JP2019060837A - グリコサミノグリカンの分析法 - Google Patents
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Abstract
Description
2.該加熱が110分〜130分間,78℃〜82℃の温度で行われるものである,上記1の方法。
3.該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記1又は2の方法。
4.該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記1又は2の方法。
5.該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,上記4の方法。
6.該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,ヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,上記4の方法。
7.該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記6の方法。
8.該患者が,体内に蓄積したヘパラン硫酸を減少させる治療を受けたものである,上記6又は7の方法。
9.試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ,該デルマタン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,3結合した二糖に,該ヘパラン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖に分解する方法であって,
該デルマタン硫酸を,2,2−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で,20分〜100分間,60℃〜80℃の温度で加熱して分解するものであり,及び,
該ヘパラン硫酸を,上記1又は2の方法で分解するものである,方法。
10.該デルマタン硫酸の分解における該加熱が,30分〜80分間,63℃〜67℃の温度で行われるものである,上記9の方法。
11.該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記9又は10の方法。
12.該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,上記9又は10の方法。
13.該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,上記12の方法。
14.該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,ヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,上記12の方法。
15.該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,マロトー・ラミー症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記14の方法。
16.該患者が,体内に蓄積したヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けたものである,上記14又は15の方法。
17.試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定する方法であって,
上記1乃至8の何れかの方法で得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
18.試料中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって,
上記9乃至16の何れかの方法により,デルマタン硫酸を分解して得られた二糖及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を,それぞれ,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。
19.上記17又は18の方法により得られた,該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて,該試料を提供した哺乳動物の中から,ヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
20.該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,マロトー・ラミー症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,上記19の方法。
21.該試料が,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者であって,体内に蓄積したヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けた患者から,該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり,該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸の量を,上記17又は18の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて,該治療の効果を確認する方法。
試験に用いる(a)〜(l)の溶液を以下の手順で調製した。
(a)MeCN/water:
0.5 mLの注射用水と4.5 mLのアセトニトリルを混合し,これをMeCN/waterとした。本溶液は用時調製とした。
(b)重水素ラベル化溶媒:
氷浴下で,1.5 mLのメタノール-d4(Sigma-Aldrich社)に240 μLのアセチルクロリドを滴下し,これを重水素ラベル化溶媒とした。本溶液は用時調製とした。
(c)PBS/クエン酸溶液:
クエン酸を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸溶液を作製した。更に,クエン酸三ナトリウムニ水和物を純水に溶解して10 mMの濃度のクエン酸ナトリウム溶液を作製した。クエン酸溶液にクエン酸ナトリウム溶液を滴下してpH 3.0に調整した。この溶液を10 mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)とした。また,18 mLの10 mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)に2 mLのPBSを加えた溶液をPBS/クエン酸溶液とした。
(d)移動相A:
247.5 mLの純水に,2.5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と400 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)を添加して混合したものを,移動相Aとした。本溶液は用時調製とした。
(e)移動相B:
45 mLの純水に,5 mLの1 Mギ酸アンモニウム水溶液と,450 mLのアセトニトリルと,800 μLの水酸化アンモニウム水溶液 (25% NH4OH)とを混合したものを,移動相Bとした。本溶液は用時調製とした。
再溶解溶液
(f)ヘパラン硫酸標準原液(HS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにHeparan sulfate(Iduron社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をHS標準原液とした。
(g)デルマタン硫酸標準原液(DS標準原液):
1.5 mLマイクロチューブにChondroitin sulfate B sodium salt from porcine intestinal mucosa(Sigma-Aldrich社)を秤量し,注射用水を加えて溶解し,5.0 mg/mLの濃度の溶液を調製した。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに15 μLずつ分注し,使用時まで冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をDS標準原液とした。
(h)デルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液):
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのDS標準原液を計り取り,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し,撹拌した後,65℃で75分間反応させて,重水素化メタノール分解(deuteriomethanolysis)を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し,超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し,冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をデルマタン硫酸内部標準溶液(DS内部標準溶液)とした。
(i)ヘパラン硫酸内部標準溶液(HS内部標準溶液):
ホウケイ酸ねじ口試験管に40 μLのヘパリン標準原液を計り取り,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に400 μLの重水素ラベル化溶媒を添加し,撹拌した後,65℃で75分間反応させて,重水素化メタノール分解(deuteriomethanolysis)を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に500 μLのMeCN/waterを添加し,超音波処理を30分間行った。調製した溶液を0.5 mLスクリューキャップチューブに20 μLずつ分注し,冷凍(-15℃以下)して保存した。この溶液をヘパラン硫酸内部標準溶液(HS内部標準溶液)とした。
(j)サンプル溶解用溶液:
5 mLのMeCN/waterに,1 μLのHS内部標準溶液及び1 μLのDS内部標準溶液を添加して撹拌した後,超音波処理を30分間行った。この溶液をサンプル溶解用溶液とした。本溶液は用時調製とした。
(k)検量線作成用溶液:
480 μLのPBS/クエン酸溶液を計り取り,これにHS標準原液とDS標準原液をそれぞれ10 μLずつ添加し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ100 μg/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で希釈し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ2500 ng/mLずつ含有する溶液を調製した。この溶液をPBS/クエン酸溶液で2段階希釈し,デルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ25〜2500 ng/mLの濃度で含有する溶液を調製した。この溶液を検量線作成用溶液とした。
(l)組織抽出溶液
1 mLのポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテルに生理食塩液を添加し,全量を500 mLとした。この溶液を組織抽出溶液とした。
野生型マウス(C57BL/6N)及びIDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス(IDSヘミ接合体マウス,C57BL/6N)から血液を採取した。採取した血液をチューブに移して室温で30分間以上静置した後,遠心(2000 g,20分間)して血清を回収した。8 μLの血清に8 μLのPBSと144 μLの10mM クエン酸緩衝液(pH 3.0)を加えて撹拌した。これを20 μL計り取り,ホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。これを血液サンプル溶液とした。
上記実施例1で調製した検量線作成用溶液を,それぞれ20 μL計り取り,個別にホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。また,ブランクとして,PBS/クエン酸溶液をホウケイ酸ねじ口試験管に分取した。試験管中の溶媒を窒素気流下で留去した(N=1)。乾固物に,20 μLの2, 2-ジメトキシプロパンと,200 μLの塩酸の濃度が3Nである塩酸メタノールとを添加して撹拌した後,表1に示す3種類の条件(条件A〜C)でメタノリシス反応を行った。反応後,溶媒を窒素気流下で留去した。乾固物に50 μLのサンプル溶解用溶液を添加して溶解後,遠心(15000 rpm,10分間,室温)し,上清をバイアルに採取した。
LC/MS/MS分析は,親水性相互作用超高性能液体クロマトグラフィーとタンデム四重極型質量分析装置とを組み合わせたものを用いて実施した。質量分析装置(MS/MS装置)として,QTRAP5500(エー・ビー・サイエックス社)を用い,これにHPLC装置として,Nexera X2(島津製作所)をセットした。また,LCカラムとして,Acquity UPLCTM BEH Amid 1.7 μm (2.1 X 50 mm,Waters社)を用いた。移動相として,実施例1で調製した移動相A及び移動相Bを用いた。また,カラム温度は50℃に設定した。
精度(%)=測定値の標準偏差/測定値の平均値×100
真度(%)=測定値の平均値/理論濃度×100
なお,真度(%)の計算式中の理論濃度とは,QC試料に添加されたデルマタン硫酸又はヘパラン硫酸の濃度のことをいう。
上記表1に示す条件Aでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線(条件Aの検量線)は,デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても,25.0〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した(データは示さない)。相関係数(r)は,デルマタン硫酸については0.9995,ヘパラン硫酸については0.9938であった。
条件A,B及びCでメタノリシスを行った検量線作成用溶液の測定値から得られた検量線はいずれも,デルマタン硫酸及びヘパラン硫酸のいずれについても,25〜2500 ng/mLの濃度範囲において良好な直線性を示した(データは示さない)。それぞれの条件における検量線の相関係数(r)を表7に示す。
生体由来の試料中に含まれるデルマタン硫酸及びヘパラン硫酸の測定方法として,条件A,B及びCの何れが好適であるかを,実施例2に記載した野生型マウス及びIDSヘミ接合体マウスの血液から調製した血清を用いて調べた。IDSは,デルマタン硫酸,ヘパラン硫酸を含むGAGを分解する活性を有する酵素である。従って,IDSヘミ接合体マウスの血中のGAGの濃度は,野生型マウスと比較して高いことが知られている。
医療用に市販されている遺伝子組換えヒトイズロン酸−2−スルファターゼ(rhIDS)を生理食塩液で希釈し,0.1 mg/mLのrhIDS溶液を調製した。このrhIDS溶液を,IDS遺伝子を含む染色体領域を欠損するヘミ接合体マウス(IDSヘミ接合体マウス,C57BL/6N)に,0.5 mg/kg体重の用量で,7日毎に計4回,静脈内投与した。最後に投与した日から7日後に,マウスを放血により安楽死させた。このとき血液をチューブに採取して,室温で30分間以上静置した後,遠心(2000 g, 20分間)して血清を回収した。同様にして,rhIDS非投与のIDSヘミ接合体マウス(rhIDS非投与IDSヘミ接合体マウス)及び野生型マウスからも,血清を回収した。
Claims (21)
- 試料中に含まれるヘパラン硫酸を,ウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖にまで分解する方法であって,該ヘパラン硫酸を,2,2−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で,80分〜180分間,65℃〜85℃の温度で加熱して分解するものである,方法。
- 該加熱が110分〜130分間,78℃〜82℃の温度で行われるものである,請求項1に記載の方法。
- 該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項1又は2に記載の方法。
- 該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項1又は2に記載の方法。
- 該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,請求項4に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,ヘパラン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,請求項4に記載の方法。
- 該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,請求項6に記載の方法。
- 該患者が,体内に蓄積したヘパラン硫酸を減少させる治療を受けたものである,請求項6又は7に記載の方法。
- 試料中に含まれるデルマタン硫酸とヘパラン硫酸を,それぞれ,該デルマタン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,3結合した二糖に,該ヘパラン硫酸をウロン酸とアミノ糖がα1,4結合した二糖に分解する方法であって,
該デルマタン硫酸を,2,2−ジメトキシプロパンを含む塩酸メタノール中で,20分〜100分間,60℃〜80℃の温度で加熱して分解するものであり,及び,
該ヘパラン硫酸を,請求項1又は2に記載の方法で分解するものである,方法。 - 該デルマタン硫酸の分解における該加熱が,30分〜80分間,63℃〜67℃の温度で行われるものである,請求項9に記載の方法。
- 該試料が,体液,細胞,組織,器官,細胞の培養液,組織の培養液,食品,及び飼料から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項9又は10に記載の方法。
- 該試料が,哺乳動物から得られた体液,細胞,組織,器官,血液,血清,血漿,尿,骨髄液,及び脳脊髄液からなる群から選択されるもの,又はこれらに由来するものである,請求項9又は10に記載の方法。
- 該哺乳動物が,ヒト,サル,マウス,ラット,モルモット,ハムスター,ウサギ,ウマ,ウシ,ブタ,イヌ,及びネコからなる群から選択されるものである,請求項12に記載の方法。
- 該哺乳動物がヒトであり,該ヒトが,ヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者である,請求項12に記載の方法。
- 該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,マロトー・ラミー症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,請求項14に記載の方法。
- 該患者が,体内に蓄積したヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けたものである,請求項14又は15に記載の方法。
- 試料中に含まれるヘパラン硫酸の量を測定する方法であって,
請求項1乃至8の何れかに記載の方法で得られた二糖を,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。 - 試料中に含まれるヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸の量を測定する方法であって,
請求項9乃至16の何れかに記載の方法により,デルマタン硫酸を分解して得られた二糖及びヘパラン硫酸を分解して得られた二糖を,それぞれ,液体クロマトグラフィーに付して溶出液を得るステップと,
該溶出液を質量分析に供するステップと,
を含んでなるものである,方法。 - 請求項17又は18に記載の方法により得られた,該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸の測定値に基づいて,該試料を提供した哺乳動物の中から,ヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の個体を検出する方法。
- 該疾患が,ハンター症候群,ハーラー症候群,シャイエ症候群,ハーラー・シャイエ症候群,マロトー・ラミー症候群,サンフィリッポ症候群,及びスライ症候群からなる群から選択されるものである,請求項19に記載の方法。
- 該試料が,ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸が体内に蓄積する疾患の患者であって,体内に蓄積したヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸を減少させる治療を受けた患者から,該治療の前及び該治療の後にそれぞれ得られたものであり,該試料中に含まれるヘパラン硫酸又は/及びデルマタン硫酸の量を,請求項17又は18に記載の方法により測定することにより得られた測定値に基づいて,該治療の効果を確認する方法。
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