JP2019001783A - 医薬、並びにその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】放射線架橋によってハイドロゲルを製造する方法において、従来の方法では達成できなかった小さな粒径を含む広範囲の粒径の中から特定の範囲の粒径を有するハイドロゲルを任意に選択して製造可能な方法を提供すること等。
【解決手段】親水性ポリマーを含む水溶液に放射線を照射して、ハイドロゲル粒子を製造する方法において、該溶液中の溶存酸素濃度を調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する該親水性ポリマーを選択して、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御する。
【選択図】 なし
【解決手段】親水性ポリマーを含む水溶液に放射線を照射して、ハイドロゲル粒子を製造する方法において、該溶液中の溶存酸素濃度を調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する該親水性ポリマーを選択して、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御する。
【選択図】 なし
Description
本発明は、イメージング剤（特にＭＲＩ造影剤）、治療剤、治療補助剤等の医薬、並びにこれらの製造方法に関し、より詳細には、ハイドロゲルナノ粒子に標識プローブを担持した医薬、並びにその製造方法に関する。
イメージング剤としては、ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、量子ドットイメージング剤、及びＭＲＩ造影剤などが開発され、医療現場、研究現場等で広く利用されている。
特に、ＭＲＩ造影剤は、近年様々なタイプの造影剤が開発されており、様々な診断に利用されている。例えば、細胞外液分布造影剤として、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＯＴＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＥＡ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ等のＧｄ造影剤が使用又は開発され、肝特異性造影剤として、ＳＰＩＯ（Ｓｕｐｅｒ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ）造影剤、Ｇｄ−ＥＯＢ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＢＯＰＴＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＤｅＡ等のＧｄ造影剤が使用又は開発され、血液プール造影剤として、アルブミン結合性Ｇｄ造影剤、高分子Ｇｄ造影剤、及びＵＳＰＩＯ（Ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ）造影剤が使用又は開発されている（例えば、非特許文献１参照）。
特に、ＭＲＩ造影剤は、近年様々なタイプの造影剤が開発されており、様々な診断に利用されている。例えば、細胞外液分布造影剤として、Ｇｄ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＤＯＴＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＥＡ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ等のＧｄ造影剤が使用又は開発され、肝特異性造影剤として、ＳＰＩＯ（Ｓｕｐｅｒ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ）造影剤、Ｇｄ−ＥＯＢ−ＤＴＰＡ、Ｇｄ−ＢＯＰＴＡ、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＤｅＡ等のＧｄ造影剤が使用又は開発され、血液プール造影剤として、アルブミン結合性Ｇｄ造影剤、高分子Ｇｄ造影剤、及びＵＳＰＩＯ（Ｕｌｔｒａｓｍａｌｌ Ｓｕｐｅｒ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｉｒｏｎ Ｏｘｉｄｅ）造影剤が使用又は開発されている（例えば、非特許文献１参照）。
ＭＲＩ造影剤は、一般的に安全性は高いと考えられているが、組織への蓄積が確認されているものもあり、人体への影響が懸念されている（例えば、非特許文献２参照）。例えば、近年、ＭＲＩ造影剤として用いられている、ガドペンテト酸ジメグルミンなどの直鎖型Ｇｄ錯体では、一定量のＧｄが脳脊髄液関門から脳に入り、一定量が脳内に蓄積することが報告されている（非特許文献３）。また、ガドテル酸メグルミンなどのマクロ環型Ｇｄ錯体では、直鎖型Ｇｄ錯体と比較して脳内への蓄積量は少ないものの、脳脊髄液に入ることが報告されており（非特許文献４）、免疫細胞によるｐＨ分解の結果、ごく少量が脳に残留する可能性がある。また、骨に沈着することが報告されている（非特許文献５）。
このため、短時間で体外に排出され組織への蓄積がより低減されたＭＲＩ造影剤が求められている。また、このような特性への要求は、他のイメージング剤でも同様であり、治療、又は治療補助用途の医薬でもこのような特性が求められることがある。
このため、短時間で体外に排出され組織への蓄積がより低減されたＭＲＩ造影剤が求められている。また、このような特性への要求は、他のイメージング剤でも同様であり、治療、又は治療補助用途の医薬でもこのような特性が求められることがある。
また、特定の細胞を標識しその分布を追跡するなど、細胞内へ導入される造影剤の開発も試みられているが、ＭＲＩ造影剤では、細胞内の分子に結合するなどの相互作用により水プロトンの横緩和時間が短縮し、造影剤の局所濃度や計測するＭＲＩの磁場強度によってはＴ１強調画像上で信号低下を引き起こす陰性化を生じることがある（非特許文献６）。この陰性化は、対象とする細胞と、空気、血管、骨などとの判別を困難にするため、視認性を劣化させる。
従って、細胞内に造影剤を導入するＭＲＩ検査では、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤が求められている。
従って、細胞内に造影剤を導入するＭＲＩ検査では、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤が求められている。
また、近年、抗がん剤、再生医療分野などにおいて、標的組織又は細胞のみに向けられる分子標的薬の開発が行われている。
ところで、キトサン、寒天、アガロース、ゼラチン、アルブミン、セルロース、カラギーナン、デキストロース等の天然高分子又はその誘導体；ポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の合成高分子；或いはこれらの１種又は２種以上を架橋結合したハイドロゲルは、生体親和性が高い材料として様々な医療用途に利用されている（例えば、非特許文献７及び８、特許文献１）。臓器イメージング剤への利用としては、中村らが、特定のアミノ酸配列を有する遺伝子組換えゼラチンが、一過性に腎臓に集積することを見出し、これに標識プローブを担持させた腎臓イメージング剤を提案している（特許文献２）。ただし、この腎臓イメージング剤は、細胞内に造影剤を導入した際の陰性化の問題を取り扱うものではなく、ＭＲＩ造影剤としての利用について具体的な記載はない。また、この遺伝子組換えゼラチンは組織への蓄積を回避するために利用するものでもない。
須田らは、アルブミンと水または緩衝液の混合物に、放射線照射してナノ及びサブミクロンサイズオーダーの粒子状成形体を製造する方法を開示し（特許文献３）、古沢らは、０．２５〜１ｍｇ／Ｌの濃度のゼラチン水溶液にγ線照射する、ゼラチン架橋体の製造方法を開示している（非特許文献９）。ただし、これらの報告では、粒径の制御に関する開示は無く、ＭＲＩ造影剤等のイメージング剤や治療剤への応用についても特に開示は無い。これに対して、秋山らは、γ線照射によってゼラチン架橋体を製造する方法に関して、ゼラチン水溶液の初期濃度、照射線量、溶液温度、ｐＨといった条件について検討し、数十〜数百ｎｍのゼラチン架橋体を製造している（非特許文献１０）。但し、この文献では、照射前にナノゲルが観測されており、放射線架橋されていないナノ粒子が形成されており、上限が百ｎｍ未満の架橋体は得られていない。また、ＭＲＩ造影剤等のイメージング剤や治療剤等の医薬への応用について特に開示は無い。
「改訂版MRI応用自在」MEDICAL VIEW 2004 p.142-153
MRI造影剤の基礎と副作用について［http://www.google.co.jp/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0ahUKEwig-f3siKPUAhULjLwKHbcXBzMQFggiMAA&url=http%3A%2F%2Fgifuart.umin.ne.jp%2Fsibu%2Fhida%2Flog%2F23nendo_2kai_benkyoukai%2FH23_2kai_benkyoukai_syouroku_terumo.pdf&usg=AFQjCNEHjccpGXqyyZnpg7ynZsgz9Z9Kug］２０１７年６月４日参照
Kanda T, Ishii K, Kawaguchi H, Kitajima K, Takenaka D. High signal intensity in the dentate nucleus and globus pallidus on unenhanced T1-weighted MR images: relationship with increasing cumulative dose of a gadolinium-based contrast material. Radiology 2014;270(3):834-841.
Naganawa S, Nakane T, Kawai H, Taoka T. Gd-based Contrast Enhancement of the Perivascular Spaces in the Basal Ganglia. Magn Reson Med Sci. 2017 Jan 10;16(1):61-65. doi: 10.2463/mrms.mp.2016-0039. Epub 2016 Jul 12. PubMed PMID:27430361.
Aime S, Caravan P. Biodistribution of gadolinium-based contrast agents,including gadolinium deposition. J Magn Reson Imaging. 2009 Dec;30(6):1259-67.doi: 10.1002/jmri.21969. Review. PubMed PMID: 19938038; PubMed Central PMCID:PMC2822463.
Odaka K, Aoki I, Moriya J, Tateno K, Tadokoro H, Kershaw J, Minamino T, Irie T, Fukumura T, Komuro I, Saga T. In vivo tracking of transplanted mononuclear cells using manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI). PLoS One.2011;6(10):e25487. doi: 10.1371/journal.pone.0025487. Epub 2011 Oct 7. PubMed PMID: 22003393; PubMed Central PMCID: PMC3189206.
河田ら 「γ線架橋による新規ハイドロゲルの調製と製剤素材としての可能性」日本医療薬学会年会２０１１年、要旨集２９P-0555
市川ら YAKUGAKU ZASSHI The Pharmaceutical Society of Japan 127(5)813-823(2007)
K. Furusawa, et al., Colloid Polymer Science, 283, 229-233 (2004)
Y. Akiyama, et al., Colloid Polymer Science, 285, 801-807 (2007)
本発明は、以上のような技術水準において、放射線架橋によってハイドロゲルを製造する方法において、従来の方法では達成できなかった小さな粒径を含む広範囲の粒径の中から特定の範囲の粒径を有するハイドロゲルを任意に選択して製造可能な方法を提供することを第一の目的とする。
本発明はまた、脳脊髄液関門の通過がより妨げられ、脳内への蓄積がより少ない、安全性が高いイメージング剤、治療剤、治療補助剤等の医薬（以下、単に「医薬」、又は「イメージング剤等の医薬」と総称することがある）を提供することを第二の目的とする。
本発明はさらに、短時間で体外に排出され、肝臓等の他の臓器中への蓄積もより少ない、より安全性が高いイメージング剤等の医薬を提供することを第三の目的とする。
他方、本発明は、癌組織等の特定の組織や細胞に取り込ませて当該組織や細胞を標識又はその医薬用途に応じて組織又は細胞に作用する、イメージング剤等の医薬を提供することを第四の目的とする。
本発明はさらにまた、細胞に導入されるＭＲＩ造影剤において、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤を提供することを第五の目的とする。
本発明はまた、脳脊髄液関門の通過がより妨げられ、脳内への蓄積がより少ない、安全性が高いイメージング剤、治療剤、治療補助剤等の医薬（以下、単に「医薬」、又は「イメージング剤等の医薬」と総称することがある）を提供することを第二の目的とする。
本発明はさらに、短時間で体外に排出され、肝臓等の他の臓器中への蓄積もより少ない、より安全性が高いイメージング剤等の医薬を提供することを第三の目的とする。
他方、本発明は、癌組織等の特定の組織や細胞に取り込ませて当該組織や細胞を標識又はその医薬用途に応じて組織又は細胞に作用する、イメージング剤等の医薬を提供することを第四の目的とする。
本発明はさらにまた、細胞に導入されるＭＲＩ造影剤において、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤を提供することを第五の目的とする。
本発明らは、上記第一の目的に関し、天然タンパク質（例えばゼラチン等）などの親水性ポリマーの溶液に放射線を照射してハイドロゲル粒子を調製するための条件を検討したところ、親水性ポリマーの分子量、及び親水性ポリマー水溶液の酸素濃度が得られる粒子の粒径に影響を及ぼすことを見出し、特定の条件下で放射線照射することによって、秋山らが達成できなかった非常に小さな粒径を含む広範囲の粒径の中から特定の粒径範囲のナノハイドロゲル粒子を任意に調製できることを見出した。
上記第二の目的に関しては、ハイドロゲルに標識プローブを担持することで脳脊髄液関門の通過を防止し得ることを見出した。
上記第三の目的に関しては、ハイドロゲルを特定の非常に小さな粒径とすることで、イメージング剤等の医薬の腎排出が容易となり、肝臓等の臓器への蓄積が低減されることを見出した。
逆に、上記第四の目的に関しては、ハイドロゲルを比較的大きな特定の粒径とすることで、イメージング剤の腎排出が妨げられ、癌組織等の特定の組織又は細胞に取り込まれ易くなることを見出した。
更に、上記第五の目的に関し、ハイドロゲルにＧｄ錯体等の標識プローブを担持させることで標識プローブの周囲に自由水が多く存在する空間が形成され、これにより細胞内に導入された際でも横緩和時間の短縮が抑制されることを見出した。このようなハイドロゲルによる効果はこれまで全く報告は無く、驚くべき事象である。
上記第二の目的に関しては、ハイドロゲルに標識プローブを担持することで脳脊髄液関門の通過を防止し得ることを見出した。
上記第三の目的に関しては、ハイドロゲルを特定の非常に小さな粒径とすることで、イメージング剤等の医薬の腎排出が容易となり、肝臓等の臓器への蓄積が低減されることを見出した。
逆に、上記第四の目的に関しては、ハイドロゲルを比較的大きな特定の粒径とすることで、イメージング剤の腎排出が妨げられ、癌組織等の特定の組織又は細胞に取り込まれ易くなることを見出した。
更に、上記第五の目的に関し、ハイドロゲルにＧｄ錯体等の標識プローブを担持させることで標識プローブの周囲に自由水が多く存在する空間が形成され、これにより細胞内に導入された際でも横緩和時間の短縮が抑制されることを見出した。このようなハイドロゲルによる効果はこれまで全く報告は無く、驚くべき事象である。
本発明は、このような知見に基くものであり、以下のイメージング剤等の医薬、並びにその製造方法等を提供する。
［１］放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する医薬。
［２］前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜７０ｎｍである、［１］に記載の医薬。
［３］前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜１０ｎｍである、［１］に記載の医薬。
［４］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、３０ｎｍ以下である、［１］に記載の医薬。
［５］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、５ｎｍ以下である、［１］に記載の医薬。
［６］投与後に迅速に腎排泄させるための、［２］〜［５］の何れか１項に記載の医薬。
［７］前記標識プローブの腎髄質での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、投与後１時間以内に１０％以上増大し、投与後２時間以内に１０％以下の増加レベルになる、［［６］に記載の医薬。
［８］肝臓への蓄積無しにイメージ化又は治療を行なうための、［２］〜［７］の何れか１項に記載の医薬。
［９］前記標識プローブの肝臓での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで１０％以上増加しない、［８］に記載の医薬。
［１０］肝臓機能が低下している患者に用いる、［２］〜［９］の何れか１項に記載の医薬。
［１１］細胞内に取り込まれて該細胞を標識又は該細胞に作用するための、［１］に記載の医薬。
［１２］前記ハイドロゲル粒子の粒径が１ｎｍ〜５μｍである、［１１］に記載の医薬。
［１３］前記ハイドロゲル粒子の粒径が１０〜２００ｎｍである、癌組織の標識又は抗癌治療のための、［１１］に記載の医薬。
［１４］前記ハイドロゲル粒子の粒径が５００ｎｍ〜５μｍである、貪食細胞を標識するための、［１１］に記載の医薬。
［１５］前記ハイドロゲルは、ゼラチン、コラーゲン、及びペプチドからなる群から選択される少なくとも１種の親水性ポリマーに由来する、［１］〜［１４］の何れか１項に記載の医薬。
［１６］投与後、脳室への移行が無い、［１］〜［１５］の何れか１項に記載の医薬。
［１７］前記標識プローブの脳室での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで５％以上増加しない、［１６］に記載の医薬。
［１８］ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、又はＭＲＩ造影剤である、［１］〜［１７］の何れか１項に記載の医薬。
［１９］ＭＲＩ造影剤である、［１］〜［１７］の何れか１項に記載の医薬。
［２０］細胞内に導入されるＭＲＩ造影剤である、［１９］に記載の医薬。
［２１］細胞内に導入された際、ＭＲＩ装置で撮像されたＴ１強調画像法において水および生体組織において信号低下を生じさせない、［２０］に記載の医薬。
［２２］細胞外液分布造影剤として用いられるＭＲＩ造影剤である、［２］〜［９］の何れか１項に記載の医薬。
［２３］前記標識プローブが、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｉ、Ａｕ、酸化鉄、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、２９Ｓｉ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ、１２３Ｉ又は９９ｍＴｃを含む、［１８］〜［２２］の何れか１項に記載の医薬。
［２４］Ｇｄ、Ｍｎ、又はＦｅが、前記ハイドロゲル粒子に直接結合しているか、又はこれら原子の少なくとも１つの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）の錯体が前記ハイドロゲル粒子に結合している、［１９］に記載の医薬。
［２５］［１］〜［２４］の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を、in vitroで、対象細胞と共培養して該細胞に該イメージング剤を取り込ませ、該細胞中の該イメージング剤からの信号を検出し、画像化する、細胞イメージング方法。
［２６］［１］〜［２４］の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を取り込んでいる対象からの信号を検出し、画像化する、組織又は細胞のイメージング方法。
［２７］親水性ポリマーを含む水溶液に放射線を照射して、ハイドロゲル粒子を製造する方法であって、
該溶液中の溶存酸素濃度を調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する該親水性ポリマーを選択して、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御することを特徴とする、方法。
［２８］前記溶液中の溶存酸素濃度を０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調整し、且つ／又は分子量１，０００〜１，０００，０００の範囲の前記親水性ポリマーから選択する、［２７］に記載の方法。
［２９］前記親水性ポリマーは、デキストリン、デキストラン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アガロース、ジェランガム、キサンタンガム、フィブリン、カラヤガム、カラギーナン、セルロース、スターチ、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択される天然高分子化合物、該天然高分子化合物をヒドロキシ低級アルキル基、又は低級アルコキシアルキル基で置換した誘導体、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される合成高分子からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２７］又は［２８］に記載の方法。
［３０］前記放射線が、電子線、Ｘ線、及びγ線のいずれか１種、或いはこれらの混合放射線である、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法。
［３１］さらに、前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度、前記放射線の線量、前記放射線の線量率、および／又は前記放射線の照射時の温度を調整することにより、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御する、［２７］〜［３０］の何れか１項に記載の方法。
［３２］前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、放射線の線量を０．０４〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線のうちγ線やＸ線の線量率を０．1〜１００ｋＧｙ／ｈ、電子線の線量率は０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を０〜７０℃の範囲で調整する、［３１］に記載の方法。
［３３］分子量が５０，０００〜１，０００，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整し、必要に応じて限外ろ過フィルターにかけ、所望の粒径のゼラチンナノゲルを分取することにより、典型的には、粒径が１〜７０ｎｍの前記ハイドロゲル粒子を得る、［３１］に記載の方法。
［３４］分子量が１，０００〜５０，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜０．５質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整することにより、典型的には、粒径が１〜１０ｎｍのハイドロゲル粒子を調製する、［３１］に記載の方法。
［３５］前記溶液中の溶存酸素濃度を３０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節する、［３１］〜［３４］の何れか１項に記載の方法。
［３６］分子量が１，０００〜１０，０００の前記親水性ポリマーを選択する、［３１］〜［３５］の何れか1項に記載の方法。
［３７］粒径が１〜１０ｎｍの放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
［３８］［２７］〜［３６］の何れか１項に記載の方法で得られたハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
［３９］前記医薬は、ＭＲＩ造影剤であり、前記ハイドロゲル粒子にマクロ環型キレート剤を結合し、前記マクロ環型キレート剤に標識化合物を結合させて錯体を形成する、［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４０］
前記マクロ環型キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）であり、前記標識化合物は、Ｇｄである、［３９］に記載の方法。
［４１］放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子であって、粒径が１〜１０ｎｍの粒子。
［４２］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、５ｎｍ以下である、［４１］に記載の粒子。
［４３］［４１］又は［４２］に記載の粒子を含む水性組成物。
［１］放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する医薬。
［２］前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜７０ｎｍである、［１］に記載の医薬。
［３］前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜１０ｎｍである、［１］に記載の医薬。
［４］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、３０ｎｍ以下である、［１］に記載の医薬。
［５］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、５ｎｍ以下である、［１］に記載の医薬。
［６］投与後に迅速に腎排泄させるための、［２］〜［５］の何れか１項に記載の医薬。
［７］前記標識プローブの腎髄質での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、投与後１時間以内に１０％以上増大し、投与後２時間以内に１０％以下の増加レベルになる、［［６］に記載の医薬。
［８］肝臓への蓄積無しにイメージ化又は治療を行なうための、［２］〜［７］の何れか１項に記載の医薬。
［９］前記標識プローブの肝臓での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで１０％以上増加しない、［８］に記載の医薬。
［１０］肝臓機能が低下している患者に用いる、［２］〜［９］の何れか１項に記載の医薬。
［１１］細胞内に取り込まれて該細胞を標識又は該細胞に作用するための、［１］に記載の医薬。
［１２］前記ハイドロゲル粒子の粒径が１ｎｍ〜５μｍである、［１１］に記載の医薬。
［１３］前記ハイドロゲル粒子の粒径が１０〜２００ｎｍである、癌組織の標識又は抗癌治療のための、［１１］に記載の医薬。
［１４］前記ハイドロゲル粒子の粒径が５００ｎｍ〜５μｍである、貪食細胞を標識するための、［１１］に記載の医薬。
［１５］前記ハイドロゲルは、ゼラチン、コラーゲン、及びペプチドからなる群から選択される少なくとも１種の親水性ポリマーに由来する、［１］〜［１４］の何れか１項に記載の医薬。
［１６］投与後、脳室への移行が無い、［１］〜［１５］の何れか１項に記載の医薬。
［１７］前記標識プローブの脳室での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで５％以上増加しない、［１６］に記載の医薬。
［１８］ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、又はＭＲＩ造影剤である、［１］〜［１７］の何れか１項に記載の医薬。
［１９］ＭＲＩ造影剤である、［１］〜［１７］の何れか１項に記載の医薬。
［２０］細胞内に導入されるＭＲＩ造影剤である、［１９］に記載の医薬。
［２１］細胞内に導入された際、ＭＲＩ装置で撮像されたＴ１強調画像法において水および生体組織において信号低下を生じさせない、［２０］に記載の医薬。
［２２］細胞外液分布造影剤として用いられるＭＲＩ造影剤である、［２］〜［９］の何れか１項に記載の医薬。
［２３］前記標識プローブが、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｉ、Ａｕ、酸化鉄、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、２９Ｓｉ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ、１２３Ｉ又は９９ｍＴｃを含む、［１８］〜［２２］の何れか１項に記載の医薬。
［２４］Ｇｄ、Ｍｎ、又はＦｅが、前記ハイドロゲル粒子に直接結合しているか、又はこれら原子の少なくとも１つの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）の錯体が前記ハイドロゲル粒子に結合している、［１９］に記載の医薬。
［２５］［１］〜［２４］の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を、in vitroで、対象細胞と共培養して該細胞に該イメージング剤を取り込ませ、該細胞中の該イメージング剤からの信号を検出し、画像化する、細胞イメージング方法。
［２６］［１］〜［２４］の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を取り込んでいる対象からの信号を検出し、画像化する、組織又は細胞のイメージング方法。
［２７］親水性ポリマーを含む水溶液に放射線を照射して、ハイドロゲル粒子を製造する方法であって、
該溶液中の溶存酸素濃度を調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する該親水性ポリマーを選択して、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御することを特徴とする、方法。
［２８］前記溶液中の溶存酸素濃度を０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調整し、且つ／又は分子量１，０００〜１，０００，０００の範囲の前記親水性ポリマーから選択する、［２７］に記載の方法。
［２９］前記親水性ポリマーは、デキストリン、デキストラン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アガロース、ジェランガム、キサンタンガム、フィブリン、カラヤガム、カラギーナン、セルロース、スターチ、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択される天然高分子化合物、該天然高分子化合物をヒドロキシ低級アルキル基、又は低級アルコキシアルキル基で置換した誘導体、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される合成高分子からなる群から選択される少なくとも１種を含む、［２７］又は［２８］に記載の方法。
［３０］前記放射線が、電子線、Ｘ線、及びγ線のいずれか１種、或いはこれらの混合放射線である、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法。
［３１］さらに、前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度、前記放射線の線量、前記放射線の線量率、および／又は前記放射線の照射時の温度を調整することにより、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御する、［２７］〜［３０］の何れか１項に記載の方法。
［３２］前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、放射線の線量を０．０４〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線のうちγ線やＸ線の線量率を０．1〜１００ｋＧｙ／ｈ、電子線の線量率は０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を０〜７０℃の範囲で調整する、［３１］に記載の方法。
［３３］分子量が５０，０００〜１，０００，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整し、必要に応じて限外ろ過フィルターにかけ、所望の粒径のゼラチンナノゲルを分取することにより、典型的には、粒径が１〜７０ｎｍの前記ハイドロゲル粒子を得る、［３１］に記載の方法。
［３４］分子量が１，０００〜５０，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜０．５質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整することにより、典型的には、粒径が１〜１０ｎｍのハイドロゲル粒子を調製する、［３１］に記載の方法。
［３５］前記溶液中の溶存酸素濃度を３０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節する、［３１］〜［３４］の何れか１項に記載の方法。
［３６］分子量が１，０００〜１０，０００の前記親水性ポリマーを選択する、［３１］〜［３５］の何れか1項に記載の方法。
［３７］粒径が１〜１０ｎｍの放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
［３８］［２７］〜［３６］の何れか１項に記載の方法で得られたハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
［３９］前記医薬は、ＭＲＩ造影剤であり、前記ハイドロゲル粒子にマクロ環型キレート剤を結合し、前記マクロ環型キレート剤に標識化合物を結合させて錯体を形成する、［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４０］
前記マクロ環型キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）であり、前記標識化合物は、Ｇｄである、［３９］に記載の方法。
［４１］放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子であって、粒径が１〜１０ｎｍの粒子。
［４２］前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、５ｎｍ以下である、［４１］に記載の粒子。
［４３］［４１］又は［４２］に記載の粒子を含む水性組成物。
本発明の一の実施形態では、溶液中の溶存酸素を架橋反応の反応停止剤として利用し、この濃度を適宜調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する親水性ポリマーを選択し、任意選択で放射線照射の他の条件を適宜調整して、簡単且つ確実に、１０ｎｍ以下の粒径を含む広範囲の粒径から任意に選択される特定範囲の粒径の放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子を製造可能にする。また、本発明の他の実施形態では、このような本発明の方法を使用して小さな粒径のハイドロゲル粒子を調製し、これに標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持することで、迅速に体外へ排出され臓器への蓄積がより低減された医薬を提供する。逆に、本発明の更に他の実施の形態では、比較的大きな粒径のハイドロゲル粒子に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持することで、癌組織などの特定の組織や貪食細胞などの細胞への取り込みが容易に成り、当該組織や細胞のイメージング化又はこれらへの薬学的に活性な物質の作用を可能とする医薬を提供する。
また、本発明の更に他の実施の形態では、細胞に導入されるＭＲＩ造影剤において、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤を提供する。すなわち、本発明の造影剤では、ハイドロゲル粒子に標識プローブ、典型的には陽性造影剤用標識化合物（例えばＧｄを含む標識化合物など）が担持されるが、ハイドロゲルは、内部又はその周りに多くの水を保持するため、標識プローブの周囲に自由水が多く存在する空間が形成される。この多くの自由水の存在は、ＭＲＩ造影剤の横緩和時間の短縮を最小限に抑制し、細胞内においてもＭＲＩ造影剤が高い陽性効果を発揮することができる。
また、本発明の更に他の実施の形態では、細胞に導入されるＭＲＩ造影剤において、横緩和時間の短縮を生じず細胞内でも高い陽性効果を奏する造影剤を提供する。すなわち、本発明の造影剤では、ハイドロゲル粒子に標識プローブ、典型的には陽性造影剤用標識化合物（例えばＧｄを含む標識化合物など）が担持されるが、ハイドロゲルは、内部又はその周りに多くの水を保持するため、標識プローブの周囲に自由水が多く存在する空間が形成される。この多くの自由水の存在は、ＭＲＩ造影剤の横緩和時間の短縮を最小限に抑制し、細胞内においてもＭＲＩ造影剤が高い陽性効果を発揮することができる。
ここで、本願明細書で使用する用語の定義を以下に示す。
本願明細書における「親水性ポリマー」とは、親水性基を有し、架橋反応により吸水性高分子となるポリマーを意味する。
本願明細書における「ハイドロゲル」とは、架橋構造を有し、その内部又は周りに多くの水を保持することができる高分子を意味する。
本願明細書における「放射線架橋構造」は、親水性ポリマーが架橋剤を介さずに結合して形成される橋渡し構造であり、このような構造は、架橋剤に由来する構造を有しないことを特徴とする。後述する実施例で実証する通り、典型的な放射線架橋では、フェニルアラニンなどアミノ酸残基が減少するものの、標識プローブや薬学的に活性な物質を担持させるためのアミノ基を有するリジン残基を化学架橋に比して2倍程度多く残すことができる。
本願明細書における「低級アルキル」、「低級アルコキシ」及び「低級アルコキシアルキル」とは、それぞれ炭素数が１〜１０、好ましくは１〜５の「アルキル」、「アルコキシ」及び「アルコキシアルキル」を意味する。
本願明細書では、特に言及しない限り、「分子量」は重量平均分子量を意味するものとする。重量平均分子量は、示差屈折計を有する水系ＧＰＣ分析装置(TOSOH 8020 model Gel Permeation Chromatography)を用い、サイズ排除クロマトカラム(TSK gel PWXL-Mを2本とPWXL2500を1本連結させたもの)を50℃に保ち、リン酸バッファー(0.1M KH2PO4、0.1M Na2HPO4・12H2O混合溶液)を溶離液として1.0 ml/minで通液することで、分析できる。
本願明細書では、特に言及しない限り、「医薬」は、生体成分、細胞若しくは組織の分析、診断、治療、又は治療補助等の医療又はライフサイエンスに関連する目的で用いられる物質を意味する。
また、「薬学的に活性な物質」とは、低分子化学物質、生体分子、放射性同位体、ラジカル、熱等の、治療、予防、又は治療補助等の目的に応じて、化学的、物理的、生物学的等の活性を通じて何らかの薬理活性を奏する物質をいう。
本願明細書における「親水性ポリマー」とは、親水性基を有し、架橋反応により吸水性高分子となるポリマーを意味する。
本願明細書における「ハイドロゲル」とは、架橋構造を有し、その内部又は周りに多くの水を保持することができる高分子を意味する。
本願明細書における「放射線架橋構造」は、親水性ポリマーが架橋剤を介さずに結合して形成される橋渡し構造であり、このような構造は、架橋剤に由来する構造を有しないことを特徴とする。後述する実施例で実証する通り、典型的な放射線架橋では、フェニルアラニンなどアミノ酸残基が減少するものの、標識プローブや薬学的に活性な物質を担持させるためのアミノ基を有するリジン残基を化学架橋に比して2倍程度多く残すことができる。
本願明細書における「低級アルキル」、「低級アルコキシ」及び「低級アルコキシアルキル」とは、それぞれ炭素数が１〜１０、好ましくは１〜５の「アルキル」、「アルコキシ」及び「アルコキシアルキル」を意味する。
本願明細書では、特に言及しない限り、「分子量」は重量平均分子量を意味するものとする。重量平均分子量は、示差屈折計を有する水系ＧＰＣ分析装置(TOSOH 8020 model Gel Permeation Chromatography)を用い、サイズ排除クロマトカラム(TSK gel PWXL-Mを2本とPWXL2500を1本連結させたもの)を50℃に保ち、リン酸バッファー(0.1M KH2PO4、0.1M Na2HPO4・12H2O混合溶液)を溶離液として1.0 ml/minで通液することで、分析できる。
本願明細書では、特に言及しない限り、「医薬」は、生体成分、細胞若しくは組織の分析、診断、治療、又は治療補助等の医療又はライフサイエンスに関連する目的で用いられる物質を意味する。
また、「薬学的に活性な物質」とは、低分子化学物質、生体分子、放射性同位体、ラジカル、熱等の、治療、予防、又は治療補助等の目的に応じて、化学的、物理的、生物学的等の活性を通じて何らかの薬理活性を奏する物質をいう。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。但し、本発明は以下に記載する実施形態に限定されるものではない。
上述の通り、本発明の医薬は、ハイドロゲル粒子に標識プローブ又は薬学的に活性な物質が担持されているものである。
本発明の医薬は、特に制限は無いが、例えば、ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、蛍光イメージング・蛍光顕微鏡用各種蛍光・発光イメージング剤、量子ドットイメージング剤、及びＭＲＩ造影剤等のイメージング剤；例えば、抗癌剤、抗炎症剤、核酸医薬等の治療若しくは予防剤；並びに放射線治療効果増感剤、放射線防護剤等の治療補助剤等が挙げられるが、これらに限定さるものではない。標識プローブは、典型的には、イメージング剤を構成し、薬学的に活性な物質は、典型的には、治療若しくは予防剤又は治療補助剤を構成する。
ＰＥＴイメージング剤用の標識プローブとしては、例えば、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ等を挙げることができる。
ＳＰＥＣＴイメージング剤用の標識プローブとしては、例えば、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ等を挙げることができる。
ＣＴ造影剤用の標識プローブとしては、例えば、ヨード、金、酸化鉄、鉄等を挙げることができる。
蛍光・発光イメージング剤の標識プローブとしては、例えば、メロシアニン、ペリレン、アクリジン、ペリレン、ルシフェリン、ピラニン、スチルベン、ローダミン、クマリン、４−（ジシアノメチレン）−２−メチル−６−（４−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン（ＤＣＭ）、ピロメテン、フルオレセイン、ウンベリフェロン等を挙げることができる。
ＭＲＩ造影剤用の標識プローブとしては、例えば、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ等の常磁性金属を含む錯体であるＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−ｅｓｔｅｒ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＥＡ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＴＰＡ−ＤｅＡ、ＤＰＤＰ等を挙げることができる。また、金属粒子である酸化鉄微粒子（ＳＰＩＯ、ＵＳＰＩＯ）、ＭｎＯ、ＧｄＦ３、化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）用の化合物、超偏極用の核種（１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ、２９Ｓｉ等）等を挙げることができる。
量子ドットイメージング剤用標識プローブとしては、例えば、カドミウム、セレン、鉛等の量子ドットをアルブミン等の生体高分子でコーティングしたものが挙げられる。
量子ドットイメージング剤用標識プローブとしては、例えば、カドミウム、セレン、鉛等の量子ドットをアルブミン等の生体高分子でコーティングしたものが挙げられる。
抗癌剤の薬学的に活性な物質としては、例えば、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤（ａｎｔｉ−ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗生物質等の化学療法剤；８９Ｓｒ、９０Ｙ、１３１Ｉ、アスタチン−２１１、塩化ラジウム２２３、塩化ラジウム２１１等の放射性同位体；タクロリムス水和物、プレドニゾロン等の免疫抑制剤が挙げられ、抗炎症剤としては、例えば、ジクロフェナック、サリチル酸コリン、イブプロフェン等が挙げられ、核酸医薬としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、アプタマー、デコイ等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
また、放射線治療効果増感剤の薬学的に活性な物質としては、例えば、ニトロフラン誘導体、ニトロイミダゾール誘導体等が挙げられ、放射線防護剤の薬学的に活性な物質としては、例えば、システアミン、エタノール等が挙げられるが、これらに限定さるものではない。
以上の標識プローブ及び薬学的に活性な物質は、１種のみがハイドロゲル粒子に担持されてもよいが、２種以上の標識プローブ及び薬学的に活性な物質がハイドロゲル粒子に担持されてもよい。例えば、標識プローブと薬学的に活性な物質の両方を担持して、イメージング剤と治療剤の両方の機能を付与してもよいし、例えば、ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、及びＭＲＩ造影剤の少なくとも１種のイメージング剤の標識プローブと伴に、各種蛍光・発光イメージング剤の標識プローブをハイドロゲル粒子に結合させて、複数のイメージング機能を付与することができる。
以上の標識プローブ及び薬学的に活性な物質は、１種のみがハイドロゲル粒子に担持されてもよいが、２種以上の標識プローブ及び薬学的に活性な物質がハイドロゲル粒子に担持されてもよい。例えば、標識プローブと薬学的に活性な物質の両方を担持して、イメージング剤と治療剤の両方の機能を付与してもよいし、例えば、ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、及びＭＲＩ造影剤の少なくとも１種のイメージング剤の標識プローブと伴に、各種蛍光・発光イメージング剤の標識プローブをハイドロゲル粒子に結合させて、複数のイメージング機能を付与することができる。
本発明で用いられるハイドロゲルは、水を吸収して、自由水を保持できる特性を有するものであればよい。したがって、これまで生体適合性材料として医療用途に利用されている各種ハイドロゲルを用いることができる。例えば、デキストリン、デキストラン、キチン、キトサン、ゼラチン、寒天、アガロース、ジェランガム、キサンタンガム、アルブミン、フィブリン、カラヤガム、カラギーナン、セルロース、スターチ、ペプチド、コラーゲン及び核酸からなる群から選択される天然高分子；当該天然高分子を低級アルキル基、低級アルコキシアルキル基、又はヒドロキシ低級アルキル基で置換した誘導体、例えば、低級アルキル基置換セルロース誘導体、低級アルコキシアルキル基置換セルロース誘導体、ヒドロキシ低級アルキル基置換セルロース誘導体、低級アルコキシアルキル基置換キトサン誘導体、低級アルコキシアルキル基置換キチン誘導体、低級アルコキシアルキル基置換スターチ誘導体及び低級アルコキシアルキル基置換カラギーナン誘導体からなる群から選択される天然高分子誘導体；並びにポリエチレンオキサイド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド及びポリエチレングリコールからなる群から選択される合成高分子からなる群から選択される１種又は２種以上の親水性ポリマーを相互に結合して架橋構造を導入した吸水性高分子化合物が挙げられる。
本発明の医薬は、体内に投与することから安全性の高い天然高分子由来のハイドロゲルが好ましく、中でも、生物毒性が低く、生体親和性の高く、生分解性であることが良く知られ、架橋した際に多くの水を保持する事ができる点で、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン等の生体タンパク質由来のハイドロゲルが好ましい。
本発明の医薬は、体内に投与することから安全性の高い天然高分子由来のハイドロゲルが好ましく、中でも、生物毒性が低く、生体親和性の高く、生分解性であることが良く知られ、架橋した際に多くの水を保持する事ができる点で、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリン等の生体タンパク質由来のハイドロゲルが好ましい。
ハイドロゲルは架橋構造を有し、本発明の医薬において好ましい特性をもたらす。例えば、ゼラチンなどは、融点が体温より低く（ゼラチンの融点は、２８℃である）、体内に投与した際に短時間で溶解して標識プローブ又は薬学的に活性な物質を保持できない状態になる。架橋構造を導入する事で融点を体温より高くすることができ、生体内に存在する間又は長時間標識プローブ又は薬学的に活性な物質を保持できるようになる。また、一般的には、架橋構造を導入することで、より多くの水を保持できるようになる。特に、細胞内においても、ハイドロゲル中に水を保持することができ、上述した細胞内にＭＲＩ造影剤を導入した際の陰性化の問題の改善にも寄与する。
また、本発明のハイドロゲルは、放射線照射によってポリマーを活性化させて導入される放射線架橋構造を有する。化学的方法で導入される架橋構造では、架橋剤等の橋かけ構造に寄与する化合物を介して複数のポリマーが結合し、生体内でハイドロゲルが生分解すると、架橋剤に由来する部分が遊離し、生体に悪影響を及ぼす恐れがある。また、ハイドロゲル中に未反応の架橋剤が残存し、これが生体に悪影響を及ぼす恐れがある。他方、放射線照射による物理化学的方法で導入される架橋構造は、架橋剤に由来する化学構造を介することなく複数のポリマーが結合するため、化学的方法で導入される架橋構造に比べ安全である。また、後述する実施例で実証する通り、ハイドロゲル粒子に標識プローブ及び薬学的に活性な物質を結合する場合、アミノ基を有するリジンの残存量が重要となるが、放射線架橋構造では、化学的架橋構造に比べアミノ基を有するリジンの残存量が多いという特徴が有り、より多くの標識プローブ及び薬学的に活性な物質を結合させる事ができる点で有利である。
本発明のハイドロゲル粒子は、調製される医薬に応じて種々の粒径を有し得、通常１ｎｍ〜５μｍ、典型的には１〜３００ｎｍの粒径から特定範囲の粒径を有するハイドロゲル粒子が選択される。後述する通り、本発明の方法では、各条件を調整することで、特定範囲の粒径を有するハイドロゲル粒子を得ることができる。したがって、例えば、細胞外液分布イメージング剤等の迅速な体外への排出が望まれる医薬の場合には、１〜７０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜６０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜５０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜４０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜３０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜２０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜１０ｎｍの粒径分布の粒子としたり、１〜５ｎｍの粒径分布の粒子とすることができる。同様に、ハイドロゲル粒子の平均粒径を、１〜３０ｎｍとしたり、３〜２５ｎｍとしたり、３〜２０ｎｍとしたり、３〜１０ｎｍとしたり、３〜５ｎｍとすることができる。特に腎臓での排出を促進し、体内への蓄積が少ない、イメージング剤等の医薬とするために、粒径を３０ｎｍ以下（典型的には１〜３０ｎｍ）、好ましくは粒径を１０ｎｍ以下（典型的には１〜１０ｎｍ）、より好ましくは５ｎｍ以下（典型的には１〜５ｎｍ）、さらに好ましくは３ｎｍ以下（典型的には１〜３ｎｍ）、よりさらに好ましくは２ｎｍ以下（典型的には１〜２ｎｍ）のハイドロゲル粒子に標識プローブを担持したイメージング剤とすることができる。同様の点から、ハイドロゲル粒子の平均粒径を、２０ｎｍ以下（典型的には３〜２０ｎｍ）とすることもでき、好ましくは１０ｎｍ以下（典型的には３〜１０ｎｍ）とすることもでき、より好ましくは５ｎｍ以下（典型的には３〜５ｎｍ）とすることもできる。この大きさの粒子では、後述する実施例で実証されている通り、イメージング剤が２時間以内にほぼ総て腎臓から排泄され、体内に存在する間、肝臓への取り込みは極めて少なく脳に蓄積しない。なお、放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子にあって、このような迅速な腎排泄が達成され、肝臓への蓄積が無い粒子は、後述する本発明の方法によって初めて可能になったことに留意すべきである。ここで、臓器への蓄積が無いとは、MRIのT1強調画像法で測定したときに信号強度の上昇が確認されないことをいう。
また、ＥＰＲ効果により比較的大きな粒径のハイドロゲル粒子が癌組織に集積し易くなるので、これを利用して癌組織を標識したり、抗癌治療を行うことができる。この観点から、例えば、１０〜２００ｎｍの粒径分布の粒子とすることが好ましく、２０〜１００ｎｍの粒径分布の粒子とすることがより好ましい。
また、各種細胞内へ取り込まれ易い粒径とすることもでき、例えば、これを利用して、標識プローブを担持させたハイドロゲル粒子を細胞内に取り込ませて当該細胞を標識し、当該細胞の生体内での動態を観察することができる。
特に限定するものでは無いが、例えば、マクロファージ、単球、好中球等の貪食細胞へ標識プローブを担持させたハイドロゲル粒子を取り込ませて当該細胞を標識するために用いることができる。このとき、ハイドロゲル粒子は、上記貪食細胞のエンドサイトーシス（特にファゴサイトーシス）により細胞内に取り込まれる粒径とすることが好ましい。例えば、５００ｎｍ以上、通常は５００ｎｍ〜５μｍ、好ましくは１μｍ〜４μｍの粒径のハイドロゲル粒子とすることができる。
或いはまた、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫細胞、遺伝子改変された免疫細胞等の非貪食細胞へ標識プローブを担持させたハイドロゲル粒子を取り込ませて当該細胞を標識するために用いることもできる。これにより、例えば移植細胞の動態観察を実現できる。このとき、ハイドロゲル粒子は、上記非貪食細胞の細胞外物質の取り込み方法に対応した粒径とすることが好ましい。例えば、エンドサイトーシス（例えば、マクロピノサイトーシスなど）により細胞内に取り込まれる粒径とすることが好ましい。例えば、１０ｎｍ以上、通常は１０ｎｍ〜４００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍの粒径のハイドロゲル粒子とすることができる。
なお、対象細胞によるハイドロゲル粒子の取り込みは、in vitro環境下で行っても良いし、in vivo環境下で行っても良い。例えば、in vitro環境下でイドロゲル粒子を取り込んだ細胞の生体内での動態を観察するために、上記イメージング剤を用いても良い。
特に限定するものでは無いが、例えば、マクロファージ、単球、好中球等の貪食細胞へ標識プローブを担持させたハイドロゲル粒子を取り込ませて当該細胞を標識するために用いることができる。このとき、ハイドロゲル粒子は、上記貪食細胞のエンドサイトーシス（特にファゴサイトーシス）により細胞内に取り込まれる粒径とすることが好ましい。例えば、５００ｎｍ以上、通常は５００ｎｍ〜５μｍ、好ましくは１μｍ〜４μｍの粒径のハイドロゲル粒子とすることができる。
或いはまた、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫細胞、遺伝子改変された免疫細胞等の非貪食細胞へ標識プローブを担持させたハイドロゲル粒子を取り込ませて当該細胞を標識するために用いることもできる。これにより、例えば移植細胞の動態観察を実現できる。このとき、ハイドロゲル粒子は、上記非貪食細胞の細胞外物質の取り込み方法に対応した粒径とすることが好ましい。例えば、エンドサイトーシス（例えば、マクロピノサイトーシスなど）により細胞内に取り込まれる粒径とすることが好ましい。例えば、１０ｎｍ以上、通常は１０ｎｍ〜４００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ〜２００ｎｍの粒径のハイドロゲル粒子とすることができる。
なお、対象細胞によるハイドロゲル粒子の取り込みは、in vitro環境下で行っても良いし、in vivo環境下で行っても良い。例えば、in vitro環境下でイドロゲル粒子を取り込んだ細胞の生体内での動態を観察するために、上記イメージング剤を用いても良い。
本発明の医薬は、その標的又はその投与経路等の利用態様に応じて、ハイドロゲル粒子の表面を改質してもよく、例えば、凝集が生じることなく血中を循環できるようにしたり、血液中での循環時間を調節するために、ポリエチレングリコール等を表面に結合してもよい。また、特定の組織、物質を標的化するために、ペプチド、抗体等を表面に結合したり、粒子に電荷を付加したりしてもよい。
本発明の医薬は、通常、水、生理食塩水等に含まれる水性の組成物とすることができる。なお、本発明のハイドロゲル粒子は、医薬以外の様々な分野で利用可能であり、ハイドロゲル粒子を含む水性組成物は、様々な用途で中間物質として利用可能である。
本発明の医薬は、上述の通り、組織・細胞のイメージ化、疾患の治療若しくは予防、治療補助等の様々な目的で利用可能であり、様々な標的に利用できる。例えば、細胞外液；マクロファージ、単球及び好中球等の貪食細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞、免疫細胞及び遺伝子改変された免疫細胞等の非貪食細胞などの細胞；並びに移植組織・臓器、自家移植組織・臓器、外部から移植される組織・臓器及び人工的に作成された組織・臓器を標的にすることができる。
また、患者への投与経路は、その分析、治療等の目的及び標的などに応じて選択すればよいが、例えば静脈投与、標的臓器への局所投与などで投与することができる。その他については、担持される標識プローブ又は薬学的に活性な物質の通常の利用方法を参考に決定すればよい。
また、患者への投与経路は、その分析、治療等の目的及び標的などに応じて選択すればよいが、例えば静脈投与、標的臓器への局所投与などで投与することができる。その他については、担持される標識プローブ又は薬学的に活性な物質の通常の利用方法を参考に決定すればよい。
次に、本発明の医薬の製造方法について説明する。
本発明の医薬を構成するハイドロゲル粒子は、親水性ポリマーを架橋反応させて得られ、親水性ポリマーとしては前述した天然高分子、その誘導体、及び合成高分子を挙げることができる。親水性ポリマーは、通常溶液として調製され、架橋反応に供される。溶媒としては水が望ましいが、親水性ポリマーの種類に応じて、適宜、アルコールを添加したり、乳化剤を添加してもよい。
本発明の医薬を構成するハイドロゲル粒子は、親水性ポリマーを架橋反応させて得られ、親水性ポリマーとしては前述した天然高分子、その誘導体、及び合成高分子を挙げることができる。親水性ポリマーは、通常溶液として調製され、架橋反応に供される。溶媒としては水が望ましいが、親水性ポリマーの種類に応じて、適宜、アルコールを添加したり、乳化剤を添加してもよい。
本発明においては、親水性ポリマーは、放射線を照射する架橋方法に供され、本発明は、このような放射線を照射する物理化学的方法で、１０ｎｍ以下の粒径を含む広範囲の粒径から特定の粒径のハイドロゲル粒子を製造することを今回初めて可能にした。
本発明による放射線架橋方法では、親水性ポリマーを含む溶液に、放射線、典型的にはγ線又は電子線を照射する際に、溶液中の溶存酸素濃度、及び／又は親水性ポリマーの分子量を含む架橋反応条件を調節して、ハイドロゲル粒子の粒径を制御する。
親水性ポリマーを含む溶液にγ線等の放射線を照射すると、水分子の分解によって活性の高い分子が形成され、これが親水性ポリマーから水素原子を引き抜き、親水性ポリマーは反応活性の高い状態になる。この結果、近傍の親水性ポリマーと結合して３次元的なネットワーク構造を形成し、耐熱性や形状安定性が向上すると共に、多くの水を保持できるようになる。この架橋反応が連続すると多くのポリマーが架橋し大きな粒子になるが、反応中、親水性ポリマーを含む溶液に酸素が存在すると、これが架橋反応を停止する。そこで、親水性ポリマーを含む溶液中の酸素濃度を調整することでハイドロゲル粒子の粒径を制御することができる。
他方、親水性ポリマーの分子量は、ネットワーク構造の構造単位の点から、分子量を制御する。すなわち、架橋反応が同じ数繰り返された場合でも、相互に架橋してハイドロゲルを形成する親水性ポリマーの分子量が小さければ、ハイドロゲル粒子の粒径も小さくなる。このため、溶液中の酸素濃度等の他の条件と相まって特定の分子量の親水性ポリマーを選択することで、ハイドロゲル粒子の粒径を制御することができる。
親水性ポリマーを含む溶液にγ線等の放射線を照射すると、水分子の分解によって活性の高い分子が形成され、これが親水性ポリマーから水素原子を引き抜き、親水性ポリマーは反応活性の高い状態になる。この結果、近傍の親水性ポリマーと結合して３次元的なネットワーク構造を形成し、耐熱性や形状安定性が向上すると共に、多くの水を保持できるようになる。この架橋反応が連続すると多くのポリマーが架橋し大きな粒子になるが、反応中、親水性ポリマーを含む溶液に酸素が存在すると、これが架橋反応を停止する。そこで、親水性ポリマーを含む溶液中の酸素濃度を調整することでハイドロゲル粒子の粒径を制御することができる。
他方、親水性ポリマーの分子量は、ネットワーク構造の構造単位の点から、分子量を制御する。すなわち、架橋反応が同じ数繰り返された場合でも、相互に架橋してハイドロゲルを形成する親水性ポリマーの分子量が小さければ、ハイドロゲル粒子の粒径も小さくなる。このため、溶液中の酸素濃度等の他の条件と相まって特定の分子量の親水性ポリマーを選択することで、ハイドロゲル粒子の粒径を制御することができる。
放射線としては、γ線、Ｘ線及び電子線のいずれか１種、或いはこれらの混合放射線等を挙げることができ、粒度分布の制御が容易なγ線又は電子線が好ましい。
親水性ポリマーを含む溶液中の酸素濃度は、通常０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調整され、例えば、０〜７ｍｇ／Ｌ、又は２５〜４０ｍｇ／Ｌの範囲に調整することもできる。他の架橋条件にもよるが、例えば、平均粒径が３０ｎｍを超える粒子とする場合には、溶液中の溶存酸素濃度を０．１ｍｇ／Ｌ以下とすることが好ましく、０ｍｇ／Ｌとすることがより好ましい。他方、平均粒径が３０ｎｍ以下の粒子とする場合には、８〜４０ｍｇ／Ｌの溶存酸素濃度を選択することが好ましく、２５〜４０ｍｇ／Ｌの溶存酸素濃度とすることがより好ましく、３０〜４０ｍｇ／Ｌの溶存酸素濃度とすることが更に好ましい。
溶液中の溶存酸素濃度を０．１ｍｇ／Ｌ以下とする場合には、例えば、ゼラチン溶液を窒素ガスを充填するなどした無酸素雰囲気に攪拌しながら一定時間（少なくとも３０分以上、好ましくは１時間から１２時間）置くことが好ましく、必要に応じて脱気工程を行ってもよい。他方、８ｍｇ／Ｌより多い溶存酸素濃度、典型的には１０〜４０ｍｇ／Ｌの溶存酸素濃度とするには、例えば、ゼラチン溶液を、２０〜１００％の酸素含有雰囲気、好ましくは３０〜１００％、より好ましくは７５〜１００％の酸素濃度の雰囲気下で、必要に応じて加圧及び／又は攪拌しながら一定時間（少なくとも２０分以上、好ましくは３０分以上、より好ましくは１時間から１２時間）置けばよい。大気は、約２０％の酸素を含有しており、ゼラチン溶液に酸素を溶存させる簡便な雰囲気である。もっとも、より多くの酸素を含有させるために、より高濃度の酸素を含有する雰囲気を選択しても良い。
溶液中の溶存酸素濃度を０．１ｍｇ／Ｌ以下とする場合には、例えば、ゼラチン溶液を窒素ガスを充填するなどした無酸素雰囲気に攪拌しながら一定時間（少なくとも３０分以上、好ましくは１時間から１２時間）置くことが好ましく、必要に応じて脱気工程を行ってもよい。他方、８ｍｇ／Ｌより多い溶存酸素濃度、典型的には１０〜４０ｍｇ／Ｌの溶存酸素濃度とするには、例えば、ゼラチン溶液を、２０〜１００％の酸素含有雰囲気、好ましくは３０〜１００％、より好ましくは７５〜１００％の酸素濃度の雰囲気下で、必要に応じて加圧及び／又は攪拌しながら一定時間（少なくとも２０分以上、好ましくは３０分以上、より好ましくは１時間から１２時間）置けばよい。大気は、約２０％の酸素を含有しており、ゼラチン溶液に酸素を溶存させる簡便な雰囲気である。もっとも、より多くの酸素を含有させるために、より高濃度の酸素を含有する雰囲気を選択しても良い。
親水性ポリマーの分子量は、通常１，０００〜１，０００，０００の範囲から選択され、例えば、平均粒径が３０ｎｍ以上のハイドロゲルを調製する場合には、他の架橋条件にもよるが、分子量が１００，０００以上（例えば、１００，０００〜１，０００，０００の親水性ポリマーを選択することが好ましく、分子量が１５０，０００以上（例えば、１５０，０００〜８００，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましく、分子量が１８０，０００以上（例えば、１８０，０００〜５００，０００）の親水性ポリマーを選択することが更に好ましい。
他方、平均粒径が３０ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が１８０，０００以下（例えば、１，０００〜１８０，０００）の親水性ポリマーを選択するこが好ましく、分子量が１０，０００以下（例えば、１，０００〜１０，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましく、分子量が３，０００以下（例えば、１，０００〜３，０００）の親水性ポリマーを選択することが更に好ましい。特に、平均粒径が１０ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が１０，０００以下（例えば、１，０００〜１０，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましく、平均粒径が５ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が５，０００以下（例えば、１，０００〜５，０００）の親水性ポリマーを選択することが好ましく、分子量が３，０００以下（例えば、１，０００〜３，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましい。
他方、平均粒径が３０ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が１８０，０００以下（例えば、１，０００〜１８０，０００）の親水性ポリマーを選択するこが好ましく、分子量が１０，０００以下（例えば、１，０００〜１０，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましく、分子量が３，０００以下（例えば、１，０００〜３，０００）の親水性ポリマーを選択することが更に好ましい。特に、平均粒径が１０ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が１０，０００以下（例えば、１，０００〜１０，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましく、平均粒径が５ｎｍ以下の粒子とする場合には、分子量が５，０００以下（例えば、１，０００〜５，０００）の親水性ポリマーを選択することが好ましく、分子量が３，０００以下（例えば、１，０００〜３，０００）の親水性ポリマーを選択することがより好ましい。
本発明の一実施形態によれば、溶液中の溶存酸素濃度及び／又は親水性ポリマーの分子量に加え、放射線、典型的にはγ線又は電子線の照射量・照射率、照射時の溶液温度、溶液中の親水性ポリマー濃度、溶液のｐＨを特定範囲で調節することにより、ハイドロゲル粒子の粒径を制御する。例えば、溶液中の溶存酸素濃度を０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調整するとともに、水溶液中の親水性ポリマーの濃度を０．０４〜７．０質量％の範囲で調整し、放射線、典型的にはγ線の線量を０．０４〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、γ線又はＸ線の線量率を０．１〜１００ｋＧｙ／ｈの範囲で調整し、電子線の線量率を０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲で調整しγ線等の放射線の照射時の溶液温度を０〜７０℃の範囲で調整して、ハイドロゲル粒子の粒径を制御する。
親水性ポリマーの濃度は、広範囲の濃度を選択可能であり、典型的には、０．０４〜７．０質量％の範囲から選択される。平均粒径が３０ｎｍ以上のハイドロゲルを調製するには、１．０質量％以上の濃度とすることが好ましく、３．０質量％以上の濃度とすることがより好ましく、４．０質量％以上の濃度とすることが特に好ましい。他方、３０ｎｍ未満の平均粒径のハイドロゲルを調製するには、１．０質量％未満が好ましく、０．５質量％以下がより好ましく、０．２質量％以下が更に好ましい。また、０．０４〜０．２質量％の範囲であれば、粒径に大きな差異はないが、生成される粒子数が濃度に依存して多くなるため、０．０８質量％以上の濃度を選択することが好ましく、０．１質量％以上の濃度を選択することがより好ましい。
γ線等の放射線の線量・線量率も、広範囲の線量・線量率を選択可能であり、通常、γ線やＸ線の線量率は０．１〜１００ｋＧｙ／ｈの範囲から選択され、電子線の線量率は０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲から選択され、照射線量は１ｋＧｙ〜１００ｋＧｙの範囲から選択される。平均粒径が３０ｎｍ以上のハイドロゲルを調製する場合には、溶液中の親水性ポリマーの濃度を１．０質量％より大きく、好ましくは４．０質量％以上とした上で、γ線の照射線量を５ｋＧｙ以上とすることが好ましく、１０ｋＧｙ以上とすることがより好ましく、１５ｋＧｙ以上とするがさらに好ましい。溶液中の親水性ポリマーの濃度が１．０質量％以下、特に０．５質量％以下の場合には、放射線の線量・線量率は、ほとんど粒径に影響を及ぼさず、主に、形成される粒子の濃度に関連する。従って、このような親水性ポリマーの濃度においては、典型的にはγ線やＸ線の場合、０．１ｋＧｙ／ｈ〜２０ｋＧｙ／ｈの範囲から選択することができ、形成される粒子の濃度に対するエネルギー効率の観点から、好ましくは０．３ｋＧｙ／ｈ〜１５ｋＧｙ／ｈの範囲から選択され、より好ましくは２ｋＧｙ／ｈ〜１０ｋＧｙ／ｈの範囲から選択される。また、電子線の場合、０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲から選択することができ、形成される粒子の濃度に対するエネルギー効率の観点から、好ましくは０．０４〜１０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲から選択され、より好ましくは０．０４〜５ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲から選択される。
照射時の溶液温度は、形成される粒子の粒径に影響を及ぼす因子であり、通常、０℃〜７０℃から選択される。特に、親水性ポリマーの濃度を３．０質量％以上とし、照射線量を１ｋＧｙ以上とする場合には、２５℃以上の温度を選択することで平均粒径が５０ｎｍ以上の粒子を得ることができる。他方、溶液中の親水性ポリマーの濃度が１．０質量％以下、特に０．５質量％以下の場合には、２０℃以上の温度では、温度が粒径に殆ど影響を及ぼさないが、２０℃未満の温度とすると粒径が大きくなる。従って、例えば、平均粒径が３０ｎｍを超える粒子とする場合には、２０℃未満の温度を選択することが好ましく、１５℃以下の温度を選択することがより好ましい。他方、平均粒径が３０ｎｍ以下の粒子とする場合には、２０℃より高い温度を選択することが好ましく、平均粒径が２５ｎｍ以下の粒子とする場合には、２５℃以上の温度を選択することが好ましい。
溶液のｐＨは、親水性ポリマーの濃度を３．０質量％以上とする場合には、粒径に関連する因子になり、例えば、平均粒径が４０ｎｍ以上の粒子とする場合には、ｐＨ６以上を選択することが好ましく、ｐＨ７以上を選択することがより好ましい。他方、親水性ポリマーの濃度を１．０質量％以下とする場合には、溶液のｐＨは、粒径に影響を及ぼさない。従って、特にｐＨを調製する必要は無いが、通常はｐＨ５〜１１程度とする。
以上の点を踏まえ、一実施形態において、平均粒径５ｎｍ以下の粒径を有するハイドロナノゲル粒子、典型的にはゼラチンナノゲルを調製する場合、以下の条件が選択される。
親水性ポリマーの分子量：５，０００以下（例えば、１，０００〜５，０００、好ましくは１，０００〜３，０００）
親水性ポリマー溶液の濃度：０．０５〜３．０重量％
溶存酸素濃度：８〜４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２５〜４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０〜４０ｍｇ／Ｌ）
γ線線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２０〜６０℃。
親水性ポリマーの分子量：５，０００以下（例えば、１，０００〜５，０００、好ましくは１，０００〜３，０００）
親水性ポリマー溶液の濃度：０．０５〜３．０重量％
溶存酸素濃度：８〜４０ｍｇ／Ｌ（好ましくは２５〜４０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは３０〜４０ｍｇ／Ｌ）
γ線線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２０〜６０℃。
また、他の実施形態において、平均粒径３０ｎｍ以下の粒径を有するハイドロナノゲル粒子、典型的にはゼラチンナノゲルを調製する場合、以下の条件が選択される。
親水性ポリマーの分子量：１５０，０００以下（例えば、１，０００〜１５０，０００、好ましくは１，０００〜１００，０００）
親水性ポリマー溶液の濃度：０．０５〜０．５重量％
溶存酸素濃度：８〜４０ｍｇ／Ｌ、（好ましくは、３０〜４０ｍｇ／Ｌ）
γ線線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２０〜６０℃（好ましくは２５〜６０℃）。
親水性ポリマーの分子量：１５０，０００以下（例えば、１，０００〜１５０，０００、好ましくは１，０００〜１００，０００）
親水性ポリマー溶液の濃度：０．０５〜０．５重量％
溶存酸素濃度：８〜４０ｍｇ／Ｌ、（好ましくは、３０〜４０ｍｇ／Ｌ）
γ線線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２０〜６０℃（好ましくは２５〜６０℃）。
さらに他の実施形態において、平均粒径２０ｎｍ以下（好ましくは１５ｎｍ以下）の粒径を有するゼラチンナノゲルを調製する場合、以下の条件が選択される。
親水性ポリマーの分子量：１００，０００以下（通常１，０００〜１００，０００）
ゼラチン水溶液の濃度：０．０５〜０．５重量％
溶存酸素濃度：３０〜４０ｍｇ／Ｌ
γ線の照射線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２５〜６０℃。
親水性ポリマーの分子量：１００，０００以下（通常１，０００〜１００，０００）
ゼラチン水溶液の濃度：０．０５〜０．５重量％
溶存酸素濃度：３０〜４０ｍｇ／Ｌ
γ線の照射線量：０．１〜１００ｋＧｙ
溶液温度が２５〜６０℃。
他方、さらに他の実施形態において、平均粒径６０ｎｍ以上（好ましくは７０ｎｍ以上）を有するゼラチンナノゲルを調製する場合、以下の条件が選択される。
親水性ポリマーの分子量：５，０００以上（通常５，０００〜１,０００，０００）
ゼラチン水溶液の濃度：０．０５〜５重量％
溶存酸素濃度：０〜８ｍｇ／Ｌ
γ線の照射線量：０．１〜１００ｋＧｙ
照射温度が０〜１５℃。
親水性ポリマーの分子量：５，０００以上（通常５，０００〜１,０００，０００）
ゼラチン水溶液の濃度：０．０５〜５重量％
溶存酸素濃度：０〜８ｍｇ／Ｌ
γ線の照射線量：０．１〜１００ｋＧｙ
照射温度が０〜１５℃。
本発明の製造方法では、上述のようにして得られたハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を結合・担持して、医薬を調製する。
ハイドロゲル粒子に結合・担持される標識プローブ及び薬学的に活性な物質は、前述のとおりであり、例えば、エステル化反応やキレート剤の活用によって、標識プローブ及び薬学的に活性な物質をハイドロゲル粒子に結合・担持させる。
ＭＲＩ造影剤の標識プローブを例に説明すると、標識プローブは、通常、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ等の常磁性体を含み、標識プローブの担持は、通常、これら常磁性体を含む化合物をハイドロゲル粒子にエステル結合させることにより行なう。これら常磁性体は、生体内でイオン化すると毒性を有することがあるため、キレート剤などに捕捉させた上でハイドロゲル粒子に結合させることが好ましい。このようなキレート剤としては、ＤＴＰＡ等の直鎖型キレート剤、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル（一般名ガドテル酸メグミン）等のマクロ環型誘導体、複合型のＰｙＣ３Ａ、金属粒子である酸化鉄微粒子（ＳＰＩＯ、ＵＳＰＩＯ）、ＭｎＯ、ＧｄＦ３、化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）用の標識化合物、超偏極用の核種（１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ等）などが挙げられる。
ＭＲＩ造影剤の標識プローブを例に説明すると、標識プローブは、通常、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｇｄ等の常磁性体を含み、標識プローブの担持は、通常、これら常磁性体を含む化合物をハイドロゲル粒子にエステル結合させることにより行なう。これら常磁性体は、生体内でイオン化すると毒性を有することがあるため、キレート剤などに捕捉させた上でハイドロゲル粒子に結合させることが好ましい。このようなキレート剤としては、ＤＴＰＡ等の直鎖型キレート剤、ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル（一般名ガドテル酸メグミン）等のマクロ環型誘導体、複合型のＰｙＣ３Ａ、金属粒子である酸化鉄微粒子（ＳＰＩＯ、ＵＳＰＩＯ）、ＭｎＯ、ＧｄＦ３、化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）用の標識化合物、超偏極用の核種（１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ等）などが挙げられる。
標識プローブ又は薬学的に活性な物質をキレート化合物に捕捉させた上でハイドロゲル粒子に結合させる方法としては、例えば、キレート化合物をハイドロゲル粒子に結合させた後、標識プローブ又は薬学的に活性な物質をハイドロゲル粒子に結合したキレート化合物と反応させて錯体を形成する方法が挙げられる。
キレート化合物とハイドロゲル粒子との結合は、例えば、キレート化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド部分等の官能基と、ハイドロゲルのアミノ基とのアミド結合を典型的な一例として挙げることができ、その他では、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、ホスホジエステル結合、メタセシス反応、アルドール縮合等を利用して行なう事ができる。反応は、例えば、常温で水中で両化合物を混合する、事前に両化合物を結合するなどして行なう事ができる。
錯体の形成は、標識プローブ又は薬学的に活性な物質のハロゲン化合物等の塩を用いてキレート化合物に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を捕捉させることで行なうことができる。
キレート化合物以外の化合物についても、同様の結合を利用することができるし、ゲルの網目に保持することでハイドロゲルに担持させることも可能である。
キレート化合物とハイドロゲル粒子との結合は、例えば、キレート化合物のＮ−ヒドロキシコハク酸イミド部分等の官能基と、ハイドロゲルのアミノ基とのアミド結合を典型的な一例として挙げることができ、その他では、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、ホスホジエステル結合、メタセシス反応、アルドール縮合等を利用して行なう事ができる。反応は、例えば、常温で水中で両化合物を混合する、事前に両化合物を結合するなどして行なう事ができる。
錯体の形成は、標識プローブ又は薬学的に活性な物質のハロゲン化合物等の塩を用いてキレート化合物に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を捕捉させることで行なうことができる。
キレート化合物以外の化合物についても、同様の結合を利用することができるし、ゲルの網目に保持することでハイドロゲルに担持させることも可能である。
ハイドロゲル粒子に、ポリエチレングリコール、ペプチド、抗体等を結合したり、粒子に電荷を付加したりする方法は、多数の報告があるので、それらに従って行えばよい。また、蛍光化合物をゲルに結合させることも、多数の報告があるので、それらに従って行えばよい。
本発明の製造方法では、場合によっては、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する前の、又は担持したゼラチンナノゲルを濃縮及び／又は精製する工程を行なってもよい。また、特定の粒径のゼラチンナノゲルを分取する工程を含んでよい。
このような濃縮、精製及び分取工程は、一般的に利用されている方法でよいが、例えば、１〜１００ｋＤａの限外ろ過フィルターにより行なうことができる。
このような濃縮、精製及び分取工程は、一般的に利用されている方法でよいが、例えば、１〜１００ｋＤａの限外ろ過フィルターにより行なうことができる。
標識プローブ又は薬学的に活性な物質がハイドロゲル粒子に担持された医薬は、その用途に応じて他の成分を配合して医薬組成物を調製することができ、通常の診断薬、分析試薬、治療薬、予防薬等で用いられる成分を用いて調整すれば良い。典型的には、水性組成物として調製される。
以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
（ＭＲＩ造影剤の調製）
［実施例１］
分子量１５０，０００の豚ゼラチン０．１重量％に蒸留水９９．９重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。次いで、得られた溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量５ｋＧｙで照射したところ、白濁した液が得られた。動的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社ゼータサイザーナノＺＳＰ）を用いて、液にレーザー光を照射して散乱光のゆらぎ（拡散係数を反映する）を検出し、ストークス・アインシュタイン式を利用して液中のゼラチンナノゲルの粒径を分析したところ、図１に示した通り、８〜６０ｎｍであった。
得られた白濁液を１００ｋＤａ限外ろ過フィルターにかけ、未反応のゼラチンを弁別し、ゼラチンナノゲルを分取、濃縮、精製した。
得られたゼラチンナノゲルの濃縮液を、５ｍｍｏｌ／Ｌの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）と混合し、２５℃で１時間静置して反応させ、得られたＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを担持したゼラチンナノゲルと５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ガドリニウムを４０℃で３時間反応させることにより、ゼラチンナノゲルにＧｄ錯体を担持したＭＲＩ造影剤を得た。
得られたＭＲＩ造影剤を含有する水溶液を密閉容器に入れ、透過型電子顕微鏡で観察した。得られた顕微鏡の像を図２に示す。観察された像からも、造影剤はサイズの揃った粒子であることが分かる。
（ＭＲＩ造影剤の調製）
［実施例１］
分子量１５０，０００の豚ゼラチン０．１重量％に蒸留水９９．９重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。次いで、得られた溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量５ｋＧｙで照射したところ、白濁した液が得られた。動的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社ゼータサイザーナノＺＳＰ）を用いて、液にレーザー光を照射して散乱光のゆらぎ（拡散係数を反映する）を検出し、ストークス・アインシュタイン式を利用して液中のゼラチンナノゲルの粒径を分析したところ、図１に示した通り、８〜６０ｎｍであった。
得られた白濁液を１００ｋＤａ限外ろ過フィルターにかけ、未反応のゼラチンを弁別し、ゼラチンナノゲルを分取、濃縮、精製した。
得られたゼラチンナノゲルの濃縮液を、５ｍｍｏｌ／Ｌの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）と混合し、２５℃で１時間静置して反応させ、得られたＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステルを担持したゼラチンナノゲルと５ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ガドリニウムを４０℃で３時間反応させることにより、ゼラチンナノゲルにＧｄ錯体を担持したＭＲＩ造影剤を得た。
得られたＭＲＩ造影剤を含有する水溶液を密閉容器に入れ、透過型電子顕微鏡で観察した。得られた顕微鏡の像を図２に示す。観察された像からも、造影剤はサイズの揃った粒子であることが分かる。
［実施例２〜９］
以下の条件でγ線の照射を行なった他は、実施例１と同様にして（線量５ｋＧｙ、分子量１５０，０００の豚ゼラチン）、ＭＲＩ造影剤を得た。
以下の条件でγ線の照射を行なった他は、実施例１と同様にして（線量５ｋＧｙ、分子量１５０，０００の豚ゼラチン）、ＭＲＩ造影剤を得た。
実施例２乃至９で得られたゼラチンナノゲルの粒径、並びにＭＲＩ造影剤を、実施例１と同様に分析及び観察した。各実施例で得られたゼラチンナノゲルの粒径範囲及び平均粒径を、放射線架橋条件と伴に、表２に纏めて示す。
上記の通り、ゼラチン水溶液にγ線を照射する際の条件によって、粒径を制御でき、酸素含有雰囲気での放射線架橋は、酸素を含有しない雰囲気での放射線架橋に比べ、粒子が小さくなった。また、空気雰囲気または高酸素雰囲気で２５℃以上の温度で０．０５〜０．１質量％の濃度のゼラチン水溶液に０．５〜１０ｋＧｙ／ｈの線量率でγ線を照射した場合には、平均粒径３０ｎｍ以下のゼラチンナノゲルが得られることが分った。
（ＭＲＩ細胞内へ導入した造影剤のＭＲＩ画像の分析）
実施例１で得られた造影剤を、２４時間、間葉系幹細胞と共培養し、細胞内に導入した。培養液をＰＣＲチューブに移し、遠心装置により沈殿させた後、チューブをＭＲＩ装置内に固定し、ＭＲＩ計測を行った。対照として、粒径１０ｎｍ未満のデキストランにＭｎ−ＤＯＴＡを担持した造影剤を用いた。装置は、７テスラ前臨床用ＭＲＩおよび送受信バードケージコイルを用い、典型的なＴ１強調画像、Ｔ２強調画像、Ｔ１計算画像、Ｔ２計算画像を撮像し、得られた画像より、緩和時間および緩和率を計算した。
図３の左は、実施例１の造影剤を導入した細胞のＴ１強調画像及びＴ２強調画像であり、右は、対照であるデキストランＭｎ−ＤＯＴＡを導入した細胞のＴ１強調画像及びＴ２強調画像である。図３に示すように、実施例１の造影剤は、細胞内に入ってもＴ１強調画像で陽性効果を維持した。一方、デキストランＭｎ−ＤＯＴＡでは陰性化した。実施例１の造影剤では、水を多く保持しているゼラチンナノゲルを母材としたことで、Ｇｄ錯体の周囲に自由水が多く存在する空間が形成され、これにより、横緩和時間の短縮が抑制されたものと予想される。結果として、本発明の造影剤は、細胞追跡など、造影剤を細胞内に導入して行なうＭＲＩ検査に有用と考えられる。
実施例１で得られた造影剤を、２４時間、間葉系幹細胞と共培養し、細胞内に導入した。培養液をＰＣＲチューブに移し、遠心装置により沈殿させた後、チューブをＭＲＩ装置内に固定し、ＭＲＩ計測を行った。対照として、粒径１０ｎｍ未満のデキストランにＭｎ−ＤＯＴＡを担持した造影剤を用いた。装置は、７テスラ前臨床用ＭＲＩおよび送受信バードケージコイルを用い、典型的なＴ１強調画像、Ｔ２強調画像、Ｔ１計算画像、Ｔ２計算画像を撮像し、得られた画像より、緩和時間および緩和率を計算した。
図３の左は、実施例１の造影剤を導入した細胞のＴ１強調画像及びＴ２強調画像であり、右は、対照であるデキストランＭｎ−ＤＯＴＡを導入した細胞のＴ１強調画像及びＴ２強調画像である。図３に示すように、実施例１の造影剤は、細胞内に入ってもＴ１強調画像で陽性効果を維持した。一方、デキストランＭｎ−ＤＯＴＡでは陰性化した。実施例１の造影剤では、水を多く保持しているゼラチンナノゲルを母材としたことで、Ｇｄ錯体の周囲に自由水が多く存在する空間が形成され、これにより、横緩和時間の短縮が抑制されたものと予想される。結果として、本発明の造影剤は、細胞追跡など、造影剤を細胞内に導入して行なうＭＲＩ検査に有用と考えられる。
実施例１で得られた造影剤と、比較対象としてのｇａｄｏｔｅｒｉｄｏｌ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３ＡＭＲＩに対する造影能を示す数値を以下に示す。
＜実施例１の造影剤＞
縦緩和能（ｒ１）：５．４０（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
横緩和能（ｒ２）：７．９６（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ１／ｒ２：０．６８
＜ｇａｄｏｔｅｒｉｄｏｌ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ＞
ｒ１：３．８２（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ２：４．８２（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ１／ｒ２：０．７９
（１テスラ装置、サンプル温度２４度、ソレノイドコイルで計測）
＜実施例１の造影剤＞
縦緩和能（ｒ１）：５．４０（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
横緩和能（ｒ２）：７．９６（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ１／ｒ２：０．６８
＜ｇａｄｏｔｅｒｉｄｏｌ、Ｇｄ−ＨＰ−ＤＯ３Ａ＞
ｒ１：３．８２（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ２：４．８２（ｓｅｃ−１・ｍＭ−１）
ｒ１／ｒ２：０．７９
（１テスラ装置、サンプル温度２４度、ソレノイドコイルで計測）
（平均粒径５ｎｍ以下のゼラチンナノゲルの調製）
［実施例１０］
分子量２，０００の豚ゼラチン２重量％に蒸留水９８重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。次いで、得られた溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率５ｋＧｙ／ｈ、線量２．５ｋＧｙで照射した。動的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社ゼータサイザーナノＺＳＰ）を用いて、この液にレーザー光を照射して散乱光のゆらぎ（拡散係数を反映する）を検出し、ストークス・アインシュタイン式を利用して液中のゼラチンナノゲルの粒径を解析したところ、図４に示す通り２〜２０ｎｍの粒径で、４ｎｍ付近に大きなピークと１１ｎｍ付近に小さなピークを有する粒径分布が得られ、平均粒径は４．９ｎｍであった。
［実施例１０］
分子量２，０００の豚ゼラチン２重量％に蒸留水９８重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。次いで、得られた溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率５ｋＧｙ／ｈ、線量２．５ｋＧｙで照射した。動的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ社ゼータサイザーナノＺＳＰ）を用いて、この液にレーザー光を照射して散乱光のゆらぎ（拡散係数を反映する）を検出し、ストークス・アインシュタイン式を利用して液中のゼラチンナノゲルの粒径を解析したところ、図４に示す通り２〜２０ｎｍの粒径で、４ｎｍ付近に大きなピークと１１ｎｍ付近に小さなピークを有する粒径分布が得られ、平均粒径は４．９ｎｍであった。
（坦がんマウスの体内でのイメージング剤の集積及び排出の動態）
実施例１０で得られた平均粒径４．９ｎｍ、濃度５ｍＭのＭＲＩ造影剤を、２１．３ｇの坦がんマウスの静脈に３００μＬ注入し、体内での集積及び排出の様子をＭＲＩにより計測・撮像した。担がんマウスは、Colon26 s.c. Day9 modelを用いた。装置は、７テスラ前臨床用ＭＲＩおよび送受信バードケージコイルを用い、Ｔ１強調画像、Ｔ２強調画像、Ｔ１計算画像、Ｔ２計算画像を撮像した。
図５は、実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を担癌マウスに投与する前のＭＲＩのＴ１強調画像であり、信号強度を測定した各部位を枠で囲んでいる。図６は、実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を静脈投与する前、投与直後及び投与から１間後にＭＲＩ計測を行った際の腎臓付近のＴ１強調画像であり、図７は、担癌マウスに実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を静脈投与する前、投与直後及び投与から１間後にＭＲＩ計測を行った際の各部位（肝臓、腎臓皮質、腎臓髄質及び腫瘍部の信号強度を示す。
これらの図に示すように、造影剤は腫瘍や肝臓には集積せず、投与直後腎臓に集積し、その後、２時間以内で腎排出され正常な値（複数回の投与で投与前の信号強度の１００〜１１０％）に戻ることが分かった。このことから、２時間後には投与された造影剤の大半の排出が終わったことが示唆される。
実施例１０で得られた平均粒径４．９ｎｍ、濃度５ｍＭのＭＲＩ造影剤を、２１．３ｇの坦がんマウスの静脈に３００μＬ注入し、体内での集積及び排出の様子をＭＲＩにより計測・撮像した。担がんマウスは、Colon26 s.c. Day9 modelを用いた。装置は、７テスラ前臨床用ＭＲＩおよび送受信バードケージコイルを用い、Ｔ１強調画像、Ｔ２強調画像、Ｔ１計算画像、Ｔ２計算画像を撮像した。
図５は、実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を担癌マウスに投与する前のＭＲＩのＴ１強調画像であり、信号強度を測定した各部位を枠で囲んでいる。図６は、実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を静脈投与する前、投与直後及び投与から１間後にＭＲＩ計測を行った際の腎臓付近のＴ１強調画像であり、図７は、担癌マウスに実施例１０で得られたＭＲＩ造影剤を静脈投与する前、投与直後及び投与から１間後にＭＲＩ計測を行った際の各部位（肝臓、腎臓皮質、腎臓髄質及び腫瘍部の信号強度を示す。
これらの図に示すように、造影剤は腫瘍や肝臓には集積せず、投与直後腎臓に集積し、その後、２時間以内で腎排出され正常な値（複数回の投与で投与前の信号強度の１００〜１１０％）に戻ることが分かった。このことから、２時間後には投与された造影剤の大半の排出が終わったことが示唆される。
（電子線を用いたナノゲル作製）
［実施例１１］
実施例２と同じ条件で作製したゼラチン水溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、２ＭｅＶの電子線を線量率８００Ｇｙ／passで６回、線量４．８ｋＧｙ照射した。動的光散乱測定装置を用いて、液中のゼラチンナノゲルの粒径を分析したところ、図８に示す通り、１０ｎｍ以下の他、１０〜５０ｎｍの間と３００〜６００ｎｍの間にピークを有する粒度分布のナノゲルが得られた。
［実施例１１］
実施例２と同じ条件で作製したゼラチン水溶液を、空気雰囲気で、温度２５℃で、２ＭｅＶの電子線を線量率８００Ｇｙ／passで６回、線量４．８ｋＧｙ照射した。動的光散乱測定装置を用いて、液中のゼラチンナノゲルの粒径を分析したところ、図８に示す通り、１０ｎｍ以下の他、１０〜５０ｎｍの間と３００〜６００ｎｍの間にピークを有する粒度分布のナノゲルが得られた。
（放射線架橋と化学架橋後の残存アミノ酸の比較）
分子量１５０，０００の豚ゼラチン１０重量％に蒸留水９０重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。この水溶液に対し、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量６０ｋＧｙで照射し、放射線架橋ゼラチンゲルを得た。また、上記ゼラチン水溶液に、化学架橋剤であるグルタルアルデヒドの水溶液（０．４８重要％）を等量加え４０℃で１２時間反応させたのち、１００ｍＭのグリシン水溶液で５０℃１時間洗浄し化学架橋ゼラチンゲルを得た。それぞれの手法で得られた架橋ゼラチンゲルを３０℃で２４時間真空乾燥し、約１ｍｇを１．５ｍＬの小型バイアルに採取した。窒素飽和条件下、１１０℃で塩酸により２４時間加水分解した。リファレンスとして未架橋のゼラチンも同様に加水分解した。その後、水酸化ナトリウムで中和し、各アミノ酸を４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎにより蛍光標識し、ＨＰＬＣにより定性、定量測定した。ゲル粒子にキレート剤を結合する場合、アミノ基を有するリジンの残存量が重要となる。解析の結果、表３に示すように、未処理のゼラチンと比較して、グルタルアルデヒド処理ではリジンが２０％程度まで減少するものの、γ線照射では４０％以上残すことが出来るが明らかにされた。さらに、放射線照射では、架橋に関与すると考えられているフェニルアラニンの残存率がグルタルアルデヒドと比べて減少することが明らかにされた。
＊表中の数値は、未処理のゼラチン中のアミノ基を有するリジン及びフェニルアラニンのモル数を１００とした場合の各架橋ゲルのリジン及びフェニルアラニン残存率を示す。
分子量１５０，０００の豚ゼラチン１０重量％に蒸留水９０重量％を加え、２５℃において空気雰囲気で（酸素含有量約２１％、大気圧）、１０分間攪拌して溶存酸素濃度８ｍｇ／Ｌのゼラチン水溶液を得た。この水溶液に対し、空気雰囲気で、温度２５℃で、Ｃｏ６０照射施設においてγ線を線量率１０ｋＧｙ／ｈ、線量６０ｋＧｙで照射し、放射線架橋ゼラチンゲルを得た。また、上記ゼラチン水溶液に、化学架橋剤であるグルタルアルデヒドの水溶液（０．４８重要％）を等量加え４０℃で１２時間反応させたのち、１００ｍＭのグリシン水溶液で５０℃１時間洗浄し化学架橋ゼラチンゲルを得た。それぞれの手法で得られた架橋ゼラチンゲルを３０℃で２４時間真空乾燥し、約１ｍｇを１．５ｍＬの小型バイアルに採取した。窒素飽和条件下、１１０℃で塩酸により２４時間加水分解した。リファレンスとして未架橋のゼラチンも同様に加水分解した。その後、水酸化ナトリウムで中和し、各アミノ酸を４−Ｆｌｕｏｒｏ−７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｆｕｒａｚａｎにより蛍光標識し、ＨＰＬＣにより定性、定量測定した。ゲル粒子にキレート剤を結合する場合、アミノ基を有するリジンの残存量が重要となる。解析の結果、表３に示すように、未処理のゼラチンと比較して、グルタルアルデヒド処理ではリジンが２０％程度まで減少するものの、γ線照射では４０％以上残すことが出来るが明らかにされた。さらに、放射線照射では、架橋に関与すると考えられているフェニルアラニンの残存率がグルタルアルデヒドと比べて減少することが明らかにされた。
＊表中の数値は、未処理のゼラチン中のアミノ基を有するリジン及びフェニルアラニンのモル数を１００とした場合の各架橋ゲルのリジン及びフェニルアラニン残存率を示す。
本発明は、脳内に入らない臨床ＭＲＩ診断用造影剤として広く利用できる可能性がある。また、幹細胞などの移植細胞を標識して、体内動態を追跡できる陽性造影剤としても利用できる可能性がある。また、ナノハイドロゲルの粒径制御法として期待できる。
Claims (41)
- 放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜７０ｎｍである、請求項１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の粒径は、１〜１０ｎｍである、請求項１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、３０ｎｍ以下である、請求項１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の平均粒径は、５ｎｍ以下である、請求項１に記載の医薬。
- 投与後に迅速に腎排泄させるための、請求項２〜５の何れか１項に記載の医薬。
- 前記標識プローブの腎髄質での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、投与後１時間以内に１０％以上増大し、投与後２時間以内に１０％以下の増加レベルになる、請求項６に記載の医薬。
- 肝臓への蓄積無しにイメージ化又は治療を行なうための、請求項２〜７の何れか１項に記載の医薬。
- 前記標識プローブの肝臓での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで１０％以上増加しない、請求項８に記載の医薬。
- 肝臓機能が低下している患者に用いる、請求項２〜９の何れか１項に記載の医薬。
- 細胞内に取り込まれて該細胞を標識又は該細胞に作用するための、請求項１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の粒径が１ｎｍ〜５μｍである、請求項１１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の粒径が１０〜２００ｎｍである、癌組織の標識又は抗癌治療のための、請求項１１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲル粒子の粒径が５００ｎｍ〜５μｍである、貪食細胞を標識するための、請求項１１に記載の医薬。
- 前記ハイドロゲルは、ゼラチン、コラーゲン、及びペプチドからなる群から選択される少なくとも１種の親水性ポリマーに由来する、請求項１〜１４の何れか１項に記載の医薬。
- 投与後、脳室への移行が無い、請求項１〜１５の何れか１項に記載の医薬。
- 前記標識プローブの脳室での信号強度が、投与前の該信号強度に対して、少なくとも投与後２時間まで５％以上増加しない、請求項１６に記載の医薬。
- ＰＥＴイメージング剤、ＳＰＥＣＴイメージング剤、ＣＴ造影剤、又はＭＲＩ造影剤である、請求項１〜１７の何れか１項に記載の医薬。
- ＭＲＩ造影剤である、請求項１〜１７の何れか１項に記載の医薬。
- 細胞内に導入されるＭＲＩ造影剤である、請求項１９に記載の医薬。
- 細胞内に導入された際、ＭＲＩ装置で撮像されたＴ１強調画像法において水および生体組織において信号低下を生じさせない、請求項２０に記載の医薬。
- 細胞外液分布造影剤として用いられるＭＲＩ造影剤である、請求項２〜９の何れか１項に記載の医薬。
- 前記標識プローブが、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｉ、Ａｕ、酸化鉄、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、２９Ｓｉ、６２Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、１３Ｃ、１９Ｆ、３Ｈｅ、１２９Ｘｅ、１５Ｎ、１２３Ｉ又は９９ｍＴｃを含む、請求項１８〜２２の何れか１項に記載の医薬。
- Ｇｄ、Ｍｎ、又はＦｅが、前記ハイドロゲル粒子に直接結合しているか、又はこれら原子の少なくとも１つの１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）の錯体が前記ハイドロゲル粒子に結合している、請求項１９に記載の医薬。
- 請求項１〜２４の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を、in vitroで、対象細胞と共培養して該細胞に該イメージング剤を取り込ませ、該細胞中の該イメージング剤からの信号を検出し、画像化する、細胞イメージング方法。
- 請求項１〜２４の何れか１項に記載の医薬がイメージング剤であり、前記イメージング剤を取り込んでいる対象からの信号を検出し、画像化する、組織又は細胞のイメージング方法。
- 親水性ポリマーを含む水溶液に放射線を照射して、ハイドロゲル粒子を製造する方法であって、
該溶液中の溶存酸素濃度を調整し、且つ／又は特定の範囲の分子量を有する該親水性ポリマーを選択して、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御することを特徴とする、方法。 - 前記溶液中の溶存酸素濃度を０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調整し、且つ／又は分子量１，０００〜１，０００，０００の範囲の前記親水性ポリマーから選択する、請求項２７に記載の方法。
- 前記親水性ポリマーは、デキストリン、デキストラン、キチン、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、寒天、アガロース、ジェランガム、キサンタンガム、フィブリン、カラヤガム、カラギーナン、セルロース、スターチ、ペプチド、タンパク質および核酸からなる群から選択される天然高分子化合物、該天然高分子化合物をヒドロキシ低級アルキル基、又は低級アルコキシアルキル基で置換した誘導体、並びにポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、およびポリエチレングリコールからなる群から選択される合成高分子からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
- 前記放射線が、電子線、Ｘ線、及びγ線のいずれか１種、或いはこれらの混合放射線である、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法。
- さらに、前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度、前記放射線の線量、前記放射線の線量率、および／又は前記放射線の照射時の温度を調整することにより、前記ハイドロゲル粒子の粒径を制御する、請求項２７〜３０の何れか１項に記載の方法。
- 前記水溶液中の前記親水性ポリマーの濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、放射線の線量を０．０４〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の線量率を、ガンマ線やX線の場合は０．1〜１０ｋＧｙ／ｈの範囲で、電子線の場合は０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を０〜７０℃の範囲で調整する、請求項３１に記載の方法。
- 分子量が５０，０００〜１，０００，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜５．０質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の線量率をγ線又はＸ線では０．1〜１００ｋＧｙ／ｈの範囲で、電子線では０．０４〜５０ｋＧｙ／ｐａｓｓの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整し、必要に応じて限外ろ過フィルターにかけ、所望の粒径のゼラチンナノゲルを分取する、請求項３１に記載の方法。
- 分子量が１，０００〜５０，０００の前記親水性ポリマーを選択し、前記溶液中の溶存酸素濃度を８〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節し、前記水溶液中の前記天然高分子化合物又はその誘導体の濃度を０．０５〜０．５質量％に調整し、前記放射線の線量を０．１〜１００ｋＧｙの範囲で調整し、前記放射線の線量率を０．1〜１０ｋＧｙ／ｈの範囲で調整し、前記放射線の照射時の温度を２５〜６０℃の範囲で調整する、請求項３１に記載の方法。
- 前記溶液中の溶存酸素濃度を３０〜４０ｍｇ／Ｌの範囲で調節する、請求項３１〜３４の何れか１項に記載の方法。
- 分子量が１，０００〜１０，０００の前記親水性ポリマーを選択する、請求項３１〜３５の何れか１項に記載の方法。
- 粒径が１〜１０ｎｍの放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
- 請求項２７〜３６の何れか１項に記載の方法で得られたハイドロゲル粒子に、標識プローブ又は薬学的に活性な物質を担持する工程を含む、医薬の製造方法。
- 前記イメージング剤は、ＭＲＩ造影剤であり、前記ハイドロゲル粒子にマクロ環型キレート剤を結合し、前記マクロ環型キレート剤に標識化合物を結合させて錯体を形成する、 請求項３７又は３８に記載の方法。
- 前記マクロ環型キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＤＯＴＡ−ＮＨＳ−エステル）であり、前記標識化合物は、Ｇｄである、請求項３９に記載の方法。
- 放射線架橋構造を有するハイドロゲル粒子であって、粒径が１〜１０ｎｍの粒子を含む水性組成物。
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| 改訂版 ＭＲＩ応用自在, JPN6021049286, 2004, pages 142 - 153, ISSN: 0004660003 * |
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| JP7156665B2 (ja) | 2022-10-19 |
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