することを示す。
これらの結果は、ＬＮＰ０９−１８３２８およびＬＮＰ１１−１８３２８が、ＩＶ注入による投与時に、非ヒト霊長類肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡおよび血中循環中の野生型ＴＴＲタンパク質を抑制するのに効果的であることを実証する。さらになお、ＬＮ０９−１８３２８による抑制は、持続し、ＩＶ注入から少なくとも２８日間存続する。
実施例１２.ＬＮＰ１２−１８３２８による非ヒト霊長類の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのインビボの低下
ＬＮＰ１２を製剤化したＡＤ−１８３２８を、非ヒト霊長類に投与して、この製剤の有効性を評価した。
ＬＮＰ１２−１８３２８製剤は、Ｊｅｆｆｓら（Ｊｅｆｆｓ ＬＢ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ，Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ ２２：３６２−３７２）から編集されている方法を用いて調製した。簡潔に言えば、Ｔｅｃｈ−Ｇ１（上述の）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびｍＰＥＧ２０００−ＤＭＧを、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で９０％のエタノール中で可溶化した。ｓｉＲＮＡを、０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で、１０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３緩衝液中で可溶化した。エタノール脂質溶液およびｓｉＲＮＡ水溶液は、等価低積流量で複式ポンプヘッドを備えた蠕動ポンプによって汲み上げられ、「Ｔ」分岐において混合された。脂質は、７：１（ｗｔ：ｗｔ）の総脂質のｓｉＲＮＡに対する比率で、ｓｉＲＮＡと組み合わされた。自然発生的に形成されたＬＮＰ１２−１８３２８製剤を、ＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）に対して透析して、エタノールを除去し、緩衝液交換した。この製剤は、約９０パーセントのｓｉＲＮＡ封入効率を有する平均粒子直径８０ｎｍを得た。
カニクイザル（ｎ＝３／群）は、橈側皮静脈による１５分間の静脈内注入（５ｍＬ／ｋｇ）として、ＰＢＳ、あるいは０．０３、０．１、もしくは０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ１２−１８３２８のいずれかを与えた。肝生検は、投与してから４８時間後、動物から採取した。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルに対するＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、本明細書に記載される肝臓試料中で判定した。
図１９に示すように、野生型トランスチレチン（ＴＴＲ）遺伝子の高いレベルの特異的なノックダウンが、わずか０．０３ｍｇ／ｋｇの用量で観察された。これにより、ＬＮＰ１２製剤が、いかなる前述の肝臓への送達システムによって必要とされるものよりも数桁低い用量で、遺伝子の発現停止を促進することが実証された。
実施例１３.ＴＴＲが並べられた配列の合成
ＡＤ−１８３２８の標的領域付近でＴＴＲ遺伝子を標的とされる、ＴＴＲ二重鎖（「並べられた（tiled）二重鎖」）のセットを設計し、これは、ＮＭ＿０００３７１．３のヌクレオチド６２８で開始するヒトＴＴＲ遺伝子を標的とする。
下の実施例では、転写物上のｓｉＲＮＡの５′位の塩基を示す番号付けは、ＮＭ＿０００３７１．３（図１２、配列番号１３３１）に基づく。上記の実施例では、ヒトｓｉＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡの番号付けは、ＮＭ＿０００３７１．２（図１３Ａ）に基づく。ＮＭ＿０００３７１．３は、図１４に示すように、ＮＭ＿０００３７１．２と比較して、１１０塩基まで５′ＵＴＲの配列を延在する。したがって、一例として、ＡＤ−１８３２８の開始位置は、ＮＭ＿０００３７１．３上の６２８およびＮＭ＿０００３７１．２上の５１８である（図１４）。
１μモルの規模で、ＭｅｒＭａｄｅ １９２合成機において、ＴＴＲが並べられた配列を合成した。配列表の全ての配列については、「エンドライト」化学反応を以下の詳細のように適用した。
・センス鎖内の全てのピリミジン（シトシンおよびウリジン）は、２′−Ｏ−メチル塩基（２′ Ｏ−メチルＣおよび２′−Ｏ−メチルＵ）を含有した。
・アンチセンス鎖では、リボＡヌクレオシドに隣接する（５′位に向かって）ピリミジンは、それらの対応する２−Ｏ−メチルヌクレオシドと置換された。
・センスおよびアンチセンス配列の両方の３′末端で、２つの塩基ｄＴｄＴの拡張を導入した。
・配列ファイルをテキストファイルに変換し、ＭｅｒＭａｄｅ１９２合成ソフトウェアにおける負荷に対して互換性を保つようにした。
合成、切断、および脱保護：
ＴＴＲ配列の合成は、ホスホラミダイト化学反応を用いて、固定支持されたオリゴヌクレオチド合成を使用した。９６ウェルプレート中の１ｕｍの規模で、配列の合成を行った。アミダイト溶液を、０．１Ｍ 濃度で調製し、エチルチオテトラゾール（アセトニトリル中０．６Ｍ）を活性剤として使用した。合成した配列を切断し、第１のステップにおいてメチルアミン、および第２のステップにおいて、フッ化物試薬を用いて、９６ウェルプレート中に脱保護した。粗配列は、アセトン：エタノール（８０：２０）の混合液を用いて、沈殿させ、ペレットを、０．２Ｍ 酢酸ナトリウム緩衝液中に再懸濁させた。それぞれの配列からの試料を、定量化のための紫外線の同一性を確認するために、ＬＣ−ＭＳによって、および純度を決定するために、ＩＥＸクロマトグラフィーによって選択された試料のセットを分析した。
精製および脱塩：
ＴＴＲが並べられた配列は、Ｓｏｕｒｃｅ １５Ｑカラムを用いて、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システムにおいて精製した。６５℃のカラム温度を精製中維持した。試料の注射および収集を、９６ウェル（１．８ｍＬの深いウェル）プレート中で行った。完全長配列に対応する単一ピークを、溶離液中に収集した。ＡＫＴＡ精製器を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラム上に精製された配列を、脱塩した。濃度（Ａ２６０での紫外線測定によって）および純度（イオン交換ＨＰＬＣによって）のために、脱塩したＴＴＲ配列を、分析した。次いで、アニーリングのために単鎖を提出した。
ＴＴＲの単鎖および二重鎖：
ＴＴＲが並べられた二重鎖および対応する単鎖（センスおよびアンチセンス）の詳細な表を、下表（表１３）に示す。
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実施例１４.ＴＴＲが並べられたｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
ＴＴＲが並べられた二重鎖を、リアルタイムＰＣＲアッセイを用いて、内因性ＴＴＲの発現の阻害のために、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内でアッセイした。
細胞培養およびトランスフェクション：Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、トリプシン処理によりプレートから放出される前に、１０％ ＦＢＳ、ストレプトマイシン、およびグルタミン（ＡＴＣＣ）で補完されるイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＴＣＣ）中の５％ ＣＯ２の雰囲気下で、３７℃でほぼコンフルエントまで増殖した。９６ウェルプレートの個々のウェル中に、５μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭを５μＬのそれぞれのｓｉＲＮＡに添加することによって、逆転写を実行した。これに、１０μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号＃１３７７８−１５０）を、ウェルごとに添加し、混合物を室温で１５分間インキュベートした。次いで、上記のものであるが、２．０×１０４ Ｈｅｐ３Ｂ細胞を含有する抗生物質を含有しない、８０μＬの完全成長培地を添加した。ＲＮＡ精製前に、細胞を、２４時間インキュベートした。０．１または１０ｎＭの最終２重濃度で実験を行った。
ＭａｇＭＡＸ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ，部品番号＃：ＡＭ１８３０）を用いた総ＲＮＡ単離：細胞は、採集され、１４０μＬの溶解／結合溶液中で溶解され、次いで、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで１分間混合した（混合速度は、過程を通して同一であった）。２０マイクロリットルの電磁ビーズおよび溶解／結合エンハンサーの混合物を、細胞溶解物に添加し、５分間混合した。磁気ビーズは、磁気スタンドを用いて捕捉し、ビーズを妨害することなく、浮遊物を除去した。浮遊物を除去した後、磁気ビーズを洗浄液１（イソプロパノールを添加）で洗浄し、１分間混合した。ビーズを再度捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、ビーズを１５０μＬの洗浄液２（エタノールを添加）で洗浄し、捕捉し、浮遊物を除去した。次いで、５０μＬのＤＮアーゼ混合物（ＭａｇＭａｘ ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ ＢｕｆｆｅｒおよびＴｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ）をビーズに添加し、それらを１０〜１５分間混合した。混合後、１００μＬのＲＮＡ再生溶液を添加し、３分間混合した。浮遊物を除去し、磁気ビーズを１５０μＬの洗浄液２で再度洗浄し、１分間混合し、浮遊物を完全に除去した。磁気ビーズを２分間混合し、ＲＮＡを５０μＬの水で溶離する前に乾燥させた。
ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成：２μＬの１０×緩衝液、０．８μＬの２５×ｄＮＴＰ、２μＬのランダムプライマー、１μＬの逆転写酵素、１μＬのＲＮａｓｅ阻害剤、および反応当たり３．２μＬのＨ２Ｏのマスターミックスを、１０μＬの総ＲＮＡに添加した。以下のステップを通して、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００のサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒間、４℃で保持。
リアルタイムＰＣＲ：２μＬのｃＤＮＡを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ＃０４７２９７４００１）中のウェル当たり、０．５μＬのＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｔ＃４３２６３１７Ｅ）、０．５μＬのＴＴＲ ＴａｑＭａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｃａｔ＃ＨＳ００１７４９１４ Ｍ１）、および１０μＬのＲｏｃｈｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃０４８８７３０１００１）を含有するマスターミックスに添加した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲ機械（Ｒｏｃｈｅ）において、リアルタイムＰＣＲを行った。それぞれの二重鎖を、２つの独立したトランスフェクションにおいて試験し、それぞれのトランスフェクションを二重でアッセイした。
ΔΔＣｔ法を用いて、リアルタイムデータを分析した。それぞれの試料を、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化し、非標的二重鎖ＡＤ−１９５５でトランスフェクションした細胞と比較してノックダウンを評価した。表１４は、ｓｉＲＮＡを用いた、ＴＴＲのノックダウンを示す。データは、ＡＤ−１９５５で標的とされた細胞に対して、メッセージの残存する割合（％）として表される。
ＡＤ−１８３２８の標的近くのＴＴＲを標的とする、多数ではあるが、全てではない並べられたＴＴＲ−ｄｓＲＮＡは、０．１ｎＭで、Ｈｅｐ３Ｂ細胞にトランスフェクションされる場合、ＴＴＲのｍＲＮＡ少なくとも７０％低下した。
Figure 2019089799
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実施例１５.Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回静脈内投与の有効性における注入期間の評価
目的
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルにおけるＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回ＩＶ注入の有効性における注入期間の効果を決定すること。
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上表からのＡＤ−１８５３４のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列を、以下に再現する。
Figure 2019089799
研究材料
試験物質
ＳＮＡＬＰ−１８５３４は、標的組織に送達するために、安定な核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）に製剤化される、齧歯類ＴＴＲのｍＲＮＡ（ＡＤ−１８５３４）を標的とするｓｉＲＮＡからなる。ＳＮＡＬＰ製剤（脂質粒子）は、新規のアミノ脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ＰＥＧ化脂質（ｍＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ）、中性脂質（ＤＰＰＣ）、およびコレステロールからなる。ＳＮＡＬＰ製剤中の脂質：核酸の比は、約５．８：１（ｗ：ｗ）である。ＳＮＡＬＰ−１９５５は、ＳＮＡＬＰ−１８５３４として同一の脂質粒子で製剤化される、非哺乳動物のルシフェラーゼｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを含有し、非薬理学的に活性な対照としての役割を果たす。用量レベルは、ｓｉＲＮＡ含有量の重量に基づいて、ｍｇ／ｋｇとして表す。
研究設計＆手順
動物および試験物質の投与：
研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの９つの群（４匹の雄／群）からなった。動物は、研究前の少なくとも２日間の順応期間が与えられ、全ての動物は、投薬開始時、７週齢であった。投与された用量は、１日目の投薬前に収集された体重データに基づいて計算された。試験および対照物質は、Ｂａｘｔｅｒ ＡＳ４０Ａ注射器ポンプに２７Ｇ テルモ翼状針を介して接続されたＢａｘｔｅｒ注射部位の隔膜で密閉された２４Ｇ ３／４”のカニューレを用いて、尾静脈を介して、単回１５分間、１時間、２時間、または３時間のＩＶ注入として投与された。投与容量は、３ｍＬ／ｋｇであり、注入速度は、１２ｍＬ／ｋｇ／時であり、動物は、投薬中、ケージ中で自由に行動していた。ラットは、９つの処置群に分割され、表１６に示されるように、ＳＮＡＬＰ−１８５３４、ＳＮＡＬＰ−１９５５、またはＰＢＳの単回ＩＶ注入で投与した。
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組織収集およびＲＮＡ単離：
０日目に、イソフルレン吸入で動物に麻酔をかけ、投薬前の血液試料を、ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄにより血清分離管に収集した。４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間、血液試料を凝固させた。次いで、血清試料は、分析が行われるまで、−８０℃で保存された。３日目に、全ての９つの処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。後大静脈を介して血清分離管に血液を収集し、次いで、４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間、凝固させた。血清試料は、分析が行われるまで、−８０℃で保存された。肝組織は、収穫され、ドライアイス上で瞬間凍結された。凍結された肝組織は、粉砕され、組織溶解物は、肝臓ｍＲＮＡの定量化のために調製された。
ＴＴＲのｍＲＮＡの定量化：
分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いることによって、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料に対するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。
ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得るために、１５分間、１時間、および２時間の注入時間でのＳＮＡＬＰ−１９５５およびＳＮＡＬＰ−１８５３４処置群に対する群平均値は、次いで、１５分間の注入時間でのＰＢＳ処置群に対する平均値に対して正規化され、一方、３時間の注入時間でのＳＮＡＬＰ−１９５５およびＳＮＡＬＰ−１８５３４処置群に対する群平均値は、次いで、３時間の注入時間でのＰＢＳ処置群に対する平均値に対して正規化された。
結果
図１６に示されるように、１５分間〜３時間の異なる注入時間での１ｍｇ／ｋｇ ＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回ＩＶ注入は、投薬から２日後に測定された肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに匹敵する阻害をもたらす。１ｍｇ／ｋｇ ＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回ＩＶ注入はまた、ＳＮＡＬＰ−１９５５対照と比較した場合、１５分間の単回ＩＶ注入から２９日間にわたって持続的なＴＴＲの下方調節を示した（データは示さず）。ＰＢＳ処置群と比較して、１ｍｇ／ｋｇにて、ＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回１５分間、１時間、２時間、または３時間のＩＶ注入は、相対ＴＴＲのｍＲＮＡの発現レベルを、それぞれ、９４％（ｐ＜０．００１）、９４％（ｐ＜０．００１）、９２％（ｐ＜０．００１）、および９３％（ｐ＜０．００１）有意に低下させた。ＳＮＡＬＰ−１８５３４活性の特異性は、同一の用量レベルで、１時間、２時間、または３時間のＩＶ注入でのＳＮＡＬＰ−１９５５投与による有意な標的阻害の欠如により実証される。
結論
本研究は、１５分間から最長３時間の異なる注入時間が、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの低下により評価されるように、ラットにおいて、１ｍｇ／ｋｇ ＳＮＡＬＰ−１８５３４の単回ＩＶ投与の有効性に影響を及ぼさないことを実証する。
実施例１６.ＬＮＰ０７−１８５３４およびＬＮＰ０８−１８５３４によるラット肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡのインビボの低下
ラットにおいて、ｓｉＲＮＡの送達のための２つの新規の脂質ナノ粒子製剤のＬＮＰ０７およびＬＮＰ０８の有効性を評価するために、齧歯類特異的なＴＴＲのｓｉＲＮＡ、ＡＤ−１８５３４が、ＬＮＰ０７（ＬＮＰ０７−１８５３４）またはＬＮＰ０８（ＬＮＰ０８−１８５３４）に製剤化され、１５分間のＩＶ注入により投与され、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡが定量化された。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（群当たり４匹の動物）に、ＬＮＰ０７−１８５３４（０．０３、０．１、０．３、もしくは１ｍｇ／ｋｇ）、ＬＮＰ０８−１８５３４（０．０１、０．０３、もしくは０．１ｍｇ／ｋｇ）、または非哺乳動物のルシフェラーゼ遺伝子を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１９５５を含有するＬＮＰ０７−１９５５（１ｍｇ／ｋｇ）もしくはＬＮＰ０８−１９５５（０．１ｍｇ／ｋｇ）の１５分間のＩＶ注入により投与された。４８時間後、動物に麻酔をかけ、肝組織は、収集され、急速冷凍され、処理するまで−８０℃で保存された。
ＴＴＲのｍＲＮＡ定量化のために、冷凍の肝組織を粉末に粉砕し、溶解物を調製した。分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いることによって、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料に対するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次いで、正規化した値の群平均を、ＰＢＳ処置群に対する平均値に対してさらに正規化し、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得た。
結果を図１７に示す。ＬＮＰ０７−１８５３４は、用量依存的な様式で、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させ、１ｍｇ／ｋｇでＴＴＲのｍＲＮＡの９４％抑制を得た。１ｍｇ／ｋｇで陰性対照ＬＮＰ０７−１９５５が、ＰＢＳ対照と比較して、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに大きな影響を及ぼさなかったため、効果は、特異的であった。ｍＲＮＡ ＥＤ５０は、約０．０５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０７−１８５３４であることが確認された。ＬＮＰ０８−１８５３４は、用量依存的な様式で、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させ、０．１ｍｇ／ｋｇでＴＴＲのｍＲＮＡの８６％抑制を得た。０．１ｍｇ／ｋｇで陰性対照ＬＮＰ０８−１９５５が、ＰＢＳ対照と比較して、ＴＴＲのｍＲＮＡレベルに大きな影響を及ぼさなかったため、効果は、特異的であった。ｍＲＮＡ ＥＤ５０は、約０．０２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０８−１８５３４であることが確認された。
これらの結果は、ＬＮＰ０７−１８５３４およびＬＮＰ０８−１８５３４が、ＩＶ注入により投与された場合、ラット肝臓中の野生型ＴＴＲのｍＲＮＡを抑制するのに効果的であり、ＬＮＰ０７およびＬＮＰ０８が、肝臓にｓｉＲＮＡを送達するために効果的な製剤であることを実証する。
実施例１７.Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＬＮＰ０９−１８５３４またはＬＮＰ１１−１８５３４の単回静脈内投与によるＴＴＲ肝臓のｍＲＮＡの低下
目的：
内因性（野生型）肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡレベルを低下させることに対する、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、齧歯類ＴＴＲ特異的なｓｉＲＮＡのＡＤ−１８５３４の送達のための２つの新規の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の有効性を評価すること。ラットに、０．０１、０．０３、０．１、もしくは０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ０９−１８５３４、ＬＮＰ１１−１８５３４、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のいずれかで１５分間の注入を介して静脈内に投与し、ＴＴＲ肝臓のｍＲＮＡレベルを、処置から４８時間後にアッセイした。
材料および方法：
ＬＮＰ０９製剤：（ＸＴＣ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４）＝５０／１０／３８．５／１．５モル％、脂質：ｓｉＲＮＡ 約１１：１。ＬＮＰ１１製剤：（ＭＣ３／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ２０００−Ｃ１４）＝５０／１０／３８．５／１．５モル％、脂質：ｓｉＲＮＡ 約１１．１：１。
組織収集およびＲＮＡ単離：３日目に、全ての処置群の動物に、致死量のケタミン／キシラジンを与えた。後大静脈を介して血清分離管に血液を収集し、次いで、４℃で遠心分離を行う前に、室温で約３０分間、凝固させた。血清試料は、分析が行われるまで、−８０℃で保存された。肝組織は、収穫され、ドライアイス上で瞬間凍結された。凍結された肝組織は、粉砕され、組織溶解物は、肝臓ｍＲＮＡの定量化のために調製された。
ＴＴＲのｍＲＮＡの定量化：分岐ＤＮＡアッセイ（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いることによって、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルと比較したＴＴＲのｍＲＮＡレベルを、溶解物中で決定した。簡潔に言えば、製造業者の取扱説明書に従って、組織試料の溶解物中のｍＲＮＡレベルを定量化するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅアッセイ（Ｇｅｎｏｓｐｅｃｔｒａ）を使用した。ＴＴＲのｍＲＮＡの平均レベルを、それぞれの試料に対するＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化した。次いで、群平均値は、ＰＢＳ処置群に対する平均値に対して正規化され、ＴＴＲのｍＲＮＡの発現の相対レベルを得た。
結果：
図１８に示されるように、ＰＢＳ処置動物と比較して、ＬＮＰ０９−１８５３４およびＬＮＰ１１−１８５３４で処置した動物は、肝臓中のＴＴＲのｍＲＮＡレベルの有意な用量依存的な低下を有し、ＰＢＣ対照群と比較して、０．３ｍｇ／ｋｇで、ＬＮＰ０９およびＬＮＰ１１製剤化群の両方に対して、約９０％のｍＲＮＡの最大低下率に達し、用量は、ＬＮＰ１１−１８５３４の０．０３ｍｇ／ｋｇ未満で、ＬＮＰ０９−１８５３４の０．１ｍｇ／ｋｇ未満で、５０％低下（ＥＤ５０）に達した。
結論
本研究は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＬＮＰ０９−１８５３４またはＬＮＰ１１−１８５３４の単回１５分間のＩＶ注入が、肝臓ＴＴＲのｍＲＮＡの用量依存的な低下をもたらすことを実証する。これらのデータは、内因性に発現した（野生型）ＴＴＲ ｍＲＮＡを、ＬＮＰ１１−１８５３４およびＬＮＰ０９−１８５３４についてそれぞれ０．０３ｍｇ／ｋｇ未満および０．１ｍｇ／ｋｇ未満のＥＤ５０レベルで低下させる、ＬＮＰ０９−１８５３４およびＬＮＰ１１−１８５３４の有効性を実証する。
実施例１８.動物における毒性に対するアッセイ
ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、非ＧＬＰおよびＧＬＰ条件下で、安全性および毒物学のアッセイを行った。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、ＳＮＡＬＰ製剤（ＤＬｉｎＤＭＡ／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ２０００−ｃＤＭＡ（５７．１／７．１／３４．４／１．４）脂質：ｓｉＲＮＡ約７）中のｓｉＲＮＡ ＡＤ−１８３２８である。アッセイは、カニクイザル（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ）およびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（０．３、１、３、および６ｍｇ／ｋｇ）において行われた。ラットにおいて１ｍｇ／ｋｇ以下で、ＮＨＰにおいて３ｍｇ／ｋｇ以下でＡＬＮ−ＴＴＲ０１の毒性は見出されなかった。（データは示さず）。
実施例１９.薬物製品ＡＬＮ−ＴＴＲ０１
薬物製品ＡＬＮ ＴＴＲ０１ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎは、等張リン酸緩衝生理食塩水中の脂質賦形剤（安定核酸脂質粒子［ＳＮＡＬＰ］と称される）を含むｓｉＲＮＡ ＡＬＮ−１８３２８の白色からオフホワイト色の均質な滅菌脂質懸濁液である。ＡＬＮ ＴＴＲ０１の組成物は、下表に示される。
Figure 2019089799
脂質賦形剤は、下表に示される分子量および構造を有する。
Figure 2019089799
 ・ａ 別名：ｍＰＥＧ２０００−Ｃ−ＤＭＡ
ＡＬＮ ＴＴＲ０１薬物製品は、５．５ｍＬの充填量を有する１０ｍＬのガラス製バイアル中に包装される（バイアル当たり１１ｍｇのＡＬＮ−１８３２８）。容器の閉鎖システムは、ＵＳＰ／ＥＰのＩ型ホウケイ酸塩ガラス製バイアル、テフロン表面加工ブチルゴム栓、およびアルミニウム製フリップオフキャップからなる。薬物製品は、５±３℃で保管される。
薬物製品の安定性は、最長２４ヶ月間アッセイされ、以下の基準を用いて判定される。
外観：白色からオフホワイト色、均質な乳白色の液体、異物なし
ｐＨ：６．８〜７．８
オスモル濃度：２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ
脂質：ｓｉＲＮＡ比：５．６〜８．４ｍｇ／ｍｇ
粒径（Ｚ−平均）：６０〜１２０ｎｍ＜０．１５．
実施例２０.ＡＲＰＥ１９細胞におけるＡＤ−１８３２４によるインビトロでのヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現の低下
インビトロでのＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるＴＴＲのｓｉＲＮＡの効果を判定するために、ｓｉＲＮＡ ＡＤ−１８３２４およびＡＤ−１８５３４が、ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞において試験された。
ＡＤ−１８３２４は、ヒトＴＴＲのｓｉＲＮＡの二重鎖であり、ＡＤ−１８５３４は、ラットＴＴＲのｓｉＲＮＡの二重鎖である。ＡＤ−１８５３４およびＡＤ−１８３２４のセンスおよびアンチセンス鎖の配列を、以下に再現する。
Figure 2019089799
対照ｓｉＲＮＡは、ＬＵＣ遺伝子を標的とするＡＤ−１９５５であった。
ＡＲＰＥ−１９細胞は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした。この方法の幾つかの実施形態において、コレステロールまたはアテロコラーゲンを含む、他のトランスフェクション剤を用いることができる。２４時間インキュベーション後、５０〜６０％コンフルエントのＡＲＰＥ−１９細胞は、製造業者の取扱説明書に従って、ＡＤ−１８５３４またはＡＤ−１８３２４により一過性にトランスフェクションした。総ＲＮＡは、トランスフェクションの開始から４８時間後、リアルタイム定量ＰＣＲ法のために単離された。ＡＲＰＥ−１９細胞は、１ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは５０ｎＭのＡＤ−１８５３４で、または１ｎＭ、１０ｎＭ、もしくは５０ｎＭのＡＤ−１８３２４で投与された。
ＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、リアルタイム定量ＰＣＲ法によって測定された。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによってトランスフェクションした細胞から単離された。総ＲＮＡ（０．５μｇ）は、製造業者のプロトコルに従って、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いることによってｃＤＮＡに逆転写させた。それぞれのＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて、２μＬのｃＤＮＡおよび０．２μｍｏｌ／Ｌのそれぞれのプライマーを用いて実施された。以下のプライマーが使用された：ヒトＴＴＲ（順方向：５′−ＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣ−３′（配列番号１４１５）、逆方向：５′−ＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧ−３′（配列番号１４１６）。ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるヒトＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して算出された。
ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、用量依存性様式で、ＡＤ−１８３２４によって著しく低下した。結果を図２２に示す。１ｎＭ用量のＡＤ−１８３２４は、対照ｓｉＲＮＡ群と比較して、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの相対的発現の少なくとも１０％低下をもたらした。１０ｎＭ用量のＡＤ−１８３２４は、対照ｓｉＲＮＡ群と比較して、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの相対的発現の少なくとも４０％低下をもたらした。５０ｎＭ用量のＡＤ−１８３２４は、対照ｓｉＲＮＡ群と比較して、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの相対的発現の少なくとも６０％低下をもたらした。ＡＤ−１８５３４は、それぞれの用量で、ヒトＴＴＲの相対的発現において顕著な低下を生じなかった。対照と比較して、Ｉｌ−６またはＴＮＦ−αレベルにおける効果がなかった。
これらの結果は、ＡＤ−１８３２４が、用量依存性様式で、ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞において、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡの発現を阻害するするのに有効であり、炎症反応を生じないことを実証する。
実施例２１.ダークアグーチ（ＤＡ）ラットにおけるＡＤ−１８５３４による内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現のインビボの低下
内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるラットＴＴＲのｓｉＲＮＡの効果を判定するために、二重鎖ＡＤ−１８５３４が、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットにおいて、インビボで試験された。
ＡＤ−１８５３４のセンスおよびアンチセンス鎖の配列は、上述される。
ＤＡラットは、ＡＤ−１８５３４をそれらの硝子体腔中に注射した。成熟ラットを、ジエチルエーテル吸入によって麻酔した。瞳孔を拡張するために、１〜２滴の１％のトロピカミドをラットの眼に適用した。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび３３ゲージの針を用いて、ｓｉＲＮＡの硝子体内注射を実施した。注射した体積は、硝子体体積が、できる限り正常に近い状態であるように、５μＬであった。２４時間後、ラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体を、分析用の後嚢カップから網膜を除去することによって単離した。他の方法を用いて、ｓｉＲＮＡ送達を最適化することができ、これには、用量の量または用量の時期を変更することが含まれる。幾つかの実施形態において、注射方法は、結膜下腔または網膜下を含む、眼の別の部分で起こる場合がある。他の実施形態において、注射した生理食塩水またはｓｉＲＮＡの量は、増加させてもよい。
ラットのＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、リアルタイム定量ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）によって測定された。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによってそれぞれのＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体から単離された。総ＲＮＡは、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いることによってｃＤＮＡに逆転写させた。それぞれのＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行われた。以下のプライマーが使用された：ラットＴＴＲ（順方向：５′−ＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧ−３′（配列番号１４１７）；逆方向：５′−ＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡ−３′（配列番号１４１８））。ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して算出された。
図２３は、対照ｓｉＲＮＡ、生理食塩水、または非処置を投与されたＤＡラットと比較して、ＡＤ−１８５３４を注射した後のＤＡラットにおける、内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現の阻害を示す（ｐ＜０．０１）。ＡＤ−１８３５４で処置したＤＡラットは、対照ｓｉＲＮＡ群および生理食塩水対照群と比較して、内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現において、少なくとも６０％低下を示した（ｐ＜０．０１）。
これらの結果は、ＡＤ−１８３５４が、ＤＡラットの網膜色素上皮細胞において、内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現を抑制するのに活性があることを実証する。
実施例２２.ＡＴＴＲ Ｖ３０Ｍトランスジェニック（Ｔｇ）ラットにおける、ＡＤ−１８３２４によるＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現のインビボの低下
ヒト変異体（Ｖ３０Ｍ）ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるＴＴＲのｓｉＲＮＡのＡＤ−１８３２４の効果を評価するために、ＡＤ−１８３２４は、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍトランスジェニック（Ｔｇ）ラットの網膜色素上皮細胞において、インビボで試験された。
ヒトＡＴＴＲのＶ３０Ｍ遺伝子を保有するトランスジェニックラットは、それらの硝子体腔中に、ＡＤ−１８３２４を注射した。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび３３ゲージの針を用いて、ＡＤ−１８３２４のｓｉＲＮＡの硝子体内注射を実施した。２４時間後、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ Ｔｇラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるＡＤ−１８３２４の効果を評価するために、網膜を後嚢カップから取り出すことによって、ＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体を単離した。ＡＤ−１８３２４のｓｉＲＮＡを、３３ゲージの針を用いて、硝子体腔中に、注射した。２４時間後、網膜色素上皮を単離して、ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるＡＤ−１８３２４の効果を評価した。
ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、リアルタイムＰＣＲ法によって測定された。総ＲＮＡは、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いることによってｃＤＮＡに逆転写させた。それぞれのＰＣＲ法は、Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行われた。以下のプライマーが使用された：ヒトＴＴＲ（順方向：５′−ＧＣＣＧＴＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＡ−３′（配列番号１４１９）、逆方向：５′−ＧＣＴＣＴＣＣＡＧＡＣＴＣＡＣＴＧＧＴＴＴＴ−３′（配列番号１４２０））。プローブが、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｌｉｂｒａｒｙ（プローブ番号＃６６、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって提供された。ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ ＴｇラットにおけるラットＧＡＰＤＨの発現と比較して算出された。
図２４は、対照ｓｉＲＮＡ群、生理食塩水群、および非処置群と比較した、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ ＴｇラットのＲＰＥ細胞におけるＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現の有意な低下を示す。ＡＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、非処置群と比較して、少なくとも６０％低下した。
ウエスタンブロット分析を用いて、ＡＴＴＲタンパク質の発現を評価した。ラットから等量の水性の体液タンパク質を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に移した。膜を、２．５％の無脂肪乳でブロックし、ウサギポリクローナル抗ＴＴＲであった一次抗体（希釈１：１０００、Ｄａｋｏ）で、４℃で終夜インキュベートし、続いて、二次反応として、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役したヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（希釈１：１０００、Ｄａｋｏ）で、室温で１時間インキュベートした。免疫複合体は、ＥＣＬ＋ウエスタンブロット検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて可視化した。
結果を図２５に示す。ＡＴＴＲタンパク質の発現は、対照ｓｉＲＮＡの注射後、ＡＴＴＲタンパク質の発現と比較して、ＡＤ−１８３２４により有意に低下した。
これらの結果は、ＡＴＴＲのＶ３０Ｍ ＴｇラットにおけるＡＤ−１８３２４の硝子体内注射が、ヒトＴＴＲのｍＲＮＡおよびＲＰＥにおけるタンパク質の発現を有意に低下させることを実証する。
実施例２３.コレステロールとコンジュゲートしたＡＤ−１８５３４を用いたダークアグーチ（ＤＡ）ラットにおける内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現のインビボの低下
内因性ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現におけるコレステロールとコンジュゲートしたラットＴＴＲのｓｉＲＮＡの効果を判定するために、二重鎖ＡＤ−２３０４３が、ダークアグーチ（ＤＡ）ラットにおいて、インビボで試験された。
ＡＤ−２３０４３は、以下の配列を有するコレステロールとコンジュゲートしたｓｉＲＮＡである。
Figure 2019089799
ＤＡラットは、ＡＤ−２３０４３をそれらの硝子体腔中に注射された。成熟ラットを、ジエチルエーテル吸入によって麻酔した。瞳孔を拡張するために、１〜２滴の１％のトロピカミドをラットの眼に適用した。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび３３ゲージの針を用いて、ｓｉＲＮＡ（５μｇ）の硝子体内注射を実施した。注射した体積は、硝子体体積が、できる限り正常に近い状態であるように、５μＬであった。１４日または２１日後、ラットは、ジエチルエーテル吸入によって殺処分され、眼は、その後の解離のために採取された。眼は、角膜および水晶体を別々にして、後嚢カップに入れた。ＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体を、分析用の後嚢カップから網膜を除去することによって単離した。
ラットのＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、リアルタイム定量ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）によって測定された。総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いることによってそれぞれのＲＰＥ−脈絡膜−強膜の複合体から単離された。総ＲＮＡは、ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ試薬（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いることによってｃＤＮＡに逆転写させた。それぞれのＰＣＲ法は、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行われた。以下のプライマーが使用された：ラットＴＴＲ（順方向：５′−ＴＧＣＣＴＣＧＣＴＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＴＴＧ−３′（配列番号１４２４）；逆方向：５′−ＴＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＣＡＣＧＧＣＣＡＣＡ−３′（配列番号１４２３））。ラットＴＴＲのｍＲＮＡの発現は、ラットＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して算出された。
結果を図２６および図２７に示す。ラットＴＴＲを標的とするコレステロール共役したｓｉＲＮＡは、対照ｓｉＲＮＡと比較して、内因性ラットＴＴＲの発現を約４０％低下させた。
実施例２４.ヒトにおける眼アミロイドーシスの処置
ヒトにおける眼アミロイドーシスの治療のために、本発明において使用された医薬組成物は、処置の侵襲性に依存して、および局所的または全身的治療が望ましいかどうかに基づいて、多くの方法において投与することができる。好ましい初期治療は、点眼、軟膏、経口投与、または注入によって実施することができる。非経口投与には、皮下眼瞼、結膜下注射、テノン嚢下注射、球後注射、前房注射、硝子体注射、または眼血管注射が含まれる。

Claims (26)

  1. 対象の網膜色素上皮におけるＴＴＲの発現を低下させるための方法であって、十分な量のｄｓＲＮＡを前記対象の網膜に投与することを含み、前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４またはＡＤ−１８５３４またはＡＤ−２３０４３である、方法。
  2. 前記ｄｓＲＮＡは、コレステロール分子にコンジュゲートされる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象は、ヒトである、請求項１に記載の方法。
  4. 前記対象は、ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療を必要とするヒトである、請求項３に記載の方法。
  5. 前記対象は、Ｖ３０Ｍ ＴＴＲ遺伝子を含むヒトである、請求項３に記載の方法。
  6. 前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である、請求項３に記載の方法。
  7. ＴＴＲの発現が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）において低下される、請求項３に記載の方法。
  8. ＴＴＲ ｍＲＮＡの発現が、対照と比較して、少なくとも４０％または少なくとも６０％低下される、請求項３に記載の方法。
  9. 投与が、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項３に記載の方法。
  10. 前記対象は、ダークアグーチ（Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ）（ＤＡ）ラットである、請求項１に記載の方法。
  11. 前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８５３４である、請求項１０に記載の方法。
  12. ＴＴＲの発現が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）において低下される、請求項１０に記載の方法。
  13. ＴＴＲ ｍＲＮＡの発現が、対照と比較して、少なくとも６０％低下される、請求項１０に記載の方法。
  14. 投与が、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記対象は、ヒトＡＴＴＲのＶ３０Ｍ遺伝子を有するトランスジェニックラットである、請求項１に記載の方法。
  16. 前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である、請求項１５に記載の方法。
  17. ＴＴＲの発現が、網膜色素上皮（ＲＰＥ）において低下される、請求項１５に記載の方法。
  18. ＴＴＲ ｍＲＮＡの発現が、対照と比較して、少なくとも６０％低下される、請求項１５に記載の方法。
  19. 投与が、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項１５に記載の方法。
  20. ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスの治療、予防、または管理する方法であって、そのような治療、予防、または管理を必要とする患者に、治療上または予防上有効量のＡＤ−１８３２４を、前記患者の網膜に投与することを含む、方法。
  21. ＴＴＲ関連眼アミロイドーシスに罹患している、またはＴＴＲ関連眼アミロイドーシスを発症する危険性があると診断されたヒトを同定することと、前記ヒトに、治療上もしくは予防上有効量のＡＤ−１８３２４を前記ヒトの網膜に投与することと、を含む、ヒトを治療する方法。
  22. 網膜上皮細胞におけるＴＴＲの発現を阻害するための方法であって、
    （ａ）ＡＤ−１８３２４またはＡＤ−１８５３４であるｄｓＲＮＡを、前記網膜上皮細胞に導入すること、および
    （ｂ）ステップ（ａ）で産生された細胞を、ＴＴＲ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得るために十分な時間維持し、それによって、前記細胞内の前記ＴＴＲ遺伝子の発現を阻害することを含む、方法。
  23. 前記ｄｓＲＮＡは、ＡＤ−１８３２４である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記網膜上皮細胞は、ヒト網膜色素上皮トランスジェニック細胞である、請求項２２に記載の方法。
  25. ＴＴＲの発現が、少なくとも１０％、４０％、または少なくとも６０％阻害される、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記ｄｓＲＮＡの導入が、ＩＬ−６またはＴＮＦ−αレベルによって測定された場合、炎症反応をもたらさない、請求項２２に記載の方法。
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